CN105018515A - 一种利用谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌提高精氨酸产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌及其提高精氨酸产量的方法，所述谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌的dtsR1基因被敲除，本发明将dtsR1基因敲除后，使其调控的α-酮戊二酸脱氢酶复合物(oxoglutarate？dehydrogenase？complex，ODHC)的转录水平大幅下降，使α-酮戊二酸流向了精氨酸；同时在发酵培养基中添加吐温80或油酸或二者混合物弥补了dtsR1缺失造成的营养缺失，在发酵培养对数生长初期添加吐温40诱导了磷酸戊糖途径的基因转录水平大幅提高，从而为精氨酸的合成提供了足量的NADPH，省去了采用其他繁琐的分子育种手段来提高NADPH供应及提高三羧酸循环途径中α-酮戊二酸的其他积累方法。

Description

一种利用谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌提高精氨酸产量的方法

技术领域

本发明涉及一种利用微生物提高精氨酸产量的方法，尤其涉及一种利用谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌提高精氨酸产量的方法。

背景技术

L-精氨酸是一种含有胍基的碱性氨基酸，在哺乳动物中是半必需或条件性必需氨基酸。近年来研究显示，L-Arg能促进各种免疫分子的合成从而可抑制癌细胞的生长，促进尿液循环并降低血液中氨的含量，同时作为生成NO的前体代谢产物，L-Arg还具备放松和扩张血管等重要功能。因此，L-Arg在医药和食品方面有广泛的应用价值，备受国内外研发和生产机构的关注。目前，全世界L-Arg年需求量在15000吨以上，而实际年产量却不到8000吨，生产商主要集中在日本、美国和欧洲等国家，L-Arg在我国还主要依赖进口，是药用氨基酸生产的瓶颈，每年在进口L-Arg这一个产品上的费用达4到5亿元人民币，所以加强L-Arg的生产研究是很有现实意义的。

目前L-精氨酸发酵工程菌株主要集中于棒杆菌属，特别是C.glutamicum和与其DNA序列极其类似的C.crenatum。国内外有关提高精氨酸产量的研究已有很多报道，对其生产菌分子育种策略主要是对其合成途径的疏通、截流、增流等方法。如，Ikeda等通过解除反馈阻遏和反馈抑制的方法对传统的精氨酸产生菌种C.glutamicumA-27、C.glutamicum I-30、C.glutamicum D-77与野生型C.glutamicum的精氨酸操纵子进行测序比对分析，发现这三株菌中分别存在argB26、argB31和argR123等点突变。为探究该突变对C.glutamincum发酵产精氨酸的影响，Ikeda等以不产精氨酸的野生型C.glutamicum为亲本，对其argB的26和31位点分别或组合突变并与argR的致死突变结合，结果发现argB26、argB31两个位点发生点突变且负调控蛋白ArgR缺失时，其精氨酸产量发生了零的突破，达到8.76g/L。Xu等通过PCR方法获得了与精氨酸合成相关的基因簇argCJBDF-argGH，并将其克隆至穿梭表达质粒pJC1，再导入C.crenatum SYPA5-5，利用该基因簇自身的启动子实现了argCJBDF-argGH在C.crenatum SYPA 5-5体内表达上调，其产精氨酸能力较亲本提高了24.9％。三羧酸循环代谢支路生成的谷氨酸不仅是精氨酸合成的前体，而且还是脯氨酸合成的前体，脯氨酸与精氨酸的合成形成竞争关系。因此，切断脯氨酸合成支路有利于细菌体内代谢流向精氨酸合成方向。李小曼等运用同源重组技术构建了一株缺失了γ-谷氨酰激酶编码基因(proB)的工程菌C.crenatum 8-193，该菌种体内γ-谷氨酰激酶活性严重下降，精氨酸产量却能达到13.78g/L，较出发菌株提高了13.6％。

但目前未见敲除dtsR1基因、在对数生长初期添加吐温40或吐温80及在发酵培养基中添加吐温80或油酸或二者混合物以提高精氨酸产量的报道。精氨酸的前体物质是谷氨酸，而谷氨酸的前体物质是三羧酸循环的中间代谢产物α-酮戊二酸，α-酮戊二酸可在α-酮戊二酸脱氢酶复合物(oxoglutarate dehydrogenase complex，ODHC)进一步循环为琥珀酰辅酶A，而ODHC的编码基因sucB、odhA和lpdA受dtsR1基因的正调控。当敲除dtsR1基因，sucB、odhA和lpdA基因的转录水平大幅下降，这有利于α-酮戊二酸流向谷氨酸并进一步流向精氨酸；同时，发现添加Tween 40不仅有利于降低sucB、odhA和lpdA基因的转录水平，而且提高了合成NADPH的磷酸戊糖途径相关基因(如zwf基因)的表达水平，且通过NADPH及NAD/NADPH比值的测定，证实NADPH的供应得到了大幅提高，而1mol精氨酸的合成需要消耗3mol NADPH。因此，二者共同促进了精氨酸产量的大幅提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌提高精氨酸产量的方法。

本发明是这样实现的，一种利用谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌提高精氨酸产量的方法，其实现的技术步骤为，1、dtsR1基因敲除同源臂的构建及敲除质粒的构建：设计敲除谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌dtsR1基因的上下同源臂引物并分别在上下臂引物的5‘端和3’端加上HindIII和XbaI限制性内切酶位点，分别通过PCR技术扩增dtsR1的上下同源臂，采用DNA纯化试剂盒纯化dtsR1的上下同源臂，并等摩尔混合后进行重叠PCR获得dtsR1基因敲除同源臂；通过HindIII和XbaI双酶切，将dtsR1基因敲除同源臂克隆至蔗糖致死质粒pK18mobsacB中，获得敲除质粒pK18mobsacB-ΔdtsR1，并将其分别电转至谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌；

2、诱导敲除了dtsR1基因的谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌高产精氨酸：先在28～30℃种子培养基中活化谷氨酸棒杆菌或钝齿棒杆菌，培养14～16h后以1％～2％v/v的接种量接种至发酵培养基中，在28～30℃发酵生长至对数生长初期加入1mg/mL～15mg/mL吐温40或吐温80诱导高产精氨酸，其中种子培养基配方如下：葡萄糖30g/L，玉米浆25g/L，硫酸铵45g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，尿素1.5g/L，pH＝7.2；发酵培养基配方如下：葡萄糖120g/L，玉米浆25g/L，硫酸铵45g/L，磷酸二氢钾0.05g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，并加入了0.5g/L～2.0g/L油酸或吐温80或二者混合物，如摇瓶发酵则需加30g/L CaCO₃；

3、高密度发酵：对谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌重组菌进行高密度发酵，前期菌体生长阶段的参数为温度28～30℃，溶氧控制在18～22％的饱和溶氧浓度，pH为6.5～7.5；待OD₆₀₀至5-6时，加吐温40诱导，溶氧控制在28～32％左右的饱和溶氧浓度，pH 6.5～7.5，继续培养70～108h收集菌液。

所述的诱导剂是吐温40，发酵培养基中是添加了油酸或吐温80或二者混合物。

所述谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌的dtsR1基因被敲除。

本发明的技术效果是：本发明将dtsR1基因敲除后，使其调控的α-酮戊二酸脱氢酶复合物(oxoglutarate dehydrogenase complex，ODHC)的转录水平大幅下降，使α-酮戊二酸流向了精氨酸；同时在发酵培养基中添加吐温80或油酸或二者混合物弥补了dtsR1缺失造成的营养缺失，在发酵培养对数生长初期添加吐温40诱导了磷酸戊糖途径的基因转录水平大幅提高，从而为精氨酸的合成提供了足量的NADPH，省去了采用其他繁琐的分子育种手段来提高NADPH供应及提高三羧酸循环途径中α-酮戊二酸的其他积累方法。

附图说明

图1为PCR方法扩增敲除dtsR1上下同源臂及重叠PCR图。

图2为敲除dtsR1的单交换图。

图3为敲除dtsR1的双交换子的筛选图。

图4为荧光定量PCR图。

在图1中，1为上臂片断；2为下臂片断；3为重叠片断；4为DL2000标准分子量。

在图2中，M为DL2000标准分子量；1为阴性对照；2-3为阳性对照；4-6为dtsR1-single-F和dtsR1-down-R引物单交换子筛选片断。

在图3中，M为DL2000标准分子量；1-2为阴性对照；3、5、7和9为dtsR1-inner check-F和dtsR1-inner check-R引物筛选的双交换子片断；4、6、8和10为dtsR1-up-F和dtsR1-down-R引物双交换子筛选片断。

具体实施方式

下面将结合附图1-4来详细说明本发明所具有的有益效果，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的实质，但不能对本发明的实施和保护范围构成任何限定。

实施例1

重组菌C.glutamicumΔdtsR1和C.crenatumΔdtsR1的构建过程及在摇瓶规模下精氨酸生产的方法，包括以下步骤：

(1)敲除dtsR1质粒的构建及其重组菌的构建：根据C.glutamicum(登录号：BX927147.1)和C.crenatum(登录号：NZ_AQPS01000045.1)中的dtsR1上下同源序列设计引物，引物序列见表1(双下划线为限制性内切酶位点，单下划线为重叠序列)，分别以C.glutamicum和C.crenatum的单菌落为PCR反应模板，PCR反应条件为95℃预变性10min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，最后在72℃延伸10min，扩增出二条与预期大小相符的DNA片段，参照图1所示，泳道4为DNA marker，泳道1、2分别为dtsR1的上下同源臂；上下同源臂纯化回收、等摩尔数混合后，再通过重叠PCR反应获得敲除dtsR1重叠片段，其PCR反应条件为95℃预变性10min，95℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，共30个循环，最后在72℃延伸10min，图1泳道3为重叠PCR结果。

重组菌的构建：将获得的敲除dtsR1同源片段，通过HindIII和XbaI双酶切，克隆至经同样双酶切的蔗糖致死质粒pK18mobsacB中，获得敲除质粒pK18mobsacB-ΔdtsR1，并将其分别电转至二宿主中，获得重组菌C.glutamicumΔdtsR1和C.crenatumΔdtsR1。重组菌的筛选经过了两次交换过程才获得无痕敲除，图2为筛选单交换子电泳图谱，泳道M为DNA marker，泳道1为阴性对照，泳道2-3为阳性对照，泳道4-6为单交换子片断，图3为筛选4株菌的双交换子的电泳图谱，1和2泳道为阴性对照，3和4泳道为同一菌株，以此类推，如用表1的内部引物能扩到条带，则为恢复突变株，因此有3株菌是双交换子。

(2)C.glutamicumΔdtsR1和C.crenatumΔdtsR1摇瓶发酵工艺：接种上述新鲜的重组菌单菌落于20mL种子培养基中，30℃，200rpm活化16h，将活化的种子接种于30mL(250mL的锥形瓶)发酵培养基中发酵生长36h后，加入5mg/L Tween 40继续摇瓶发酵72h，收集菌液，采用氨基酸自动分析仪分析精氨酸产量，其中另培养收集了48h的菌体，提取其总RNA后进行了荧光定量PCR检测了相关基因转录水平的变化(对照组为未敲除dtsR1的菌株及重组菌未加吐温40)，其中dtsR1敲除ODHC的编码基因sucB、odhA和lpdA的转录水平分别下调了3.20、2.47和2.19倍，具有正调控ODHC的基因pknG下调了6.00倍，负调ppp基因上调了8.53倍，而精氨酸合成途径的关键酶编码基因argB转录水平上调了17.25倍，且有关磷酸戊糖途径的关键酶编码基因zwf上调了5.5倍。

表1 引物序列

实施例2

不同浓度的Tween 40对C.crenatumΔdtsR1产精氨酸的影响：

重组菌C.crenatumΔdtsR1的构建见实施例1，将C.crenatumΔdtsR1的单菌落接种于20mL种子培养基中，30℃，200rpm活化16h后按2％接种量接种于30mL发酵培养基中发酵生长36h后，分别加入1mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、7.5mg/mL及10mg/mL不同浓度的Tween40，继续摇瓶培养72h后离心收集菌液，采用氨基酸自动分析仪分析不同浓度吐温40对C.crenatumΔdtsR1精氨酸产量的影响，结果显示5mg/mL的吐温40加入量最合适。

实施例3

不同浓度的Tween 80对C.crenatumΔdtsR1产精氨酸的影响：

重组菌C.crenatumΔdtsR1的构建见实施例1，将C.crenatumΔdtsR1的单菌落接种于20mL种子培养基中，30℃，200rpm活化16h后按2％接种量接种于30mL发酵培养基中发酵生长36h后，分别加入5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL及20mg/mL的吐温80，继续摇瓶培养72h后离心收集菌液，采用氨基酸自动分析仪分析发酵培养基中不同吐温80的浓度对C.crenatumΔdtsR1产精氨酸的影响，结果显示，添加15mg/mL的吐温80于发酵培养基中最有利于精氨酸的积累。

实施例4

重组菌C.crenatumΔdtsR1接种量的优化：

重组菌C.crenatumΔdtsR1的构建见实施例1，C.crenatumΔdtsR1的单菌落接种于20mL种子培养基中，30℃，200rpm活化16h后，分别按1％、2％、3％及4％活化的种子接种于30mL发酵培养基中发酵生长至对数生长初期后，加入5mg/mL的吐温40，继续摇瓶培养72h后离心收集菌液，采用氨基酸自动分析仪分析不同接种量对产精氨酸水平的影响，结果显示，接种量在1％～2％(v/v)范围时精氨酸产量最好。

实施例5

重组菌C.crenatumΔdtsR1发酵培养基中吐温80添加浓度的优化：

重组菌C.crenatumΔdtsR1的构建见实施例1，将C.crenatumΔdtsR1的单菌落接种于20mL种子培养基中，30℃，200rpm活化16h后，按2％的接种量分别接种于含不同浓度的吐温80(其浓度分别为：0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL及2.0mg/mL)的发酵培养基中，于30℃，200rpm培养36h后加入5mg/mL的吐温40，继续摇瓶培养72h后离心收集菌液，采用氨基酸自动分析仪分析发酵培养基中不同吐温80的浓度对C.crenatumΔdtsR1产精氨酸的影响。结果显示，添加1.0mg/mL的吐温80于发酵培养基中最有利于精氨酸的积累。

实施例5

3L发酵罐高密度发酵重组菌C.crenatumΔdtsR1产精氨酸的状况：

3L发酵罐发酵(工作体积为1.8L)，接种量为36mL，菌体生长阶段条件控制在温度30℃，pH为7.0，溶氧控制在20％左右，转速和溶氧关联。补料培养基为20％的葡萄糖(含有3mmol/L KH₂PO₄及油酸1.0mg/mL)，待菌体密度的OD₆₀₀达到5-6时，加入吐温40，溶氧控制在30％，同时不断的流加补料培养基，继续培养72h后放罐，并分别在0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h及108h取样测定精氨酸含量，发现在96h已达到了最高峰。

目前在国内外，还未有关于敲除dtsR1并在发酵培养基中添加油酸或吐温80，并在发酵的对数生长初期添加吐温40来提高精氨酸产量的报道。因此，这为进一步采用分子育种方法提高精氨酸产量提供了坚实的基础。本发明在前期工作的基础上，将上述方法用于改造谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌，成功地使它们产精氨酸的能力获得了约1.5倍。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (3)

1.一种利用谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌提高精氨酸产量的方法，其特征在于，(1)dtsR1基因敲除同源臂的构建及敲除质粒的构建：设计敲除谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌dtsR1基因的上下同源臂引物并分别在上下臂引物的5‘端和3’端加上HindIII和XbaI限制性内切酶位点，分别通过PCR技术扩增dtsR1的上下同源臂，采用DNA纯化试剂盒纯化dtsR1的上下同源臂，并等摩尔混合后进行重叠PCR获得dtsR1基因敲除同源臂；通过HindIII和XbaI双酶切，将dtsR1基因敲除同源臂克隆至蔗糖致死质粒pK18mobsacB中，获得敲除质粒pK18mobsacB-ΔdtsR1，并将其分别电转至谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌；(2)诱导敲除了dtsR1基因的谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌高产精氨酸：先在28～30℃种子培养基中活化谷氨酸棒杆菌或钝齿棒杆菌，培养14～16h后以1％～2％v/v的接种量接种至发酵培养基中，在28～30℃发酵生长至对数生长初期加入1mg/mL～15mg/mL吐温40或吐温80诱导高产精氨酸，其中种子培养基配方如下：葡萄糖30g/L，玉米浆25g/L，硫酸铵45g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，尿素1.5g/L，pH＝7.2；发酵培养基配方如下：葡萄糖120g/L，玉米浆25g/L，硫酸铵45g/L，磷酸二氢钾0.05g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，并加入了0.5g/L～2.0g/L油酸或吐温80或二者混合物，如摇瓶发酵则需加30g/L CaCO₃；(3)高密度发酵：对谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌重组菌进行高密度发酵，前期菌体生长阶段的参数为温度28～30℃，溶氧控制在18～22％的饱和溶氧浓度，pH为6.5～7.5；待OD₆₀₀至5-6时，加吐温40诱导，溶氧控制在28～32％左右的饱和溶氧浓度，pH6.5～7.5，继续培养70～108h收集菌液。

2.根据权利要求1所述的一种利用谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌提高精氨酸产量的方法，其特征在于，所述的诱导剂是吐温40，发酵培养基中是添加了油酸或吐温80或二者混合物。

3.根据权利要求1所述的一种利用谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌提高精氨酸产量的方法，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌的dtsR1基因被敲除。