CN112877271A - 一种提高钝齿棒杆菌厌氧发酵产l-精氨酸的方法 - Google Patents

一种提高钝齿棒杆菌厌氧发酵产l-精氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种提高钝齿棒杆菌厌氧发酵产L‑精氨酸的方法。本发明成功实现了敲除硝酸盐呼吸narKGHJI操纵子的抑制转录调控因子arnR基因，在钝齿棒杆菌中过量表达大肠杆菌的亚硝酸还原酶基因nirBD。优化NaNO3添加量，最终重组钝齿棒杆菌ΔarnR/pXMJ19‑nirBD摇瓶厌氧发酵至120h，重组菌的L‑精氨酸产量达到2.41±0.11g/L，较出发菌株提高了28.8％，实现了提高厌氧发酵L‑精氨酸的产量。说明敲除arnR基因和过量表达大肠杆菌的亚硝酸还原酶基因nirBD对厌氧发酵L‑精氨酸的产量具有显著效果。

Description

一种提高钝齿棒杆菌厌氧发酵产L-精氨酸的方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种提高钝齿棒杆菌厌氧发酵产L-精氨酸的方法。
背景技术
对于氨基酸的生产，在发酵过程中保持溶解氧在一定水平是至关重要的。为此，一般的解决方案是增加发酵过程中的曝气和搅拌速度。然而，通过注入无菌纯氧、空气，或者提高搅拌速度获得的高氧供应，能耗高，增加成本。此外，过量的注入氧气或空气会使菌体的产生活性氧而损害自身，并且增加染杂菌和噬菌体的风险。因此，通过改造钝齿棒杆菌厌氧发酵产L-精氨酸具有重要的实际意义。
在没有氧气的环境中生长的专性厌氧菌和兼性厌氧菌，具有各种厌氧代谢途径，总体分为两种：“厌氧呼吸”和“发酵”。在典型的“发酵”中，没有任何电子受体，大部分碳通量都指向乙醇、乳酸和琥珀酸盐。因此，在发酵代谢的同时，很难实现氨基酸的高效生产。此外，许多微生物可以利用氧以外的各种化合物作为终端电子受体来实现厌氧呼吸。例如，许多细菌拥有硝酸盐呼吸系统，使用硝酸盐作为电子受体。硝酸盐呼吸系统与发酵代谢不同，不会增加有机酸产生。因此，碳通量可以有效地指向氨基酸生物合成。钝齿棒杆菌也可以以硝酸盐为末端电子受体，在无氧气限制下生长。由于缺少亚硝酸还原酶，钝齿棒杆菌厌氧呼吸过程中硝酸盐还原的主要最终产物为有毒的亚硝酸盐。
钝齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatum)是我国学者从土壤中分离的一种无芽孢钝齿状的革兰氏阳性菌，其突变株被广泛应用于国内的各种氨基酸生产中，但对其遗传背景的研究相对较少。
发明内容
本发明的目的是从加强硝酸盐呼吸角度出发，敲除arnR基因及添加硝酸盐加强硝酸盐呼吸强度；引入NirBD基因，将有毒的亚硝酸盐转化为可利用的氨，提高钝齿棒杆菌厌氧条件下发酵产L-精氨酸的产量；为此，本发明首先提供了一种重组钝齿棒杆菌，所述重组钝齿棒杆菌是通过敲除硝酸盐呼吸抑制转录调控因子arnR基因和过量表达大肠杆菌的亚硝酸还原酶基因nirBD得到的。
为实现上述目的，本发明提供一种重组钝齿棒杆菌，所述重组钝齿棒杆菌是以钝齿棒杆菌AS1.542为出发菌株，通过敲除narKGHJI操纵子的转录调控因子arnR基因，并过量表达大肠杆菌的亚硝酸还原酶基因nirBD得到的。
优选的，所述narKGHJI操纵子的转录调控因子arnR基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
优选的，所述过量表达大肠杆菌的亚硝酸还原酶基因nirBD的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
优选的，所述重组钝齿棒杆菌的制备方法包括以下步骤：
(1)通过敲除钝齿棒杆菌中敲除narKGHJI操纵子的转录调控因子ArnR基因arnR，成功构建了钝齿棒杆菌株ΔarnR；
(2)以大肠杆菌DH5α的基因组DNA为模板，将编码亚硝酸还原酶的基因nirBD与穿梭型载体pXMJ19成功连接，获得重组质粒pXMJ19-nirBD；
(3)将重组质粒pXMJ19-nirBD电转入钝齿棒杆菌株ΔarnR，得到重组菌ΔarnR/pXMJ19-nirBD，将重组菌ΔarnR/pXMJ19-nirBD进行厌氧发酵。
优选的，所述步骤(3)的厌氧发酵是将种子液按5-15％接种于发酵培养基中进行不供氧发酵培养，发酵温度为28-31℃，转速为100-180r/min。
优选的，所述种子液是从活化固体培养基上挑取单菌落接种于含氯霉素的LBG培养基中，28-31℃振荡培养22-26h，然后转接于种子培养基中，28-31℃培养22-26h，种子培养基组成：葡萄糖100-150g/L，玉米浆20-30g/L，硫酸铵30-50g/L，氯化钾0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾1-1.5g/L，七水合硫酸镁0.3-0.6g/L，去离子水配置，pH 7.0-7.2。
优选的，所述发酵培养基成分为葡萄糖100-150g/L，玉米浆20-30g/L，硫酸铵30-50g/L，氯化钾0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾1-1.5g/L，碳酸钙20-40g/L，七水合硫酸镁0.3-0.6g/L，硝酸钠5-8g/L，硫胺素300-800μg/L,生物素50-200μg/L去离子水配置，pH 7.0-7.2。
优选的，所述重组钝齿棒杆菌在厌氧生产L-精氨酸中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明成功实现了敲除硝酸盐呼吸抑制转录调控因子ArnR，过量表达亚硝酸还原酶基因nirBD的重组钝齿棒杆菌的构建。优化厌氧发酵条件，最终重组钝齿棒杆菌ΔarnR/pXMJ19-nirBD发酵至120h，L-精氨酸产量达到2.41g/L，相比出发菌株，L-精氨酸的产量提高了28.8％，实现了L-精氨酸的产量提高,通过硝酸盐的呼吸作用来提高精氨酸产量。同时，重组钝齿棒杆菌ΔarnR/pXMJ19-nirBD还增加了NADPH和ATP的浓度胞内浓度，说明敲除敲除硝酸盐呼吸抑制转录调控因子ArnR，过量表达亚硝酸还原酶基因nirBD对L-精氨酸的产量具有显著效果。
具体实施方式
下面结合实例对本发明进行进一步的说明。
实施例1
敲除硝酸盐呼吸抑制转录调控因子ArnR的基因arnR
BHI培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g，氯化钠10g，牛脑心浸提物25g/L。
种子培养基：葡萄糖100-150g/L，玉米浆20-30g/L，硫酸铵30-50g/L，氯化钾0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾1-1.5g/L，七水合硫酸镁0.3-0.6g/L，去离子水配置，pH7.0-7.2。
PBS缓冲液：NaCl8g/L，Na2HPO41.42g/L，KCl0.2g/L，KH2PO40.27g/L，NaOH调节PH为7.4。
以钝齿棒杆菌AS1.542的基因组DNA为模板，以arnRF1(序列如SEQ IDNO.3所示)和R1(序列如SEQIDNO.4所示)、arnRF2(序列如SEQID NO.5所示)和R2(序列如SEQIDNO.6所示)为引物，进行PCR扩增出上下游两段同源臂各700bp左右，进行融合延伸PCR，得到大小为1400bp基因片段，连接至pK18mobsacB载体得到pK18-arnR，将pK18-arnR测序，通过序列比对，结果表明序列无误。将pK18-arnR重组质粒电转到钝齿棒杆菌AS1.542中，BHI培养基中复苏3h，然后涂布于卡那霉素抗性平板上，长出的单菌落验证后进行扩大培养，转接至含10％蔗糖的平板上进行筛选，菌落PCR进行双交换验证，筛选得到arnR基因完全敲除的钝齿棒杆菌株，命名为钝齿棒杆菌ΔarnR。
实施例2
大肠杆菌的亚硝酸还原酶基因nirBD克隆与在钝齿棒杆菌ΔarnR过表达
以大肠杆菌DH5α的基因组DNA为模板，引物nirBDF1/R1进行PCR扩增，得到2867bp的基因片段。用Hind III和XbaI双酶切后，回收nirBD片段，与利用相同酶线性化的pXMJ19连接后转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性转化子提取质粒，利用质粒为模板，进行PCR验证，结果表明质粒pXMJ19-nirBD构建成功。将重组质粒pXMJ19-nirBD电转化到钝齿棒杆菌ΔarnR中，得到重组钝齿棒杆菌ΔarnR/pXMJ19-nirBD。
将重组钝齿棒杆菌ΔarnR/pXMJ19-nirBD在装有10mL LBG培养基的50mL容器中培养18-24h，然后按10％的接种量转移到装有50mL LBG培养基的250m L容器中培养3-5h，加入10u L的238mg/m L的IPTG进行诱导，整个培养过程均在30℃，180rpm的往复式摇床中进行。诱导培养8-12h后收集细胞，将细胞利用超声破碎仪进行破碎，离心后收集上清液，验证nirBD在钝齿棒杆菌中成功表达。
实施例3
重组菌ΔarnR/pXMJ19-nirBD的厌氧摇瓶发酵
(1)种子培养
从活化平板上挑取重组钝齿棒杆菌ΔarnR/pXMJ19-nirBD的单菌落接种于5-10mLLBG培养基(含10mg/ml氯霉素)中，30℃振荡培养24h，然后全部转接于50ml种子培养基中，30℃培养24h。
(2)发酵培养
发酵培养体积为25mL，采用的发酵培养基成分如下：
发酵培养基成分：葡萄糖100-150g/L，玉米浆20-30g/L，硫酸铵30-50g/L，氯化钾0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾1-1.5g/L，碳酸钙20-40g/L，七水合硫酸镁0.3-0.6g/L，硝酸钠5-8g/L，硫胺素300-800μg/L,生物素50-200μg/L，pH 7.0-7.2。
发酵条件：将上述培养好的种子液按5-10％接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度为30℃，pH为7.0，转速为200r/min，橡胶塞塞住瓶口，厌氧发酵时间为120h。
发酵过程中，每12h取样一次，用生物传感分析仪(山东省科学院)测定葡萄糖的含量,采用酶标仪在A562下测细胞OD值，HPLC测定L-精氨酸(安捷伦1100，美国)。结果表明，相比于出发菌株，重组菌生长速率和糖耗都加快，发酵至120h，重组菌ΔarnR/pXMJ19-nirBD的L-精氨酸产量达到2.41±0.11g/L，较出发菌株C.crenatumAS1.542提高了28.8％，实现了提高厌氧发酵L-精氨酸的产量。
实施例4
检测重组菌和野生型AS1.542发酵过程中胞内NADPH和ATP浓度
取实施例3中发酵36h时的培养液，离心，去上清，收集细胞，检测NADPH和ATP浓度。
通过对比重组菌和野生型C.crenatum AS1.542发酵过程中胞内外NADPH和ATP浓度的变化，重组菌的NADPH和ATP胞内浓度分别增加了68.7％和45.4％。
SEQUENCE LISTING
<110> 江西师范大学
<120> 一种提高钝齿棒杆菌厌氧发酵产L-精氨酸的方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 693
<212> DNA
<213> Corynebacteriumcrenatum AS1.542
<400> 1
gtgaccacac aaaccgcccc taccgcagcc accgatcttt ttgccgagtc ctacaaactc 60
agcccaaagc agcgcgaagt tttagatgcc ctacaaacct tccctgacgg tgcccgcgcg 120
atcgatgtcg ccaaaaaact cgaccttcac gtcaacaccg cccgcggcca cctcgaagaa 180
ctcgtagcaa aagaagccat ccgagtagtc accgcagcag ccaaaggtcg cggacgcccc 240
tccctcatct tccaaacacg cgtccccgac aaccgcgctg tcgccaaaga atacatcacc 300
ctgatcgaac tcatggccaa catgctcggc gatgtcgacg atgacgcaat gcacaacccc 360
gaactccgcg ccaaagcact ttccatcgga acccagtggg cacacgtcat gggcattaaa 420
cacgccgaag ccgaagaact cgacgaagcc ctctccccgc tcattaaccg cctccgcgaa 480
atgggctttg accccaccga aaccgaagaa gcaaactccc tcgctctcca cagctgccca 540
tttgtggtca acgacaaacg cccatcagcc ttcgtctgcg ccatccacgc cggattcatc 600
caagaaagcc tcggtgaaaa caaccgcatc cagctggaac tcaaaccact caacgcgccg 660
ggcacctgta aggttcacgt gttcagcgag taa 693
<210> 2
<211> 2867
<212> DNA
<213> Escherichia coli DH5α
<400> 2
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aacttcattt tgtgcggcgt acggatgcct ttgtagcggt tttccagttc cacgccgagg 900
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atctccggca gatcgtcttt ctgtgcgcca aacatcgcca gacgctggga gccagtgatc 1080
ttggtgtaga gattaaattc acgcgcgata cgacctaccg ccatcagccc ttccggggtg 1140
atttcaccgc ccggagaacg cgggatcacc gagtaggtgc cgtctttctg gatgttagcg 1200
aggaagttgt cgttagaatc ctgcagcgga gtatgttccg gcttcagaat gtattcgttc 1260
cagcaggagg ccagcagcga accgacggtt ggtttacaaa cttcacaacc gtagcctttg 1320
ccgtgtttcg ccagcagttc ttcgaaggtt ttaatgcctt caacgcggat caaatggaac 1380
agttcctgac gcgaataagc aaagtgttcg cacaggttgt tgttaacttc gatgccctgt 1440
ttcgccagtt ccgcgttcag tacctgagtg accagcggga tacagccacc gcagccagta 1500
cccgctttgg tttcagcttt cagcgccgca actgtgtggc agcctttgtt gatggcagca 1560
atcagatcac ctttggtgac gtcgaagcag gagcagattt gcgcgctgtc cggcagttta 1620
tcaacaccga tagacggctt gccgctaccc gagtgtgctg gcaggatcag ggaatccggg 1680
ttttccggca gttcgatagc gttcagcacc agttgcagca ggttaccgta gtcgctggta 1740
tcgcccacca gtaccgcacc gagcagggtt ttgttgtctt cgctgacaat caggcgtttg 1800
tagatctctt tactttcgtc gaggtaaacg tagctacgtg cgccaggcgt gcgaccgtgc 1860
gcatcaccaa taccgcctac gtctacgccc agcagtttca gcttggcgct aaggtcagca 1920
ccttcaaagg cgttttcgct accgagaata tggtcaacgg cgacctgcgc cattttgtag 1980
ccaggtgcta ccagaccaaa tacacggttg ttccagcttg cgcattcacc gatggcgtag 2040
atatccggat cggaagtctg gcaggaatca ttaatgacaa tacccccacg cggagcaacg 2100
tccagaccac actgggttgc cagcttatcg cgcggacgga taccggtaga gaagacgata 2160
aagtcgactt ccagttcgct gccgtcggca aaacgcatgg ttttacgcgc ttcaacacct 2220
tcctgcacaa tctcaagggt gtttttgctg gtgtgaacgc gcacgcccat actttcgatt 2280
ttgcgacgca gctgctcgcc gcccatctga tcaagctgtt ctgccatcag cataggggca 2340
aattcgataa cgtgggtttc aatacctaag tttttcagcg cgcctgcggc ttccagacct 2400
aacaggccgc caccaacaac ggcaccgcgt ttgctgcgac gggcgcagga ttcaatggcg 2460
ttgaggtctt caatagtgcg atagacaaag cagtcctgag tatcagaacc tttgattggc 2520
gggatccacg ggtaggaacc ggttgccatg atcagcttgt cataaaaaac ggtacgtccg 2580
gcgctggagt gaatcacctt ctcctgacgg ttgatggtga tagcgcgttc gccgaccaga 2640
actttgatgc cgtgtttctc gtagaagcct tcgcgcacca gcgacagctc ttcggcggtg 2700
tggtgagaga agtaagacga gaggtgtacg cggtcataag cgatgcgcgg ttcttcacag 2760
aaaacggtaa tatcaaagtt ggccgcatca gatttatcaa gaagatcttc gataaagcga 2820
tggccgacca taccgttacc gataattgcg agtctgactt tgctcat 2867
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
aacgacggcc agtgccaagc tgttgcagca gctaatggtt tg 42
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
aacggtctgt taagccaata attcagccac taagaaggcc cc 42
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
gtttattttt atccttgtca tgtcgggctc gctctggtgg gg 42
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
cggtacccgg ggatcctcta gttggactca tcggcttgat ta 42

Claims (8)

1.一种重组钝齿棒杆菌，其特征在于:所述重组钝齿棒杆菌是以钝齿棒杆菌AS1.542为出发菌株，通过敲除narKGHJI操纵子的转录调控因子arnR基因，并过量表达大肠杆菌的亚硝酸还原酶基因nirBD得到的。
2.根据权利要求1所述重组钝齿棒杆菌，其特征在于:所述narKGHJI操纵子的转录调控因子arnR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述重组钝齿棒杆菌，其特征在于：所述过量表达大肠杆菌的亚硝酸还原酶基因nirBD的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述重组钝齿棒杆菌，其特征在于：所述重组钝齿棒杆菌的制备方法包括以下步骤：
(1)通过敲除钝齿棒杆菌中敲除narKGHJI操纵子的转录调控因子ArnR基因arnR，成功构建了钝齿棒杆菌株ΔarnR；
(2)以大肠杆菌DH5α的基因组DNA为模板，将编码亚硝酸还原酶的基因nirBD与穿梭型载体pXMJ19成功连接，获得重组质粒pXMJ19-nirBD；
(3)将重组质粒pXMJ19-nirBD电转入钝齿棒杆菌株ΔarnR，得到重组菌ΔarnR/pXMJ19-nirBD，将重组菌ΔarnR/pXMJ19-nirBD进行厌氧发酵。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于：所述步骤(3)的厌氧发酵是将种子液按5-15％接种于发酵培养基中进行不供氧发酵培养，发酵温度为28-31℃，转速为100-180r/min。
6.根据权利要求5所述厌氧发酵，其特征在于：所述种子液是从活化固体培养基上挑取单菌落接种于含氯霉素的LBG培养基中，28-31℃振荡培养22-26h，然后转接于种子培养基中，28-31℃培养22-26h，种子培养基组成：葡萄糖100-150g/L，玉米浆20-30g/L，硫酸铵30-50g/L，氯化钾0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾1-1.5g/L，七水合硫酸镁0.3-0.6g/L，去离子水配置，pH 7.0-7.2。
7.根据权利要求5所述厌氧发酵，其特征在于：所述发酵培养基成分为葡萄糖100-150g/L，玉米浆20-30g/L，硫酸铵30-50g/L，氯化钾0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾1-1.5g/L，碳酸钙20-40g/L，七水合硫酸镁0.3-0.6g/L，硝酸钠5-8g/L，硫胺素300-800μg/L,生物素50-200μg/L去离子水配置，pH 7.0-7.2。
8.一种如权利要求1所述的重组钝齿棒杆菌，其特征在于：所述重组钝齿棒杆菌在厌氧生产L-精氨酸中的应用。
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