CN117844728A

CN117844728A - 一种l-缬氨酸生产菌株及其构建方法与应用

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Publication number: CN117844728A
Application number: CN202410239011.9A
Authority: CN
Inventors: 李燕军; 刘月香; 蔡柠匀; 吴晨; 王非傲; 田思宇
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2024-03-04
Filing date: 2024-03-04
Publication date: 2024-04-09
Anticipated expiration: 2044-03-04

Abstract

本发明提供了一种L‑缬氨酸生产菌株及其构建方法与应用，通过构建辅酶平衡系统将L‑缬氨酸合成与磷酸戊糖途径和TCA循环剥离开来，利用辅酶平衡以消除对除糖酵解和L‑缬氨酸合成途径之外的代谢途径的依赖，且采用静态和动态代谢工程调控策略弱化回补途径和TCA循环，同时敲除了有机酸合成途径的关键基因，所构建菌株可以在好氧条件下高效率合成L‑缬氨酸，发酵周期短，转化率高；不携带质粒，发酵过程无需控制微氧或厌氧，从而不产生有机酸等副产物，满足高纯度L‑缬氨酸的生产要求，在氨基酸生产领域具有较为广泛的应用前景。

Description

一种L-缬氨酸生产菌株及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其是一种L-缬氨酸生产菌株及其构建方法与应用。

背景技术

缬氨酸（valine）是人体所必需的8种氨基酸和生糖氨基酸之一，属于支链氨基酸。缬氨酸是手性异构分子，分为L-缬氨酸和D-缬氨酸两种对映体。其中由生物合成的天然氨基酸即为L-缬氨酸。动物体内不能自身合成L-缬氨酸，需要通过外界摄取。由于其具有很多生理功能，L-缬氨酸被广泛应用于医药、饲料、食品、保健品和化妆品等领域。

L-缬氨酸的生产方法有直接提取法、化学合成法和微生物发酵法。前两种方法存在较多缺点，直接提取法采用离子交换技术，操作简单，分离效率高，但是成本过高；而化学合成法制成的氨基酸都是DL型，需要拆分才能得到L型，所以需要先以异丁醛为原料合成为DL-缬氨酸，再得到L-缬氨酸，其中的反应操作都比较复杂，且成本高、产量低，不适合大规模生产。

目前，微生物发酵法是用于工业化生产L-缬氨酸的最佳方法，随着微生物代谢工程研究的不断深入，发酵技术指标的不断提升，其他生产L-缬氨酸的方法已经逐渐被微生物发酵法替代。微生物发酵法需要的反应条件温和，成本较低，生产效率取决于所应用的工程菌株，因此越来越多的研究人员将重点放在高效率L-缬氨酸生产菌株的构建中，以期进一步提高L-缬氨酸的发酵指标和降低其生产成本。

现有的L-缬氨酸生产菌株主要为谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌。谷氨酸棒杆菌采用好氧培养细胞、厌氧条件下在无机盐培养基中利用细胞转化葡萄糖合成L-缬氨酸，其产酸和转化率指标较高，然而该工艺需要在无菌条件下浓缩菌体细胞，对设备要求高，存在污染风险，且厌氧条件下发酵周期长，易产生有机酸等杂质，而且对关键酶的维持要求高，因此该工艺仍然采用质粒过表达关键酶的方式进行，存存抗生素添加和菌株稳定性的问题。大肠杆菌的发酵工艺为先好氧培养菌体然后在微氧条件下发酵产酸的双阶段工艺，该工艺不需要无菌设备和培养基的切换，操作比较方便，然而微氧条件下也会产生有机酸等杂质，无法生产高纯度L-缬氨酸。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种L-缬氨酸生产菌株。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述L-缬氨酸生产菌株的构建方法。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述L-缬氨酸生产菌株的应用。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种L-缬氨酸生产菌株，以C.glutamicum（谷氨酸棒杆菌）rpsL ^K43R作为出发菌株，用启动子P_tuf表达来源于菌株谷氨酸棒杆菌 XV菌株的ilvB*和ilvN*基因簇，然后在相同位点整合突变的ilvC*基因（使得乙酰羟酸异构还原酶变为NADH偏好性），解除L-缬氨酸对乙酰羟酸合成酶的反馈调节，引入球形芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶基因leuDH，调节辅因子平衡；然后对ilvB*N*C*和leuDH进行二拷贝整合表达；敲除iolR阻遏蛋白基因同时整合葡萄糖激酶基因glk1，激活IolT葡萄糖摄取通道，强化细胞对葡萄糖的吸收；在hdpA位点整合gapA基因，来强化EMP的限速步骤；整合来自需钠弧菌的edd和eda基因，在基因组水平表达异源ED途径强化前体物丙酮酸的供应；敲除ilvE、avtA、ldhA、ppc、pckA、pta、pqo基因，降低副产物的生成；点突变icd基因的起始密码子为GTG稀有密码子以降低异柠檬酸脱氢酶的表达活性；并进行基因组整合lrp-P_brnF-tetR，将gltA基因的启动子替换为P_tetA启动子构建L-缬氨酸生物传感系统来动态弱化TCA循环，提高L-缬氨酸合成过程中碳原子的利用率。

优选的，上述L-缬氨酸生产菌株，所述谷氨酸棒杆菌的保藏号为ATCC 13032。

上述L-缬氨酸生产菌株的构建方法，具体步骤如下：

（1）构建菌株VS-1：在C.glutamicum rpsL ^K43R菌株的基因组中敲除ldhA基因（Cgl2911；KEGG：中搜索编号可见，下同）的同时在该位点整合由P_tuf启动子（P_tuf启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示）驱动的来源于诱变产生的L-缬氨酸生产菌株XV（GenBank:CP018175.1）的ilvB*和ilvN*基因簇（XV基因组上1450351-1452763对应的DNA序列）来解除L-缬氨酸对乙酰羟酸合酶的反馈抑制，然后在该ilvB*N*后紧接着整合ilvC突变基因（由金唯智公司合成，ilvC突变基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示），使得乙酰羟酸异构还原酶变为NADH偏好性，得到C.glutamicum rpsL ^K43RΔldhA::P_tuf -ilvB*N*C*菌株（菌株VS-1）；

（2）构建菌株VS-2：敲除菌株VS-1中敲除基因ilvE（Cgl2204）的同时整合由P_sod启动子（P_sod启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示）启动的来源于球形芽孢杆菌（Lysinibacillus sphaericus）的leuDH基因（由金唯智公司合成，根据谷氨酸棒杆菌做密码子优化，leuDH基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示），得到VS-1ΔilvE::P_sod - leuDH菌株（菌株VS-2）；

（3）构建菌株VS-3：将菌株VS-2的基因avtA（Cgl2844）敲除的同时整合由P_sod启动子启动的leuDH基因（扩增于菌株VS-2），得到VS-2 ΔavtA::P_sod -leuDH菌株（菌株VS-3）；

（4）构建菌株VS-4：在菌株VS-3上采用先敲后整的编辑策略，先将ilvBNC操纵子（Cgl1271-Cgl1272-Cgl1273）敲除，再将P_tuf启动子启动ilvB*N*C*（扩增于菌株VS-1）整合到该位点，得到菌株VS-3 ΔilvBNC::P_tuf -ilvB*N*C*菌株（菌株VS-4）；

（5）构建菌株VS-5：敲除菌株VS-4的基因iolR（Cgl0157）的同时整合由P_sod启动子启动的glk1基因（Cgl2185），得到VS-4 ΔiolR::P_sod -glk1菌株（菌株VS-5）；

（6）构建菌株VS-6：敲除菌株VS-5的基因hdpA（Cgl2256）的同时整合由P_tuf启动子启动的gapA基因（Cgl0937），得到VS-5 ΔhdpA::P_tuf -gapA菌株（菌株VS-6）；

（7）构建菌株VS-7：在敲除菌株VS-6的pta基因（Cgl2753）的同时整合由P_tuf启动子启动的来源于需钠弧菌（Vibrio natriegens）ATCC 14048来源的edd和eda基因（PN96_ 16555-PN96_16560；KEGG：中搜索编号可见），得到VS-6 Δpta::P_tuf -eddeda菌株（菌株VS-7）；

（8）构建菌株VS-8：将菌株VS-7中的ppc基因（Cgl1585）和pckA基因（Cgl2863）依次敲除，获得VS-7 ΔppcΔpckA菌株（菌株VS-8）；

（9）构建菌株VS-9：将菌株VS-8中icd基因（Cgl0664）的起始密码子由ATG变为GTG（A1G），得到VS-8Icd ^A1G菌株（菌株VS-9）；

（10）构建菌株VS-10：在敲除菌株VS-9中pqo基因（Cgl2610）的同时整合lrp-P_brnF-tetR（lrp-P_brnF-tetR的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示），然后将gltA基因（Cgl0829）的启动子替换为P_tetA启动子（P_tetA启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示），得到VS-9 Δpqo::lrp-P_brnF-tetRΔP_gltA::P_tetA菌株（菌株VS-10）。

优选的，上述L-缬氨酸生产菌株的构建方法，所述步骤（1）中C.glutamicum rpsL ^K43R菌株是以C.glutamicum（谷氨酸棒杆菌）为出发菌株，在出发菌株中转化rpsL突变基因（NCBI Gene ID: 3343178，含A128G突变），在链霉素抗性平板上筛选得到链霉素抗性菌株，该菌株用于后续pk18mobrpsL介导的基因组编辑（Wang等，2019，MicrobialBiotechnology，12(5): 907-919，doi: 10.1111/1751-7915.13444）。

优选的，上述L-缬氨酸生产菌株的构建方法，所述C.glutamicum的保藏号为ATCC13032。

上述各菌株中，不带“*”的均代表野生序列，带“*”的均代表包含突变的序列。

上述L-缬氨酸生产菌株在发酵生产L-缬氨酸方面的应用。

优选的，上述L-缬氨酸生产菌株的应用，使用发酵罐发酵生产L-缬氨酸，具体步骤如下：

（1）菌种活化：接种环蘸取甘油管中菌种接种于斜面培养基中传代活化，将划好的斜面置于32℃培养箱中恒温静置培养20-24 h，得到一代活化斜面；接种环划取一代活化斜面上的菌体转接至茄形斜面上再次传代，同样置于32℃培养箱中恒温静置培养20-24 h，得到二代活化斜面；

（2）种子培养：将茄形斜面上已经活化好的二代菌种通过无菌水洗脱下来接种到5L发酵罐进行种子培养，并将种子培养液定容至3 L；温度控制在32-34℃，自动流加25%的氨水控制发酵液pH值在6.7-7.2，控制初始通气量为2 L/min，初始搅拌转速为200 r/min，溶氧维持在10-40%的条件下培养15-20 h；

（3）发酵培养：种子培养至OD为20-30时，按照20％的接种量，将培养好的种子液接入发酵培养基，并将初始发酵液体积定容至5 L，通过自动流加25%的氨水控制培养基pH在6.7-7.2，温度控制在32-34℃，通过搅拌和通风控制溶氧在10-40%，通过流加800g/L的葡萄糖溶液发酵30-48h。

上述发酵过程可根据实际需要流加消泡剂进行消泡。

优选的，上述L-缬氨酸生产菌株的应用，所述种子培养中采用的种子培养基：葡萄糖 30 g/L，KH₂PO₄1.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4 g/L，MnSO₄·H₂O 10 mg/L，VB₁0.3 mg/L，VH0.2 mg/L，酵母粉5 g/L，蛋氨酸1 g/L，谷氨酸1 g/L，玉米浆干粉20 g/L（121℃，20 min单独灭菌），豆粕水解液10 mL/L，其余为水，115℃灭菌15 min。

优选的，上述L-缬氨酸生产菌株的应用，所述发酵培养中采用的发酵培养基：葡萄糖 80 g/L，(NH₄)₂SO₄3 g/L，KH₂PO₄2.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 2 g/L，FeSO₄·7H₂O 10 mg/L，MnSO₄·H₂O 10 mg/L，VB₁0.2 mg/L，VH 0.08 mg/L，酵母粉5 g/L，蛋氨酸0.7 g/L，谷氨酸5g/L，氯化胆碱1 g/L，玉米干粉16 g/L（121℃，20 min单独灭菌），豆粕水解液20 mL/L，其余为水，115℃灭菌 15 min。

上述培养基均可采用标准方法制备获得。

有益效果：

上述L-缬氨酸生产菌株，通过构建辅酶平衡系统将L-缬氨酸合成与磷酸戊糖途径和TCA循环剥离开来，利用辅酶平衡以消除对除糖酵解和L-缬氨酸合成途径之外的代谢途径的依赖，且采用动态和静态代谢工程调控策略弱化回补途径和TTCA循环，同时敲除了有机酸合成途径的关键基因，所构建菌株可以在好氧条件下高效率合成L-缬氨酸，发酵周期短，转化率较高；不携带质粒，发酵过程无需控制微氧或厌氧，从而不产生有机酸等副产物，无有机酸积累，满足高纯度L-缬氨酸的生产要求，最终在5 L发酵罐以葡萄糖为碳源，L-缬氨酸产量达到103 g/L，糖酸转化率为35%，生产强度为2.7 g/L/h。所述生产菌株构建及培养方法简单易操作，发酵法生产L-缬氨酸的方法在氨基酸生产领域具有较为广泛的应用前景。

附图说明

图1为菌株VS-10在5 L发酵罐发酵过程曲线。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。

以下实施例中所用基因编辑系统如下所述：以完成rpsL点突变的C. glutamicumrpsL ^K43R菌株作为出发菌进行后续基因编辑。采用的编辑方法为自杀质粒pK18mobrpsL介导的谷氨酸棒杆菌的基因编辑系统（具体构建原理和编辑方法见：Wang等，An update of the suicide plasmid-mediated genome editing systeminCorynebacterium glutamicum.MicrobialBiotechnology，2019，12(5)：907-919，doi:10.1111/1751-7915.13444）。

实施例1

菌株VS-10的构建，采用非复制型质粒进行基因组编辑，涉及到一系列pK18mobrpsL衍生质粒的构建，然后转化质粒进行两次同源重组的筛选完成每一步基因组编辑，依次迭代进行，最终获得VS-10菌株。

（1）质粒的构建

质粒pK18-ΔldhA::Ptuf-ilvB*的构建，以C.glutamicumATCC 13032菌株的基因组为模板，通过引物ldhA-up-1和ldhA-up-2扩增上游同源臂，引物ldhA-down-1和ldhA-down-2扩增下游同源臂；以C. glutamicumXV基因组为模板，通过引物ilvB*-1和ilvB*-2扩增突变的ilvB*基因；以C. glutamicumATCC 13032基因组为模板，通过引物ldhA-P_tuf-1和ldhA-P_tuf-2扩增强启动子P_tuf。上述引物设计时依次带有重叠区域，将上述扩增得到的片段通过重叠PCR进行连接。将质粒pK18mobrpsL（Wang等，MicrobialBiotechnology，2019，12(5)：907-919，doi: 10.1111/1751-7915.13444）进行双酶切（酶切位点为KpnI和XbaI）并通过琼脂糖凝胶电泳验证酶切效果，进行纯化回收获得线性化载体。将重叠片段和线性化载体进行同源重组后转化到大肠杆菌DH5α中，通过引物M13-47和RV-M进行菌落PCR验证得到序列正确的转化子，即获得质粒pK18-ΔldhA::Ptuf-ilvB*。

同样的，以C.glutamicumXV基因组为模板，通过引物ilvN*-up-1和ilvN*-up-2扩增上游同源臂，通过引物ilvN*-1和ilvN*-2扩增突变的ilvN*基因; 以C. glutamicumATCC13032基因组为模板，通过引物ilvN*-down-1和ilvN*-down-2扩增下游同源臂。然后通过重叠PCR按顺利连接这些片段，经琼脂糖凝胶电泳验证后进行纯化回收。将质粒pK18mobrpsL进行双酶切并通过琼脂糖凝胶电泳验证酶切效果，进行纯化回收获得线性化载体。将重叠片段和线性化载体进行同源重组后转化到大肠杆菌DH5α中，通过菌落PCR验证正确的转化子，即获得质粒pK18-ilvN*。以C. glutamicumXV基因组为模板，通过引物ilvC*-up-1和ilvC*-up-2扩增上游同源臂，以C. glutamicumATCC 13032基因组为模板，通过引物ilvC*-down-1和ilvC*-down-2扩增下游同源臂；由苏州金唯智基因科技有限公司合成ilvC*基因（ilvC突变基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示），设计引物ilvC*-1 和ilvC*-2扩增ilvC*基因，通过相同方法进行质粒pK18-ilvC*的构建。

其他质粒的构建采用相同方法完成，包含pK18-ΔilvE::P_sod -leuDH、pK18-ΔavtA::P_sod -leuDH、pK18-ΔilvBNC、pK18-ΔilvBNC::P_tuf -ilvB*、pK18-ilvN*ilvC*、pK18-ΔiolR::Psod-glk1、pK18-ΔhdpA::P_tuf -gapA、pK18-Δpta::P_tuf -eddeda、pK18-Δppc、pK18-ΔpckA、pK18-icd ^A1G、pK18-Δpqo::lrp-P_brnF-tetR、pK18-ΔP_gltA::P_tetA。质粒构建过程所用到的引物见表1，所涉及到的基因或DNA片段的描述见发明内容部分。DNA扩增于C. glutamicum基因组，或者由金唯智公司合成（序列见所附序列表）。

（2）基因组编辑

将构建好的pK18-ΔldhA::P_tuf -ilvB*电转化至菌株C. glutamicumrpsL ^K43R感受态中，用上述谷氨酸棒杆菌的基因编辑系统，即分别利用卡纳霉素和链霉素筛选发生两次同源重组的菌株，均采用鉴定引物ldhA-jd-1和ldhA-jd-2进行菌落PCR验证，得到菌株C. glutamicumrpsL ^K43R ilvB*。

将构建好的pK18-ilvN*电转化至菌株C. glutamicumrpsL ^K43R ilvB*感受态中，用上述谷氨酸棒杆菌的基因编辑系统，通过鉴定引物ilvN*-jd-1和ilvN*-jd-2进行菌落PCR验证，得到菌株C. glutamicum rpsL ^K43R ilvB*ilvN*。

将构建好的pK18-ilvC*电转化至菌株C. glutamicumrpsL ^K43R ilvB*ilvN*感受态中，用上述谷氨酸棒杆菌的基因编辑系统，通过鉴定引物ilvC*-jd-1和ilvC*-jd-2进行菌落PCR验证，得到菌株C. glutamicum rpsL ^K43RΔldhA::P_tuf -ilvB*N*C*（VS-1）。

将构建好的pK18-ΔilvE::P_sod -leuDH电转化至菌株C. glutamicumVS-1感受态中，筛选得到菌株C. glutamicumVS-1ΔilvE::P_sod -leuDH（VS-2）。

将构建好的pK18-ΔavtA::P_sod -leuDH电转化至菌株C. glutamicumVS-2感受态中，筛选得到菌株C. glutamicumVS-2 ΔavtA::P_sod -leuDH（VS-3）。

将构建好的pK18-ΔilvBNC电转化至菌株C. glutamicumVS-3感受态中，筛选得到菌株C. glutamicumVS-3 ΔilvBNC。

将构建好的pK18-ΔilvBNC::P_tuf-ilvB*电转化至菌株C. glutamicumVS-3 ΔilvBNC感受态中，筛选得到菌株C. glutamicumVS-3 ΔilvBNC::P_tuf-ilvB*。

将构建好的pK18-ilvN*ilvC*电转化至菌株C. glutamicumVS-3 ΔilvBNC::P_tuf-ilvB*感受态中，筛选得到菌株C. glutamicumVS-3 ΔilvBNC::P_tuf-ilvB*ilvN*ilvC*（VS-4）。

将构建好的pK18-ΔiolR::P_sod -glk1电转化至菌株C. glutamicumVS-4 感受态中，筛选得到菌株C. glutamicumVS-4 ΔiolR::P_sod -glk1（VS-5）。

将构建好的pK18-ΔhdpA::P_tuf -gapA电转化至菌株C. glutamicumVS-5 感受态中，筛选得到菌株C. glutamicumVS-5 ΔhdpA::P_tuf -gapA（VS-6）。

将构建好的pK18-Δpta::P_tuf -eddeda电转化至菌株C. glutamicumVS-6 感受态中，筛选得到菌株C. glutamicumVS-6 Δpta::P_tuf -eddeda（VS-7）。

将构建好的pK18-Δppc电转化至菌株C. glutamicumVS-7 感受态中，筛选得到菌株C. glutamicumVS-7 Δppc。

将构建好的pK18-ΔpckA电转化至菌株C. glutamicumVS-7 Δppc感受态中，筛选得到菌株C. glutamicumVS-7 ΔppcΔpckA（VS-8）。

将构建好的pK18-icd ^A1G电转化至菌株C. glutamicumVS-8 感受态中，筛选得到菌株C. glutamicumVS-8 Icd ^A1G（VS-9）。

将构建好的pK18-Δpqo::lrp-P_brnF-tetR电转化至菌株C. glutamicumVS-9 感受态中，筛选得到菌株C. glutamicumVS-9 Δpqo::lrp-P_brnF-tetR。

将构建好的pK18-ΔP_gltA::P_tetA电转化至菌株C. glutamicumVS-9 Δpqo::lrp-P_brnF-tetR感受态中，筛选得到菌株C. glutamicumVS-9 Δpqo::lrp-P_brnF-tetR ΔP_gltA::P_tetA（VS-10）。

本发明所用到的引物序列见表1。

表1 所用引物序列

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实施例2

5 L发酵罐中应用该生产菌株VS-10生产L-缬氨酸，具体方法如下：

（2）种子培养：将茄形斜面上已经活化好的二代菌种通过无菌水洗脱下来接种到5L发酵罐进行种子培养，并将种子培养液定容至3 L；温度控制在32-34℃，自动流加25%的氨水控制发酵液pH值在6.7-7.2，控制初始通气量为2 L/min，初始搅拌转速为200 r/min，溶氧维持在10-40%的条件下培养18 h，其中，种子培养基组成为：葡萄糖 30 g/L，KH₂PO₄1.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4 g/L，MnSO₄·H₂O 10 mg/L，VB₁0.3 mg/L，VH 0.2 mg/L，酵母粉5 g/L，蛋氨酸1 g/L，谷氨酸1 g/L，玉米浆干粉20 g/L（121℃，20 min单独灭菌），豆粕水解液10mL/L，其余为水，115℃灭菌15 min；

（3）发酵培养：种子培养至OD为20-30时，按照20％的接种量，将培养好的种子液接入发酵培养基，并将初始发酵液体积定容至5 L，通过自动流加25%的氨水控制培养基pH在6.7-7.2，温度控制在32-34℃，通过搅拌和通风控制溶氧在10-40%，通过流加800 g/L的葡萄糖溶液发酵40 h，其中，发酵培养基组成为：葡萄糖 80 g/L，(NH₄)₂SO₄3 g/L，KH₂PO₄2.5g/L，MgSO₄·7H₂O 2 g/L，FeSO₄·7H₂O 10 mg/L，MnSO₄·H₂O 10 mg/L，VB₁0.2 mg/L，VH0.08 mg/L，酵母粉5 g/L，蛋氨酸0.7 g/L，谷氨酸5 g/L，氯化胆碱1 g/L，玉米干粉16 g/L（121℃，20 min单独灭菌），豆粕水解液20 mL/L，其余为水，115℃灭菌 15 min。

上述发酵过程可根据实际需要流加消泡剂进行消泡。

实施例3

实施例2所述发酵液中L-缬氨酸的测定

使用高效液相色谱法对样品进行测定，具体测定步骤如下：取适量发酵液于1.5mL EP 管中，13000 r/min 离心2 min后取上清，用去离子水稀释适当倍数备用，经衍生后用0.2 μm有机系针头滤器做过膜处理，使用HPLC进行测定。

标准曲线的制作：称取 5 g L-缬氨酸溶解到去离子水中定容至1000 mL，即得到5g/L的L-缬氨酸标品。将5 g/L的标品稀释一定的倍数，得到0.1 g/L、0.2 g/L、0.5 g/L、1g/L和2 g/L的样品，用HPLC测定得到不同浓度L-缬氨酸对应的峰面积，以L-缬氨酸浓度为横坐标、以峰面积为纵坐标，做出标准曲线。

检测条件如下：

仪器Agilent 1100高效液相色谱仪；

色谱柱Phenomenex Gemini 5u C18（250×4.6 mm，美国菲罗门公司）；

流动相：50%（v/v）的乙腈溶液和50 mmol/L乙酸钠溶液；

柱温33℃；

检测波长360 nm；

流速1.0 mL/min。

生物量的测定采用分光光度计进行，以OD₆₀₀表示。

葡萄糖的测定采用SBA-40E生物传感器（山东省科学院研制）进行。

菌株VS-10在5 L发酵罐发酵过程曲线见图1。

由图1可知，菌株VS-10在5 L发酵罐中缬氨酸的产量最终L-缬氨酸的产量达到103g/L，发酵周期为38 h，由此可得生产强度为2.7 g/L/h。通过葡萄糖消耗量计算得到糖酸转化率为35%。

综上，本发明所述菌株VS-10通过引入ilvBN突变基因解除了产物对乙酰羟酸合酶的反馈抑制。为了实现L-缬氨酸合成过程的辅酶平衡，将乙酰羟酸异构还原酶基因ilvC突变为NADH偏好性，同时引入球形芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶编码基因leuDH替代自身的转氨酶基因ilvE。对突变的ilvBNC操纵子和leuDH进行了第二拷贝基因组整合表达。敲除iolR阻遏蛋白基因同时整合表达葡萄糖激酶基因glk1，强化葡萄糖的非PTS摄取。基因组过表达gapA和来源于需钠弧菌的ED途径，强化葡萄糖的分解途径和前体物丙酮酸的供应。敲除ppc和pckA基因来弱化回补途径，将异柠檬酸脱氢酶基因icd的起始密码子替换为GTG来弱化TCA循环。最后通过构建L-缬氨酸生物传感器弱化柠檬酸合酶的表达来动态下调TCA的代谢通量。

该菌株所有遗传操作均在基因组水平，不携带质粒，具有较高遗传稳定性，菌株不产生乳酸、乙酸等有机酸。通过改变辅酶偏好性和转氨途径，使得L-缬氨酸合成过程不需要谷氨酸作为氨基供体，也不需要磷酸戊糖途径和TCA循环提供NADPH。此外，通过动态弱化TCA循环，保证菌株正常生长的同时最大程度地减少了碳流的损失。

所述菌株好氧条件下发酵周期短，几乎没有副产物，实现了高产率、高转化率和高生产强度。该菌株以葡萄糖为发酵底物，技术简单、成本低，5 L发酵罐中缬氨酸的产量最终L-缬氨酸的产量达到103 g/L，糖酸转化率为35%，生产强度为2.7 g/L/h。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，本技术领域技术人员以本发明的方法或以本方法为基础进行的菌种改造等改进和润饰均视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种L-缬氨酸生产菌株，其特征在于：是以C.glutamicumrpsL ^K43R作为出发菌株，用启动子P_tuf表达来源于菌株谷氨酸棒杆菌 XV菌株的ilvB*和ilvN*基因簇，然后在相同位点整合突变的ilvC*基因，引入球形芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶基因leuDH；然后对ilvB*N*C*和leuDH进行二拷贝整合表达；敲除iolR阻遏蛋白基因同时整合葡萄糖激酶基因glk1；在hdpA位点整合gapA基因；整合来自需钠弧菌的edd和eda基因；敲除ilvE、avtA、ldhA、ppc、pckA、pta、pqo基因；点突变icd基因的起始密码子为GTG稀有密码子；并进行基因组整合lrp-P_brnF-tetR、将gltA基因的启动子替换为P_tetA启动子构建得到的。

2.根据权利要求1所述的L-缬氨酸生产菌株，其特征在于：所述谷氨酸棒杆菌由野生菌株通过迭代基因组改造构建而成，野生菌株保藏号为ATCC 13032。

3.权利要求1所述L-缬氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）构建菌株VS-1：在C.glutamicum rpsL ^K43R菌株的基因组中敲除ldhA基因的同时在该位点整合由P_tuf启动子驱动的ilvB*和ilvN*基因簇，然后在该ilvB*N*后紧接着整合ilvC突变基因，得到菌株VS-1；

（2）构建菌株VS-2：敲除菌株VS-1的基因ilvE的同时整合由P_sod启动子启动的leuDH基因，得到菌株VS-2；

（3）构建菌株VS-3：将菌株VS-2的基因avtA敲除的同时整合由P_sod启动子启动的leuDH基因，得到菌株VS-3；

（4）构建菌株VS-4：在菌株VS-3上采用先敲后整的编辑策略，先将ilvBNC操纵子敲除，再将P_tuf启动子启动ilvB*N*C*整合到该位点，得到菌株VS-4；

（5）构建菌株VS-5：敲除菌株VS-4的基因iolR的同时整合由P_sod启动子启动的glk1基因，得到菌株VS-5；

（6）构建菌株VS-6：敲除菌株VS-5的基因hdpA的同时整合由P_tuf启动子启动的gapA基因，得到菌株VS-6；

（7）构建菌株VS-7：在敲除菌株VS-6的pta基因的同时整合由P_tuf启动子启动的edd和 eda基因，得到菌株VS-7；

（8）构建菌株VS-8：将菌株VS-7中的ppc基因和pckA基因依次敲除，获得菌株VS-8；

（9）构建菌株VS-9：将菌株VS-8中icd基因的起始密码子由ATG变为GTG，得到菌株VS-9；

（10）构建菌株VS-10：在敲除菌株VS-9中pqo基因的同时整合lrp-P_brnF-tetR，然后将gltA基因的启动子替换为P_tetA启动子，得到菌株VS-10。

4.根据权利要求3所述的L-缬氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于：所述步骤（1）中C.glutamicum rpsL ^K43R菌株是以C.glutamicum ATCC 13032为出发菌株，在出发菌株中转化rpsL突变基因，所述rpsL突变基因含A128G突变，在链霉素抗性平板上筛选得到的链霉素抗性菌株。

5.根据权利要求3所述的L-缬氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于：所述P_tuf启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；ilvC突变基因的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.2所示；P_sod启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；leuDH基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示；lrp-P_brnF-tetR的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示；P_tetA启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示。

6.权利要求1所述L-缬氨酸生产菌株在发酵生产L-缬氨酸方面的应用。

7.根据权利要求6所述的L-缬氨酸生产菌株的应用，其特征在于：使用发酵罐发酵生产L-缬氨酸，具体步骤如下：

（2）种子培养：将茄形斜面上已经活化好的二代菌种通过无菌水洗脱下来接种到5 L发酵罐进行种子培养，并将种子培养液定容至3 L；温度控制在32-34℃，自动流加25%的氨水控制发酵液pH值在6.7-7.2，控制初始通气量为2 L/min，初始搅拌转速为200 r/min，溶氧维持在10-40%的条件下培养15-20 h；

8.根据权利要求7所述的L-缬氨酸生产菌株的应用，其特征在于：所述种子培养中采用的种子培养基：葡萄糖 30 g/L，KH₂PO₄ 1.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4 g/L，MnSO₄·H₂O 10 mg/L，VB₁ 0.3 mg/L，VH 0.2 mg/L，酵母粉5 g/L，蛋氨酸1 g/L，谷氨酸1 g/L，玉米浆干粉20g/L，豆粕水解液10 mL/L，其余为水。

9.根据权利要求7所述的L-缬氨酸生产菌株的应用，其特征在于：所述发酵培养中采用的发酵培养基：葡萄糖 80 g/L，(NH₄)₂SO₄ 3 g/L，KH₂PO₄ 2.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 2 g/L，FeSO₄·7H₂O 10 mg/L，MnSO₄·H₂O 10 mg/L，VB₁ 0.2 mg/L，VH 0.08 mg/L，酵母粉5 g/L，蛋氨酸0.7 g/L，谷氨酸5 g/L，氯化胆碱1 g/L，玉米干粉16 g/L，豆粕水解液20 mL/L，其余为水。