CN118147033A - 高产l-半胱氨酸的基因工程菌、构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物代谢工程技术领域，尤其涉及一种高产L‑半胱氨酸的基因工程菌、构建方法及其应用。本发明通过减少发酵过程中副产物积累以及提高目标代谢物的外转运效率来促进L‑半胱氨酸的生产，即通过敲除乳酸合成途径，限制丙酮酸向乳酸的转化，促进碳代谢流向L‑半胱氨酸生物合成途径的集中，来提高L‑半胱氨酸的产量；通过过表达L‑半胱氨酸转运蛋白基因的表达，促进L‑半胱氨酸向细胞外的出口，降低细胞内的L‑半胱氨酸浓度，提高L‑半胱氨酸的胞外积累水平；通过引入L‑半胱氨酸动态响应的启动子PyhaO驱动L‑半胱氨酸转运蛋白的表达，解决在高强度的L‑半胱氨酸出口效率下的L‑丝氨酸竞争出口问题，使得L‑半胱氨酸产量的显著提升至7.19g/L。
Description
技术领域
本发明涉及微生物代谢工程技术领域，尤其涉及一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌、构建方法及其应用。
背景技术
L-半胱氨酸是构成蛋白质的重要组成部分之一。它在人体内发挥着多种重要的生物学功能，对于维持身体健康和正常生理功能至关重要。L-半胱氨酸包含有一个巯基(-SH)，可以与另外一个L-半胱氨酸的巯基形成二硫键，这种连接是蛋白质中二级和三级结构形成的重要依据之一。此外，L-半胱氨酸也是一些蛋白质分子中的重要功能性基团，参与着酶的催化和细胞信号转导等生物学过程。L-半胱氨酸还参与了体内抗氧化反应。它作为谷胱甘肽的一个组成部分，可以通过还原反应帮助清除自由基和有毒代谢产物，保护细胞免受氧化应激的损害。尽管在日常饮食中并不常见，但通过合理的饮食和补充，可以确保获得足够的L-半胱氨酸，维持身体健康和正常功能。因此，L-半胱氨酸具有较高的工业生产价值。
微生物发酵法生产L-半胱氨酸是一种具有潜力的L-半胱氨酸生产方法。该方法利用微生物，例如大肠柑橘、谷氨酸棒氨酸等，在发酵罐中生长和代谢产生L-半胱氨酸。选用高效的微生物菌株，并通过基因工程技术改良菌株的代谢途径，提高L-半胱氨酸的产量。相比于化学方法，微生物发酵法具有更高的产率和更低的成本，同时也更环保，因为它不需要大量的化学药品和能源，且生产过程中产生的废弃物相对较少。
在大肠杆菌中，L-半胱氨酸的合成途径主要分为碳代谢途径和硫代谢途径。在碳代谢途径中，L-半胱氨酸的合成从葡萄糖出发，经过一系列反应后生成3-磷酸甘油酸。3-磷酸甘油酸通过三步反应生成L-半胱氨酸的重要前体物质L-丝氨酸。L-丝氨酸在丝氨酸乙酰基转移酶的作用下，生成O-乙酰丝氨酸。随后，O-乙酰丝氨酸通过同化硫代谢途径还原的含硫分子，生成L-半胱氨酸。
在工程菌株的代谢改造过程中，减少副产物的积累和提高关键代谢物的出口是提升目标代谢物的产量行之有效的方法。乳酸、乙酸等有机酸是微生物发酵过程中常见的副产物。这些代谢物的过量积累不仅会造成营养的浪费，还会对细胞的生长产生抑制作用。因此，限制以有机酸为代表的副产物的积累是改善细胞生产的有效方法之一。此外，加强目标代谢物由细胞内向细胞外的运输效率也可以有效地提高发酵过程的产量。尤其是对于有毒化合物，例如L-半胱氨酸来说，促进L-半胱氨酸的外运是一种非常有效的方法，在改善细胞生长，降低细胞毒性和提高产量方面。因此，通过有效地限制L-半胱氨酸工程菌株中的副产物积累和提高L-半胱肝素钠的出口效率是一种有潜力的代谢工程策略。而具体如何对工程菌株进行代谢改造，使其能够克服现有技术中存在的副产物积累水平高，产品出口效率低，L-半胱氨酸产量较低等问题，是一项值得深入研究的内容。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌及其构建方法，并将其应用于发酵生产L-半胱氨酸，以克服现有技术中存在的L-半胱氨酸生产菌株的副产物积累水平高，产品出口效率低，在发酵生产L-半胱氨酸过程中的L-半胱氨酸产量较低的问题。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
第一方面，本发明提供了一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：
(1)以菌株BW08::125126glyA::cysM::nrdH/pTrc99a-cysEf作为出发菌株，敲除其基因组中的基因ptsG，过表达基因glk和基因galP，将质粒pTrc99a-cysEf上基因cysEf的Trc启动子替换为TrcX5启动子，得到载体质粒pEX5，并导入至工程菌BW08::125126glyA::cysM::nrdH中，由此获得工程菌BW08::125126glyA::cysM::nrdHΔptsG::glk::galP/pEX5，记作菌株BW14/pEX5；
(2)在所述菌株BW14/pEX5的基因组上，敲除基因ldhA，过表达基因tpiA、基因eamA和基因eamB，并将所述基因eamB突变成eamBN157S突变体，插入由动态响应启动子PyhaO驱动的基因eamA，由此获得工程菌BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamBN157S::PyhaO-eamA/pEX5，即为所述高产L-半胱氨酸的基因工程菌。
本发明通过优化菌株的葡萄糖摄取方式，从而改善碳流向L-半胱氨酸途径集中，同时实现大肠杆菌中L-半胱氨酸生物合成量的提高。通过削弱磷酸转移系统介导的葡萄糖摄取方式，增强Glk/GalP介导的葡萄糖摄取，来减少碳流向丙酮酸途径的转化，提高L-半胱氨酸生物合成的代谢通量。同时，通过增加关键基因cysEf的表达，解决L-半胱氨酸碳代谢途径通量增强后产生的前体积累问题，有效实现碳流向L-半胱氨酸的顺畅转化；通过敲除乳酸合成途径，限制丙酮酸向乳酸的转化，促进碳代谢流向L-半胱氨酸生物合成途径的集中，来提高L-半胱氨酸的产量。同时，通过过表达L-半胱氨酸转运蛋白基因的表达，促进L-半胱氨酸向细胞外的出口，降低细胞内的L-半胱氨酸浓度，提高L-半胱氨酸的胞外积累水平。此外，通过引入能够响应L-半胱氨酸浓度的动态启动子PyhaO驱动L-半胱氨酸转运蛋白的表达，解决在高强度的L-半胱氨酸出口效率下的L-丝氨酸竞争出口问题。
其中，出发菌株BW08::125126glyA::cysM::nrdH/pTrc99a-cysEf，已在专利CN116836905A中公开。
作为优选，所述基因ptsG的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述基因glk的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述基因galP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
作为优选，所述基因ldhA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述基因tpiA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述基因eamA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述基因eamB的序列如SEQ ID NO.8所示，所述基因eamBN157S的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
作为优选，所述基因tpiA、基因eamA和基因eamB由Trc启动子启动，所述Trc启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
作为优选，所述动态响应启动子PyhaO的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
作为优选，所述TrcX5启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
作为优选，所述基因cysEf的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
第二方面，本发明提供了一种用于构建所述的高产L-半胱氨酸的基因工程菌的方法，以菌株BW08::125126glyA::cysM::nrdH/pTrc99a-cysEf作为出发菌株，包括以下步骤：
(1)敲除其基因组中的基因ptsG，向其基因组中插入基因glk和基因galP，将质粒pTrc99a-cysEf上基因cysEf的Trc启动子替换为TrcX5启动子，得到载体质粒pEX5，并导入至工程菌BW08::125126glyA::cysM::nrdH中，由此获得工程菌BW08::125126glyA::cysM::nrdHΔptsG::glk::galP/pEX5，记作菌株BW14/pEX5；
(2)敲除所述菌株BW14/pEX5基因组中的乳酸脱氢酶基因ldhA，获得工程菌BW14ΔldhA/pEX5；
(3)向所述工程菌BW14ΔldhA/pEX5的基因组上插入Trc启动子驱动的基因tpiA，获得工程菌BW14ΔldhA::tpiA/pEX5；
(4)将所述工程菌BW14ΔldhA::tpiA/pEX5的基因组上的基因eamA和基因eamB的启动子替换为Trc启动子，并将所述基因eamB突变成eamBN157S突变体，插入由动态响应启动子PyhaO驱动的基因eamA，由此获得工程菌BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamBN157S::PyhaO-eamA/pEX5，即为所述高产L-半胱氨酸的基因工程菌。
第三方面，本发明提供了所述的高产L-半胱氨酸的基因工程菌或者所述的方法构建的高产L-半胱氨酸的基因工程菌在微生物发酵制备L-半胱氨酸中的应用。
作为优选，将所述基因工程菌株接种至发酵培养基，在28～37℃，150-200rpm条件下发酵培养，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到L-半胱氨酸。
作为优选，所述发酵培养前先在培养基中30～37℃，150～200rpm条件下培养12～24h，再接种至发酵培养基。
具体为将基因工程菌株先接种至10ml LB培养基试管中，于温度30～37℃，转速150～200rpm的摇床上培养12～24h。然后以体积浓度1％接种量接种到20～50ml发酵培养基中开始发酵。培养4～6小时后添加0.1mM的IPTG。发酵温度为28～37℃，转速150-200rpm，发酵时长为2-4天。发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到L-半胱氨酸。
作为优选，所述发酵培养基组成包括：葡萄糖20～30g/L、(NH4)2SO45～10g/L、KH2PO42～5g/L、Na2S2O35～10g/L、酵母提取物5～10g/L、Na2HPO410～15g/L、蛋白胨1～5g/L，1ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水。
作为优选，所述微量元素溶液组成为：300～500g/L MgSO4·8H2O，2～5g/LMnSO4·8H2O，2～5g/L ZnSO4·7H2O，2～8g/L Fe2SO4，溶剂为去离子水。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过减少发酵过程中副产物积累以及提高目标代谢物的外转运效率来促进L-半胱氨酸的生产。通过敲除乳酸脱氢酶介导的乳酸合成途径，减少丙酮酸向乳酸的转化，促进碳代谢流向L-半胱氨酸生物合成途径的汇集。通过过表达关键的节点基因，进一步将碳代谢流重定向于L-半胱氨酸代谢途径。同时，通过过表达L-半胱氨酸外转运基因，加强L-半胱氨酸向细胞外的输送，削弱L-半胱氨酸胞内积累对细胞造成的负面影响。然而，L-丝氨酸是L-半胱氨酸的竞争出口底物，过高的出口效率容易导致L-半胱氨酸前体——L-丝氨酸在细胞外的过度积累。通过引入L-半胱氨酸动态响应的启动子PyhaO驱动L-半胱氨酸转运蛋白的表达。通过感知细胞内的L-半胱氨酸积累浓度实时调节L-半胱氨酸转运蛋白的表达强度，来协调L-半胱氨酸和L-丝氨酸之间的竞争机制问题，实现L-半胱氨酸产量的显著提升至7.19g/L。
附图说明
图1为菌株BW14/pEX5的L-半胱氨酸产量和OD600情况。
图2为菌株BW14ΔldhA/pEX5的L-半胱氨酸产量和OD600情况。
图3为菌株BW14ΔldhA::tpiA/pEX5的L-半胱氨酸产量和OD600情况。
图4为菌株BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamB/pEX5的L-半胱氨酸产量和OD600情况。
图5为菌株BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamBN157S/pEX5的L-半胱氨酸产量和OD600情况。
图6为菌株BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamBN157S::PyhaO-eamA/pEX5的L-半胱氨酸产量和OD600情况。
具体实施方式
下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明做进一步描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。
下述实施例中，所述卡那霉素在培养基中终浓度为50mg/L，所述壮观霉素在培养基中终浓度为50mg/L，所述氨苄霉素在培养基中终浓度为100mg/L。出发菌株BW08::125126glyA::cysM::nrdH/pTrc99a-cysEf已在专利CN116836905A中公开，来自浙江工业大学生物工程学院合成生物技术研究所菌种库。
实施例1发酵液中L-半胱氨酸产量的测定
(1)取1mL菌液于2mL的EP管中，在12000rpm条件下离心1分钟，将上清和沉淀分离。上清用于L-半胱氨酸，L-丝氨酸以及其他代谢产物的检测。
(2)称取0.27g的CNBF溶于10mL乙腈中作为Ⅰ液；以0.2M硼酸溶液和0.05M硼砂溶液作为母液，4:1体积混合配成pH＝9.0标准缓冲溶液记为Ⅱ液。将样品稀释成0～5g/L浓度，按照样品100μL，Ⅰ液300μL和Ⅱ液500μL比例混合，在恒温振荡器中40～60℃，500～1000rpm反应0.5～1小时。样品过膜装入液相瓶中待测。
(3)仪器为赛默飞UPLC超高压液相色谱仪。色谱柱为C18柱(4.6×250mm，5μm)；紫外检测器检测波长260nm；进样量10μL；柱温30℃；流速0.8mL/min；流动相使用AB两相，A相纯乙腈，B相50mM HAc-NaAc缓冲液：乙腈：三乙胺＝82.8：17：0.2，pH＝4.9。梯度洗脱程序如表1所示。
表1梯度洗脱程序
实施例2过表达cysEf基因的载体pEX5的构建
为了实现L-半胱氨酸的积累，过表达解除反馈抑制的cysEf是必要的。为了实现cysEf的过表达，将cysEf克隆到载体pTrc99a中，并使用TrcX5启动子驱动表达。
(1)以pTrc99a质粒为模版(99aline-F和99aline-R)，通过PCR进行扩增，得到线性化载体。以E.coli BW25113基因组为模板(引物cysE-F和cysE-R)，扩增得到基因cysE片段。用DpnI对PCR产物进行消化。所有PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并纯化PCR片段。按照一步克隆试剂盒(One step clonekit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将线性化载体与基因片段cysE进行连接，转化到E.coli DH5α中，涂布于氨苄青霉素抗性平板，挑取单菌落用菌落PCR验证(引物99a-VF和99a-VR)，测序验证得到pTrc99a-cysE质粒。
(2)以质粒pTrc99a-cysE为模板，利用引物T167A-F和T167A-R，G245S-F和G245S-R进行PCR，转化到E.coli DH5α中，涂布于氨苄青霉素抗性平板，挑取单菌落用菌落PCR验证(引物99a-VF和99a-VR)，测序验证得到含Trc启动子驱动cysE突变体的pE的质粒。
(3)以质粒pE为模板，利用引物X5-F和X5-R进行PCR，转化到E.coli DH5α中，涂布于氨苄青霉素抗性平板，挑取单菌落用菌落PCR验证(引物99a-VF和99a-VR)，测序验证得到pEX5质粒。
表2实施例2引物
| 引物名称 | 序列(5’-3’) |
| cysE-F | tttcacacaggaaacagaccatgtcgtgtgaagaactggaaattg |
| cysE-R | tctcatccgccaaaacagccttagatcccatccccatactcaaatg |
| 99aline-F | ggctgttttggcggatgagag |
| 99aline-R | ggtctgtttcctgtgtgaaattg |
| T167A-F | gttggtgaagcggcggtgattgaaaacgac |
| T167A-R | tcaccgccgcttcaccaacgacgatgcctg |
| G245S-F | tattgtcagcaaaccagacagcgataagcc |
| G245S-R | ctggtttgctgacaatacgagccggaacgc |
| X5-F | cggataacaaaaagagggcacaatgtcgtgtgaagaactggaaattg |
| X5-R | cacacgacattgtgccctctttttgttatccgctcacaattccacac |
| 99a-VF | gtttgacagcttatcatcgactgc |
| 99a-VR | agaccgcttctgcgttctg |
实施例3生产L-半胱氨酸的基因工程菌株BW14/pEX5的构建
(1)以pTarget质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，通过PCR扩增(引物pT-glk-F和pT-glk-R)，对gRNA进行定点突变。用DpnI对PCR产物进行消化。将消化产物化转到E.coli DH5α中，涂布于壮观酶素平板，挑取单菌落进行测序验证(引物pT-VF和pT-VR)，筛选突变成功的pTarget-glk质粒。
(2)以E.coli BW25113基因组为模板，通过引物glk-Up-F和glk-Up-R，glk-Down-F和glk-Down-R，进行PCR扩增得到插入位置的上下游500bp。通过融合PCR将上述两个DNA片段融合，得到片段Donor-glk。
(3)将菌株BW08::125126glyA::cysM::nrdH制备成化转感受态，将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)通过化学转化法转化到BW08::125126glyA::cysM::nrdH化转感受态中，涂布于卡那霉素抗性平板，得到菌株BW08::125126glyA::cysM::nrdH/pCas。
(4)将菌株BW08::125126glyA::cysM::nrdH/pCas制备成电转感受态。将质粒pTarget-glk，片段Donor-glk电转到BW08::125126glyA::cysM::nrdH/pCas电转感受态后，涂布于卡那霉素和壮观霉素双抗性平板，挑取单菌落进行PCR验证(引物glk-VF和glk-VR)，筛选编辑成功菌株，得到菌株BW08::125126glyA::cysM::nrdHΔptsG::glk。引物如表3所示。
(5)挑取阳性单菌落接种到含1mM IPTG和0.05mg/L卡那霉素的LB试管，30℃培养过夜，划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，30℃培养24h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L壮观霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L壮观霉素的LB平板的单菌落，其pTarget-glk质粒成功消除。挑取pTarget-glk质粒成功消除的单菌落于LB试管，37℃培养过夜，次日菌液划线于LB平板，37℃培养12h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L卡那霉素的LB平板的单菌落，其pCas质粒成功消除，最终得到无质粒BW08::125126glyA::cysM::nrdHΔptsG::glk。
(6)根据上述的方法，再将基因galP插入到BW08::125126glyA::cysM::nrdHΔptsG::glk基因组中，获得所述菌株BW08::125126glyA::cysM::nrdHΔptsG::glk::galP，并命名为菌株BW14。
(7)将菌株BW14制备成化转感受态细胞，将实施例2中构建的pEX5质粒，通过化学转化法转化到BW14感受态中，获得BW14/pEX5菌株。
(8)将菌株BW14/pEX5接种到10mL的LB培养基中，30～37℃、150～200rpm培养过夜。接种1mL预培养物到装有20～50mL发酵培养基的500mL摇瓶中，培养4～6小时后添加0.1mM的IPTG，进行2～4天的发酵。所述发酵培养基组成如下：葡萄糖20～30g/L、(NH4)2SO45～10g/L、KH2PO42～5g/L、Na2S2O35～10g/L、酵母提取物5～10g/L、Na2HPO410～15g/L、蛋白胨1～5g/L，1ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然。微量元素溶液组成为：300～500g/L MgSO4·8H2O，2～5g/L MnSO4·8H2O，2～5g/L ZnSO4·7H2O，2～8g/L Fe2SO4，溶剂为去离子水。根据实施例1方法对发酵液进行检测，OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图1所示。
从图1结果可以看出，菌株BW14/pEX5的L-半胱氨酸产量为3.04g/L，细胞的OD600值为32.29。
表3实施例3引物
| 引物名称 | 序列(5’-3’) |
| glk-Up-F | atcggttactggtggaaactgactc |
| glk-Up-R | tccgctcacaattccacacattatacgagccggatgattaattgtcaaaattgagagtgctcctgagt |
| glk-F | aatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagaccatgacaaagtatgcattagtc |
| glk-R | acgtcttacggattacagaatgtgacctaaggtctg |
| glk-Down-F | cattctgtaatccgtaagacgttggggagactaag |
| glk-Down-R | gtggatgggacagtcagtaaaggg |
| pT-glk-F | ggtaaatcgctgatgctgcgttttagagctagaaatagc |
| pT-glk-R | cagcatcagcgatttaccgactagtattatacctaggactgagc |
| glk-VF | agaaacggcgggtaaattactg |
| glk-VR | atagccgtctgaccaccac |
| galP-Up-F | aaggcggtcacgttgattttg |
| galP-Up-R | gcgtcaggcatggtctgtttcctgtgtgaaattacagaatgtgacctaag |
| galP-F | cattctgtaatttcacacaggaaacagaccatgcctgacgctaaaaaacag |
| galP-R | ccatctggctgttaatcgtgagcgcctatttcg |
| galP-Down-F | tcacgattaacagccagatggctgccttttttac |
| galP-Down-R | ctataaagcggtggatgggacagtcagtaaag |
| pT-galP-F | taagacgttggggagactagttttagagctagaaatagc |
| pT-galP-R | agtctccccaacgtcttacactagtattatacctaggactgagctag |
| galP-VF | tgctgaaaaaagagcatctgattcag |
| galP-VR | atagccgtctgaccaccac |
实施例4敲除ldhA基因对L-半胱氨酸生产的影响
副产物乳酸的过度积累会对细胞的生长造成抑制。此外，过量的乳酸产生容易导致碳源的浪费，不利于L-半胱氨酸的生产。本发明通过删除乳酸脱氢酶基因ldhA，阻断丙酮酸向乳酸的转化，改善L-半胱氨酸的生物合成。
(1)以pTarget质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，通过PCR扩增(引物pT-ldhA-F和pT-ldhA-R)，对gRNA进行定点突变。用DpnI对PCR产物进行消化。将消化产物化转到E.coli DH5α中，涂布于壮观酶素平板，挑取单菌落进行测序验证(引物pT-VF和pT-VR)，筛选突变成功的pTarget-ldhA质粒。
(2)将菌株BW14制备成化转感受态，将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)通过化学转化法转化到BW14化转感受态中，涂布于卡那霉素抗性平板，得到菌株BW14/pCas。
(3)以E.coli BW25113基因组为模板，通过引物ldhA-Up-F和ldhA-Up-R，ldhA-Down-F和ldhA-Down-R，进行PCR扩增得到插入位点的上下游500bp和glk基因。通过融合PCR将上述DNA片段融合，得到片段Donor-ldhA。
(4)将菌株BW14/pCas制备成电转感受态。将质粒pTarget-ldhA，片段Donor-ldhA电转到BW14/pCass电转感受态后，涂布于卡那霉素和壮观霉素双抗性平板，挑取单菌落进行PCR验证(引物ldhA-VF和ldhA-VR)，筛选编辑成功菌株，得到菌株BW14ΔldhA。引物如表4所示。
(5)挑取阳性单菌落接种到含1mM IPTG和0.05mg/L卡那霉素的LB试管，30℃培养过夜，划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，30℃培养24h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L壮观霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L壮观霉素的LB平板的单菌落，其pTarget-ldhA质粒成功消除。挑取pTarget-ldhA质粒成功消除的单菌落于LB试管，37℃培养过夜，次日菌液划线于LB平板，37℃培养12h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L卡那霉素的LB平板的单菌落，其pCas质粒成功消除，最终得到无质粒BW14ΔldhA。
(6)将菌株BW14ΔldhA制备成化转感受态细胞，将实施例2中构建的pEX5质粒，通过化学转化法转化到BW14ΔldhA感受态中，获得BW14ΔldhA/pEX5菌株。
(7)将菌株BW14ΔldhA/pEX5接种到10mL的LB培养基中，30～37℃、150～200rpm培养过夜。接种1mL预培养物到装有20～50mL发酵培养基的500mL摇瓶中，培养4～6小时后添加0.1mM的IPTG，进行2～4天的发酵。发酵培养基如实施例2中所述。根据实施例1方法对发酵液进行检测，OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图2所示。
从图2结果可以看出，菌株BW14ΔldhA/pEX5的L-半胱氨酸产量为3.42g/L。结果说明，基因ldhA的删除有效地促进了L-半胱氨酸的生产，削弱乳酸的积累对进一步提高L-半胱氨酸的产量具有显著效果。
表4实施例4引物
| 引物名称 | 序列(5’-3’) |
| ldhA-Up-F | caagcagaatcaagttctaccgtg |
| ldhA-Up-R | agcggcaagaaagactttctccagtgatgttgaatc |
| ldhA-Down-F | agaaagtctttcttgccgctcccctgcattc |
| ldhA-Down-R | tgtctgttttgcggtcgcc |
| pT-ldhA-F | taatactagtaactgccaatggctgcgaaggttttagagctagaaatagc |
| pT-ldhA-R | gctctaaaaccttcgcagccattggcagttactagtattatacctaggac |
| ldhA-VF | tcagtttatcgatattgatccaggtg |
| ldhA-VR | ggcgattgggatgtgtgcattac |
实施例5过表达tpiA基因对L-半胱氨酸生产的影响
将乳酸合成途径阻断后的碳代谢流重定向于L-半胱氨酸合成途径在提高L-半胱氨酸产量方面可能具有潜力。为了进一步评估增强tpiA对L-半胱氨酸生产的影响，基因tpiA被进一步过表达，以增强碳流的供给。
(1)以pTarget质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，通过PCR扩增(引物pT-tpiA-F和pT-tpiA-R)，对gRNA进行定点突变。用DpnI对PCR产物进行消化。将消化产物化转到E.coli DH5α中，涂布于壮观酶素平板，挑取单菌落进行测序验证(引物pT-VF和pT-VR)，筛选突变成功的pTarget-tpiA质粒。
(2)将菌株BW14制备成化转感受态，将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)通过化学转化法转化到BW14化转感受态中，涂布于卡那霉素抗性平板，得到菌株BW14/pCas。
(3)以E.coli BW25113基因组为模板，通过引物tpiA-Up-F和tpiA-Up-R，tpiA-F和tpiA-R，tpiA-Down-F和tpiA-Down-R，进行PCR扩增得到插入位点的上下游500bp和tpiA基因。通过融合PCR将上述DNA片段融合，得到片段Donor-tpiA。
(4)将菌株BW14/pCas制备成电转感受态。将质粒pTarget-tpiA，片段Donor-tpiA电转到BW14/pCas电转感受态后，涂布于卡那霉素和壮观霉素双抗性平板，挑取单菌落进行PCR验证(引物tpiA-VF和tpiA-VR)，筛选编辑成功菌株，得到菌株BW14ΔldhA::tpiA。引物如表5所示。
(5)挑取阳性单菌落接种到含1mM IPTG和0.05mg/L卡那霉素的LB试管，30℃培养过夜，划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，30℃培养24h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L壮观霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L壮观霉素的LB平板的单菌落，其pTarget-tpiA质粒成功消除。挑取pTarget-tpiA质粒成功消除的单菌落于LB试管，37℃培养过夜，次日菌液划线于LB平板，37℃培养12h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L卡那霉素的LB平板的单菌落，其pCas质粒成功消除，最终得到无质粒BW14ΔldhA::tpiA。
(6)将菌株BW14ΔldhA::tpiA制备成化转感受态细胞，将实施例2中构建的pEX5质粒，通过化学转化法转化到BW14ΔldhA::tpiA感受态中，获得BW14ΔldhA::tpiA/pEX5菌株。
(7)将菌株BW14ΔldhA::tpiA/pEX5接种到10mL的LB培养基中，30～37℃、150～200rpm培养过夜。接种1mL预培养物到装有20～50mL发酵培养基的500mL摇瓶中，培养4～6小时后添加0.1mM的IPTG，进行2～4天的发酵。发酵培养基如实施例2中所述。根据实施例1方法对发酵液进行检测，OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图3所示。
从图3结果可以看出，菌株BW14ΔldhA::tpiA/pEX5的L-半胱氨酸产量为4.51g/L。这结果说明，基因tpiA的进一步过表达有效地促进了L-半胱氨酸的生产。
表5实施例5引物
| 引物名称 | 序列(5’-3’) |
| tpiA-Up-F | caagcagaatcaagttctaccgtg |
| tpiAUp-R | ggatgtcgcataagactttctccagtgatgttgaatc |
| tpiA-Down-F | acaggcttaatcttgccgctcccctgc |
| tpiA-Down-R | tgtctgttttgcggtcgcc |
| pT-tpiA-F | taatactagtaactgccaatggctgcgaaggttttagagctagaaatagc |
| pT-tpiA-R | gctctaaaaccttcgcagccattggcagttactagtattatacctaggac |
| tpiA-VF | tcagtttatcgatattgatccaggtg |
| tpiA-VR | ggcgattgggatgtgtgcattac |
| tpiA-F | agaaagtcttatgcgacatcctttagtgatggg |
| tpiA-R | agcggcaagattaagcctgtttagccgcttc |
实施例6加强L-半胱氨酸的外转运对L-半胱氨酸生产的影响
提高目标代谢物，尤其是有毒化合物，例如L-半胱氨酸，的出口有助于改善细胞的生长水平和提高目标代谢物的胞外积累水平。通过Trc启动子过表达L-半胱氨酸外转运蛋白基因将有效加强L-半胱氨酸的出口效率，提高L-半胱氨酸的生产。
(1)以pTarget质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，通过PCR扩增(引物pT-eamA-F和pT-eamA-R)，对gRNA进行定点突变。用DpnI对PCR产物进行消化。将消化产物化转到E.coli DH5α中，涂布于壮观酶素平板，挑取单菌落进行测序验证(引物pT-VF和pT-VR)，筛选突变成功的pTarget-eamA质粒。
(2)将菌株BW14ΔldhA::tpiA制备成化转感受态，将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)通过化学转化法转化到BW14ΔldhA::tpiA化转感受态中，涂布于卡那霉素抗性平板，得到菌株BW14ΔldhA::tpiA/pCas。
(3)以E.coli BW25113基因组为模板，通过引物eamA-Up-F和eamA-Up-R，eamA-Down-F和eamA-Down-R，进行PCR扩增得到插入位点的上下游500bp。通过融合PCR将上述DNA片段融合，得到片段Donor-eamA。
(4)将菌株BW14ΔldhA::tpiA/pCas制备成电转感受态。将质粒pTarget-eamA，片段Donor-eamA电转到BW14ΔldhA::tpiA/pCas电转感受态后，涂布于卡那霉素和壮观霉素双抗性平板，挑取单菌落进行PCR验证(引物tpiA-VF和tpiA-VR)，筛选编辑成功菌株，得到菌株BW14ΔldhA::tpiA::eamA。引物如表6所示。
(5)挑取阳性单菌落接种到含1mM IPTG和0.05mg/L卡那霉素的LB试管，30℃培养过夜，划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，30℃培养24h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L壮观霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L壮观霉素的LB平板的单菌落，其pTarget-eamA质粒成功消除。挑取pTarget-eamA质粒成功消除的单菌落于LB试管，37℃培养过夜，次日菌液划线于LB平板，37℃培养12h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L卡那霉素的LB平板的单菌落，其pCas质粒成功消除，最终得到无质粒BW14ΔldhA::tpiA::eamA。
(6)根据上述的方法，在菌株BW14ΔldhA::tpiA::eamA的基因组中，再次利用Trc启动子驱动的基因eamB的表达，获得所述菌株并命名为菌株BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamB。
(7)将菌株BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamB制备成化转感受态细胞，将实施例2中构建的pEX5质粒，通过化学转化法转化到BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamB感受态中，获得BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamB/pEX5菌株。
(8)将菌株BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamB/pEX5接种到10mL的LB培养基中，30～37℃、150～200rpm培养过夜。接种1mL预培养物到装有20～50mL发酵培养基的500mL摇瓶中，培养4～6小时后添加0.1mM的IPTG，进行2～4天的发酵。发酵培养基如实施例2中所述。根据实施例1方法对发酵液进行检测，OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图3所示。
从图4结果可以看出，菌株BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamB/pEX5的L-半胱氨酸产量为5.67g/L。这结果说明，基因eamA和eamB的进一步过表达有效地促进了L-半胱氨酸的生产。
表6实施例6引物
| 引物名称 | 序列(5’-3’) |
| eamA-Up-F | ttgagaagattttcgttttgctgg |
| eamA-Up-R | gctcacaattccacacattatacgagccggatgattaattgtcaatgcgcaaataagtcgctata |
| eamA-down-F | gtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagaccatgtcgcgaaaagatggggt |
| eamA-down-R | gacatgatctttttattgaagatgttgcc |
| pT-eamA-F | taatactagtcaaaagatgaaattcagagggttttagagctagaaatagc |
| pT-eamA-R | gctctaaaaccctctgaatttcatcttttgactagtattatacctaggac |
| eamA-VF | tccagccaatgtttagcatggtg |
| eamA-VR | cagactgtgaatcatggttgcgg |
| eamB-Up-F | cagcaccagtgattgttcacc |
| eamB-Up-R | cacaattccacacattatacgagccggatgattaattgtcaattatggatctgcgccgtttt |
| eamB-down-F | atgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagaccgtgacaccgacccttttaag |
| eamB-down-R | aacagatgccccgccagc |
| pT-eamB-F | taatactagtggtactgtctaccaaaacaggttttagagctagaaatagc |
| pT-eamB-R | gctctaaaacctgttttggtagacagtaccactagtattatacctaggac |
| eamB-VF | tgtcttcccggctcagtaaaatc |
| eamB-VR | ttaatagaaaatgcgtaccgcgc |
实施例7引入转运蛋白突变体对L-半胱氨酸生产的影响
(1)以pTarget质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，通过PCR扩增(引物pT-N157S-F和pT-N157S-R)，对gRNA进行定点突变。用DpnI对PCR产物进行消化。将消化产物化转到E.coli DH5α中，涂布于壮观酶素平板，挑取单菌落进行测序验证(引物pT-VF和pT-VR)，筛选突变成功的pTarget-N157S质粒。
(2)将菌株BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamB制备成化转感受态，将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)通过化学转化法转化到BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamB化转感受态中，涂布于卡那霉素抗性平板，得到菌株BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamB/pCas。
(3)以E.coli BW25113基因组为模板，通过引物N157S-Up-F和N157S-Up-R，N157S-Down-F和N157S-Down-R，进行PCR扩增得到插入位点的上下游500bp。通过融合PCR将上述DNA片段融合，得到片段Donor-N157S。
(4)将菌株BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamB/pCas制备成电转感受态。将质粒pTarget-N157S，片段Donor-N157S电转到BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamB/pCas电转感受态后，涂布于卡那霉素和壮观霉素双抗性平板，挑取单菌落进行PCR验证(引物N157S-VF和N157S-VR)，筛选编辑成功菌株，得到菌株BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamBN157S。引物如表7所示。
(5)挑取阳性单菌落接种到含1mM IPTG和0.05mg/L卡那霉素的LB试管，30℃培养过夜，划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，30℃培养24h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L壮观霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L壮观霉素的LB平板的单菌落，其pTarget-N157S质粒成功消除。挑取pTarget-N157S质粒成功消除的单菌落于LB试管，37℃培养过夜，次日菌液划线于LB平板，37℃培养12h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L卡那霉素的LB平板的单菌落，其pCas质粒成功消除，最终得到无质粒BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamBN157S。
(6)将菌株BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamBN157S制备成化转感受态细胞，将实施例2中构建的pEX5质粒，通过化学转化法转化到BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamBN157S感受态中，获得BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamBN157S/pEX5菌株。
(7)将菌株BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamBN157S/pEX5接种到10mL的LB培养基中，30～37℃、150～200rpm培养过夜。接种1mL预培养物到装有20～50mL发酵培养基的500mL摇瓶中，培养4～6小时后添加0.1mM的IPTG，进行2～4天的发酵。发酵培养基如实施例2中所述。根据实施例1方法对发酵液进行检测，OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图3所示。
从图5结果可以看出，菌株BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamBN157S/pEX5的L-半胱氨酸产量为6.26g/L。结果说明，基因eamB的突变体eamBN157S的引入进一步促进了L-半胱氨酸的生产。
表7实施例7引物
| 引物名称 | 序列(5’-3’) |
| N157S-Up-F | gtgacaccgacccttttaagtg |
| N157S-Up-R | aacacacgctaccgaaggtgccaatcatcgccagcaaaa |
| N157S-down-F | caccttcggtagcgtgtgttgggcgctggcggggc |
| N157S-down-R | actctttctggctgctggac |
| pT-N157S-F | taatactagtgacgtttggcaatgtgtgctgttttagagctagaaatagc |
| pT-N157S-R | gctctaaaacagcacacattgccaaacgtcactagtattatacctaggac |
| N157S-VF | cagcctcacgaagcgtatcc |
| N157S-VR | gttttaccaattggccgcgac |
实施例8引入L-半胱氨酸动态响应启动子PyhaO缓解L-丝氨酸和L-半胱氨酸竞争出口问题
(1)以pTarget质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，通过PCR扩增(引物pT-PyhaO-F和pT-PyhaO-R)，对gRNA进行定点突变。用DpnI对PCR产物进行消化。将消化产物化转到E.coli DH5α中，涂布于壮观酶素平板，挑取单菌落进行测序验证(引物pT-VF和pT-VR)，筛选突变成功的pTarget-PyhaO质粒。
(2)将菌株BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamBN157S制备成化转感受态，将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)通过化学转化法转化到BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamBN157S化转感受态中，涂布于卡那霉素抗性平板，得到菌株BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamBN157S/pCas。
(3)以E.coli BW25113基因组为模板，通过引物PyhaO-Up-F和PyhaO-Up-R，PyhaO-Down-F和PyhaO-Down-R，eamA-F和eamA-R，PyhaO-F和PyhaO-R，进行PCR扩增得到插入位点的上下游500bp，eamA基因，PyhaO启动子。通过融合PCR将上述DNA片段融合，得到片段Donor-PyhaO。
(4)将菌株BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamBN157S/pCas制备成电转感受态。将质粒pTa rget-PyhaO，片段Donor-PyhaO电转到BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamBN157S/pCas电转感受态后，涂布于卡那霉素和壮观霉素双抗性平板，挑取单菌落进行PCR验证(引物PyhaO-VF和Pyh aO-VR)，筛选编辑成功菌株，得到菌株BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamBN157S::PyhaO-emaA。引物如表8所示。
(5)挑取阳性单菌落接种到含1mM IPTG和0.05mg/L卡那霉素的LB试管，30℃培养过夜，划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，30℃培养24h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L壮观霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L壮观霉素的LB平板的单菌落，其pTarget-PyhaO质粒成功消除。挑取pTarget-PyhaO质粒成功消除的单菌落于LB试管，37℃培养过夜，次日菌液划线于LB平板，37℃培养12h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L卡那霉素的LB平板的单菌落，其pCas质粒成功消除，最终得到无质粒BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamBN157S::PyhaO-emaA。
(6)将菌株BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamBN157S::PyhaO-emaA制备成化转感受态细胞，将实施例2中构建的pEX5质粒，通过化学转化法转化到BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamBN157S::PyhaO-emaA感受态中，获得BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamBN157S::PyhaO-emaA/pEX5菌株。
(7)将菌株BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamBN157S::PyhaO-emaA/pEX5接种到10mL的LB培养基中，30～37℃、150～200rpm培养过夜。接种1mL预培养物到装有20～50mL发酵培养基的500mL摇瓶中，培养4～6小时后添加0.1mM的IPTG，进行2～4天的发酵。发酵培养基如实施例2中所述。根据实施例1方法对发酵液进行检测，OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图3所示。
从图6结果可以看出，菌株BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamBN157S::PyhaO-emaA/pEX5的L-半胱氨酸产量为7.19g/L。这结果说明，利用PyhaO启动子驱动L-半胱氨酸转运蛋白基因eamA的表达进一步促进了L-半胱氨酸的生产。
表8实施例8引物
| 引物名称 | 序列(5’-3’) |
| PyhaO-Up-F | aagcccgtgagcaggcagaa |
| PyhaO-Up-R | ttactgctttcaatccagtttttcagctcatcatc |
| PyhaO-down-F | gggaagttaacccatcgtttagcgaagttgc |
| PyhaO-down-R | ctcggcagtacgatagtagaagcc |
| eamA-F | tcgtgctggatttcacacaggaaacagaccatgtcgcgaaaagatggggtg |
| eamA-R | aaacgatgggttaacttcccacctttaccgc |
| PyhaO-F | aaactggattgaaagcagtaaacgccgcgc |
| PyhaO-R | ttcgcgacatggtctgtttcctgtgtgaaatccagcacgacccgccgg |
| pT-PyhaO-F | taatactagtatcaaaattcgtccgtaaccgttttagagctagaaatagc |
| pT-PyhaO-R | gctctaaaacggttacggacgaattttgatactagtattatacctaggac |
| PyhaO-VF | gcggaagcgtagtcgaaattctc |
| PyhaO-VR | ttcgtcattcaggtgccactc |
Claims (10)
1.一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌，其特征在于，由如下方法构建获得：
(1)以菌株BW08::125126glyA::cysM::nrdH/pTrc99a-cysEf作为出发菌株，敲除其基因组中的基因ptsG，过表达基因glk和基因galP，将质粒pTrc99a-cysEf上基因cysEf的Trc启动子替换为TrcX5启动子，得到载体质粒pEX5，并导入至工程菌BW08::125126glyA::cysM::nrdH中，由此获得工程菌BW08::125126glyA::cysM::nrdHΔptsG::glk::galP/pEX5，记作菌株BW14/pEX5；
(2)在所述菌株BW14/pEX5的基因组上，敲除基因ldhA，过表达基因tpiA、基因eamA和基因eamB，并将所述基因eamB突变成eamBN157S突变体，插入由动态响应启动子PyhaO驱动的基因eamA，由此获得工程菌BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamBN157S::PyhaO-eamA/pEX5，即为所述高产L-半胱氨酸的基因工程菌。
2.如权利要求1所述的高产L-半胱氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因ptsG的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述基因glk的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述基因galP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.如权利要求1或2所述的高产L-半胱氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因ldhA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述基因tpiA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述基因eamA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述基因eamB的序列如SEQ ID NO.8所示，所述基因eamBN157S的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
4.如权利要求1所述的高产L-半胱氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因tpiA、基因eamA和基因eamB由Trc启动子启动，所述Trc启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
5.如权利要求1或4所述的高产L-半胱氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述动态响应启动子PyhaO的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
6.如权利要求1所述的高产L-半胱氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述TrcX5启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
7.如权利要求1或6所述的高产L-半胱氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因cysEf的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
8.一种用于构建权利要求1～7中任意一项所述的高产L-半胱氨酸的基因工程菌的方法，其特征在于，以菌株BW08::125126glyA::cysM::nrdH/pTrc99a-cysEf作为出发菌株，包括以下步骤：
(1)敲除其基因组中的基因ptsG，向其基因组中插入基因glk和基因galP，将质粒pTrc99a-cysEf上基因cysEf的Trc启动子替换为TrcX5启动子，得到载体质粒pEX5，并导入至工程菌BW08::125126glyA::cysM::nrdH中，由此获得工程菌BW08::125126glyA::cysM::nrdHΔptsG::glk::galP/pEX5，记作菌株BW14/pEX5；
(2)敲除所述菌株BW14/pEX5基因组中的乳酸脱氢酶基因ldhA，获得工程菌BW14ΔldhA/pEX5；
(3)向所述工程菌BW14ΔldhA/pEX5的基因组上插入Trc启动子驱动的基因tpiA，获得工程菌BW14ΔldhA::tpiA/pEX5；
(4)将所述工程菌BW14ΔldhA::tpiA/pEX5的基因组上的基因eamA和基因eamB的启动子替换为Trc启动子，并将所述基因eamB突变成eamBN157S突变体，插入由动态响应启动子PyhaO驱动的基因eamA，由此获得工程菌BW14ΔldhA::tpiA::eamA::eamBN157S::PyhaO-eamA/pEX5，即为所述高产L-半胱氨酸的基因工程菌。
9.权利要求1～7中任意一项所述的高产L-半胱氨酸的基因工程菌或者权利要求8所述的方法构建的高产L-半胱氨酸的基因工程菌在微生物发酵制备L-半胱氨酸中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，将所述基因工程菌株接种至发酵培养基，在28～37℃，150-200rpm条件下发酵培养，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到L-半胱氨酸。
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