CN116836904A - 高产l-半胱氨酸的基因工程菌、构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物代谢工程技术领域，尤其涉及高产L‑半胱氨酸的基因工程菌、构建方法及应用，以工程菌株E.coliBW25113作为出发菌株，通过将serAf，serB和serC基因分别插入到基因组上的假基因yjiP，mbhA和ydeU的位置，来加强L‑半胱氨酸前体L‑丝氨酸的合成；继续敲除基因组上的基因sdaA，sdaB，tdcG，tnaA和yhaM，削弱L‑丝氨酸和L‑半胱氨酸的降解；利用pTrc99a质粒过表达解除反馈抑制的丝氨酸转移酶基因cysEf，构建pTrc99a‑cysEf导入至前一步骤获得的工程菌种中，过表达反馈抑制不敏感的丝氨酸转移酶基因cysEf，进一步获得能够高产L‑半胱氨酸的基因工程菌株，实现了L‑半胱氨酸的高效合成。

Description

高产L-半胱氨酸的基因工程菌、构建方法及应用
技术领域
本发明涉及微生物代谢工程技术领域，尤其涉及高产L-半胱氨酸的基因工程菌、构建方法及应用。
背景技术
L-半胱氨酸是一种重要的氨基酸，是蛋白质中不可缺少的成分之一。它包含有一个硫原子和一个羧基，属于非极性氨基酸。L-半胱氨酸在体内发挥着重要的作用。它可以与另外一个L-半胱氨酸残基形成二硫键，促进蛋白质的折叠和稳定。此外，L-半胱氨酸还可以转化为其他重要的化合物，如辅酶A、牛磺酸等，这些化合物在能量代谢、细胞信号传导等方面都扮演着重要的角色。
大肠杆菌是一种常见的微生物，常用于生产各类高价值化合物。同时，大肠杆菌也是微生物发酵法生产L-半胱氨酸的潜在宿主。L-半胱氨酸对大肠杆菌的生长是必须的。L-半胱氨酸是大肠杆菌生长所必需的唯一硫源，因为大肠杆菌不能直接利用无机硫来合成必需的生物分子。L-半胱氨酸在大肠杆菌中的生物合成途径受到多种调节，这也反映了其对于大肠杆菌生长的重要性。如果大肠杆菌缺乏L-半胱氨酸，其生长速度将受到明显影响，并可能导致代谢异常和细胞死亡。因此，L-半胱氨酸对于大肠杆菌的生长是必须的，是一种重要的营养物质。
在大肠杆菌中，L-半胱氨酸的合成途径主要分为碳代谢途径和硫代谢途径。在碳代谢途径中，L-半胱氨酸的合成从葡萄糖出发，经过一系列反应后生成3-磷酸甘油酸。3-磷酸甘油酸通过三步反应生成L-半胱氨酸的重要前体物质L-丝氨酸。L-丝氨酸在丝氨酸乙酰基转移酶的作用下，生成O-乙酰丝氨酸。随后，O-乙酰丝氨酸通过同化硫代谢途径还原的含硫分子，生成L-半胱氨酸。此外，L-丝氨酸还会被丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)催化成甘氨酸，进入碳代谢途径。
在常见的代谢改造过程中，研究人员通过替换靶基因的原始启动子来实现对靶基因的过表达。其中。Trc启动子是代谢工程中常用的强启动子。Trc启动子是一种诱导型的启动子，受到乳糖操纵子的调控。在缺乏乳糖的情况下，Trc启动子的转录受到转录调控因子LacI的抑制。通过添加乳糖或乳糖类似物，例如IPTG等，可以诱导Trc启动子的表达。因此，Trc启动子作为一种典型的诱导型启动子，常被用于各类代谢改造过程中，实现基因的诱导表达。尤其是对于有毒化合物的生物合成来说，诱导表达是一种常见的代谢改造策略。主要思路为，在生长阶段，通过抑制目标代谢物合成途径中基因的表达，将代谢通量引向细胞生长。随着细胞生长达到一定阶段后，通过添加诱导剂，激活各类诱导启动子的表达，实现目标代谢物合成途径的激活，开始生产模式，以此来减少有毒化合物在细胞生长前期的积累，缓解细胞生产对细胞生长的影响。然而，对于生长必须的有毒化合物，例如L-半胱氨酸来说，直接利用Trc启动子强化L-半胱氨酸合成途径的基因的表达可能不利于细胞的生长，因为在非诱导阶段，即细胞生长阶段，Trc启动子受到的来自LacI的抑制，会限制L-半胱氨酸的正常合成。这种限制作用会对细胞的正常生长造成消极的影响。因此，需要提出更加合理的代谢工程手段来改造L-半胱氨酸的合成途径。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌及其构建方法，并将其应用于发酵生产L-半胱氨酸，以克服现有技术中存在的L-半胱氨酸生产菌株的L-半胱氨酸的合成途径不利于细胞正常生长，在发酵生产L-半胱氨酸过程中的产量较低的问题。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
本发明的第一个目的在于，提供一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：(1)以菌株E.coli BW25113作为出发菌株，保留原生启动子驱动的L-半胱氨酸合成途径，将serAf基因插入至其基因组上的假基因yjiP的位置，将serB基因插入至其基因组上的假基因mbhA的位置，将serC基因插入至其基因组上的假基因ydeU的位置，获得工程菌E.coli BW25113::serAf::serB::serC；
(2)将工程菌E.coli BW25113::serAf::serB::serC基因组上的基因sdaA，sdaB和tdcG敲除，获得工程菌E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcG；
(3)构建载体质粒pTrc99a-cysEf，并导入至敲除了工程菌E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcG基因组上的基因tnaA和yhaM的工程菌中，获得工程菌E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcGΔtnaAΔyhaM/pTrc99a-cysEf，即为所述高产L-半胱氨酸的基因工程菌。
由于在常见的代谢改造过程中，一般通过替换靶基因的原始启动子来实现对靶基因的过表达，而直接利用Trc启动子强化L-半胱氨酸合成途径的基因的表达可能不利于细胞的生长。因此本发明提出多拷贝的基因表达策略，来实现大肠杆菌中L-半胱氨酸的生物合成。通过保留原生启动子驱动的L-半胱氨酸合成途径，来实现基因工程菌株在非诱导阶段，即生长阶段对L-半胱氨酸的需求。随后，通过在基因组上增加启动子控制的L-半胱氨酸合成途径基因的拷贝，来搭建L-半胱氨酸生产途径，实现L-半胱氨酸在诱导后高效合成，并获得一株高产L-半胱氨酸的大肠杆菌基因工程菌。
具体为首先选择生产半胱氨酸的工程菌株E.coli BW25113作为出发菌株，(1)通过将启动子驱动的serAf，serB和serC基因分别插入到基因组上的假基因yjiP，mbhA和ydeU的位置，来加强L-半胱氨酸前体L-丝氨酸的合成，获得能够生产L-半胱氨酸的前体L-丝氨酸的菌株；(2)继续敲除基因组上的基因sdaA，sdaB和tdcG，削弱L-丝氨酸的降解，进一步获得能够生产L-半胱氨酸的前体L-丝氨酸的菌株；(3)利用在步骤(2)获得的菌株中的pTrc99a质粒过表达解除反馈抑制的丝氨酸转移酶基因cysEf，构建pTrc99a-cysEf；(4)在步骤(2)获得的菌株中敲除基因组上的基因tnaA和yhaM，削弱L-半胱氨酸的降解，并导入(3)中构建的质粒，过表达反馈抑制不敏感的丝氨酸转移酶基因cysEf，进一步获得能够生产L-半胱氨酸的菌株。
作为优选，所述serAf基因的序列如SEQ ID NO.1所示，所述serB基因的序列如SEQID NO.2所示，所述serC基因的序列如SEQ ID NO.3所示。
作为优选，所述cysEf基因的序列如SEQ ID NO.4所示。
作为优选，所述sdaA基因的序列如SEQ ID NO.5所示，所述sdaB基因的序列如SEQID NO.6所示和所述tdcG基因的序列如SEQ ID NO.7所示，所述tnaA基因的序列如SEQ IDNO.8所示，所述yhaM基因的序列如SEQ ID NO.9所示。
作为优选，所述serAf，serB和serC基因由Trc启动子驱动，所述Trc启动子的的序列如SEQ ID NO.10所示。
本发明的第二个目的在于，提供一种用于构建所述的高产L-半胱氨酸的基因工程菌的方法，以菌株E.coli BW25113作为出发菌株，包括以下步骤：
(1)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将serAf基因插入至其基因组上的假基因yjiP的位置，将serB基因插入至其基因组上的假基因mbhA的位置，将serC基因插入至其基因组上的假基因ydeU的位置，获得工程菌E.coli BW25113::serAf::serB::serC；
(2)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将工程菌E.coli BW25113::serAf::serB::serC基因组上的基因sdaA，sdaB和tdcG敲除，获得工程菌E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcG；
(3)以pTrc99a质粒为模版，构建载体质粒pTrc99a-cysEf；
(4)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将工程菌E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcG基因组上的基因tnaA和yhaM敲除，并向导入步骤(3)中所构建的载体质粒pTrc99a-cysEf，获得工程菌E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcGΔtnaAΔyhaM/pTrc99a-cysEf，即为所述高产L-半胱氨酸的基因工程菌。
本发明的第三个目的在于，提供所述的高产L-半胱氨酸的基因工程菌或者所述的方法构建的高产L-半胱氨酸的基因工程菌在微生物发酵制备L-半胱氨酸中的应用。
作为优选，将所述基因工程菌菌株接种至发酵培养基，在28～37℃，150-200rpm条件下发酵培养，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到L-半胱氨酸。
作为优选，所述基因工程菌发酵培养前先在培养基中30～37℃，150～200rpm条件下培养12～24h，再接种至发酵培养基。
具体为将基因工程菌株先接种至10ml LB培养基试管中，于温度30～37℃，转速150～200rpm的摇床上培养12～24h。然后以体积浓度1％接种量接种到20～50ml发酵培养基中开始发酵。培养4～6小时后添加0.1mM的IPTG。发酵温度为28～37℃，转速150-200rpm，发酵时长为2-4天。发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到L-半胱氨酸。
作为优选，所述发酵培养基组成包括：葡萄糖20～30g/L、(NH4)2SO45～10g/L、KH2PO42～5g/L、Na2S2O35～10g/L、酵母提取物5～10g/L、Na2HPO410～15g/L、蛋白胨1～5g/L，1ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成为：300～500g/LMgSO4·8H2O，2～5g/L MnSO4·8H2O，2～5g/L ZnSO4·7H2O，2～8g/LFe2SO4，溶剂为去离子水。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提出了多拷贝基因表达策略来控制大肠杆菌中L-半胱氨酸生物合成途径的表达。通过将诱导型启动子控制的靶基因插入到基因组上的假基因位点中，来增加靶基因的拷贝数量，提高靶基因的表达水平。同时，保留了原生启动子控制的靶基因，可满足工程菌株在非诱导阶段对于L-半胱氨酸合成的需求。L-半胱氨酸的合成途径在多拷贝基因表达策略的驱动下，实现了两阶段的表达水平。生长阶段，由于未添加诱导剂，诱导型启动子控制的L-半胱氨酸合成途径的基因的表达受到抑制，原生启动子控制的L-半胱氨酸合成基因可以正常表达，以此来满足正常的代谢需求。生产阶段，由于诱导剂的添加，诱导性启动子控制的L-半胱氨酸合成途径的表达被激活，有效提高了L-半胱氨酸的合成通量。由此通过多拷贝基因表达策略，构建了一株高产L-半胱氨酸的基因工程菌株，实现了L-半胱氨酸的高效合成。
附图说明
图1为菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serC的L-丝氨酸产量和OD600情况。
图2为菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serC/pTrc99a-cysEf的L-半胱氨酸产量和OD600情况。
图3为菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcG的L-丝氨酸产量和OD600情况。
图4为菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcG/pTrc99a-cysEf的L-半胱氨酸产量和OD600情况。
图5为菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcGΔtnaAΔyhaM/pTrc99a-cysEf的L-半胱氨酸产量和OD600情况。
具体实施方式
下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明做进一步描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例中，卡那霉素在培养基中终浓度为50mg/L，壮观霉素在培养基中终浓度为50mg/L，氨苄霉素在培养基中终浓度为100mg/L。出发菌株E.coli BW25113购自中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCAB 2012134。
实施例1L-半胱氨酸和L-丝氨酸含量的测定
(1)取1mL菌液于2mL的EP管中，在12000rpm条件下离心1分钟，将上清和沉淀分离。上清用于L-半胱氨酸，L-丝氨酸以及其他代谢产物的检测。
(2)称取0.27g的CNBF溶于10mL乙腈中作为Ⅰ液；以0.2M硼酸溶液和0.05M硼砂溶液作为母液，4:1体积混合配成pH＝9.0标准缓冲溶液记为Ⅱ液。将样品稀释成0～5g/L浓度，按照样品100μL，Ⅰ液300μL和Ⅱ液500μL比例混合，在恒温振荡器中40～60℃，500～1000rpm反应0.5～1小时。样品过膜装入液相瓶中待测。
(3)仪器为赛默飞UPLC超高压液相色谱仪。色谱柱为C18柱(4.6×250mm，5μm)；紫外检测器检测波长260nm；进样量10μL；柱温30℃；流速0.8mL/min；流动相使用AB两相，A相纯乙腈，B相50mM HAc-NaAc缓冲液：乙腈：三乙胺＝82.8：17：0.2，pH＝4.9。梯度洗脱程序如表1所示。
表1梯度洗脱程序
序号 时间(min) A(％) B(％)
1 0 18 82
2 3 20 80
3 5 35 65
4 8 35 65
5 10 50 50
6 12 50 50
7 13 80 20
8 15 70 30
9 18 18 82
10 23 18 82
。
实施例2生产L-半胱氨酸前体L-丝氨酸的基因工程菌株E.coli BW25113：：serAf：：serB：：serC的构建为了促进L-半胱氨酸的生产，提高L-半胱氨酸的前体L-丝氨酸的生物合成是必要的。在大肠杆菌中，L-丝氨酸的合成从3-磷酸甘油酸出发，通过三步反应完成。这三步反应由基因serA，serC和serB控制。其中，大肠杆菌的serA基因受到L-丝氨酸的反馈抑制。因此，解除反馈抑制的突变体serAf被引入。通过将Trc启动子驱动的serAf，serB和serC基因分别插入到基因组上基因yjiP，mbhA和ydeU的位置，来加强L-半胱氨酸前体L-丝氨酸的合成。
(1)以pTarget质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，通过PCR扩增(引物pT-serAf-F和pT-serAf-R)，对gRNA进行定点突变。用DpnI对PCR产物进行消化。将消化产物化转到E.coli DH5α中，涂布于壮观酶素平板，挑取单菌落进行测序验证(引物pT-VF和pT-VR)，筛选突变成功的pTarget-serAf质粒。
(2)以E.coli BW25113基因组为模板，通过引物serAf-Up-F和serAf-Up-R，serAf-Down-F和serAf-Down-R，进行PCR扩增得到假基因yjiP的上下游500bp。以E.coilW3110 EYC(CCTCC NO：M 20191026)基因组为模板，通过引物serAf-F和serAf-R，进行PCR扩增得到基因serAf的片段。通过融合PCR将上述三个DNA片段融合，得到片段Donor-serAf。
(3)将菌株E.coli BW25113制备成化转感受态，将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)通过化学转化法转化到E.coli BW25113化转感受态中，涂布于卡那霉素抗性平板，得到菌株E.coli BW25113/pCas。
(4)将菌株E.coli BW25113/pCas制备成电转感受态。将质粒pTarget-serAf，片段Donor-serAf电转到E.coli BW25113/pCas电转感受态后，涂布于卡那霉素和壮观霉素双抗性平板，挑取单菌落进行PCR验证(引物serAf-VF和serAf-VR)，筛选编辑成功菌株，得到菌株E.coli BW25113::serAf。引物如表2所示。
(5)挑取阳性单菌落接种到含1mM IPTG和0.05mg/L卡那霉素的LB试管，30℃培养过夜，划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，30℃培养24h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L壮观霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L壮观霉素的LB平板的单菌落，其pTarget-serAf质粒成功消除。挑取pTarget-serAf质粒成功消除的单菌落于LB试管，37℃培养过夜，次日菌液划线于LB平板，37℃培养12h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L卡那霉素的LB平板的单菌落，其pCas质粒成功消除，最终得到无质粒E.coliBW25113::serAf。
(6)根据上述的方法，依次将基因serB和serC分别插入到假基因mbhA和ydeU基因位置中，获得菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serC。将菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serC接种到10mL的LB培养基中，30～37℃、150～200rpm培养过夜。接种1mL预培养物到装有20～50mL发酵培养基的500mL摇瓶中，培养4～6小时后添加0.1mM的IPTG，进行2～4天的发酵。所述发酵培养基组成如下：葡萄糖20～30g/L、(NH4)2SO45～10g/L、KH2PO42～5g/L、Na2S2O35～10g/L、酵母提取物5～10g/L、Na2HPO410～15g/L、蛋白胨1～5g/L，1ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然。微量元素溶液组成为：300～500g/L MgSO4·8H2O，2～5g/L MnSO4·8H2O，2～5g/L ZnSO4·7H2O，2～8g/L Fe2SO4，溶剂为去离子水。根据实施例1方法对发酵液进行检测，OD600及发酵液上清中的L-丝氨酸含量如图1所示。
从图1结果可以看出，菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serC的L-丝氨酸产量为856.78mg/L。这结果说明，利用多拷贝的基因表达策略的，来加强L-丝氨酸合成基因serB，serC和serAf的表达，可以有效促进L-丝氨酸的生物合成。在大肠杆菌中，L-丝氨酸作为L-半胱氨酸的重要前提物质，它的高效合成对于L-半胱氨酸的生产至关重要。
表2实施例2引物
实施例3过表达cysEf基因对菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serC的L-半胱氨酸生产的影响为了实现L-半胱氨酸的积累，过表达解除反馈抑制的cysEf是必要的。为了实现cysEf的过表达，将cysEf克隆到载体pTrc99a中，并导入到菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serC中。
(1)以pTrc99a质粒为模版(99aline-F和99aline-R)，通过PCR进行扩增，得到线性化载体。以E.coli BW25113基因组为模板(引物cysE-F和cysE-R)，扩增得到基因cysE片段。用DpnI对PCR产物进行消化。所有PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并纯化PCR片段。按照一步克隆试剂盒(One step clonekit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将线性化载体与基因片段cysE进行连接，转化到E.coli DH5α中，涂布于氨苄青霉素抗性平板，挑取单菌落用菌落PCR验证(引物99a-VF和99a-VR)，测序验证得到pTrc99a-cysE质粒。以质粒pTrc99a-cysE为模板，利用引物T167A-F和T167A-R，G245S-F和G245S-R进行PCR，转化到E.coli DH5α中，涂布于氨苄青霉素抗性平板，挑取单菌落用菌落PCR验证(引物99a-VF和99a-VR)，测序验证得到含cysE突变体的pTrc99a-cysEf的质粒。引物如表3所示。
(2)将菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serC制备成化转感受态细胞，将构建好的pTrc99a-cysEf质粒，通过化学转化法转化到E.coli BW25113::serAf::serB::serC感受态中，获得E.coli BW25113::serAf::serB::serC/pTrc99a-cysEf菌株。
(3)将E.coli BW25113::serAf::serB::serC/pTrc99a-cysEf接种到10mL的LB培养基中，30～37℃、150～200rpm培养过夜。接种1mL预培养物到装有20～50mL发酵培养基的500mL摇瓶中，培养4～6小时后添加0.1mM的IPTG，进行2～4天的发酵。发酵培养基如实施例2中所述。根据实施例1方法对发酵液进行检测，OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图2所示。
在大肠杆菌中，L-丝氨酸在基因cysE的作用下，生成O-乙酰丝氨酸。O-乙酰丝氨酸再通过同化无机硫源，最终生成L-半胱氨酸。而基因cysE编码的酶受到L-半胱氨酸严格的反馈抑制，从而控制了大肠杆菌胞内的L-半胱氨酸水平。因此，解除cysE的反馈抑制是必须的。从图2结果可以看出，菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serC/pTrc99a-cysEf的L-半胱氨酸产量为253.47mg/L。这结果说明，过表达解除反馈抑制的cysEf基因可以有效地实现L-半胱氨酸的生物合成，这是实现L-半胱氨酸高效生产的关键步骤。
表3实施例3引物
实施例4敲除L-丝氨酸降解基因对L-半胱氨酸的前体L-丝氨酸生产的影响为了进一步提高L-半胱氨酸的前体L-丝氨酸的积累，敲除L-丝氨酸的降解途径，包括基因sdaA，sdaB和tdcG，对L-丝氨酸的影响被研究。
(1)以pTarget质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，通过PCR扩增(引物pT-sdaA-F和pT-sdaA-R)，对gRNA进行定点突变。用DpnI对PCR产物进行消化。将消化产物化转到E.coli DH5α中，涂布于壮观酶素平板，挑取单菌落进行测序验证(引物pT-VF和pT-VR)，筛选突变成功的pTarget-sdaA质粒。
(2)将菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serC制备成化转感受态，将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)通过化学转化法转化到E.coli BW25113::serAf::serB::serC化转感受态中，涂布于卡那霉素抗性平板，得到菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serC/pCas。
(3)以E.coli BW25113基因组为模板，通过引物sdaA-Up-F和sdaA-Up-R，sdaA-Down-F和sdaA-Down-R，进行PCR扩增得到假基因sdaA的上下游500bp。通过融合PCR将上述DNA片段融合，得到片段Donor-sdaA。
(4)将菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serC/pCas制备成电转感受态。将质粒pTarget-sdaA，片段Donor-sdaA电转到E.coli BW25113::serAf::serB::serC/pCas电转感受态后，涂布于卡那霉素和壮观霉素双抗性平板，挑取单菌落进行PCR验证(引物sdaA-VF和sdaA-VR)，筛选编辑成功菌株，得到菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaA。引物如表4所示。
(5)挑取阳性单菌落接种到含1mM IPTG和0.05mg/L卡那霉素的LB试管，30℃培养过夜，划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，30℃培养24h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L壮观霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L壮观霉素的LB平板的单菌落，其pTarget-sdaA质粒成功消除。挑取pTarget-sdaA质粒成功消除的单菌落于LB试管，37℃培养过夜，次日菌液划线于LB平板，37℃培养12h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L卡那霉素的LB平板的单菌落，其pCas质粒成功消除，最终得到无质粒E.coliBW25113::serAf::serB::serCΔsdaA。
(6)根据上述的方法，依次将基因sdaB和tdcG敲除，获得菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcG。将菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcG接种到10mL的LB培养基中，30～37℃、150～200rpm培养过夜。接种1mL预培养物到装有20～50mL发酵培养基的500mL摇瓶中，培养4～6小时后添加0.1mM的IPTG，进行2～4天的发酵。发酵培养基如实施例2中所述。根据实施例1方法对发酵液进行检测，OD600及发酵液上清中的L-丝氨酸含量如图3所示。
为了进一步提高L-半胱氨酸的水平，进一步改善L-丝氨酸的积累水平是有潜力的。在大肠杆菌的代谢工程中，删除目标代谢物的降解途径是一种有效的改造方法。为了提高L-丝氨酸的生物合成，参与L-丝氨酸降解的基因被删除。从图3结果可以看出，菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcG的L-丝氨酸产量为1070.11mg/L。这结果说明，L-丝氨酸降解基因sdaA，sdaB和tdcG的删除，有效地促进了L-丝氨酸的积累。这些工作为进一步提高L-半胱氨酸的高效生产提供了基础。
表4实施例4引物
实施例5过表达cysEf基因对菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcG的L-半胱氨酸的影响
为了评估菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcG的L-半胱氨酸生产性能，过表达cysEf的载体被导入E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcG中促进L-半胱氨酸的生产。
(1)将菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcG制备成化转感受态细胞，将实施例3中构建的pTrc99a-cysEf质粒，通过化学转化法转化到E.coliBW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcG感受态中，获得E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcG/pTrc99a-cysEf菌株。
(2)将E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcG/pTrc99a-cysEf接种到10mL的LB培养基中，30～37℃、150～200rpm培养过夜。接种1mL预培养物到装有20～50mL发酵培养基的500mL摇瓶中，培养4～6小时后添加0.1mM的IPTG，进行2～4天的发酵。发酵培养基如实施例2中所述。根据实施例1方法对发酵液进行检测，OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图4所示。
为了进一步评估提高L-丝氨酸的生物合成对L-半胱氨酸生产的影响，在实施例4中得到的菌株中过表达基因cysEf。从图4结果可以看出，菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcG/pTrc99a-cysEf的L-半胱氨酸产量为498.25mg/L。相较于菌株BW25113::serAf::serB::serC/pTrc99a-cysEf，L-半胱氨酸的产量提升了97％。这结果说明，L-丝氨酸降解基因sdaA，sdaB和tdcG的删除对于提高L-半胱氨酸的积累是有效的，进一步证明了L-丝氨酸和L-半胱氨酸之间的紧密联系。
实施例6敲除L-半胱氨酸降解基因对L-半胱氨酸生产的影响
为了进一步提高L-半胱氨酸积累，敲除L-半胱氨酸的降解途径可以进一步提高L-丝氨酸的积累。
(1)以pTarget质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，通过PCR扩增(引物pT-tnaA-F和pT-tnaA-R)，对gRNA进行定点突变。用DpnI对PCR产物进行消化。将消化产物化转到E.coli DH5α中，涂布于壮观酶素平板，挑取单菌落进行测序验证(引物pT-VF和pT-VR)，筛选突变成功的pTarget-tnaA质粒。
(2)将菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcG制备成化转感受态，将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)通过化学转化法转化到E.coliBW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcG化转感受态中，涂布于卡那霉素抗性平板，得到菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcG/pCas。
(3)以E.coli BW25113基因组为模板，通过引物tnaA-Up-F和tnaA-Up-R，tnaA-Down-F和tnaA-Down-R，进行PCR扩增得到假基因tnaA的上下游500bp。通过融合PCR将上述DNA片段融合，得到片段Donor-tnaA。
(4)将菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcG/pCas制备成电转感受态。将质粒pTarget-tnaA，片段Donor-tnaA电转到E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcG/pCas电转感受态后，涂布于卡那霉素和壮观霉素双抗性平板，挑取单菌落进行PCR验证(引物sdaA-VF和sdaA-VR)，筛选编辑成功菌株，得到菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcGΔtnaA。引物如表5所示。
(5)挑取阳性单菌落接种到含1mM IPTG和0.05mg/L卡那霉素的LB试管，30℃培养过夜，划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，30℃培养24h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L壮观霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L壮观霉素的LB平板的单菌落，其pTarget-tnaA质粒成功消除。挑取pTarget-tnaA质粒成功消除的单菌落于LB试管，37℃培养过夜，次日菌液划线于LB平板，37℃培养12h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L卡那霉素的LB平板的单菌落，其pCas质粒成功消除，最终得到无质粒E.coliBW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcGΔtnaA。
(6)根据上述的方法，进一步将基因yhaM敲除，获得菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcGΔtnaAΔyhaM。将菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcGΔtnaAΔyhaM制备成化转感受态细胞，将实施例3中构建的pTrc99a-cysEf质粒，通过化学转化法转化到E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcGΔtnaAΔyhaM感受态中，获得E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcGΔtnaAΔyhaM/pTrc99a-cysEf菌株。
(7)将E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcGΔtnaAΔyhaM/pTrc99a-cysEf接种到10mL的LB培养基中，30～37℃、150～200rpm培养过夜。接种1mL预培养物到装有20～50mL发酵培养基的500mL摇瓶中，培养4～6小时后添加0.1mM的IPTG，进行2～4天的发酵。发酵培养基如实施例2中所述。根据实施例1方法对发酵液进行检测，OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图5所示。
为了提高L-半胱氨酸的生产，削弱L-半胱氨酸的降解被执行。在大肠杆菌中，基因tnaA和yhaM被发现参与L-半胱氨酸降解。因此，tnaA和yhaM被视为靶点进行删除。从图5结果可以看出，E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcGΔtnaAΔyhaM/pTrc99a-cysEf的L-半胱氨酸产量为598.30mg/L。相较于菌株BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcG/pTrc99a-cysEf，L-半胱氨酸的产量提升了20％。这结果说明，L-半管肝素钠降解基因tnaA和yhaM的删除对于提高L-半胱氨酸的积累是有效的，这为大肠杆菌实现L-半胱氨酸的高效生产提供了更多的手段。其中，菌株E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcGΔtnaAΔyhaM/pTrc99a-cysEf即为本专利所述优选菌株。
表5实施例5引物

Claims (10)

1.一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌，其特征在于，由如下方法构建获得：
(1)以菌株E.coliBW25113作为出发菌株，保留原生启动子驱动的L-半胱氨酸合成途径，将serAf基因插入至其基因组上的假基因yjiP的位置，将serB基因插入至其基因组上的假基因mbhA的位置，将serC基因插入至其基因组上的假基因ydeU的位置，获得工程菌E.coli BW25113::serAf::serB::serC；
(2)将工程菌E.coliBW25113::serAf::serB::serC基因组上的基因sdaA，sdaB和tdcG敲除，获得工程菌E.coliBW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcG；
(3)构建载体质粒pTrc99a-cysEf，并导入至敲除了工程菌E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcG基因组上的基因tnaA和yhaM的工程菌中，获得工程菌E.coliBW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcGΔtnaAΔyhaM/pTrc99a-cysEf，即为所述高产L-半胱氨酸的基因工程菌。
2.如权利要求1所述的一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述serAf基因的序列如SEQ ID NO.1所示，所述serB基因的序列如SEQ ID NO.2所示，所述serC基因的序列如SEQ ID NO.3所示。
3.如权利要求1或2所述的一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述cysEf基因的序列如SEQ ID NO.4所示。
4.如权利要求3所述的一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述sdaA基因的序列如SEQ ID NO.5所示，所述sdaB基因的序列如SEQ ID NO.6所示和所述tdcG基因的序列如SEQ ID NO.7所示，所述tnaA基因的序列如SEQ ID NO.8所示，所述yhaM基因的序列如SEQ ID NO.9所示。
5.如权利要求1所述的一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述serAf、serB和serC基因由Trc启动子驱动，所述Trc启动子的的序列如SEQ ID NO.10所示。
6.一种用于构建权利要求1～5中任意一项所述的高产L-半胱氨酸的基因工程菌的方法，其特征在于，以菌株E.coliBW25113作为出发菌株，包括以下步骤：
(1)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将serAf基因插入至其基因组上的假基因yjiP的位置，将serB基因插入至其基因组上的假基因mbhA的位置，将serC基因插入至其基因组上的假基因ydeU的位置，获得工程菌E.coliBW25113::serAf::serB::serC；
(2)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将工程菌E.coliBW25113::serAf::serB::serC基因组上的基因sdaA、sdaB和tdcG敲除，进一步获得工程菌E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcG；
(3)以pTrc99a质粒为模版，构建载体质粒pTrc99a-cysEf；
(4)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将工程菌E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcG基因组上的基因tnaA和yhaM敲除，并导入步骤(3)中所构建的载体质粒pTrc99a-cysEf，获得工程菌E.coli BW25113::serAf::serB::serCΔsdaAΔsdaBΔtdcGΔtnaAΔyhaM/pTrc99a-cysEf，即为所述高产L-半胱氨酸的基因工程菌。
7.权利要求1～5中任意一项所述的高产L-半胱氨酸的基因工程菌或者权利要求6所述的方法构建的高产L-半胱氨酸的基因工程菌在微生物发酵制备L-半胱氨酸中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述基因工程菌株接种至发酵培养基，在28～37℃，150-200rpm条件下发酵培养，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到L-半胱氨酸。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述发酵培养前先在培养基中30～37℃，150～200rpm条件下培养12～24h，再接种至发酵培养基。
10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基组成包括：葡萄糖20～30g/L、(NH4)2SO45～10g/L、KH2PO42～5g/L、Na2S2O35～10g/L、酵母提取物5～10g/L、Na2HPO410～15g/L、蛋白胨1～5g/L，1ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成为：300～500g/LMgSO4·8H2O，2～5g/LMnSO4·8H2O，2～5g/LZnSO4·7H2O，2～8g/LFe2SO4，溶剂为去离子水。
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