CN113736719B - 一种谷氨酸棒杆菌基因工程菌及其在亚精胺生产中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种谷氨酸棒杆菌基因工程菌及其在亚精胺生产中的应用，属于遗传工程领域。本发明采用代谢工程改造的方法，解除亚精胺合成途径的各种产物抑制、改变亚精胺转运系统、强化关键通路的酶活性、并引入外源途径，获得了可以高产亚精胺的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，具有良好的工业应用前景。

Description

一种谷氨酸棒杆菌基因工程菌及其在亚精胺生产中的应用
技术领域
本发明涉及一种生产亚精胺的谷氨酸棒杆菌工程菌，属于生物工程技术领域。
背景技术
亚精胺(Spermidine)，线性分子式为NH2(CH2)3NH(CH2)4NH2，广泛存在于微生物、植物和动物体内，是一种重要的生理活性物质。亚精胺具有延长动物寿命的功效，并抵消与年龄相关的疾病，如心血管疾病，神经退行性疾病和癌症等。
如图1所示，生物体中主要有两条途径合成亚精胺：
(1)经由羧基化腺苷甲硫氨酸和腐胺在亚精胺合成酶的作用下直接合成亚精胺，羧基化腺苷甲硫氨酸可由甲硫氨酸(Met)，经过相关酶的腺苷化和脱羧化催化得到，该途径在动物、植物和微生物体内，是比较常见的传统亚精胺合成的途径；
(2)经由天冬氨酸-β-半醛和腐胺在羧基亚精胺脱氢酶和脱羧酶的催化下合成亚精胺，天冬氨酸-β-半醛可经常见氨基酸如天冬氨酸(Asp)经相关酶的磷酸化和脱氢化催化合成，该途径为新发现的替代合成途径，主要存在于一些细菌中，包括重要的人类病原体，肠道菌群等。这些途径中的酶受到高度调控，动植物体的亚精胺含量较低，目前也未发现可以大量生产亚精胺的微生物。
谷氨酸棒杆菌作为生产谷氨酸，赖氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苏氨酸的著名菌株，也具有作为生产甲硫氨酸，S-腺苷甲硫氨酸的能力，并且可潜在的作为腐胺，尸胺，亚精胺等多胺类物质的菌株。
发明内容
本发明要解决的技术问题是构建一种经改造的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，能够实现亚精胺的高效生产。
本发明提供了一种谷氨酸棒杆菌基因工程菌，该工程菌的构建方法包括：将精氨酸脱羧酶编码基因、胍基丁胺脱亚胺酶编码基因、亚精胺合成酶编码基因和鸟氨酸脱羧酶编码基因整合至谷氨酸棒杆菌中。
进一步，将所述精氨酸脱羧酶编码基因、胍基丁胺脱亚胺酶编码基因、亚精胺合成酶编码基因和鸟氨酸脱羧酶编码基因组成的基因片段整合到谷氨酸棒杆菌基因组的thrB基因位点上。
可选的，所述精氨酸脱羧酶编码基因、胍基丁胺脱亚胺酶编码基因、亚精胺合成酶编码基因来自大肠杆菌，所述鸟氨酸脱羧酶编码基因来自Escherichia coli MG1655、Shewanellaoneidensis MR-1、Staphylococcus lugdunensis HKU09-01或Pseudomonasaeruginosa PAO1。
更进一步地，本发明还敲除了谷氨酸棒杆菌基因组中编码DNA结合转录装调节因子的mcbR基因、编码羧酸胺连接酶的Ncgl2640基因，解除该两种阻遏蛋白对甲硫氨酸合成过程中的反馈抑制，同时，也敲除了谷氨酸棒杆菌中argR编码的DNA结合双转录调节因子，进而解除了对arg系列基因表达的抑制，提高了腐胺的合成。
更进一步地，本发明强化表达谷氨酸棒杆菌基因组中的编码N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸还原酶的argC基因、编码乙酰鸟氨酸氨基转移酶的argJ基因、编码N-乙酰谷氨酸激酶的argB和编码N-乙酰鸟氨酸5-氨基转移酶的argD基因；强化表达谷氨酸棒杆菌基因组中编码O-乙酰高丝氨酸硫水解酶的metY基因和编码甲硫氨酸合成酶的metE/metH基因。提高甲硫氨酸的合成。
更进一步地，本发明将转运蛋白MdtJI编码基因整合至谷氨酸棒杆菌基因组中。提高亚精胺转运至细胞外的能力。可选的，所述转运蛋白MdtJI编码基因来自大肠杆菌。
更进一步地，本发明强化表达谷氨酸棒杆菌基因组中编码甲硫氨酸腺苷基转移酶的metK基因；将编码S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的speD基因和血红蛋白基因vgb基因整合至谷氨酸棒杆菌基因组中并强化表达。可选的，所述编码S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的speD基因来自大肠杆菌。所述血红蛋白基因vgb基因来自透明颤菌。
更进一步地，本发明将编码谷氨酸-6-磷酸脱氢酶的zwf基因、编码6-磷酸果糖脱氢酶的gnd基因和编码丙酮酸羧化酶的pyc基因的负反馈突变体整合至谷氨酸棒杆菌中。解除相关抑制，增加了NADPH水平和三羧酸循环通量。
更进一步地，本发明强化表达谷氨酸棒杆菌基因组中编码谷氨酸脱氢酶的gdh基因。增加中间体谷氨酸的合成。
更进一步地，本发明弱化谷氨酸棒杆菌基因组中编码4-羟基-四氢二吡啶甲酸合成酶的dapA基因的表达，敲除了编码二氨基庚二酸酯脱羧酶的lysA基因。
更进一步，本发明敲除编码胱硫醚-γ-合成酶的metB基因。弱化了编码γ-谷氨酸激酶的proB基因的表达。敲除编码N-乙酰转移酶的snaA基因。
更进一步地，本发明还引入外源的合成亚精胺的途径，表达了外源羧基亚精胺脱氢酶基因、外源羧基亚精胺脱羧酶基因。可选的，所述羧基亚精胺脱氢酶编码基因来自Ruminococcuscallidus ATCC 27760、Porphyromonascatoniae ATCC 51270、Rhodobactersphaeroides ATCC BAA-808、Clostridium symbiosum ATCC 14940。所述羧基亚精胺脱羧酶编码基因来自Bacteroides cellulosilyticus DSM 14838、Clostridiumsymbiosum ATCC14940、Campylobacter jejuni subsp.jejuni ATCC 700819或Rhodobactersphaeroides ATCC BAA-808。
本发明提供的基因工程菌可以用于生产亚精胺，尤其是用于高密度培养生产亚精胺。
本发明的基因工程菌可以选择的宿主选自ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌MB001、谷氨酸棒杆菌AJ1511、谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌TQ2223或谷氨酸棒杆菌K051。
本发明的有益效果：
本发明基于合成生物学方法构建了一种以葡萄糖为原料高产亚精胺的谷氨酸棒杆菌，生产过程简单且原料易得成本低，具有良好的工业化应用前景。
本发明引入外源基因peA编码的精氨酸脱羧酶，speB编码的胍基丁胺脱亚胺酶、speE编码的亚精胺合成酶和speC编码的鸟氨酸脱羧酶的基础上，引入编码S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的speD基因，提高了羧基化S-腺苷甲硫氨酸的合成，进一步引进血红蛋白基因vgb基因，促进细胞的生长和蛋白质的表达，提高电子传递链的效率，增强ATP合成速率和有氧呼吸速率，能够在一定的程度上提高S-腺苷甲硫氨酸的合成。
本发明解除了反馈抑制和阻遏，如图1所示，甲硫氨酸的合成是从高丝氨酸开始的多级酶联反应，移除甲硫氨酸对metA编码的高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的抑制作用。mcbR，Ncgl2460和argR则分别为蛋氨酸(Met)和丁二胺(Put)途径的阻遏蛋白。本发明解除了甲硫氨酸，精氨酸和腐胺的反馈抑制。
本发明强化了关键酶的表达。speE基因编码的亚精胺合成酶，是Put和Dc-SAM缩合形成亚精胺(Spd)的关键酶，metK编码的蛋氨酸腺苷转移酶则是合成Dc-SAM的关键酶，精氨酸合成过程重要的基因簇argCJBD的过量表达提高精氨酸，鸟氨酸的合成。metY编码的O-乙酰高丝氨酸硫水解酶，将O-乙酰高丝氨酸在乙酸盐存在的情况下，将其转化为L-高半胱氨酸，进而在metE/metH编码的甲硫氨酸合成酶的作用下转化为L-甲硫氨酸，是S-腺苷甲硫氨酸合成的关键基因，强化该几种基因的表达，可以明显提高亚精胺的产量。
本发明还构建了多种反馈突变体，解除相应的反馈抑制。构建了编码谷氨酸-6-磷酸脱氢酶的zwf基因和6-磷酸果糖脱氢酶的gnd基因，丙酮酸羧化酶pyc基因的负反馈突变体。
本发明改善了亚精胺的转运途径，外源引入转运蛋白MdtJI，并强化其表达，可以提高亚精胺的产量。
本发明弱化了亚精胺过程的竞争途径，在亚精胺合成过程中的天冬半醛中间体有多个氨基酸生成的竞争途径，如Lys、Thr/Iso；谷氨酸中间体也存在竞争途径，如Pro的合成，并将腐胺的降解途径N-乙酰转移酶snaA基因进行敲除，将这几个途径弱化，可以提高亚精胺的产量。
本发明引入外源途径，在谷氨酸棒杆菌中，经过羧基化-S-腺苷甲硫氨酸和腐胺在亚精胺合成酶作用下合成亚精胺，羧基化-S-腺苷甲硫氨酸的合成途径较长。因此，引入了外源CASDH/CASDC合成途径，在谷氨酸棒杆菌中实现亚精胺的双途径合成，可以进一步提高亚精胺的产量。
附图说明
图1构建谷氨酸棒杆菌中合成亚精胺的代谢途径。
具体实施方式
除非有特殊说明，本发明所述的整合、敲除、强化基因表达/过表达、弱化基因表达等术语根据本领域常规认识理解或采取本领域的常规技术手段实现。例如，可以利用同源重组原理进行基因的整合表达，敲除基因时可以采用同源重组敲除方法或者Crispr/Cas9敲除方法，利用trc强启动子对相关基因强化表达。
需要解释说明的是，具有相应编码功能的基因均适用于本发明需要的特定功能基因，不限制其来源。例如，本发明所述的将精氨酸脱羧酶编码基因、胍基丁胺脱亚胺酶编码基因、亚精胺合成酶编码基因可来源于但不限于大肠杆菌、Arabidopsis thaliana、Pseudomonas aeruginosa PAO1或Salmonella enterica等菌。所述的鸟氨酸脱羧酶编码基因可来自但不限于Escherichia coli MG1655，Shewanellaoneidensis MR-1，Staphylococcus lugdunensis HKU09-01或Pseudomonas aeruginosa PAO1。所述转运蛋白MdtJI编码基因可来自但不限于大肠杆菌。编码S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的speD基因可来自但不限于大肠杆菌。所述血红蛋白基因vgb基因可来自但不限于透明颤菌。所述羧基亚精胺脱氢酶编码基因可来自但不限于Ruminococcuscallidus ATCC 27760、Porphyromonascatoniae ATCC 51270、Rhodobactersphaeroides ATCC BAA-808或Clostridium symbiosum ATCC 14940。所述羧基亚精胺脱羧酶编码基因可来自但不限于Bacteroides cellulosilyticus DSM 14838、Clostridium symbiosum ATCC 14940、Campylobacter jejuni subsp.jejuni ATCC 700819或Rhodobactersphaeroides ATCCBAA-808。
以下是发明人提供的具体实施例，需要说明的是，这些实施例及实施例间执行先后顺序是一种具体的实施方案，本发明的方案不限于各具体实施例的具体手段和组合方案，本领域技术人员在本发明所公开的整体构思及相关技术手段或技术特征基础上所进行的任意组合或/和等同替换得到的技术方案均属于本发明的公开内容。
1.以下实施例中所涉及的菌株及质粒
购自Novagen公司的pEC-XK99E穿梭质粒，pK18mobsacB穿梭质粒，以及Corynebacterium glutamicum ATCC 13032，Escherichia coli MG1655,CorynebacteriumglutamicumMB001、Corynebacterium glutamicumAJ1511、CorynebacteriumglutamicumATCC13869、Corynebacterium glutamicumTQ2223、Corynebacteriumglutamicum K051。
2.菌株培养
(1)谷氨酸棒杆菌种子培养基LBG(g/L)
10g NaCl，10g蛋白胨，5g酵母提取物，5g葡萄糖。
(2)谷氨酸棒杆菌感受态细胞生长培养基LBGT(g/L)
5g酵母提取物，10g蛋白胨，10g NaCl，30g甘氨酸，0.1％吐温80。
(3)谷氨酸棒杆菌发酵培养基(g/L)
100g葡萄糖，20g玉米浆，50g(NH4)2SO4、2.5gMgSO4·7H2O，1g KH2PO4、0.5gK2HPO4、0.5g Na2HPO4、20mg FeSO4·7H2O，20mg，MnSO4·4H2O，2g糖蜜，1mL吐温80和10gCaCO3。培养基装液量不超过摇瓶的2/3。必要的时候，添加30mg/L卡钠霉素。摇瓶发酵pH为7，温度控制30℃，发酵转速250r/min。
(4)CGXⅡ培养基20g(NH4)2SO4,5g尿素,1g KH2PO4,1g K2HPO4,0.25g ofMgSO4·7H2O,42g 3-吗啉代丙烷磺酸,10mg CaCl2,10mg FeSO4·7H2O,10mg MnSO4·H2O,1mg ZnSO4·7H2O,0.2mg CuSO4,0.02mg NiCl2·6H2O,0.2mg生物素(pH7),40g葡萄糖,0.03mg原儿茶酸.当需要的时候,添加卡钠霉素(50μg/ml)。
3.重组菌的诱导表达
从琼脂平板上接种重组谷氨酸棒杆菌到50mL LB种子培养物，并生长过夜。通过离心(4000rpm,10min)收集菌体，并利用缺少碳源的CGXⅡ基本培养基洗涤一次，随后，接种到50mL中含有20g/L葡萄糖，25μg/mL卡钠抗性，(100μg/mL氨苄抗性，)的CGXⅡ基本培养基中，培养至OD600到0.5，添加诱导剂IPTG至1mM，在20℃诱导24h后，4℃、8000rpm、20分钟离心收集上清。
4.亚精胺含量的测定
制备OPA衍生试剂：采用Uren法和Karababa(15)制备OPA试剂。0.20g OPA溶于9.0mL甲醇中，加入1.0mL浓度为0.40M(pH 9.0)的硼酸盐缓冲液和160μL 2-巯基乙醇(还原剂)。OPA试剂4℃保存。
亚精胺首先由邻苯二甲醛(OPA；Sigma，St.Louis，MO)衍生化。将50μL样品和450μL水加入400μl甲醇中。加入100μL OPA试剂后，将混合物通过0.2-μm滤膜过滤，并立即将20.0μL滤液注入HPLC仪器中。
HPLC检测条件：参考文献(Qian,Z.G.,X.X.Xia,and S.Y.Lee,Metabolicengineering of Escherichia coli for the production of putrescine:a fourcarbon diamine.BiotechnolBioeng,2009.104(4):p.651-662)中的方法对亚精胺进行检测：使用在25℃和0.8mL/min流动相下操作的Luna 5-μm C18(2)100A柱(250×4.6mm；Phenomenex)用于所有样品分离。流动相由溶剂A(在0.1M乙酸钠中的55％甲醇，pH7.2)和溶剂B(甲醇)组成。应用以下梯度：1-6分钟，100％A；6-10分钟，B的线性梯度从0％到30％；10-15分钟，B的线性梯度从30％到50％；15-19分钟，B的线性梯度从50％到100％；19-23分，100％B；23-25分钟，B的线性梯度从100％到30％；25-28分钟，B的线性梯度从30％到0％(均以体积％计)。
5.感受态细胞的制备
(1)挑取谷氨酸棒杆菌菌种划线接种到LBG平板培养基上，在30℃培养箱中培养30～48h；
(2)从平板上挑取单菌落接种到种子培养基培养12～24h，按照2％的接种量接种到LBGT培养基上，于30℃培养箱中培养一定时间，待OD600达到0.9左右，取菌液放入离心管中，冰浴15min；
(3)冰浴完后，4℃，4500rpm离心10min收集菌体，并用20mL预冷的10％甘油洗涤菌体四次，每次4500rpm离心5min收集菌体，洗涤完成后用500μL10％的无菌甘油重悬细胞，分装100μL于1.5mL离心管中，直接用于电转化或者于-80℃保存待用。
6.谷氨酸棒杆菌感受态细胞的转化
(1)在每管感受态细胞中加入2～4μL质粒，混匀，冰浴10min。
(2)将转化液移入预冷的电击杯中，2.5KV，电击4s，电击完毕后立即加入LBGT生长培养基中，轻柔地混合后吸出置于1.5mL离心管中，46℃水浴5min，后置于30℃摇床中培养1.5h。
(3)5000rpm/min离心1min，弃上清，留菌液约100～150μL，混匀涂布于含40μg/mL卡钠霉素的LBGT固体平板上，30℃培养36～48h。
7.酶切、连接、纯化、DNA提取等操作
(1)酶切反应体系：10×Q Cut Buffer 5μL，DNA 20μL，ddH2O 33μL，内切酶-1 1μL，内切酶-2 1μL，混匀，37℃水浴加热0.5～1h。
(2)连接反应体系：闪电克隆酶5μL，双酶切质粒(10-100ng)1-2μL，同源目的片段4-5μL，ddH2O补足至10μL，混匀，50℃水浴加热30min。
(3)PCR扩增目的基因反应体系(50μL)：DNA模板1μL，5×PrimeSTAR Buffer 10μL，dNTP Mixture 4μL，扩增引物1μL，扩增引物1μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5μL，ddH2O 32.5μL。PCR扩增程序：30循环(98℃10s，55℃10s，72℃1kb/min)，72℃10min，4℃保存。
(4)菌落PCR反应体系：2×Fastag PCR SuperMix 25μL，上游引物(浓度10μM)1μL，下游引物(浓度10μM)1μL，ddH2O补足至50μL，少量菌落或菌液做模板。PCR扩增程序：30循环(98℃10s，55℃10s，72℃4kb/min)，72℃10min，4℃保存。
8.Fast Mutagenesis System试剂盒构建突变体的步骤
(1)设计突变引物TB-F和TB-R；
(2)突变扩增PCR体系
TB-F 1μL，TB-R 1μL，质粒1-10ng，
Figure BDA0002515363210000071
FastPfu Fly PCR SuperMix 25μL，ddH2O补足至50μL。
94℃2-5min，20-25循环(94℃，20s；55℃，20s；72℃，2-6kb/min)72℃，10min。
(3)电泳检测目标产物；
(4)PCR产物的消化；
加入1ΜlDMT酶于PCR产物中，混匀，37℃孵育1h；
(5)转化感受态细胞
①加入2-5μLDMT酶消化产物于50μL感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴29-30min；
②42℃水浴热激45s，立即置于冰上2min；
③加入250μL平衡至室温的LB培养基，200rpm/min，37℃培养1h；
④取100-200μL菌液均匀涂布在含有抗性的平板上，在37℃培养箱中培养过夜。
实施例1：外源整合传统亚精胺合成相关基因
在谷氨酸棒杆菌中，除一些必要氨基酸的合成以外，也具有合成一些多胺类的物质的相关基因，能够合成腐胺和其它多胺物质，但是该菌的多胺代谢还未进行仔细研究，为此，该实施例以Corynebacterium glutamicum ATCC 13032为野生菌，在其产生谷氨酸，鸟氨酸，精氨酸，甲硫氨酸等多种氨基酸的基础上，外源整合合成腐胺和亚精胺的相关基因，构建多胺类合成菌株。
作为亚精胺合成过程中需要的一个重要底物腐胺，在谷氨酸棒杆菌中因缺乏相关的基因，是无法合成的，因此，本发明需要构建一个调代谢通路来合成腐胺。
本实施例选取大肠杆菌为功能基因来源，在大肠杆菌等多种细菌中，存在腐胺合成的相关基因，其中，大肠杆菌中存在两种途径合成腐胺，一种是直接合成腐胺途径，由鸟氨酸脱羧酶对鸟氨酸进行脱羧直接产生腐胺，该酶由两种基因编码，分别是speC和speF基因；另一种途径是间接合成腐胺途径，鸟氨酸经过argF编码的鸟氨酸氨基甲酰基转移酶，argG编码的精氨琥珀酸合成酶，argH编码的精氨琥珀酸裂解酶合成精氨酸，随后精氨酸经过speA编码的精氨酸脱羧酶，speB编码的胍基丁胺脱亚胺酶一系列脱羧和脱氨作用最终合成腐胺。
在谷氨酸棒杆菌中，对于从精氨酸合成腐胺的代谢途径，该实施例引入来自大肠杆菌的精氨酸脱羧ecspea，胍基丁胺脲素水解酶ecspeb，亚精胺合成酶ecspee基因整合到谷氨酸棒杆菌基因组中，其氨基酸序列在NCBI上accession NO分别为AYG18092.1，AYG18093.1，AYG20721.1，构建从精氨酸到腐胺的合成路线；
同时，分别从Escherichia coli MG1655、Shewanellaoneidensis MR-1、Staphylococcus lugdunensis HKU09-01、Pseudomonas aeruginosa PAO1中克隆得到编码鸟氨酸脱羧酶的基因ecspec，sospec，slspec，paspec，各自的氨基酸序列在NCBI上accession NO分别为AYG18065.1，AAN57109.1，ADC86394.1，AAG07907.1，使鸟氨酸经过一步脱羧直接合成腐胺；
同时，该实施例引入来自大肠杆菌MG1655中编码亚精胺合成酶的基因speE，使合成的腐胺以及羧基化S-腺苷甲硫氨酸在亚精胺合成酶的作用下合成亚精胺。
具体实施过程如下：
首先将来自不同菌株的精氨酸脱羧酶，胍基丁胺脲水解酶，鸟氨酸脱羧酶，亚精胺合成酶四个目的基因，利用同源重组的方式，分别连接到穿梭质粒pEC-XK99E的多克隆位点上，得到强化表达的谷氨酸棒杆菌，其基因的组合分别为pEC-ecspea-ecspeb-ecspee-ecspec,pEC-ecspea-ecspeb-ecspee-sospec,pEC-ecspea-ecspeb-ecspee-slspec,pEC-ecspea-ecspeb-ecspee-paspec。将得到的重组菌进行诱导表达，诱导表达方法按照上述步骤进行。利用HPLC检测上清液中亚精胺浓度。检测情况如下图所示：
表1
重组菌 亚精胺(g/L)
pEC-ecspea-ecspeb-ecspee-esspec 0.83
pEC-ecspea-ecspeb-ecspee-sospec 0.56
pEC-ecspea-ecspeb-ecspee-slspec 0.48
pEC-ecspea-ecspeb-ecspee-paspec 0.31
根据发酵实验验证结果，寻求生产亚精胺较高的菌株，例如，基因组合为pEC-ecspea-ecspeb-ecspee-esspec，在发酵的过程中，可通过添加抗生素来维持质粒的稳定性，以及采用IPTG进行诱导表达。因此，本发明将组合最好的基因整合到Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032的基因组上。
进一步，在羧基化S-腺苷甲硫氨酸合成的过程中，存在多条分支途径，分流了流向目的产物的代谢通量。由thrB基因编码的高丝氨酸激酶，将合成途径中重要中间体高丝氨酸转化为O-磷酸-L-高丝氨酸，并在相应的酶的作用下进一步合成苏氨酸，苏氨酸合成量的增加，会进一步抑制代谢途径中hom基因编码的高丝氨酸脱氢酶和lysC基因编码的天冬氨酸激酶的活性，使其受到反馈抑制，减少产物甲硫氨酸和羧基化S-腺苷甲硫氨酸的合成。因此，为了减少分支代谢流的分布以及反馈抑制，thrB基因在本发明中被敲除使其失去编码功能。为了同时达到目的基因整合到染色体上和目标基因的删除，进一步，该实施例将上述基因片段ecspea-ecspeb-ecspee-esspec整合到谷氨酸棒杆菌thrB基因位点上。
以谷氨酸棒杆菌基因组DNA为模板，通过PCR反应，利用引物thrB-F和thrB-R得到thrB基因片段，经纯化后与通过EcoRⅠ和SalⅠ双酶切之后的质粒pK18mobsacB进行连接，获得重组质粒pK18mobsacB-thrB。从重组谷氨酸棒杆菌中提取质粒pEC-ecspea-ecspeb-ecspee-esspec，以该质粒为模板，以DG-F和DG-R为引物扩增trc-ecspea-ecspeb-ecspee-esspec多基因片段。利用PspFI和SspI双酶酶切重组质粒pK18mobsacB-thrB，经纯化后和PCR产物片段trc-ecspea-ecspeb-ecspee-esspec连接，形成重组质粒pK18mobsacB-BF-trc-abec-BR。通过电转化将重组质粒pK18mobsacB-BF-trc-abec-BR转化至谷氨酸棒杆菌ATCC13023菌感受态中。在含有25g/mL卡那霉素的LB平板上筛选已经产生第一次重组的卡那霉素抗性克隆。挑选转化子接种到LB培养基中，30℃振荡过夜培养后涂布于含10％蔗糖的LB平板上，筛选已经产生第二次重组的克隆体。将转化子分别接种到含有25g/mL卡那霉素的平板和10％蔗糖的平板上，验证转化子的卡那霉素和蔗糖抗性。其中，具有蔗糖抗性，且对卡那霉素敏感的克隆菌株即为整合成功的菌株，也有可是能回复突变的菌株，因此需要提取基因组DNA，进行PCR验证，进一步确定整合的正确性。该将整合了外源基因trc-ecspea-ecspeb-ecspee-esspec的重组谷氨酸棒杆菌命名为SPD01，并以此作为出发菌株，进行后面的相关研究。其中，引物设计如下：
表2
Figure BDA0002515363210000091
Figure BDA0002515363210000101
将SPD01菌株在摇瓶发酵培养基中进行发酵，利用HPLC检测发酵液中亚精胺生产情况，测得摇瓶上清液中亚精胺浓度为1.02g/L，比以质粒进行表达的谷氨酸棒杆菌产量(0.83g/L)稍有提高。
实施例2：解除阻遏蛋白对途径中启动子的抑制以及重要酶的反馈抑制
进一步，羧基化S-腺苷甲硫氨酸作为亚精胺合成过程中重要的前体物质，其合成过程中存在阻遏蛋白抑制前体物质的合成。其中，编码DNA结合转录装调节因子的mcbR基因、编码羧酸胺连接酶的Ncgl2640基因作为羧基化S-腺苷甲硫氨酸合成过程中的阻遏蛋白，抑制met系列基因的表达，最终抑制甲硫氨酸以及羧基化S-腺苷甲硫氨酸的过量合成。作为另一种重要中间体物质，腐胺的合成过程中也受到相关阻遏蛋白的抑制。argR基因编码的DNA结合双转录调节因子，抑制arg系列基因的表达，进而抑制所需重要中间体鸟氨酸和精氨酸的过量合成，减少腐胺的合成。因此，在亚精胺合成基础菌株(例如上述实施例得到的SPD01)基础上，本发明进一步将编码抑制因子的mcbR基因和Ncgl2640基因，以及argR基因进行敲除，进而缓解羧基化S-腺苷甲硫氨酸以及腐胺合成过程中受到的抑制，得到工程菌SPD01△mcbR△Ncgl2640△argR，可将其命名为SPD02。
该实施例的具体过程如下：
(1)mcbR敲除菌株的构建
采用重叠PCR的方法构建用于基因敲除的质粒。以谷氨酸棒杆菌基因组DNA为模板，通过PCR反应，以mcbR-1和mcbR-2为引物扩增mcbR基因上游225bp片段，其中，mcbR-1带有BamHⅠ酶切位点，以mcbR-3和mcbR-4为引物扩增mcbR基因下游226bp片段，其中，mcbR-4带有SalⅠ酶切位点，并且引物mcbR-2和mcbR-3有20bp左右的互补序列。将两段PCR产物胶回收，等量混合后作为模板，以引物mcbR-1和mcbR-4进行第二轮PCR，因其两个片段具有20bp左右的互补序列，从而使上游PCR产物和下游PCR产物形成重叠链，将上下游PCR产物拼接起来，得到501bp大小的产物。得到的PCR产物与通过BamHⅠ和SalⅠ双酶切之后的质粒pK18mobsacB进行连接，获得重组质粒pK18mobsacB-mcbR。
使用构建的敲除质粒pK18mobsacB-mcbR进行mcbR基因的敲除。通过电转化将敲除质粒pK18mobsacB-mcbR转入谷氨酸棒杆菌ATCC13023菌感受态中。在含有25g/mL卡那霉素的LB平板上筛选已经产生第一次重组的卡那霉素抗性克隆。挑选转化子接种到LB培养基中，30℃振荡过夜培养后涂布于含10％蔗糖的LB平板上，筛选已经产生第二次重组的克隆体。将转化子分别接种到含有25g/mL卡那霉素的平板和10％蔗糖的平板上，验证转化子的卡那霉素和蔗糖抗性。其中，具有蔗糖抗性，且对卡那霉素敏感的克隆即为发生了敲除的克隆，并通过PCR进行验证，并提取基因，去测序验证其正确性。其中，引物设计如下：
表3
引物名称 引物序列5’-3’
mcbR-1 TCTAGAGGATCCGTGGCTGCTAGCGCTTCA
mcbR-2 CAACTGCTCTAAGCAGTAACAGGTATGCAATAACCAAGG
mcbR-3 TTTACTGCTTAGAGCAGTTGGTTGCAGCAGTGTTAGAGCA
mcbR-4 CTGCAGGTCGACCTAAATTGAGTAGTCCGCAG
(2)Ncgl2640敲除菌株的构建
该基因的敲除也是利用重叠PCR的方法，其具体步骤如(1)mcbR基因的敲除步骤。其中，引物设计如下：
表4
引物名称 引物序列5’-3’
Ncgl-1 TCTAGAGGATCATGGGCATTGAGTTTAAGCG
Ncgl-2 CAACTGCTCTAAGCAGTAATGGGTGGGATCCAGAGGTCC
Ncgl-3 TTTACTGCTTAGAGCAGTTGCAATGGCACGTTTCGGAAAA
Ncgl-4 CTGCAGGTCGACTTAGTCCAGTGCTTTGAGGT
(3)argR敲除菌株的构建
该基因的敲除也是利用重叠PCR的方法，其具体步骤如(1)mcbR基因的敲除步骤。其中，引物设计如下：
表5
引物名称 引物序列5’-3’
argR-1 TCTAGAGGATCGTGACTCGCACTGCACGC
argR-2 CAACTGCTCTAAGCAGTAACTGGGCCGACCGCGTAGT
argR-3 TTTACTGCTTAGAGCAGTTGTTTCTACAGATCATTCCG
argR-4 CTGCAGGTCGACTTAAGTGGTGCGCCCGCT
对得到的重组菌SPD02进行摇瓶发酵，利用HPLC检测发酵液中亚精胺生产情况，测得摇瓶上清液中亚精胺浓度为2.57g/L。
实施例3：强化表达途径中的关键酶
更进一步，argC编码的N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸还原酶，argJ编码的乙酰鸟氨酸氨基转移酶，argB编码的N-乙酰谷氨酸激酶，argD编码的N-乙酰鸟氨酸5-氨基转移酶共同组成的基因簇负责鸟氨酸的合成，其中，乙酰鸟氨酸氨基转移酶受到鸟氨酸的反馈抑制，N-乙酰谷氨酸激酶受到精氨酸的反馈抑制，提高鸟氨酸的合成可进一步提高重要中间体腐胺的合成，因此，本发明利用强启动子trc替换基因簇argCJBD天然启动子，解除相关基因受到的反馈抑制，并增强其表达量，提高鸟氨酸合成通量。
在甲硫氨酸的合成过程中，lysC编码的天冬氨酸激酶受到赖氨酸的抑制，尽管后面本发明减轻了来的合成，但是为了提高其活性，相关研究曾报道，存在天冬氨酸激酶突变体C932T，能够解除合成过程中的反馈调节，同时，metY编码的O-乙酰高丝氨酸硫水解酶，将O-乙酰高丝氨酸在乙酸盐存在的情况下，将其转化为L-高半胱氨酸，进而在metE/metH编码的甲硫氨酸合成酶的作用下转化为L-甲硫氨酸。因此在改造过程中，本发明过表达了metY，metE/metH。
该实施例的具体实施方法如下：
以argC-1，argC-2，和argC-3，argC-4为引物，从谷氨酸棒杆菌中克隆目的基因片段argC片段，并分别连接到经过双酶EcoRI和BamHI双酶切的质粒pEC-XK99E质粒上和经过BamHⅠ和SalⅠ双酶切之后的pK18mobsacB，构建重组质粒pEC-XK99E-argC和整合质粒pK18mobsacB-argC。以trc-argC-F和trc-argC-R为引物，以重组质粒pEC-XK99E-argC为模板，扩增目的基因trc-argC片段，得到的目的片段，连接到整合质粒pK18mobsacB-argC的BsmI和SgrAI酶切位点之间，构建新的整合质粒pK18mobsacB-argC-trc-argC。按照实施例1所述的方法，将整合质粒pK18mobsacB-argC-trc-argC转入谷氨酸棒杆菌感受态细胞SPD02中，利用同源重组的原理，将重组质粒中带有trc强启动子的argC基因替换原有的argC基因，整合进入trc强启动子，强化操纵子argCJBD的表达。构建了强化表达的菌株SPD02-Ptrc:argC、J、B、D。
利用Fast Mutagenesis System试剂盒对lysC基因的突变体的构建。以lysC-F和lysC-R为引物，以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，扩增出目的基因连接到穿梭质粒pEC-XK99E上，构建突变质粒pEC-XK99E-lysC，以突变引物lysC-TF和lysC-TR为引物，以突变质粒pEC-XK99E-lysC为模板，进行扩增，通过突变体构建的方法将突变的质粒转入到SPD02-Ptrc:argCJBD感受态细胞中，并筛选出正确的重组体SPD02-Ptrc:argCJBD-lysCfbr。
按照实施例1所述的方法，将metY和metE/metH基因的启动子替换为trc强启动子。先将目的基因连接到穿梭质粒pEC-XK99E上，构建质粒pEC-XK99E-metY-metE-metH，然后扩增目的片段trc-metY-metE-metH，将该质粒连接到整合质粒pK18mobsacB-metY的同源臂之间，构建新的整合质粒pK18mobsacB-F-trc-metY-metE-metH-R，转入到感受态细胞SPD02-Ptrc:argCJBD-lysCfbr中，通过同源重组的方式，目的片段trc-metY-metE-metH将整合进入基因组原始的metY基因上，达到同时强化该三个基因表达的目的。构建了新的菌株SPD02-Ptrc:argCJBD-lysCfbr-Ptrc:metYEH，本发明将此菌株命名为SPD03。
表6
引物名称 引物序列5’-3’
argC-1 ACCATGGAATTCATGATCATGCATAACGTG
argC-2 TCTAGAGGATCCTTAAGGTGCGACGCCGAC
argC-3 TCTAGAGGATCCATGATCATGCATAACGTG
argC-4 GACGTCGTCGACTTAAGGTGCGACGCCGAC
trc-argC-F ACCAGGGAACATGGCCTTATGGCATttgacaattaatcatccg
trc-argC-R AGCTTCACCCCAGTGCTTGCACCGT
lysC-F GAATTCGTGGCCCTGGTCGTACAG
lysC-R GGATCCTTAGCGTCCGGTGCCTGC
lysC-TF CACCACCGACATCATCTTCACCTG
lysC-TB ATGATGTCGGTGGTGCCGTCTTCTA
对得到的重组菌SPD02-Ptrc:argCJBD，SPD02-Ptrc:argCJBD-lysCfbr，SPD03进行摇瓶发酵，利用HPLC检测发酵液中亚精胺生产情况，测得摇瓶上清液中亚精胺浓度分别为2.97g/L，3.32g/L，3.68g/L。
实施例4：改善转运途径
更进一步，在谷氨酸棒杆菌中，还没有确定出对亚精胺输出起决定作用的相关蛋白，因此，为了使得细胞质中合成的亚精胺较快的转出到细胞外，减少过量合成亚精胺对其造成的影响，本发明整合了来自大肠杆菌中表征较好的亚精胺转运蛋白MdtJI，增加亚精胺转出至胞外的含量。
其整合方案如同实施例1所述。先从大肠杆菌中克隆目的基因簇mdtJI，将其连接到穿梭质粒pEC-XK99E上，构建质粒pEC-XK99E-mdtJI上；
然后以质粒pEC-XK99E-mdtJI为模板，扩增带有强启动子的目的片段trc-mdtJI，将该片段连接到质粒pK18mobsacB上，构建整合质粒pK18mobsacB-trc-mdtJI；
将整合质粒pK18mobsacB-trc-mdtJI转入到谷氨酸棒杆菌感受态细胞SPD03中，通过同源重组的原理，将目的基因片段trc-mdtJI整合到基因组上，构建菌株SPD03-mdtJI，将其命名为SPD04。
对得到的重组菌SPD04进行摇瓶发酵，利用HPLC检测发酵液中亚精胺生产情况，测得摇瓶上清液中亚精胺浓度分别为4.24g/L，转运蛋白的转入，明显提高了谷氨酸棒杆菌产生亚精胺的能力，将更多的胞内亚精胺转运至胞外。
表7
引物名称 引物序列5’-3’
MdtJI-F GAATTCATGTATATTTATTGGATTTT
MdtJI-R AAGCTTTCAGGCAAGTTTCACCATGA
Trc-MdtJI-F ACCAGGGAACATGGCCTTATGGCATttgacaattaatcatccg
Trc-MdtJI-R AGCTTCACCCCAGTGCTTGCACCGT
实施例5：增加前体供应
(1)羧基S-腺苷甲硫氨酸的增加
更进一步，为了更多的合成羧基化S-腺苷甲硫氨酸，使其于腐胺合成更多的亚精胺，因此，本发明过表达了metK(NCgl1541)基因编码的甲硫氨酸腺苷基转移酶，促使更多的甲硫氨酸转化为S-腺苷甲硫氨酸。据有关研究报道，当在谷氨酸棒杆菌中过表达来自透明颤菌中的血红蛋白基因vgb基因时，因其对氧供应减少具有影响，促进细胞的生长和蛋白质的表达，提高电子传递链的效率，增强ATP合成速率和有氧呼吸速率，能够在一定的程度上提高S-腺苷甲硫氨酸的合成。同时，过表达来自大肠杆菌中speD编码的S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶，将合成过量的S-腺苷甲硫氨酸转化为羧基化S-腺苷甲硫氨酸，进而和腐胺相互反应合成亚精胺。
该实施例的具体实施方式为：
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株为模板，metK-F和metK-R为引物，扩增metK-F片段，以质粒pDXW-8-vgb为模板，vgb-F和vgb-R为引物，扩增vgb片段，以大肠杆菌MG1655菌株为模板，speD-F和speD-R为引物，扩增speD片段，该三个片段之间存在20bp左右的同源臂，利用同源重组的方式，连接到穿梭质粒pEC-XK99E的EcoRI和SalI酶切位点之间，构建质粒pEC-metK-vgb-speD；
以构建的质粒pEC-metK-vgb-speD为模板，以trc-F和speD-R为引物，扩增目的基因trc-metK-vgb-speD片段；
将克隆的片段，连接到经过PspFI和SspI双酶酶切重组质粒pK18mobsacB上，构建整合质粒pK18mobsacB-trc-metK-vgb-speD；将该质粒电转化到谷氨酸重组菌SPD04中，通过同源重组的方式，目的基因片段trc-metK-vgb-speD整合到谷氨酸棒杆菌中，并以启动子trc该串联基因的表达，构建新的菌株SPD04-Ptrc:KBD。引物设计如下：
表8
引物名称 引物序列5’-3’
metK-F ACCATGGAATTCGTGGCTCAGCCAACCGCC
metK-R CAACTGCTCTAAGCAGTAAATTAGGCCAACTTGAGGGC
vgb-F TTTACTGCTTAGAGCAGTTGAGAAGGAGATATATCATGTTAGACCAGCAAACCATTA
vgb-R CGATAGACTAATGGGGCCGTACCTTATTCAACCGCTTGAGC
speD-F GTACGGCCCCATTAGTCTATCGTTGAAAAAACTGAAACTGCA
speD-R CTGCAGGTCGACTTAAACAGCTGGCATATT
trc-F CGTGAAGCTAGCttgacaattaatcatccg
trc-R tcgacctgcaggTTAAACAGCTGGCATATT
对得到的重组菌SPD04-Ptrc:KBD进行摇瓶发酵，利用HPLC检测发酵液中亚精胺生产情况，测得摇瓶上清液中亚精胺浓度为4.57g/L。
(2)NADPH水平的增加
还有，NADPH的水平是影响氨基酸和多胺物质合成过程中的关键因素。NADPH主要是通过磷酸戊糖途径中的zwf编码的谷氨酸-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)和gnd编码的6-磷酸果糖脱氢酶(6PGDH)的作用所产生，然而，G6PDH的活性受到磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)，ATP，以及果糖1，6-二磷酸的抑制，但是有研究报道，其活性位点727位上碱基G突变为A时，能解除反馈抑制；6PGDH能够被果糖1，6-二磷酸所抑制，但是研究报道其突变体T1083C能够解除抑制，因此，本发明外源引入该两个突变体，解除相应的反馈抑制，增加NADPH合成水平。
该实施例的具体实施方式如下：
按照实施例3所述的方法，构建对G6PDH和6PGDH解除反馈抑制的抗性菌株。首先，以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，克隆得到目的基因zwf和gnd，分别连接到穿梭质粒pEC-XK99E上，分别构建突变质粒pEC-XK99E-zwf和pEC-XK99E-gnd，然后利用突变体试剂盒以及突变体引物进行扩增，构建抗性突变体，pEC-XK99E-zwffbr和pEC-XK99E-gndfbr。然后按照实施例1所述的方法，将构建好的抗性突变体基因trc-zwffbr-gndfbr片段，转到整合质粒pK18mobsacB上，将该整合质粒转到谷氨酸棒杆菌SPD04-Ptrc:KBD感受态细胞中，通过同源重组的方式，整合到谷氨酸棒杆菌基因组上，构建重组菌株SPD04-Ptrc:KBD-zwffbr-gndfbr，并以强启动子trc启动。其引物设计如下：
表9
引物名称 引物序列5’-3’
Zwf-F GAATTCGTGAGCACAAACACGACCCC
Zwf-R GGATCCTTATGGCCTGCGCCAGGTGT
Gnd-F GAATTCATGACTAATGGAGATAATCT
Gnd-R GGATCCTTAAGCTTCAACCTCGGAGC
Zwf-TF GTCCAGATCACCATGACTGAAGATA
Zwf-TR TCATGGTGATCTGGACGTGGTCAAC
Gnd-TF CAACTGGGACGTTGATCCTCGCGAC
Gnd-TR ATCAACGTCCCAGTTGTTCTCGTCG
对得到的重组菌SPD04-Ptrc:KBD-zwffbr-gndfbr进行摇瓶发酵，利用HPLC检测发酵液中亚精胺生产情况，测得摇瓶上清液中亚精胺浓度为4.96g/L。
(3)强化三羧酸循环途径
还有，pyc基因编码的丙酮酸羧化酶PCx，是产生草酰乙酸的关键酶，而草酰乙酸，在aspC编码的天冬氨酸转氨酶的作用下转化为天冬氨酸，使合成代谢方向转向羧基S-腺苷甲硫氨酸，然而，在代谢过程中，PCx受到天冬氨酸的抑制，但是相关研究报道，编码基因中pyc的突变体C1372T能够解除反馈抑制，增加代谢通量。
该实施例的具体实施方式如下：
按照实施例3所述的方法，构建对pyc基因解除反馈抑制的抗性突变体。首先，以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，克隆得到目的基因pyc，利用突变引物和突变试剂盒对其进行定点突变，得到解除反馈抑制的抗性突变体pycfbr，通过同源重组的方式，将其整合进入谷氨酸棒杆菌中，构建新的菌株SPD04-Ptrc:KBD-zwffbr-gndfbr-pycfbr。其引物设计如下：
表10
Figure BDA0002515363210000161
Figure BDA0002515363210000171
对得到的重组菌SPD04-Ptrc:KBD-zwffbr-gndfbr-pycfbr进行摇瓶发酵，利用HPLC检测发酵液中亚精胺生产情况，测得摇瓶上清液中亚精胺浓度为5.14g/L。
(4)增加谷氨酸代谢通量
在腐胺合成的过程中，由谷氨酸经过一系列的代谢合成所形成，因此，为了得到更多的腐胺，本发明强化表达了gdh编码的谷氨酸脱氢酶，使α-酮戊二酸更多的转化为谷氨酸，进而增加腐胺的代谢通量。
具体实施方法如下：
按照实施例3所述的方法，利用强启动trc替换gdh基因原始的启动子，强化其表达。构建新的强化表达菌株SPD04-Ptrc:KBD-zwffbr-gndfbr-PCxfbr-Ptrc:G，本发明将其命名为SPD05。引物设计如下：
表11
引物名称 引物序列5’-3’
Gdh-F GAATTCATGACAGTTGATGAGCAGGT
Gdh-R GAATTCTTAGATGACGCCCTGTGCCA
Trc-gdh-F CCGGCGTTTTGACCGGTAAGttgacaattaatcatccg
Trc-gdh-R ATCGCGTAGGTTGCTACGTTGCCGG
对得到的重组菌SPD05进行摇瓶发酵，利用HPLC检测发酵液中亚精胺生产情况，测得摇瓶上清液中亚精胺浓度为5.38g/L。
实施例6：弱化竞争途径
(1)Lys竞争途径
更进一步，在重要的底物羧基S-腺苷甲硫氨酸合成的过程中，天冬氨酸半醛是重要的分流节点物质，不仅能够流向合成羧基S-腺苷甲硫氨酸的方向，还可在dapA基因编码的4-羟基-四氢二吡啶甲酸合成酶的作用下转化为二吡啶甲酸，经过一系列的二吡啶甲酸相关酶的作用下转化为二氨基庚二酸酯，最后在lysA编码的二氨基庚二酸酯脱羧酶的作用下脱羧形成赖氨酸。因此，在羧基S-腺苷甲硫氨酸合成的过程中，为了减少分支代谢的负担，本发明将编码4-羟基-四氢二吡啶甲酸合成酶基因dapA的起始密码子ATG替换为弱表达的起始密码子UUG，然后敲除编码二氨基庚二酸酯脱羧酶的lysA基因，减少赖氨酸分支代谢。
该实施例的具体实施方式如下：
起始密码子的替换原理如同定点突变的原理，按照定点突变的方式可见ATG替换为UUG，因此其操作步骤同实施例3所述。将替换好起始密码子的基因T-dapA整合进入lysA基因位点上，其整合方式如同实施例1所述的方法，构建新的菌株SPD05-△lysA-PUUG:dapA。相关的引物设计如下：
表12
引物名称 引物序列5’-3’
Dap-F GAATTCATGAGCACAGGTTTAACAGC
Dap-R GAATTCTTATAGAACTCCAGCTTTTT
Dap-TF cagaccatggaattcTTGAGCAC
Dap-TR AAgaattccatggtctg
Dap-ZHF ACGATATCGATGCGGATTAATTGAGCACAGGTTTAACAGC
Dap-ZHR TTATAGAACTCCAGCTTTTTGGAGCTACTCTAGGCGCAACTCGTG
lysA-F GAATTCTTGGAACCCTGGGCGGAAAA
LysA-R GAATTCTTAATCCGCATCGATATCGT
对得到的重组菌SPD05-△lysA-PTTG:dapA进行摇瓶发酵，利用HPLC检测发酵液中亚精胺生产情况，测得摇瓶上清液中亚精胺浓度为5.57g/L。
(2)Iso竞争途径
更进一步，在谷氨酸棒杆菌中，L-高丝氨酸经过thrB基因编码的高丝氨酸激酶作用进一步转化为苏氨酸，再经由一系列的基因编码的酶转化为异亮氨酸，除此以外，甲硫氨酸合成途径中的O-乙酰高丝氨酸和L-高半胱氨酸，在metB编码的胱硫醚-γ-合成酶作用下转化为高硫氨酸，并进一步合成异亮氨酸。在上述实施例1中，本发明将thrB基因已经敲除，提高了终产物亚精胺的合成，因此，本发明进一步敲除编码胱硫醚-γ-合成酶的metB基因，阻止异亮氨酸的合成。
该实施例的具体实施方式如下：
其敲除方法按照实施例2所述方法进行。以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，克隆得到目的基因的部分基因到穿梭质粒pK18mobsacB上，构建敲除质粒pK18mobsacB-metBF-metBR，将得到的质粒转化进入感受态细胞SPD05-△lysA-PUUG:dapA中，构建敲除菌株SPD05-△lysA-PUUG:dapA-△metB。其引物设计如下：
表13
Figure BDA0002515363210000181
Figure BDA0002515363210000191
对得到的重组菌SPD05-△lysA-PTTG:dapA-△metB进行摇瓶发酵，利用HPLC检测发酵液中亚精胺生产情况，测得摇瓶上清液中亚精胺浓度为5.82g/L。
(3)Pro竞争途径
更进一步，为了减少谷氨酸流向脯氨酸的代谢通量，本发明将编码γ-谷氨酸激酶的proB基因进行改造，删除该基因将会导致谷氨酸棒杆菌生长缓慢，易造成影响缺陷菌株，因此，本发明将弱化该基因的表达，将其起始密码子改为稀有密码子GTG或者TTG，进而减少谷氨酸流向脯氨酸的合成，促进鸟氨酸以及腐胺的大量合成。
该实施例的具体实施方式为：
将proB基因的密码子ATG突变为TTG，即为定点突变，按照实施例3所述的定点突变的方法进行改造。得到弱化proB基因表达的菌株SPD05-△lysA-PTTG:dapA-△metB-PTTG:proB。其中，引物设计如下：
表14
引物名称 引物序列5’-3’
proB-F GAATTCATGCGTGAGCGCATCTCCAA
proB-R GAATTCTTACGCGCGGCTGGCGTAGT
proB-TF cagaccatggaattcTTGCGT
proB-TR Agaattccatggtctg
对得到的重组菌SPD05-△lysA-PTTG:dapA-△metB-PTTG:proB进行摇瓶发酵，利用HPLC检测发酵液中亚精胺生产情况，测得摇瓶上清液中亚精胺浓度为6.05g/L。
(4)腐胺降解途径
还有，在谷氨酸棒杆菌中存在一种N-乙酰转移酶，由snaA(cg1722)基因所编码，催化腐胺乙酰化，增加了腐胺的其他代谢流，因此，本发明将删除该基因，减少乙酰化腐胺的积累，增加腐胺的产量.
该实施例的具体实施方式为：
对于snaA基因的敲除，其方法按照实施例2所述的方法进行，最后得到敲除的菌株SPD05-△lysA-PTTG:dapA-△metB-PTTG:proB-△sanA，将得到的菌株命名为SPD05。其引物设计如下：
表15
Figure BDA0002515363210000201
对得到的重组菌SPD06进行摇瓶发酵，利用HPLC检测发酵液中亚精胺生产情况，测得摇瓶上清液中亚精胺浓度为6.48g/L。
实施例7：双途径合成亚精胺
更进一步，天冬氨酸半醛是细胞内的重要中间代谢产物，是甲硫氨酸和脱羧S-腺苷甲硫氨酸合成的直接前体物质，也是亚精胺合成的重要前体物质。从天冬氨酸半醛到脱羧S-腺苷甲硫氨酸合成的代谢途径中复杂多变，代谢途径较长，且涉及多种氨基酸中间体的代谢，对其代谢途径进行过度改造后，容易影响菌体的生长。
基于上述原因，本发明将来自不同微生物菌株中的CASDH/CASDC途径引入到谷氨酸棒杆菌中进行异源表达。CASDH编码的羧基化亚精胺脱氢酶将直接利用天冬氨酸半醛和腐胺作为直接前体物质合成羧基化亚精胺，而后在CASDC编码的羧基化亚精胺脱羧酶作用下直接脱羧合成亚精胺，该代谢途径只包含两个基因，在很大程度上缩短代谢途径，减少代谢流的分散，更大程度的合成亚精胺。panD编码的L-天冬氨酸脱羧酶将天冬氨酸脱羧转化为β-丙氨酸，为了减少该代谢途径，增加天冬氨酸流向甲硫氨酸的代谢途径，本发明将CASDH/CASDC基因整合到该位点上，同时替换敲除该基因。具体根据实施例1采用的同源重组方式，外源整合CASDH/CASDC途径。
该实施例的具体过程如下：
利用扩增引物从Ruminococcuscallidus ATCC 27760、PorphyromonascatoniaeATCC 51270、Rhodobactersphaeroides ATCC BAA-808、Clostridium symbiosum ATCC14940的基因组中克隆得到羧基亚精胺脱氢酶基因rccsdh、pccsdh、rscsdh、cscsdh。氨基酸序列在NCBI上accession NO为ERJ96771.1、EWC93538.1、YP_351518.1、ERI79986.1。
从Bacteroides cellulosilyticus DSM 14838、Clostridium symbiosum ATCC14940、Campylobacter jejuni subsp.jejuni ATCC 700819、RhodobactersphaeroidesATCC BAA-808的基因组中克隆得到羧基亚精胺脱羧酶基因bccsdc、cscsdc、cjcsdc、rscsdc，氨基酸序列在NCBI中的编号分别是EEF87925.1、ERI79985.1、YP_002344893.1、YP_351517.1。
将克隆得到的两种基因分别连接到pEX-99a质粒上，转化至谷氨酸棒杆菌SPD06感受态细胞中，即可得到强化表达2个基因的重组谷氨酸棒杆菌。
将重组谷氨酸棒杆菌按体积比为2％的量转接到谷氨酸棒杆菌发酵培养基中，从琼脂平板上接种重组谷氨酸棒杆菌到50mL LB种子培养物，并生长过夜。通过离心(4000rpm,10min)收集菌体，并利用缺少碳源的CGXⅡ基本培养基洗涤一次，随后，接种到50mL中含有20g/L葡萄糖，25μg/mL卡钠抗性，(100μg/mL氨苄抗性，)的CGXⅡ基本培养基中，培养至OD600到0.5，添加诱导剂IPTG至1mM，在20℃诱导24h后，4℃、8000rpm、20分钟离心收集上清。利用HPLC检测发酵液中亚精胺生产情况，检测发酵液中产生亚精胺的情况。
表16
重组菌 亚精胺(g/L)
SPD06-rccsdh-bccsdc 7.54
SPD06-pccsdh-cscsdc 6.87
SPD06-rscsdh-cjcsdc 5.95
SPD06-cscsdh-rscsdc 7.28
SPD06-rccsdh-cscsdc 14.73
SPD06-pccsdh-rscsdc 11.27
SPD06-cscsdh-cscsdc 10.35
SPD06-rscsdh-cscsdc 9.34
应用表达载体过表达亚精胺合成的关键基因，会给菌体带来代谢负担影响菌体的生长，表达载体在菌体繁殖过程中的结构不稳定、易丢失以及在细胞中的拷贝数的不稳定，添加抗生素影响菌体生长且污染环境，IPTG诱导造成的成本增加等因素限制了生产规模的扩大，因此，挑选诱导表达合成亚精胺效果最好的菌株SPD06-rccsdh-cscsdc，根据实施例1所述的整合方法，将该基因片段整合到谷氨酸棒杆菌基因组上，构建新的整合菌株SPD07。
摇瓶培养验证SPD06和SPD07菌株发酵产亚精胺的情况，测得摇瓶上清液中亚精胺的浓度分别为6.48g/L，15.18g/L。整合相关基因到基因组中亚精胺的产量明显高于基于质粒表达的产量。
实施例8：各类整合表达菌株及高密度培养比较
进一步分别在谷氨酸棒杆菌MB001、AJ1511、ATCC 13869、TQ2223、K051中进行如实施例1-7的相同操作，得到类似的双途径整合亚精胺生产途径菌株SPD06-1，SPD06-2，SPD06-3，SPD06-4，SPD06-5。
将SPD06-1，SPD06-2，SPD06-3，SPD06-4，SPD06-5，分别进行摇瓶培养，亚精胺的产量分别为14.3、12.6、11.3、9.5、10.8g/L。
并进行24小时高密度培养，培养基组成及流加操作如文献所示(Simple fed-batch technique for high cell density cultivation of Escherichia coli.Journalof Biotechnology 1995,39:59-65)，菌体量及亚精胺产如表17所示。
表17不同菌株高密度培养时的结果
菌株 菌体湿重(g/L) 亚精胺浓度(g/L)
SPD06-1 125 178
SPD06-2 98 154
SPD06-3 86 137
SPD06-4 72 128
SPD06-5 90 145
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (16)

1.一种谷氨酸棒杆菌基因工程菌，其特征在于，该工程菌的构建方法包括：将精氨酸脱羧酶编码基因、胍基丁胺脱亚胺酶编码基因、亚精胺合成酶编码基因和鸟氨酸脱羧酶编码基因整合至谷氨酸棒杆菌中；所述精氨酸脱羧酶编码基因、胍基丁胺脱亚胺酶编码基因、亚精胺合成酶编码基因和鸟氨酸脱羧酶编码基因组成的基因片段整合到谷氨酸棒杆菌基因组的thrB基因位点上；
敲除谷氨酸棒杆菌基因组中的mcbR基因、Ncgl2640基因和argR基因；
强化表达谷氨酸棒杆菌基因组中的编码N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸还原酶的argC基因、编码乙酰鸟氨酸氨基转移酶的argJ基因、编码N-乙酰谷氨酸激酶的argB和编码N-乙酰鸟氨酸5-氨基转移酶的argD基因；强化表达天冬氨酸激酶突变体C932T的编码基因；强化表达谷氨酸棒杆菌基因组中编码O-乙酰高丝氨酸硫水解酶的metY基因和编码甲硫氨酸合成酶的metE/metH基因；
将转运蛋白MdtJI编码基因整合至谷氨酸棒杆菌基因组中；
强化表达谷氨酸棒杆菌基因组中编码甲硫氨酸腺苷基转移酶的metK基因；将编码S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的speD基因和血红蛋白基因vgb基因整合至谷氨酸棒杆菌基因组中并强化表达；
将活性位点727位上碱基G突变为A的编码谷氨酸-6-磷酸脱氢酶的zwf基因、编码6-磷酸果糖脱氢酶的gnd基因的突变体T1083C和编码丙酮酸羧化酶的pyc基因的突变体C1372T整合至谷氨酸棒杆菌中。
2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，其特征在于，所述精氨酸脱羧酶编码基因、胍基丁胺脱亚胺酶编码基因、亚精胺合成酶编码基因来自大肠杆菌，所述鸟氨酸脱羧酶编码基因来自Escherichia coliMG1655、Shewanella oneidensisMR-1、Staphylococcus lugdunensis HKU09-01或Pseudomonas aeruginosa PAO1。
3.根据权利要求1所述的一种谷氨酸棒杆菌基因工程菌，其特征在于，所述转运蛋白MdtJI编码基因来自大肠杆菌。
4.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，其特征在于，所述编码S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的speD基因来自大肠杆菌。
5.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，其特征在于，所述血红蛋白基因vgb基因来自透明颤菌。
6.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，其特征在于，该工程菌的构建方法还包括：强化表达谷氨酸棒杆菌基因组中编码谷氨酸脱氢酶的gdh基因。
7.根据权利要求6所述的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，其特征在于，该工程菌的构建方法还包括：弱化谷氨酸棒杆菌基因组中编码4-羟基-四氢二吡啶甲酸合成酶的dapA基因的表达，敲除了编码二氨基庚二酸酯脱羧酶的lysA基因。
8.根据权利要求7所述的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，其特征在于，敲除谷氨酸棒杆菌基因组中编码胱硫醚-γ-合成酶的metB基因。
9.根据权利要求8所述的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，其特征在于，弱化谷氨酸棒杆菌基因组中编码γ-谷氨酸激酶的proB基因的表达。
10.根据权利要求9所述的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，其特征在于，敲除谷氨酸棒杆菌基因组中编码N-乙酰转移酶的snaA基因。
11.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，其特征在于，该工程菌的构建方法还包括：在谷氨酸棒杆菌中引入外源的合成亚精胺的途径。
12.根据权利要求11所述的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，其特征在于，所述的引入外源的合成亚精胺的途径包括将羧基亚精胺脱氢酶编码基因和羧基亚精胺脱羧酶编码基因整合至谷氨酸棒杆菌中。
13.根据权利要求12所述的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，其特征在于，所述羧基亚精胺脱氢酶编码基因来自Ruminococcus callidus ATCC 27760、Porphyromonas catoniae ATCC51270、Rhodobacter sphaeroides ATCC BAA-808或Clostridium symbiosum ATCC 14940。
14.根据权利要求12所述的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，其特征在于，所述羧基亚精胺脱羧酶编码基因来自Bacteroides cellulosilyticus DSM 14838、Clostridium symbiosumATCC 14940、Campylobacter jejuni subsp. jejuni ATCC 700819或Rhodobactersphaeroides ATCC BAA-808。
15.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌选自谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌MB001、谷氨酸棒杆菌AJ1511、谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌TQ2223或谷氨酸棒杆菌K051。
16.权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌基因工程菌生产亚精胺的应用。
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