CN114958704B - 生产l-半胱氨酸的基因工程菌 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生产L‑半胱氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用，所述基因工程菌为包含来源于大肠杆菌的cysM，cysK，eamA，bcr，tolC，pntAB基因的谷氨酸棒杆菌。该菌株使用强启动子和中等强度启动子替换谷氨酸棒杆菌相关基因的自身启动子，获得一株高产L‑半胱氨酸的菌株。该菌株展现了良好的生产性能，在发酵72h后，摇瓶产量可达2.1g/L，5L发酵罐可达10.6g/L，并且其对L‑半胱氨酸的耐受性也显著提高，具有较好的工业应用价值。

Description

生产L-半胱氨酸的基因工程菌
技术领域
本发明涉及化合物生物技术生产领域，尤其是一种生产L-半胱氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
L-半胱氨酸是一种非常有价值的含硫氨基酸，广泛应用于农业、饲料添加剂、医药和化妆品等领域。L-半胱氨酸在所有生物的硫代谢途径中发挥着重要的作用，并且用于生物素，谷胱甘肽，蛋白质，硫辛酸，甲硫氨酸和其他含硫代谢产物的合成。目前，全球L-半胱氨酸的年产量达到每年约5000吨，市场需求快速增长。在传统工艺上，L-半胱氨酸的商业化生产主要由毛发等角蛋白水解提供，这也导致了严重的环境问题。微生物细胞发酵生产L-半胱氨酸因其具有成本低和生态友好性等优点而受到越来越多的关注。微生物发酵法生产L-半胱氨酸的技术已被详细地记载于例如US6218168B1、US5972663A、US2004038352A2、CA2386539A2、EP1769080和EP2138585中。此处所用的细菌宿主生物体主要是谷氨酸棒杆菌，大肠杆菌或菠萝泛菌。
根据理性的代谢工程策略，通过对菠萝泛菌的定向改造，获得一株合成L-半胱氨酸的高产菌株，并最终在摇瓶培养中达到2.2 g/L（Takumi K, Ziyatdinov MK, SamsonovV, Nonaka G. Fermentative Production of Cysteine by Pantoea ananatis. ApplEnviron Microbiol. 2017 Feb 15;83(5):e02502-16. doi: 10.1128/AEM.02502-16.）。对于大肠杆菌菌株，通过系统代谢过程优化，摇瓶中的L-半胱氨酸产量达到了1.7g/L，发酵罐的最高产量达到了8.3g/L（Liu H, Wang Y, Hou Y, Li Z. Fitness of Chassis Cellsand Metabolic Pathways for l-Cysteine Overproduction in Escherichia coli. JAgric Food Chem. 2020 Dec 16;68(50):14928-14937. doi: 10.1021/acs.jafc.0c06134.）。
此前，我们的实验室通过系统合理地改造谷氨酸棒杆菌的L-半胱氨酸合成途径，成功构建了一株高产L-半胱氨酸的菌株，并在摇瓶发酵中达到0.95g/L，这是谷氨酸棒杆菌中有史以来L-半胱氨酸产量最高的报道（Wei L, Wang H, Xu N, Zhou W, Ju J, Liu J,Ma Y. Metabolic engineering ofCorynebacterium glutamicum for L-cysteineproduction. Appl Microbiol Biotechnol. 2019 Feb;103(3):1325-1338. https://doi: 10.1007/s00253-018-9547-7.）。然而，微生物发酵生产L-半胱氨酸的产量仍然很低。阻碍生物法高水平生产L-半胱氨酸的瓶颈可能是高浓度的L-半胱氨酸对细胞具有细胞毒性，并且其代谢调节系统严格而复杂。在L-半胱氨酸生产菌株中，大肠杆菌在发酵过程中常不可避免地发生内毒素污染，而菠萝泛菌是一种常见植物病原细菌，上述菌株在生产食品或医药级L-半胱氨酸时仍存在着较大安全隐患；而谷氨酸棒杆菌是食品安全级微生物，在氨基酸工业生产中得到了广泛的应用，其产品能够符合美国、欧洲及日本食品或药用级标准，也属于清真食品级。此外，对谷氨酸棒杆菌的L-半胱氨酸的合成途径也进行了深入研究。以往的研究在代谢途径的修饰，如关键酶的优化等方面做了大量工作，但这些传统策略未能获得L-半胱氨酸产量高的菌株。
因此，亟需研发高产L-半胱氨酸的工程菌株。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种生产L-半胱氨酸的基因工程菌，其构建方法和在生产L-半胱氨酸中的应用。
为解决上述问题，本发明的技术方案是：
本发明主要是通过减弱谷氨酸棒杆菌的L-半胱氨酸降解途径，增加前体的供应，引入外源的硫代硫酸盐途径，增强外排能力，减弱吸收能力，增加NADPH的库容量获得高产L-半胱氨酸的工程菌株。其中，由于其他棒杆菌都有相似的代谢路径，因此适合于棒杆菌，以及任意的谷氨酸棒杆菌。
本发明提供一种生产L-半胱氨酸的基因工程谷氨酸棒杆菌，其特征在于，对出发谷氨酸棒杆菌进行下述一种或多种遗传改造：
1）敲除L-丝氨酸降解途径的柠檬酸合成酶和L-丝氨酸脱水酶编码基因；
2）采用对磷酸甘油酸脱氢酶，磷酸丝氨酸转氨酶，丝氨酸O-乙酰转移酶和半胱氨酸合酶A的启动子替换为比其原始启动子更强的强启动子；
3）用中等强度启动子更换磷酸丝氨酸磷酸酶的启动子，敲入解反馈抑制的的谷氨酸棒杆菌来源的磷酸甘油酸脱氢酶编码基因serA -197AA，一个或两个或三个拷贝的解反馈抑制的大肠杆菌来源的丝氨酸O-乙酰转移酶编码基因cysE（M201R），一个大肠杆菌来源的半胱氨酸合酶B编码基因cysM和一个大肠杆菌来源的半胱氨酸合酶A编码基因cysK，增加了L-半胱氨酸的前体供应；
4）敲入大肠杆菌来源的L-半胱氨酸外排蛋白eamA，bcr和tolC中的一个或多个，增强了谷氨酸棒杆菌L-半胱氨酸的外排能力；
5）敲除L-半胱氨酸吸收蛋白NCgl2463，提高了其对L-半胱氨酸的耐受性；
6）引入大肠杆菌来源的吡啶核苷酸转氢酶编码基因pntA和pntB，以将NADH转化为NADPH，增大了NADPH的库容量。
优选地，所述强启动子是H7启动子；所述中等强度启动子是M7启动子。
另外优选地，采用谷氨酸棒杆菌自身生长依赖型启动子CP_2836更换胱硫醚β裂解酶的启动子，以削弱降解途径。
在一个具体实施方式中，采用H7或M7启动子替换谷氨酸棒杆菌中serA, serB,serC, cysE, cysM, cysK基因的启动子，以增加前体供应。
具体地，在谷氨酸棒杆菌中引入eamA，bcr，tolC基因，以强化外排系统。更优选地，进一步敲除NCgl2463基因，削弱L-半胱氨酸吸收能力。
在一个具体实施方式中，在谷氨酸棒杆菌中引入pntAB基因，以增大NADPH的库容量。
在一个优选实施方式中，所述基因工程谷氨酸棒杆菌中消除选择了标记基因。
在一个极具体的实施例中，其构建方法流程如下：
1.使用谷氨酸棒杆菌自身生长依赖型启动子CP_2836更换胱硫醚β裂解酶（aecD）的启动子，命名为LJ-Cg-1，以后期减弱L-半胱氨酸的降解能力。
2.在LJ-Cg-1的基础上，以强启动子例如H7更换磷酸甘油酸脱氢酶（serA）的启动子，并敲除丝氨酸降解途径基因柠檬酸合成酶（gltA），同时敲入一个解除反馈抑制的谷氨酸棒杆菌来源的serA -197AA，命名为LJ-Cg-2。
3.在LJ-Cg-2的基础上，以强启动子H7更换磷酸丝氨酸转氨酶（serC）的启动子，命名为LJ-Cg-3。
4.在LJ-Cg-3的基础上，以中等强度启动子例如M7更换磷酸丝氨酸磷酸酶（serB）的启动子，命名为LJ-Cg-4。
5.在LJ-Cg-4的基础上，以强启动子H7更换丝氨酸O-乙酰转移酶（cysE）的启动子，并敲除丝氨酸降解途径L-丝氨酸脱水酶（sdaA），同时敲入两个拷贝的解除反馈抑制的大肠杆菌来源的cysE（M201R），命名为LJ-Cg-5。
6.在LJ-Cg-5的基础上，敲除lacI家族转录调节因子（cg1410）同时敲入一个大肠杆菌来源的半胱氨酸合酶B（cysM）,启动子为H7，命名为LJ-Cg-6。
7.在LJ-Cg-6的基础上，以强启动子H7更换半胱氨酸合酶A（cysK）的启动子，并敲除L-乳酸脱氢酶（ldh）同时敲入一个大肠杆菌来源的cysK，命名为LJ-Cg-7。
8.在LJ-Cg-7的基础上，敲除乙醇脱氢酶（adhC）和丙酮酸脱氢酶（poxB）同时敲入三个大肠杆菌来源的L-半胱氨酸外排蛋白（eamA，bcr和tolC），启动子为H7，命名为LJ-Cg-8。
9.在LJ-Cg-8的基础上，敲除L-半胱氨酸吸收蛋白（NCgl2463），命名为LJ-Cg-9。
10.在LJ-Cg-9的基础上，敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（pck）同时敲入三个大肠杆菌来源的吡啶核苷酸转氢酶（pntAB），启动子为H7，命名为LJ-Cg-10。
其中，所述编码基因serA -197AA的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示序列。
所述编码基因cysE (M201R)的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示序列。
所述编码基因cysM的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示序列。
所述编码基因cysK的核苷酸序列为SEQ ID NO：4所示序列。
所述编码基因eamA的核苷酸序列为SEQ ID NO：5所示序列。
所述编码基因bcr的核苷酸序列为SEQ ID NO：6所示序列。
所述编码基因tolC的核苷酸序列为SEQ ID NO：7所示序列。
所述编码基因pntA的核苷酸序列为SEQ ID NO：8所示序列。
所述编码基因pntB的核苷酸序列为SEQ ID NO：9所示序列。
所述启动子cp_2836的核苷酸序列为SEQ ID NO：10所示序列。
所述启动子H7的核苷酸序列为SEQ ID NO：11所示序列。
所述启动子M7的核苷酸序列为SEQ ID NO：12所示序列。
本发明还提供基因工程谷氨酸棒杆菌在生产L-半胱氨酸中的应用。
本发明提供一种L-半胱氨酸的制备方法，具体步骤如下：
（1）种子培养，将所述基因工程谷氨酸棒杆菌经活化后接种至装有种子配培养基的250mL的圆底烧瓶中，其中装有20mL种子培养基，于30-32℃，200-220rpm摇床培养10-12h；
（2）摇瓶发酵培养，以5-10%的接种量将步骤（1）的种子培养物接种至装有30mL发酵培养基的500mL圆底三角瓶中，30-32℃，200-220rpm进行发酵培养，通过添加20g/L的碳酸钙来维持PH，发酵周期60-72h，即得。
（3）发酵罐发酵培养，以5-10%的接种量将步骤（1）的种子培养物接种至装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，30-32℃，通过流加氨水维持PH在6.8-7.2，通过溶氧级联转速200-1200rpm（溶氧低于20%），60%（m/v）的葡萄糖溶液维持发酵进行，糖浓度维持到5-10g/L，发酵周期60-72h，即得。
上述L-半胱氨酸的制备方法，所得发酵液中L-半胱氨酸的检测方法为：发酵液经12000rpm高速离心2min后取上清，并用去离子水稀释到一定浓度后使用高效液相色谱法测定L-半胱氨酸含量；检测条件为：岛津WONDASIL C18色谱柱，流动相A为0.05mol/L磷酸二氢钾（PH3.9），流动相B为甲醇：水=60:40，柱温30℃，流速1mL/min，进样量10μL，紫外检测波长330nm。
优选的，上述L-半胱氨酸的制备方法，所述种子培养基成分为：，葡萄糖20-30g/L，玉米浆20-30g/L，尿素2.5-5g/L，硫酸铵2.5-5g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，硫酸镁0.25-0.5g/L。用去离子水定容到500mL。上述培养基均可采用标准方法制备获得。
优选的，所述种子培养基成分为：葡萄糖25g/L，玉米浆30g/L，尿素5g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L。用去离子水定容到500mL。
所述发酵培养基成分为：葡萄糖60-80g/L，玉米浆20-30g/L，硫酸铵5-10g/L，硫代硫酸钠10-20g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，硫酸镁0.25-0.5g/L，硫酸锰5-10mg/L，硫酸亚铁5-10mg/L，VB1 0.5-1mg/L，生物素0.05-0.1mg/L，柠檬酸钠1-2g/L，碳酸钙10-20g/L，用去离子水定容到1L。
优选的，所述发酵培养基成分为：葡萄糖80g/L，玉米浆30g/L，硫酸铵10g/L，硫代硫酸钠20g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.01g/L，硫酸亚铁0.01g/L，VB11mg/L，生物素0.1mg/L，柠檬酸钠2g/L，碳酸钙20g/L，用去离子水定容到1L。
上述培养基均可采用标准方法制备获得。
本发明的有益效果是：上述生产L-半胱氨酸的基因工程菌是通过合理的基因手段构建出的一株以葡萄糖为底物直接发酵生产L-半胱氨酸的工程菌株，60-72h发酵液中能够大量积累L-半胱氨酸，经检测它们的产量均比现有的报道要高。主要优势是原料成本较低，培养条件简单，设备损耗小，发酵周期短，操作简单，无需收集菌体提取酶液，L-半胱氨酸生产效率较高。通过如上改造并培养成功的获得了一株高产L-半胱氨酸，高耐受半胱氨酸和高硫利用率的谷氨酸棒杆菌菌株，其最高产量可达2.1g/L（摇瓶），10.6g/L（发酵罐），是目前L-半胱氨酸生产菌株的最高报道。
附图说明
图1为菌株代谢改造图。
图2为谷氨酸棒杆菌ATCC13032 和工程菌株的生物量和产量比较。
图3为5L发酵罐中上清液和沉淀中L-半胱氨酸和L-胱氨酸产量。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案做进一步的详细说明。
实施例1：L-半胱氨酸生物生产菌株的构建
本实例所用的质粒骨架为pK18mobsacB等载体，用于在谷氨酸棒杆菌基因组上插入或者删除目的基因。所用引物均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。各组分生物元件都由PCR纯化而来，并通过一步法高效无缝克隆（ClonExpress®II One Step CloningKit，Vazyme Biotech, China）等分子组装技术将各片段按一定顺序拼接，完成谷氨酸棒杆菌中L-半胱氨酸合成途径中的质粒构建。
（1）降解途径的削弱（aecD）
①采用PCR技术以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，根据CP_2836启动子和aecD上下游1000bp的基因序列设计各自引物，扩增出启动子CP_2836和aecD上下游片段。先用融合PCR将三个片段融合成一个片段，然后酶切位点为BamHI和XbaI。
②使用Thermo限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切步骤①中获得的目的片段及pK18mobsacB等载体质粒，获得带有相同粘性末端的目的基因和pK18mobsacB等载体的线性片段。
③使用Thermo T4DNA连接酶链接步骤②中获得的两个目的片段，得到目的载体Pk18-aecD。
④将步骤③中获得的质粒电转入谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，采用Red同源重组技术更换aecD启动子为CP_2836，消除阳性转化子中的卡那霉素抗性基因后获得削弱aecD的LJ-Cg-1菌株。
其产量可达15±0.5 mg/L，是出发菌株（3.2±0.2 mg/L）的4.7倍。
（2）增加前体的供应（serA, serB, serC, cysE, cysM, cysK）
①采用PCR技术以谷氨酸棒杆菌ATCC13032和大肠杆菌MG1655基因组为模板，根据H7和M7启动子和各自目的基因上下游1000bp的基因序列设计各自引物，扩增出启动子H7，M7和各目的基因上下游片段。先用融合PCR将三个片段融合成一个片段，然后酶切位点为BamHI和XbaI。
②使用Thermo限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切步骤①中获得的目的片段及pK18mobsacB等载体质粒，获得带有相同粘性末端的目的基因上下游片段和pK18mobsacB等载体的线性片段。
③使用Thermo T4DNA连接酶链接步骤②中获得的两个目的片段，得到目的载体pK18-目的基因。
④将步骤③中获得的质粒依次电转入谷氨酸棒杆菌LJ-Cg-1中，采用Red同源重组技术更换上述基因启动子，消除阳性转化子中的卡那霉素抗性基因后获得强化前提供应的LJ-Cg-2-7菌株，其产量分别为38±2 mg/L，51±2.5 mg/L，91±4.5 mg/L，270±12 mg/L，350±18 mg/L，580±27 mg/L，分别是出发菌株的11.9，15.9，28.4，84.4，109.4，181.3倍。
（3）强化外排系统，敲除吸收系统（eamA，bcr，tolC, △NCgl2463）
①采用PCR技术以谷氨酸棒杆菌ATCC13032和大肠杆菌MG1655基因组为模板，根据H7启动子和各自目的基因上下游1000bp的基因序列设计各自引物，扩增出启动子H7和各目的基因上下游片段。先用融合PCR将三/两个片段融合成一个片段，然后酶切位点为BamHI和XbaI。
②使用Thermo限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切步骤①中获得的目的片段及pK18mobsacB等载体质粒，获得带有相同粘性末端的目的基因上下游片段和pK18mobsacB等载体的线性片段。
③使用Thermo T4DNA连接酶链接步骤②中获得的两个目的片段，得到目的载体Pk18-目的基因。
④将步骤③中获得的质粒依次电转入谷氨酸棒杆菌LJ-Cg-8中，采用Red同源重组技术依次插入eamA，bcr，tolC，消除阳性转化子中的卡那霉素抗性基因后获得强化外排系统的LJ-Cg-8，然后在此基础上敲除NCgl2463，获得削弱L-半胱氨酸吸收能力的菌株LJ-Cg-9，产量分别为1532±88 mg/L，1674±82 mg/L，分别是出发菌株的478.8，523.1倍。
（4）增大NADPH的库容量
采用PCR技术以谷氨酸棒杆菌ATCC13032和大肠杆菌MG1655基因组为模板，根据H7启动子和各自目的基因上下游1000bp的基因序列设计各自引物，扩增出启动子H7和各目的基因上下游片段。先用融合PCR将三个片段融合成一个片段，然后酶切位点为BamHI和XbaI。
②使用Thermo限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切步骤①中获得的目的片段及pK18mobsacB等载体质粒，获得带有相同粘性末端的目的基因上下游片段和pK18mobsacB等载体的线性片段。
③使用Thermo T4DNA连接酶链接步骤②中获得的两个目的片段，得到目的载体Pk18-目的基因。
④将步骤③中获得的质粒依次电转入谷氨酸棒杆菌LJ-Cg-10中，采用Red同源重组技术依次插入pntAB，消除阳性转化子中的卡那霉素抗性基因后获得强化前提供应的LJ-Cg-10菌株，产量可达2145±115 mg/L，是出发菌株的670.3倍。
可见，本发明所述生产L-半胱氨酸的最终基因工程菌LJ-Cg-10具有较高的L-半胱氨酸的生产性能，其利用葡萄糖发酵生产L-半胱氨酸的产量达到目前报道的最高水平，即发酵72小时摇瓶产量为2.1g/L，发酵罐产量10.6g/L。
实施例2：L-半胱氨酸生物生产菌株的发酵培养及检测
具体步骤如下：
1）使用LBHIS培养基活化生产L-半胱氨酸的基因工程菌LJ-Cg-10，30℃，220rpm过夜培养。
2）按10%接种量接种至种子培养基，装液量为20mL的250mL三角瓶，30℃，220rpm培养12小时。
3）按照10%的接种量接种发酵摇瓶，发酵摇瓶的装液量为30mL的500mL三角瓶30℃，220rpm培养72h。
4）收集发酵液，12000rpm离心2min，收集上清液检测L-半胱氨酸的含量。
5）使用去离子水将上清液稀释10倍，经0.22μm微孔滤膜过滤后待测。
6）使用高效液相色谱仪测定L-半胱氨酸。上述制备样品使用微量进样针，进样量为10μL，色谱柱为岛津WONDASIL C18，柱温30℃，流动相A为0.05mol/L磷酸二氢钾（PH3.9），流动相B为甲醇：水=60:40，流速1mL/min，紫外检测波长为330nm。经高效液相色谱检测，摇瓶中L-半胱氨酸的产量为2.1g/L，发酵罐中L-半胱氨酸的产量为10.6g/L。
7）种子培养基成分为：种子培养剂成分为：葡萄糖25g/L，玉米浆30g/L，尿素5g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L。用去离子水定容到500mL。
8）发酵培养基成分为：葡萄糖80g/L，玉米浆30g/L，硫酸铵10g/L，硫代硫酸钠20g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.01g/L，硫酸亚铁0.01g/L，VB11mg/L，生物素0.1mg/L，柠檬酸钠2g/L，碳酸钙20g/L。用去离子水定容到1L。
可见，本发明提供了一株能够从生产L-半胱氨酸的工程菌株，所述工程菌LJ-Cg-10，通过减弱L-半胱氨酸降解途径，增加前体的供应，引入外源的硫代硫酸盐途径，增强外排能力，减弱吸收能力，增加NADPH的库容量获得一株高产L-半胱氨酸的基因工程菌。该菌主要优势是原料成本较低，培养条件简单，设备损耗小，发酵周期短，操作简单，无需收集菌体提取酶液，L-半胱氨酸生产效率较高。
上述参照具体实施方式对本发明的生产L-半胱氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属于本发明的保护范围之内。
<110>中国科学院天津工业生物技术研究所
<120>生产L-半胱氨酸的基因工程菌
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<170>PatentIn version 3.5
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ATGAGCCAGAATGGCCGTCCGGTAGTCCTCATCGCCGATAAGCTTGCGCAGTCCACTGTTGACGCGCTTGGAGATGCAGTAGAAGTCCGTTGGGTTGACGGACCTAACCGCCCAGAACTGCTTGATGCAGTTAAGGAAGCGGACGCACTGCTCGTGCGTTCTGCTACCACTGTCGATGCTGAAGTCATCGCCGCTGCCCCTAACTTGAAGATCGTCGGTCGTGCCGGCGTGGGCTTGGACAACGTTGACATCCCTGCTGCCACTGAAGCTGGCGTCATGGTTGCTAACGCACCGACCTCTAATATTCACTCCGCTTGTGAGCACGCAATTTCTTTGCTGCTGTCTACTGCTCGCCAGATCCCTGCTGCTGATGCGACGCTGCGTGAGGGCGAGTGGAAGCGGTCTTCTTTCAACGGTGTGGAAATTTTCGGAAAAACTGTCGGTATCGTCGGTTTTGGCCACATTGGTCAGTTGTTTGCTCAGCGTCTTGCTGCGTTTGAGACCACCATTGTTGCTTACGATCCTTACGCTAACCCTGCTCGTGCGGCTCAGCTGAACGTTGAGTTGGTTGAGTTGGATGAGCTGATGAGCCGTTCTGACTTTGTCACCATTCACCTTCCTAAGACCAAGGAAACTGCTGGCATGTTTGATGCGCAGCTCCTTGCTAAGTCCAAGAAGGGCCAGATCATCATCAACGCTGCTCGTGGTGGCCTTGTTGATGAGCAGGCTTTGGCTGATGCGATTGAGTCCGGTCACATTCGTGGCGCTGGTTTCGATGTGTACTCCACCGAGCCTTGCACTGATTCTCCTTTGTTCAAGTTGCCTCAGGTTGTTGTGACTCCTCACTTGGGTGCTTCTACTGAAGAGGCTCAGGATCGTGCGGGTACTGACGTTGCTGATTCTGTGCTCAAGGCGCTGGCTGGCGAGTTCGTGGCGGATGCTGTGAACGTTTCCGGTGGTCGCGTGGGCGAAGAGGTTGCTGTGTGGATGGATCTGGCTCGCTAA 1005
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atgtcgtgtgaagaactggaaattgtctggaacaatattaaagccgaagccagaacgctggcggactgtgagccaatgctggccagtttttaccacgcgacgctactcaagcacgaaaaccttggcagtgcactgagctacatgctggcgaacaagctgtcatcgccaattatgcctgctattgctatccgtgaagtggtggaagaagcctacgccgctgacccggaaatgatcgcctctgcggcctgtgatattcaggcggtgcgtacccgcgacccggcagtcgataaatactcaaccccgttgttatacctgaagggttttcatgccttgcaggcctatcgcatcggtcactggttgtggaatcaggggcgtcgcgcactggcaatctttctgcaaaaccaggtttctgtgacgttccaggtcgatattcacccggcagcaaaaattggtcgcggtatcatgcttgaccacgcgacaggcatcgtcgttggtgaaacggcggtgattgaaaacgacgtatcgattctgcaatctgtgacgcttggcggtacgggtaaatctggtggtgaccgtcacccgaaaattcgtgaaggtgtgCGCattggcgcgggcgcgaaaatcctcggcaatattgaagttgggcgcggcgcgaagattggcgcaggttccgtggtgctgcaaccggtgccgccgcataccaccgccgctggcgttccggctcgtattgtcggtaaaccagacagcgataagccatcaatggatatggaccagcatttcaacggtattaaccatacatttgagtatggggatgggatctaa 822
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AAACATGCTTGTCGACGCCACTTTCTAGCAAATTAAGCGGGCACCTCCATTTATCTTTTGGAGGTGCCCGTTTCGTGCTTTCGCCAATTAGATACATGTATAACCACCCGAACAGGGGTAATAACTTTTGAAAGGCTTTCGGCGTTGAGCTGCGAGAATTTTGAGAAAAGGGGGTGAATTTAACGGGGGTTCTAGCGCGGATTGATTTTCGTGAATATGGTGGCTGCTAAGCGTGCGAATGTGCGCGTTGTCACAATCGTTGACCAAGTGTCACCTGACGCACAGGTAGTGCTCAGGTGGAGGTGGCCCAAAGGAGACCCA 321
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GCTCGAGTGATCTATTGATTCTGCGCTCAGGTGTCTTGTACTATGTGGGTGTAAATAAACTCTATTGATCTGGAAAGGAAGATA 84
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GCTCACTCAGTCTATCGTGTACAAATGGTCGGGACGATAGTAATGTATCATAAAGTAAATTCTAGATACCGGGAAAGGACTTCG 84

Claims (7)

1.一种生产L-半胱氨酸的基因工程谷氨酸棒杆菌，其特征在于，对出发谷氨酸棒杆菌进行下述遗传改造：
1) 使用谷氨酸棒杆菌自身生长依赖型启动子CP_2836更换胱硫醚β裂解酶aecD基因的启动子，命名为LJ-Cg-1；
2) 在LJ-Cg-1的基础上，以强启动子H7更换磷酸甘油酸脱氢酶serA基因的启动子，并敲除丝氨酸降解途径基因柠檬酸合成酶gltA基因，同时敲入一个解除反馈抑制的谷氨酸棒杆菌来源的serA-197AA基因，命名为LJ-Cg-2；编码基因serA -197AA的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示序列；
3) 在LJ-Cg-2的基础上，以强启动子H7更换磷酸丝氨酸转氨酶serC的启动子，命名为LJ-Cg-3；
4) 在LJ-Cg-3的基础上，以中等强度启动子M7更换磷酸丝氨酸磷酸酶serB基因的启动子，命名为LJ-Cg-4；
5) 在LJ-Cg-4的基础上，以强启动子H7更换丝氨酸O-乙酰转移酶cysE的启动子，并敲除丝氨酸降解途径L-丝氨酸脱水酶sdaA，同时敲入两个拷贝的解除反馈抑制的大肠杆菌来源的cysE突变体基因cysE（M201R），命名为LJ-Cg-5；
6) 在LJ-Cg-5的基础上，敲除lacI家族转录调节因子cg1410，同时敲入一个大肠杆菌来源的半胱氨酸合酶B cysM，启动子采用启动子H7，命名为LJ-Cg-6；
7) 在LJ-Cg-6的基础上，以强启动子H7更换半胱氨酸合酶A cysK的启动子，并敲除L-乳酸脱氢酶ldh同时敲入一个大肠杆菌来源的cysK，命名为LJ-Cg-7；
8) 在LJ-Cg-7的基础上，敲除乙醇脱氢酶adhC和丙酮酸脱氢酶poxB基因，同时敲入三个大肠杆菌来源的L-半胱氨酸外排蛋白基因eamA，bcr和tolC，启动子采取启动子H7，命名为LJ-Cg-8。
2.如权利要求1所述的生产L-半胱氨酸的基因工程谷氨酸棒杆菌，其特征在于，在所述LJ-Cg-8的基础上，进一步敲除L-半胱氨酸吸收蛋白NCgl2463，命名为LJ-Cg-9。
3.如权利要求2所述的生产L-半胱氨酸的基因工程谷氨酸棒杆菌，其特征在于，在所述LJ-Cg-9的基础上，进一步敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶pck，同时敲入三个大肠杆菌来源的吡啶核苷酸转氢酶pntAB，启动子采用启动子H7，命名为LJ-Cg-10；
其中，
编码基因cysE (M201R)的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示序列；
编码基因cysM的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示序列；
编码基因cysK的核苷酸序列为SEQ ID NO：4所示序列；
编码基因eamA的核苷酸序列为SEQ ID NO：5所示序列；
编码基因bcr的核苷酸序列为SEQ ID NO：6所示序列；
编码基因tolC的核苷酸序列为SEQ ID NO：7所示序列；
编码基因pntA的核苷酸序列为SEQ ID NO：8所示序列；
编码基因pntB的核苷酸序列为SEQ ID NO：9所示序列；
启动子cp_2836的核苷酸序列为SEQ ID NO：10所示序列；
启动子H7的核苷酸序列为SEQ ID NO：11所示序列；
启动子M7的核苷酸序列为SEQ ID NO：12所示序列。
4.如权利要求1至3任一项所述的生产L-半胱氨酸的基因工程谷氨酸棒杆菌，其特征在于，重组菌株消除选择了标记基因。
5.如权利要求1至3任一项所述的基因工程谷氨酸棒杆菌在生产L-半胱氨酸中的应用。
6.一种L-半胱氨酸的制备方法，步骤如下：
（1）种子培养，将所述如权利要求1至3任一项所述的基因工程谷氨酸棒杆菌经活化后接种至装有种子配培养基中，于30-32℃，200-220rpm摇床培养10-12h；
（2）摇瓶或发酵罐发酵培养，以5-10%的接种量将步骤（1）的种子培养物接种至发酵培养基中，30-32℃，200-220rpm进行发酵培养，通过添加碳酸钙或通过流加氨水维持pH在6.8-7.2，发酵周期60-72h，即得。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，
所述种子培养基成分为：葡萄糖20-30g/L，玉米浆20-30g/L，尿素2.5-5g/L，硫酸铵2.5-5g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，硫酸镁0.25-0.5g/L；用去离子水定容到500mL；
所述种子培养基成分为：葡萄糖25g/L，玉米浆30g/L，尿素5g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L；用去离子水定容到500mL；
所述发酵培养基成分为：葡萄糖60-80g/L，玉米浆20-30g/L，硫酸铵5-10g/L，硫代硫酸钠10-20g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，硫酸镁0.25-0.5g/L，硫酸锰5-10mg/L，硫酸亚铁5-10mg/L，VB1 0.5-1mg/L，生物素0.05-0.1mg/L，柠檬酸钠1-2g/L，碳酸钙10-20g/L，用去离子水定容到1L。
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