CN112481288A - 促进谷氨酸棒杆菌发酵生产目标产物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促进谷氨酸棒杆菌发酵生产目标产物的方法，属于基因工程技术领域。本发明以谷氨酸棒杆菌为宿主，敲除了其葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶编码基因zwf和苹果酸酶基因malE，同时将其NADP+依赖型异柠檬酸脱氢酶编码基因icdcg替换为变形链球菌的NAD+依赖性异柠檬酸脱氢酶编码基因icdsm，获得了一株NADPH营养缺陷型谷氨酸棒杆菌。接着，在上述菌株中使用不同强度的启动子过表达大肠杆菌中烟酰胺核苷酸转氢酶PntAB编码基因pntAB，得到不同NADPH再生强度的重组菌株，筛选得到高产目标产物的重组菌，可实现目标产物合成途径的精细化调控。

Description

促进谷氨酸棒杆菌发酵生产目标产物的方法
技术领域
本发明涉及一种促进谷氨酸棒杆菌发酵生产目标产物的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
NADPH又叫还原型辅酶Ⅱ，是一种重要的辅因子，在细胞内广泛分布，通过参与800对个氧化还原反应来调节胞内氧化还原水平并影响众多基因表达、细胞功能、代谢途径、物质跨膜运输和胞内微环境。胞内NADPH水平与目标代谢产物的合成之间的关系可分为以下几种类型：(1)影响目标代谢产物产量：提高胞内NADPH水平，能促进胞内NADPH-依赖型产物的合成而阻断非NADPH-依赖型产物的合成；(2)影响底物转化率：调控胞内NADPH水平，能有效降低副产物积累，提高原料的转化率；(3)影响目标代谢产物生产强度：增加胞内NADPH供给，满足中心碳代谢途径中关键酶对NADPH的需求，可实现目标产物高强度生产；(4)拓宽底物利用范围：促进胞内NADPH再生，可提高菌体对糖蜜、羧基化合物等的利用；(5)影响胞内微环境：改变NADPH水平会影响胞内NAD(H/+)状态和ATP含量，可调节胞内pH(pHi)和活性氧簇(ROS)的形成，提高细胞对酸胁迫和氧胁迫的适应力。因此，对胞内NADPH水平的调控是菌种改造和发酵过程优化需考虑的一个重要指标。
胞内NADPH水平的调控策略可分为外源调控和内源调控。外源调控是指采用生化工程的方法，通过添加外源电子受体、不同还原态碳源和NADP+前体物，改变溶氧等实现对NADPH代谢的调控；而内源调控是基于细胞内NADPH合成与代谢的途径，通过代谢工程策略调节与NADP(H/+)代谢相关途径或酶活性。目前，内源调控是调节胞内NADPH水平的常用策略，具体思路可分为以下几个方面：(1)调控磷酸戊糖(PP)途径：PP途径是多数微生物中主要的NADPH供给途径，由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Zwf,编码基因zwf)和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(Gnd,编码基因gnd)催化合成；(2)调控糖酵解(EMP)途径：将菌体内源的NAD+-依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶(NAD+-GADPH)换成NADP+-GAPDH，可显著增加胞内NADPH水平，促进目标产物的合成；(3)调控三羧酸循环(TCA)途径：敲除琥珀酰-CoA合成酶，扰乱正常的TCA，强化流经苹果酸酶的碳通量，可增加胞内NADPH水平；(4)调控转氢酶循环途径：调节Escherichia coli中由膜结合转氢酶PntAB(或mTH,编码基因pntAB)或可溶性转氢酶UdhA(或sTH)组成的转氢酶循环途径，调控NAD(H/+)与NADP(H/+)的相互转化水平，从而实现调节胞内NADPH水平。谷氨酸棒杆菌没有转氢酶循环途径，只有由丙酮酸/磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸酶和苹果酸脱氢酶(MalE,编码基因malE)组成的类似转氢酶循环(Transhydrogenase-Like Cycle)途径，苹果酸酶可将NADH转化为NADPH，提高胞内NADPH供给水平，促进目的产物合成。虽然上述代谢改造取得了比较显著的成果，但还存在以下不足：辅因子NADPH调控微生物细胞生理代谢功能的机制还不清晰，进而难于通过控制胞内NADPH水平实现目标产物合成途径的精细化调控。
发明内容
为解决上述问题，本发明通过失活葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Zwf)和苹果酸酶(MalE)，并将NADP+依赖型异柠檬酸脱氢酶(Icdcg)替换成变形链球菌(Streptococcusmutans)中NAD+依赖型异柠檬酸脱氢酶(Icdsm)，从而阻断谷氨酸棒杆菌胞内所有参与NADPH合成途径，先构建了一株NADPH营养缺陷型谷氨酸棒杆菌。接着通过在上述菌株中使用不同强度的启动子表达大肠杆菌中PntAB，获得不同NADPH再生水平的重组菌株，可筛选能够高产目标产物的重组菌，可实现目标产物合成途径的精细化调控。
本发明的第一个目的是提供一种促进谷氨酸棒杆菌发酵生产目标产物的方法，包括如下步骤：
S1、构建NADPH营养缺陷型谷氨酸棒杆菌：以生产目标产物的谷氨酸棒杆菌为宿主，敲除了其葡萄糖-6-磷酸脱氢酶编码基因zwf和苹果酸酶基因malE，同时将其NADP+依赖型异柠檬酸脱氢酶编码基因icdcg替换为变形链球菌的NAD+依赖性异柠檬酸脱氢酶编码基因icdsm；
S2、构建重组质粒：设计不同强度的启动子序列，将烟酰胺核苷酸转氢酶基因连接到质粒上获得目的重组质粒，将目的重组质粒的启动子分别替换为不同强度的启动子，获得重组表达质粒；
S3、将重组表达质粒导入S1步骤构建的NADPH营养缺陷型谷氨酸棒杆菌中，筛选得到目标产物产量提高的重组菌。
进一步地，所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述的苹果酸酶基因malE的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述的柠檬酸脱氢酶基因icdcg的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，所述的NADP+依赖型异柠檬酸脱氢酶来源于变形链球菌，为以下任一：
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的异柠檬酸脱氢酶；
(2)具有异柠檬酸脱氢酶活性的同工酶。
进一步地，所述的烟酰胺核苷酸转氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步地，所述的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.17-31所示。
本发明的第二个目的是提供一种谷氨酸棒杆菌重组菌，所述的重组菌是在NADPH营养缺陷型谷氨酸棒杆菌中，以核苷酸序列如SEQ ID NO.16-30中的一种启动子表达烟酰胺核苷酸转氢酶；所述的NADPH营养缺陷型谷氨酸棒杆菌是以谷氨酸棒杆菌为宿主，敲除了其葡萄糖-6-磷酸脱氢酶编码基因zwf和苹果酸酶基因malE，同时将其NADP+依赖型异柠檬酸脱氢酶编码基因icdcg替换为变形链球菌的NAD+依赖性异柠檬酸脱氢酶编码基因icdsm。
进一步地，所述的烟酰胺核苷酸转氢酶以pECM为表达载体。
本发明的第三个目的是提供所述的谷氨酸棒杆菌重组菌的构建方法，包括如下步骤：
S01、将编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因连接到质粒上，并将启动子替换为核苷酸序列如SEQ ID NO.16-30中的一种启动子，获得重组表达载体；
S02、将重组表达载体导入NADPH营养缺陷型谷氨酸棒杆菌中，得到所述的谷氨酸棒杆菌重组菌。
本发明的有益效果：
本发明以谷氨酸棒杆菌为宿主，敲除了其葡萄糖-6-磷酸脱氢酶编码基因zwf和苹果酸酶基因malE，同时将其NADP+依赖型异柠檬酸脱氢酶编码基因icdcg替换为变形链球菌的NAD+依赖性异柠檬酸脱氢酶编码基因icdsm，获得了一株NADPH营养缺陷型谷氨酸棒杆菌。接着，在上述菌株中使用不同强度的启动子过表达大肠杆菌中烟酰胺核苷酸转氢酶PntAB编码基因pntAB，得到不同NADPH再生强度的重组菌株，筛选得到高产目标产物的重组菌，可实现目标产物合成途径的精细化调控。
附图说明
图1为NADPH营养缺陷型谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建策略；
图形说明：叉代表失活该基因，箭头代表替换icd基因，虚线框代表外源导入的NADPH再生途径
图2为不同重组菌株在不同碳源下菌体生长和L-赖氨酸发酵情况；
图3为不同强度启动子控制NADPH水平对L-赖氨酸生产强度的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
以下实施例中以谷氨酸棒杆菌C.glutamicum Lys-χ为例，谷氨酸棒杆菌C.glutamicum Lys-χ是在谷氨酸棒杆菌ATCC13032基础上构建得到的生产L-赖氨酸的菌株。本发明方法不限定生产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌，对其他需要NADPH的谷氨酸棒杆菌生产菌株同样适用。
胞内NADP(H)与NAD(H)浓度的测定：取适量菌体，离心后弃上清加入0.50mL酸性(碱性)提取液重悬菌体，超声破碎1min，超声破碎参数为强度20％或200W，超声2s，停1s，盖紧后沸水浴5min后冰浴中冷却，10000×g 4℃离心10min，取上清液200μL转移至另一新的离心管中，加入等体积的碱性(酸性)提取液使之中和，10000×g 4℃离心10min，取上清。随后，以试剂盒NAD/NADH Quantification Colorimeteric Kit和试剂盒NADP/NADPHQuantification Colorimeteric Kit分别特异性检测并计算NAD+/NADH和NADP+/NADPH。
表1：实施例中所用到的引物(下划线为酶切位点)
Figure BDA0002815025960000051
实施例1：重组质粒pK18mobsacB-Δzwf、pK18mobsacB-ΔmalE pK18mobsacB-ΔicdCg::icdSm的构建
根据C.glutamicum Lys-χ中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶zwf基因序列。在其基因上下游分别选择一段同源臂，在分别添加限制性内切酶BamHⅠ、XbaⅠ和HindⅢ酶切位点序列，设计出两组引物zwf-L-F，zwf-L-R和zwf-R-F，zwf-R-R，用这两组引物以谷氨酸棒杆菌Lys-χ基因组为模板进行PCR，对PCR产物进行胶回收获得两个同源臂片段。将左同源臂zwf-L与质粒pK18mobsacB同时用限制性内切酶BamHⅠ和XbaⅠ进行酶切，使用产物纯化试剂盒纯化后用T4DNA连接酶进行酶连，转化至大肠杆菌JM109中，筛选后得到转化子，提取质粒，得到pK18mobsacB/zwf-L。将该质粒再与右同源臂zwf-R同样通过酶切酶连结合，得到质粒pK18mobsacB/zwf-L/-R，即pK18mobsacB/Δzwf。
同样地，根据C.glutamicum Lys-χ中苹果酸酶malE和异柠檬酸脱氢酶Icd基因序列，设计相应的左右同源臂，使用上述同样方法，构建出质粒pK18mobsacB/ΔmalE与pK18mobsacB/Δicd。
根据NCBI中Streptococcus mutans JH1005全基因组核酸序列中NAD+-依赖型异柠檬酸脱氢酶基因icdSm序列，在其基因序列上下游分别加入EcoRI和XhoI酶切位点序列并在其上游加入C.glutamicum SD识别序列GAAAGGAGATATACC，并提交给相应公司合成该序列得到含有序列，并通过EcoRI和XhoI酶切得到片段GAAAGGAGATATACC-icdSm，并于同样酶切的穿梭表达质粒pDXW-8酶连，得到重组质粒pDXW-8-icdSm。以该质粒为模板，以Ptac-F/Ptac-R为引物进行PCR，获得包含了启动子Ptac和终止子rrnBT1T2的Ptac-icdSm-rrnBT1T2表达框。随后将纯化后的PCR产物Ptac-icdSm-rrnBT1T2与pK18mobsacB/ΔicdCg分别用SalI单酶切，将目的基因片段Ptac-icdSm-rrnBT1T2和载体pK18mobsacB/ΔicdCg酶切后的产物纯化并酶连。将酶连产物导入大肠杆菌中，筛选后得到含有重组质粒的重组菌株，提取质粒得到基因置换质粒pK18mobsacB/ΔicdCg::icdSm。
实施例2：NADPH营养缺陷型重组菌C.glutamicum Lys-χΔZMICg::ISm的构建
采用电转化法将构建成功的重组自杀型质粒pK18mobsacB-Δzwf电转化至C.glutamicum Lys-χ感受态中，经过含有50μg·mL-1卡那霉素的LBG固体培养基于30℃培养并筛选获得完成第一次同源重组转化子。再将完成第一次重组的转化子接入含100g·L-1蔗糖的LBGS液体培养基并于30℃培养，培养基中含蔗糖会导致含sacB基因的线性化整合质粒片段与基因组DNA中目的基因进行第二次同源重组，LBGS培养的菌液在LBG平板上划线分离，经过PCR验证得到C.glutamicum Lys-χ Δzwf。再通过相同的方法先后电转化质粒pK18mobsacB/ΔmalE和pK18mobsacB/ΔicdCg::icdSm得到重组菌株C.glutamicum Lys-χΔzwfΔmalEΔicdCg::icdSm，即C.glutamicum Lys-χ ΔZMICg::ISm(C.glutamicum Lys-χ1)。考察重组菌株的L-赖氨酸发酵性能(图2)及胞内吡啶核苷酸含量(NAD+、NADH、NADP+和NADPH)(表2)。结果显示以葡萄糖为碳源时，重组菌株Lys-χΔZMICg和Lys-χ1发酵液中检测不到L-赖氨酸的积累(图2C)。以葡萄糖酸为碳源时，重组菌株Lys-χΔZMICg(5.9±1.0g/L)和Lys-χ1(7.2±0.4g/L)中L-赖氨酸产量有明显提高，但仍低于出发菌株Lys-χ(15.4±1.4g/L)(图2C)。此外，以其他有机酸(如丙酮酸、α-酮戊二酸和草酰乙酸)为碳源时，重组菌株Lys-χΔZMICg和Lys-χ1发酵液中检测不到L-赖氨酸的积累(图2C)。从表2可以看出，重组菌株Lys-χΔZMICg和Lys-χ1胞内进行吡啶核苷酸含量时发现，在重组菌株Lys-χΔZMICg和Lys-χ1胞内检测不到NADPH(表2)。值得指出的是，当失活NADP+-Icd时胞内NADH水平和NADH/NAD+比例显著下降，而将NADP+-Icd替换成NAD+-Icd可显著提高胞内NADH水平和NADH/NAD+比例(表2)。
表2：重组菌和出发菌胞内吡啶核苷酸(NAD+、NADH、NADP+和NADPH)含量
Figure BDA0002815025960000081
a：单位为10-4nmol/(104cell)
实施例3：含有不同强度启动子重组表达质粒PX-pntAB-gfp的构建
根据NCBI中E.coli MG1655全基因组核酸序列中烟酰胺核苷酸转氢酶PntAB基因pntAB序列，添加限制性内切酶EcoRI和SacI酶切位点设计出引物pntAB-F和pntAB-R。以E.coli MG1655基因组为模板，PCR得到pntAB基因片段。随后，采用限制性内切酶EcoRI和SacI酶切质粒pECM和pntAB基因片段，纯化后酶连，转化进大肠杆菌后筛选得到重组菌株，提取质粒后得到重组表达质粒pECM-pntAB。随后，根据来源于Aequorea victoria的绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列经密码子优化后，在其编码基因上游加入C.glutamicum SD识别序列并通过基因合成的方法连接到重组表达质粒Ptrc-pntAB中，从而获得目的重组质粒Ptrc-pntAB-gfp。为了获得不同pntAB基因表达强度的重组质粒，将质粒pECM中的trc启动子通过融合PCR的方式替换成不同强度的启动子，从而获得重组表达质粒PX-pntAB-gfp。
表3：本实例中所用到的启动子序列
Figure BDA0002815025960000091
实施例4：不同NADPH再生强度的谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建
将上述不同强度启动子重组表达质粒PX-pntAB-gfp通过电转化法导入构建的NADPH营养缺陷型菌株，筛选后得到不同NADPH再生强度的谷氨酸棒杆菌重组菌株Lys-χ1/PX-pntAB-gfp。对重组菌进行发酵水平与胞内辅因子水平的考察(表3)。
表3：重组菌胞内NADP(+/H)和NAD(+/H)含量、菌体量和L-赖氨酸产量
Figure BDA0002815025960000101
a:单位为10-4nmol/(104cell)；b:单位为g/L；ND:未检测到.
随着胞内NADPH水平的回补，菌体生长和L-赖氨酸积累也得到了一定的恢复。但是尽管重组菌Lys-χ1/PtacM-pntAB-gfp的细胞内NADPH水平最高，但最终菌体量和L-赖氨酸产量并不是最高(表3)。通过分析不同胞内NADPH浓度下重组菌株L-赖氨酸生产强度发现，菌体量和L-赖氨酸产量在胞内NADPH水平一定范围内会随着NADPH浓度的增加而增加，但是当超过NADPH阈值时，会随着胞内NADPH浓度的增加而降低(图3)。从图2中可以得知，当胞内NADPH浓度在(3～7)×10-4nmol/(104cell)时，细胞处于最大L-赖氨酸生产强度。结合表3和图3的结果可以发现，当以强启动子控制PntAB在NADPH营养缺陷型C.glutamicum重组菌Lys-χ1中的表达时，重组菌Lys-χ1胞内NADPH水平处在(3～7)×10-4nmol/(104cell)范围内，此时L-赖氨酸生产强度最大，其中以启动子PdapA-A16控制PntAB表达时L-赖氨酸生产强度最高(即重组菌Lys-χ1/PdapA-A16-pntAB-gfp)，达到0.044g/(h·g cell)。然而，当以弱启动子或超强启动子控制PntAB在重组菌Lys-χ1中的表达时，L-赖氨酸生产强度为最大值的1％～70％。例如，以弱启动子Ppck控制PntAB表达的重组菌Lys-χ1/Ppck-pntAB-gfp的L-赖氨酸生产强度为最大值的～10％，而超强启动子PtacM控制PntAB表达的重组菌Lys-χ1/PtacM-pntAB-gfp的L-赖氨酸生产强度为最大值的～20％。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 促进谷氨酸棒杆菌发酵生产目标产物的方法
<160> 37
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1545
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
gtgagcacaa acacgacccc ctccagctgg acaaacccac tgcgcgaccc gcaggataaa 60
cgactccccc gcatcgctgg cccttccggc atggtgatct tcggtgtcac tggcgacttg 120
gctcgaaaga agctgctccc cgccatttat gatctagcaa accgcggatt gctgccccca 180
ggattctcgt tggtaggtta cggccgccgc gaatggtcca aagaagactt tgaaaaatac 240
gtacgcgatg ccgcaagtgc tggtgctcgt acggaattcc gtgaaaatgt ttgggagcgc 300
ctcgccgagg gtatggaatt tgttcgcggc aactttgatg atgatgcagc tttcgacaac 360
ctcgctgcaa cactcaagcg catcgacaaa acccgcggca ccgccggcaa ctgggcttac 420
tacctgtcca ttccaccaga ttccttcgca gcggtctgcc accagctgga gcgttccggc 480
atggctgaat ccaccgaaga agcatggcgc cgcgtgatca tcgagaagcc tttcggccac 540
aacctcgaat ccgcacacga gctcaaccag ctggtcaacg cagtcttccc agaatcttct 600
gtgttccgca tcgaccacta tttgggcaag gaaacagttc aaaacatcct ggctctgcgt 660
tttgctaacc agctgtttga gccactgtgg aactccaact acgttgacca cgtccagatc 720
accatggctg aagatattgg cttgggtgga cgtgctggtt actacgacgg catcggcgca 780
gcccgcgacg tcatccagaa ccacctgatc cagctcttgg ctctggttgc catggaagaa 840
ccaatttctt tcgtgccagc gcagctgcag gcagaaaaga tcaaggtgct ctctgcgaca 900
aagccgtgct acccattgga taaaacctcc gctcgtggtc agtacgctgc cggttggcag 960
ggctctgagt tagtcaaggg acttcgcgaa gaagatggct tcaaccctga gtccaccact 1020
gagacttttg cggcttgtac cttagagatc acgtctcgtc gctgggctgg tgtgccgttc 1080
tacctgcgca ccggtaagcg tcttggtcgc cgtgttactg agattgccgt ggtgtttaaa 1140
gacgcaccac accagccttt cgacggcgac atgactgtat cccttggcca aaacgccatc 1200
gtgattcgcg tgcagcctga tgaaggtgtg ctcatccgct tcggttccaa ggttccaggt 1260
tctgccatgg aagtccgtga cgtcaacatg gacttctcct actcagaatc cttcactgaa 1320
gaatcacctg aagcatacga gcgccttatc ttggatgcgc tgttggatga atccagcctt 1380
ttccctacca acgaggaagt ggaactgagc tggaagattc tggatccaat tcttgaagca 1440
tgggatgccg atggagaacc agaggattac ccagcaggta cgtggggtcc aaagagcgct 1500
gatgaaatgc tttcccgcaa cggtcacacc tggcgcaggc cataa 1545
<210> 2
<211> 1179
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
atgaccatcg acctgcagcg ttccacccaa aacctcaccc atgaggaaat cttcgaggca 60
cacgagggcg gaaagctctc cattagttcc actcgtccgc tccgcgacat gcgagatctt 120
tcccttgctt acacccctgg tgttgctcag gtttgtgaag caatcaagga agatccagag 180
gttgcacgca cccacacagg cattggaaac accgtcgcgg ttatttccga cggcaccgct 240
gttctgggtc ttggcgatat cggacctcag gcctcccttc ccgtcatgga gggcaaggct 300
cagctgttta gctctttcgc tggcctgaag gctatcccta tcgttttgga tgttcacgat 360
gttgacgctt tggttgagac catcgcagcc atcgcgcctt ctttcggtgc tatcaacttg 420
gaggacatct ccgctcctcg ttgcttcgag gtggagcgcc gcctcatcga gcgtcttgat 480
atcccagtta tgcacgatga ccagcacggc accgctgtgg ttatcctcgc tgcgctgcgc 540
aactccctga agctgctgga tcgcaagatc gaagacctca agattgttat ttccggcgca 600
ggtgccgctg gtgttgcagc tgtggacatg ctgaccaacg ctggagcaac cgatattgtg 660
gttctcgatt cccgaggcat catccacgac agccgtgagg atctttcccc agttaaggat 720
gctcttgcag agaagaccaa ccctcgtggc atcagcggtg gcatcaatga ggctttcacc 780
ggcgcggacc tattcattgg cgtgtccggc ggcaacatcg gcgaggacgc cctcaagctc 840
atggcaccac agccaatcct gttcaccctg gcgaacccaa ccccagagat cgatcctgag 900
ctgtctcaga agtacggcgc catcgtcgcg accggccgct ctgacctgcc taaccagatc 960
aacaacgtgc tcgcgttccc aggaattttc gccggcgctc tcgcagccaa ggctaagaag 1020
atcacccctg agatgaagct cgccgcagca gaggcaatcg ccgacatcgc agctgaggac 1080
ctcgaggtcg gccgcatcgt gcctaccgcc ttggatcccc gcgtcgcccc agcagtcaag 1140
gcagctgtcc aggccgtcgc cgaagcgcaa aacgcttaa 1179
<210> 3
<211> 2217
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
atggccaaga tcatttggac ccgcaccgac gaagcaccgt tgctcgcgac ctactcgctg 60
aagccggtcg tcgaagcatt tgccgctacc gcgggcattg aggtcgaaac ccgagacatt 120
tcactggctg gccgtatcct cgcccagttc ccagagcgtc tcaccgaaga gcagaagatt 180
ggcgacgccc tcgcagaact cggcgagctg gctaagaccc ccgaagctaa catcattaag 240
ctgccgaaca tctccgcttc tgttccacag ctcaaggctg ctattaagga actgcaggac 300
cagggttacg acatcccaga tctgccagac accgccacca ccgacgagga aaaggacatc 360
ctcgctcgtt acaacgctgt caagggttcc gctgtgaacc cagtgctgcg tgaaggcaac 420
tccgaccgcc gtgcaccaat cgctgtgaag aactttgtta agaagttccc tcaccgcatg 480
ggcgagtggt ctgcagattc taagaccaac gttgccacca tggatgcaaa cgacttccgc 540
cacaatgaga agtccgtcat cctggaagac gctgataccg tcaccattaa gcacgttgca 600
gcagacggca ccgagactat ccttaaggac ggcctcaagc tgcaaaaggg cgaagttctt 660
gacggcaccg tcatgtctgc aaaggcactg gacgcattcc tcaaggagca gattgctcgc 720
gccaaggctg agggcatcct attctccact cacctgaagg ccaccatgat gaaggtctcc 780
gaccccatca tcttcggcca cgtcgtccgt gcattcttcg cagatgtctt cgagcagtac 840
ggcgagcagc ttctggcagc tggccttaac ggcgagaacg gccttgctgc aatcttctcc 900
ggcctggagt ccctggacaa cggcgaagag atcaaggctg ctttcaacaa ggcacttgct 960
gaaggcccag atctggctat ggtgaactca gcaaagggca tcaccaacct gcacgttcct 1020
tccgacgtca tcgttgacgc ttccatgcca gctatgatcc gcacctccgg ccacatgtgg 1080
aacaaggacg atcaggagca ggacaccctc gctgtaatcc cagactcctc ctacgctggc 1140
gtgtaccaga ccgtcattga ggattgccgc aagaacggcg cattcgatcc aaccaccatg 1200
ggtaccgtcc caaacgttgg tctgatggct cagaaggctg aagagtacgg ctcccacgac 1260
aagaccttcc gcatcgaagc tgacggcaag gttcaggttg ttgcatccaa cggcgacgtc 1320
cttatcgagc acgacgttga gaccggtgac atctggcgtg catgccaggt taaggacgcc 1380
ccaatccagg actgggtcaa gcttgctgtc acccgctccc gcctgtccgg tatgccagca 1440
gtgttctggt tggatccaga gcgtgctcac gaccgcaacc tgatcaccct ggttgagaag 1500
tacctgcagg accacgacac cgacggcctg gacatccaga tcctctcccc tgtcgaggca 1560
actcagctct ccatcgaccg catccgtcgt ggcgaggaca ccatctccgt taccggtaac 1620
gtccttcgtg actacaacac cgacctcttc cccatcctgg agctgggcac ctctgcaaag 1680
atgctgtccg ttgttccttt gatggctggc ggcggacttt tcgagaccgg tgcaggtgga 1740
tccgcaccta agcacgttca gcagctgcag gaagaaaacc acctgcgctg ggactccctc 1800
ggtgagttcc tcgcactggc tgagtccttc cgccacgagc tgaacaacaa cggcaacgct 1860
aaggctggtg tcctggcaga cgctctggac aaagcaactg agaagctcct caacgaagag 1920
aagtccccat cccgcaaggt tggcgagatc gacaaccgtg gatcccactt ctggctgacc 1980
aagttctggg ctgacgagct cgctgctcag accgaagacg cagacctagc tgccaccttc 2040
gcaccagttg cagaagcact cggagagaac gctgctgaca tcgacgctgc cctcgttgca 2100
gctcagggtg gcgcagttga tcttggtggc tactacgctc caaacgatga gaagacctct 2160
gcagttatgc gcccagtcgc acagttcaac gagatcgttg acgcactgaa gaagtaa 2217
<210> 4
<211> 1182
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
atggcagaaa aagtaagttt tgaagaagga aaattacagg tgcctgataa gcccgtcatt 60
ccttacattg aaggagatgg tgttggtcag gatatttgga agaatgcgca aatcgttttt 120
gataaagcca ttgctaaagt ttatggaggt cacaagcagg ttatttggcg ggaggtctta 180
gctggtaaaa aagcttataa tgaaacaggc aactggctgc ctaatgagac tttagaaatt 240
atcaagacgc atttacttgc tattaaaggt ccattggaaa ctcctgttgg aggtggcatt 300
cgttccttaa atgttgccct gcgtcaagaa ttggatctct ttgcttgcgt gcgtccagtg 360
cgttatttca aaggtgtccc tagtccactt aagcatcctg aaaaaacggc tattaccatt 420
tttcgagaaa atactgaaga tatttacgca ggtatcgaat ggaatgcggg tacagcagaa 480
gttcaaaagg tcatcaactt tttacaagat gatatgcagg ttaagaaaat tcgttttcca 540
aaaagcagca gtatagggat taaacctatt tcaattgaag gcagccaacg tttgattcgt 600
gcagctatcg aatatgctct ggccaacaat ctgaccaagg taactttggt tcataaagga 660
aatattcaaa aattcactga aggtggcttt agaaaatggg gctatgaatt agcaaaacgt 720
gagtatgctg ccgaacttgc cagtggtcaa ttggtagttg ctgatattat tgctgacaat 780
ttcttgcaac aaattctgct caagcctgag cgttttgatg tagttgcctt aacgaatctc 840
aatggggact atgccagcga tgccttagca gcacaagttg gcggtattgg tatttcgcca 900
ggagctaata ttaactatca aacgggacat gctatttttg aagcaaccca tggaacggct 960
ccagatattg caggtcaaga cttggccaac ccatcttctg ttttattatc aggctgcatg 1020
ctttttgact atattggttg gtcaaaagtc tcagatttaa tcatgaaagc tgttgaaaaa 1080
gctattgcaa atggtcaagt taccattgat tttgccaagg aactaggggt tgaagcattg 1140
acaacccgtc agttttctga agttctattg acttatttat ag 1182
<210> 5
<211> 2932
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
ttacagagct ttcaggattg catccacgct ggctttggcg tcaccaaaca gcatgtgggt 60
gttttccttg aagaacagcg ggttttgcac accagcatag ccagtgttca tcgaacgttt 120
aaagacaatc acgttctgcg ctttccacac ttccagcaca ggcataccag caatcggact 180
cttcggatca tcctgcgccg ccgggttaac cgtatcgtta gcaccaatca ccagtacggt 240
atcggtatca gcaaagtcat cattgatctc gtccatttcc agcacgatgt catacggtac 300
ttttgcttca gccagcaata cgttcatatg tccaggcaaa cgccccgcga ccgggtggat 360
accgaaacgc acattaatac cacgagcgcg caatttctca gtaatttcag cgacaggata 420
ttgcgcctgc gcgactgcca tgccgtaccc cggagtaatg atcactgaat gggagttttt 480
cagcagttcc gctgtctctt ctgcggtgat ttcgcggtgc tcacccactt cctgatcatc 540
gccagtagaa gagccgtcgg tgccgaaacc acccgcaata acgctgataa aggaacggtt 600
catcgcctta cacataatgt aagaaaggat agcccccgaa gaaccgacca gcgcaccggt 660
cacaatcagc aggtcgttgc tgagcataaa gcccgcagcc gcagccgccc agccggagta 720
cgagttcagc atcgacacca ccactggcat atctgcacca ccgatggagg cgactaaatg 780
ccagccgaat accagcgcaa ttgcggtcat tatcagcaat gccagcactt gcaggccgac 840
gctgtccgtg cgaacaaata caatcagcag caggaaggaa acgaccagag ccgccaggtt 900
cattttgtga cggtttggca gcatcaatgg tttagacgaa atcttgccac acagtttgcc 960
gaacgccacc accgaacccg tgaacgttac cgccccgatg aagataccga ggaacacttc 1020
cgtcaggtga atattgacca gaatcggtgc cattcccgcg tcatgatgca gatagctgtt 1080
aaagccaacc agcactgccg ccagacccac gaagctatgc aggatcgcca ccagttctgg 1140
catttcggtc atttcaactt tcttcgccag acggatacca attgccccac caatgaccat 1200
cgccagcaag atccagccaa cattacccgt atccggtcca aaaatggttg cgattaacgc 1260
aatcgccatc ccggcgatac cgaagttgtt accctggcga gacgtttcat gtttcgaaag 1320
accggccaga ctgaagataa acaggatcgc ggcaacaatg tatgcagctg taactaatcc 1380
tccagacata tgttacccct taatttttgc ggaacatttt cagcatgcgc tgagtcacgg 1440
tgaagccacc gaaaatatta atgctggcta taagcaccgc gataaaacta aggaagctaa 1500
cccagccgcc ctggccaatc tgcaacagtg ctccgacaac aataatccct gaaatcgcgt 1560
tggtgaccga catcaacggt gtatgcagcg cgtgcgatac attccacacc acgtaataac 1620
cgacaacgca ggccagcgcg aaaacggtga agtgcccaag gaattctttc ggcgcaacgc 1680
ttgccatcca gccaaaaaga atgattgcca gcgccatcaa cgcgtattta cgccacggtg 1740
agcaggtaca tttttcctca gttttcactt ccggtgccgc tttttgtgcc gcctgcggct 1800
gagctgatac ctgaatcggc ggtgccggcc aggtaatttc gcccgcacgg atcacggtca 1860
cgccgcgaat caccacatca tcaaaatcaa cagtgatatt gccgtctttc tctttgcaca 1920
acagtttcag cagattaacg aggtttgtgc cgtaaagctg tgaggattgc gtcggcagac 1980
ggcccggaag atcggtataa ccaatcactt tgacaccatt ttccgtagtg aagatttcac 2040
ccggcacggt gtattcacag ttgccgccgt tttgggctgc caggtcgaca atcacactgc 2100
ccgccttcat ggagtcaacc atttcacggg taattagctt cggcgctggt ttgcctggaa 2160
taagcgcggt ggtgacaatg atatcgacct cttttgcctg ggcggcaaag agttccattt 2220
ccgctttgat gaacgcgtcc gacatcactt tggcatagcc atcgccgctg ccagcttcct 2280
ctttaaaatc cagctcgagg aattccgcgc ccatactttg aacttgttct ttcacttccg 2340
ggcgggtgtc gaatgcacgc acaatcgcgc cgagactgtt tgctgcgcca atggcggcca 2400
gacctgcaac acccgcacca atcaccatca cttttgccgg tggcactttc ccggccgcag 2460
taatttgccc ggtaaagaag cgcccaaatt catgtgccgc ttcaacaatg gcgcgataac 2520
cggcgatgtt cgccatcgag cttagtgcgt ccagcgattg tgcgcgtgag atacgcggca 2580
cagagtccat cgccatcacg gtcacgttac gttccgcaag tttttgcatt aattccggat 2640
tctgcgcagg ccagataaaa ctcaccagcg ttgtcccagg attcagtaac gcaatttcat 2700
catctaacgg cgcattgacc ttcagaatga tctctgactg ccagacgcta ttcccttcta 2760
caatttcagc gcccgcttgc acaaacgctt tatcgtcaaa acttgccagt tgacccgcgc 2820
cgctctctac cgcgacggta aaacccagtt tcagcagctg ttccactgtt tttggcgttg 2880
ctgcaacacg ggtttcattg gttaaccgtt ctcttggtat gccaattcgc at 2932
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
taggtttttt gcggggttgt ttaaccccca aatgagggaa gaaggcaacc atgaactcta 60
<210> 7
<211> 60
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 7
taggtttttt gcggggttgt ttaaccccca aatgagggaa gaaggaaacc atgaactcta 60
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 8
taggtttttt gcggggttgt ttaaccccca aatgagggaa gaagggaacc gtgaactcta 60
<210> 9
<211> 60
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 9
taggtttttt gcggggttgt ttaaccccca aatgagggaa gatcgtaacc ttgaactcta 60
<210> 10
<211> 60
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 10
taggttattt gcggggttgt ttaaccccca aatgagggaa gaacgtaacc ttgaactcta 60
<210> 11
<211> 60
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 11
taggttattt gcggggttgt ttaaccccca aatgagggaa gaaggtaacc ttgaactcta 60
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 12
taggttcctt ccggggttgt ttaaccccca aatgagggaa gaaggtaacc ttgaactcta 60
<210> 13
<211> 50
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 13
gcagatactg gaatcattaa caccttccgc tttgggctaa tgttgggggg 50
<210> 14
<211> 48
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 14
acctaaagtt ttaactagtt ctgtatctga aagctacgct agggggcg 48
<210> 15
<211> 50
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 15
cattgcgaaa tttttgttga gctacatatt tagctagtgt ttttgttcca 50
<210> 16
<211> 60
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 16
taggtttttt gcggggttgt ttaaccccca aatgagggaa gaaggtaacc ttgaactcta 60
<210> 17
<211> 43
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 17
gaatccgctg caaaatcttt gtttccccgc taaagttggg gac 43
<210> 18
<211> 44
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 18
accccgggct attttgtgtc tttaatcaat acaattgaat accg 44
<210> 19
<211> 50
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 19
tttgccgtat ctcgtgcgca gaattgcttt tgagggaaag atggaggaga 50
<210> 20
<211> 50
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 20
tttcaactga ttgcctcatc gaaacaagat tcgtgcaaca attgggtgta 50
<210> 21
<211> 50
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 21
tgggtgattg ttccggcgcg ggtgttgtga tgggtttaat atggaagaca 50
<210> 22
<211> 50
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 22
cagcgtattt gaccgatccg gacacctggg ataatgtgtg gatttgtcgg 50
<210> 23
<211> 60
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 23
taggtttttt gcggggttgt ttaaccccca aatgagggaa gaaggtataa ttgaactcta 60
<210> 24
<211> 60
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 24
taggtttttt gcggggttgt ttaaccccca aatgagggaa gaaggtaaaa ttgaactcta 60
<210> 25
<211> 60
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 25
taggttcctt ccggggttgt ttaaccccca aatgagggaa gatggtaacc ttgaactcta 60
<210> 26
<211> 156
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 26
agtttggctg ccatgtgaat ttttagcacc ctcaacagtt gagtgctggc actctcgggg 60
gtagagtgcc aaataggttg tttgacacac agttgttcac ccgcgacgac ggctgtgctg 120
gaaacccaca accggcacac acaaaatttt tctcat 156
<210> 27
<211> 31
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 27
tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt g 31
<210> 28
<211> 28
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 28
ttgacaatta atcatccggc tcgtaatg 28
<210> 29
<211> 39
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 29
tgttgacaat taatcatcga actagttaac tagtacgca 39
<210> 30
<211> 64
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 30
tgagctgttg acaattaatc atcggctcgt atataatgtg tggaattgtg agcggataac 60
aatt 64
<210> 31
<211> 50
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 31
ccggaattgc cagctggggc gccctctggt aaggttggga agccctgcaa 50
<210> 32
<211> 46
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 32
tgagctgttt acaattaatc atcgtgtggt accatgtgtg gaattg 46
<210> 33
<211> 62
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 33
tgagctgttg acaattaatc atcgtgtggt accatgtgtg gaattgtgag cggataacaa 60
tt 62
<210> 34
<211> 288
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 34
agcggtaacc atcacgggtt cgggtgcgaa aaaccatgcc ataacaggaa tgttcctttc 60
gaaaattgag gaagccttat gccctacaac cctacttagc tgccaattat tccgggcttg 120
tgacccgcta cccaataaat aggtgggctg aaaaatttcg ttgcaatatc aacaaaaagg 180
cctatcattg ggaagtgtcg caccaagtac ttttgcgaag cgccatctga cggattttca 240
aaagatgtat atgctcggtg cggaaaccta cgaaaggatt ttttaccc 288
<210> 35
<211> 196
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 35
tggccgttac ctgcgaatgt ccacagggta gctggtagtt gaaaatcaac gccgttgccc 60
ttaggattca gtaactggca catttgtaat gcgctagatc tgtgtgctca gtcttccagg 120
ctgcttatca cagtgaaagc aaaccaattc gtggctgcga aagtcgtagc caccacgaag 180
tccaggagga cataca 196
<210> 36
<211> 93
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 36
caaaagctgg gtaccaaagt aacttttcgg ttaaggtagc gcattcgtgg tgcccgtggc 60
ccggttggtt gggcaggagt atattgggat cca 93
<210> 37
<211> 96
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 37
caaaagctgg gtacctctat ctggtgccct aaacggggga atattaacgg gcccagggtg 60
gtcgcacctt ggttggtagg agtagcatgg gatcca 96

Claims (10)

1.一种促进谷氨酸棒杆菌发酵生产目标产物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、构建NADPH营养缺陷型谷氨酸棒杆菌：以生产目标产物的谷氨酸棒杆菌为宿主，敲除了其葡萄糖-6-磷酸脱氢酶编码基因zwf和苹果酸酶基因malE，同时将其NADP+依赖型异柠檬酸脱氢酶编码基因icdcg替换为变形链球菌的NAD+依赖性异柠檬酸脱氢酶编码基因icdsm；
S2、构建重组质粒：设计不同强度的启动子序列，将烟酰胺核苷酸转氢酶基因连接到质粒上获得目的重组质粒，将目的重组质粒的启动子分别替换为不同强度的启动子，获得重组表达质粒；
S3、将重组表达质粒导入S1步骤构建的NADPH营养缺陷型谷氨酸棒杆菌中，筛选得到目标产物产量提高的重组菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的苹果酸酶基因malE的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的柠檬酸脱氢酶基因icdcg的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的NADP+依赖型异柠檬酸脱氢酶来源于变形链球菌，为以下任一：
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的异柠檬酸脱氢酶；
(2)具有异柠檬酸脱氢酶活性的同工酶。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的烟酰胺核苷酸转氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.17-31所示。
8.一种谷氨酸棒杆菌重组菌，其特征在于，所述的重组菌是在NADPH营养缺陷型谷氨酸棒杆菌中，以核苷酸序列如SEQ ID NO.16-30中的一种启动子表达烟酰胺核苷酸转氢酶；所述的NADPH营养缺陷型谷氨酸棒杆菌是以谷氨酸棒杆菌为宿主，敲除了其葡萄糖-6-磷酸脱氢酶编码基因zwf和苹果酸酶基因malE，同时将其NADP+依赖型异柠檬酸脱氢酶编码基因icdcg替换为变形链球菌的NAD+依赖性异柠檬酸脱氢酶编码基因icdsm。
9.根据权利要求8所述的谷氨酸棒杆菌重组菌，其特征在于，所述的烟酰胺核苷酸转氢酶以pECM为表达载体。
10.权利要求8所述的谷氨酸棒杆菌重组菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S01、将编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因连接到质粒上，并将启动子替换为核苷酸序列如SEQ ID NO.16-30中的一种启动子，获得重组表达载体；
S02、将重组表达载体导入NADPH营养缺陷型谷氨酸棒杆菌中，得到所述的谷氨酸棒杆菌重组菌。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114958704A (zh) * 2022-06-17 2022-08-30 中国科学院天津工业生物技术研究所 生产l-半胱氨酸的基因工程菌
CN115044525A (zh) * 2022-06-30 2022-09-13 江南大学 一种利用Sigma因子提高棒杆菌抗氧化性的方法
CN117925666A (zh) * 2024-03-25 2024-04-26 天津科技大学 一种l-异亮氨酸生产菌株及其构建方法与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108441525A (zh) * 2018-04-10 2018-08-24 江南大学 一种赖氨酸产量提高的谷氨酸棒杆菌及其构建方法
CN108841734A (zh) * 2018-07-04 2018-11-20 江南大学 一种提高高山被孢霉产不饱和脂肪酸能力的方法
CN109182239A (zh) * 2018-09-14 2019-01-11 江南大学 一种谷氨酸棒杆菌重组菌及其构建方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108441525A (zh) * 2018-04-10 2018-08-24 江南大学 一种赖氨酸产量提高的谷氨酸棒杆菌及其构建方法
CN108841734A (zh) * 2018-07-04 2018-11-20 江南大学 一种提高高山被孢霉产不饱和脂肪酸能力的方法
CN109182239A (zh) * 2018-09-14 2019-01-11 江南大学 一种谷氨酸棒杆菌重组菌及其构建方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIAN-ZHONG XU ET AL.: "NADPH metabolism: a survey of its theoretical characteristics and manipulation strategies in amino acid biosynthesis", 《CRITICAL REVIEWS IN BIOTECHNOLOGY》 *
JIAN-ZHONG XU ET AL.: "NADPH metabolism: a survey of its theoretical characteristics and manipulation strategies in amino acid biosynthesis", 《CRITICAL REVIEWS IN BIOTECHNOLOGY》, 25 February 2018 (2018-02-25), pages 1 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114958704A (zh) * 2022-06-17 2022-08-30 中国科学院天津工业生物技术研究所 生产l-半胱氨酸的基因工程菌
CN114958704B (zh) * 2022-06-17 2023-09-05 中国科学院天津工业生物技术研究所 生产l-半胱氨酸的基因工程菌
CN115044525A (zh) * 2022-06-30 2022-09-13 江南大学 一种利用Sigma因子提高棒杆菌抗氧化性的方法
CN115044525B (zh) * 2022-06-30 2023-07-25 江南大学 一种利用Sigma因子提高棒杆菌抗氧化性的方法
CN117925666A (zh) * 2024-03-25 2024-04-26 天津科技大学 一种l-异亮氨酸生产菌株及其构建方法与应用
CN117925666B (zh) * 2024-03-25 2024-06-11 天津科技大学 一种l-异亮氨酸生产菌株及其构建方法与应用

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