CN117925666A - 一种l-异亮氨酸生产菌株及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种L‑异亮氨酸生产菌株及其构建方法与应用，所述菌株具有良好的L‑异亮氨酸合成能力，性能稳定，产酸效率高，通过缺失livJ、rhtA、tdh、ilvE、ilvBN（eco）基因，上调pntAB、thrA fbr BC、ilvD、ilvA fbr 、ilvIH fbr 、ilvC、tdcB、ygaZH、lrp、avtA基因的转录水平，异源表达来源于B.subtilis 168的ald、gdh基因、来源于Corynebacterium glutamicum K051的ilvBN fbr （cgl）、cysK基因，有效提高了L‑异亮氨酸合成效率，应用于发酵生产L‑异亮氨酸，具有广泛的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术与发酵工程技术领域，尤其是一种L-异亮氨酸生产菌株及其构建方法与应用。
背景技术
L-异亮氨酸(C6H13NO2)化学名称为2-氨基-3-甲基丁酸，属于支链氨基酸，L-缬氨酸是组成蛋白质的20种氨基酸之一，是人体必需的8种氨基酸和生糖氨基酸，它与其他两种高浓度氨基酸（缬氨酸和亮氨酸）一起工作促进身体正常生长，修复组织，调节血糖，并提供需要的能量。L-异亮氨酸已广泛应用于医药、食品及保健品、动物饲料和化妆品的制造等，尤其是在医学研究和治疗中的作用，日益受到重视。
目前，L-异亮氨酸的生产有蛋白质水解法、化学合成法以及生物发酵法三条主要途径。其中，蛋白质水解法存在着污染严重、得率低、产品杂质较多、纯度低、晶型差等缺点。化学合成法由于原料数量和来源较少，合成步骤相对复杂。而发酵法具有成本低，控制简单等优点，在L-异亮氨酸的大规模工业化生产中占有很大的优势，是目前L-异亮氨酸工业化生产的主要方法。
目前，微生物发酵技术已被成功地应用于有应用前景的代谢产物如醇、有机酸和氨基酸等物质的工业化生产中。目前主要采用谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）发酵法工业化生产L-异亮氨酸，然而该类菌株发酵周期较长。大肠杆菌具有遗传背景清晰、技术操作简单、代时短等优势，因而被广泛应用于L-苏氨酸、L-色氨酸及L-苯丙氨酸等氨基酸的生产，但传统的异亮氨酸生产菌株分子学改造复杂且不稳定，因此目前急需一种高效、方便、稳定的工程菌株。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种L-异亮氨酸生产菌株。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述L-异亮氨酸生产菌株的构建方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述L-异亮氨酸生产菌株的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种人工操纵子，为avtA-ald人工操纵子，包括avtA、ald基因，具体为：
（1）操纵子基因顺序为trc启动子、RBS、avtA、ald、rrnB T1终止子；
（2）trc启动子、RBS核糖结合位点与avtA基因首尾直接相连；
（3）avtA、ald基因使用linker基因相连，所述linker基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；
（4）ald、rrnB T1终止子首尾直接相连。
上述人工操纵子的构建方法，由同一个trc启动子与RBS核糖体结合位点控制操纵子开始转录，由同一个rrnB T1终止子控制操纵子终止转录，通过优化基因连接方式与基因在操纵子中的存在位置获得。
一种L-异亮氨酸生产菌株，为基因组上具有上述avtA-ald人工操纵子所有特征的菌株XX16，所述菌株以E.coli W3110作为底盘菌株，缺失了livJ、rhtA、tdh、ilvE、ilvBN（eco）基因，上调了pntAB、thrAfbrBC、ilvD、ilvAfbr、ilvIHfbr、ilvC、tdcB、ygaZH、lrp、avtA基因的转录水平，异源表达了来源于B.subtilis 168的ald、gdh基因、来源于Corynebacterium glutamicum K051的ilvBNfbr（cgl）、cysK基因。
优选的，上述L-异亮氨酸生产菌株，是由下述方法改造获得的：以E.coli W3110作为底盘菌株，敲除了菌株基因组上的livJ、rhtA、tdh、ilvE、ilvBN（eco）基因；利用trc启动子强化了pntAB基因转录，并整合到基因组yjiV假基因位点；利用trc启动子强化了苏氨酸操纵子thrAfbrBC基因转录，并整合到基因组ycgH假基因位点且双拷贝至yeeP假基因位点；利用trc启动子强化了ilvD基因转录，并整合到基因组yciQ假基因位点；利用trc启动子强化了ilvAfbr基因转录，并整合到基因组yeeL假基因位点；利用trc启动子强化了ilvIHfbr基因转录，并整合到基因组mbhA假基因位点；利用trc启动子强化了ilvC基因转录，并整合到基因组ycdN假基因位点；利用trc启动子强化了tdcB基因转录，并整合到基因组ygaY假基因位点；利用trc启动子强化了ygaZH基因转录，并整合到基因组ylbE假基因位点；利用trc启动子强化了lrp基因转录，并整合到基因组ilvG假基因位点；利用trc启动子强化了avtA基因和来源于B.subtilis 168的ald基因转录，并整合到基因组yjgX假基因位点形成avtA-ald人工操纵子；利用trc启动子强化了来源于Corynebacterium glutamicum K051的ilvBNfbr（cgl）基因转录，并整合到基因组rhtA假基因位点；利用trc启动子强化了来源于Corynebacterium glutamicum K051的cysK基因转录，并整合到基因组tdh假基因位点；利用trc启动子强化了来源于B.subtilis 168的gdh基因转录，并整合到基因组ilvE假基因位点。
上述thrAfbrBC基因进行了点突变，即第1034位碱基由C变为T，导致第345位氨基酸残基由丝氨酸变为苯丙氨酸；上述ilvAfbr基因进行了点突变，即第1339位碱基由 C 变为T,第1341位碱基由G 变为T, 第1351位碱基由 C 变为G, 第1352位碱基由T变为C，导致第447位氨基酸残基由亮氨酸变为苯丙氨酸，第451为氨基酸残基由亮氨酸变为丙氨酸；上述ilvIHfbr基因进行了点突变，即第41位碱基由G变为A，第50位碱基由C变为T，导致第14位氨基酸残基由甘氨酸变为天冬氨酸，第17位氨基酸残基由丝氨酸变为苯丙氨酸；上述ilvBNfbr（cgl）经过了点突变，即第526位碱基由C变为T，第1278位碱基由C变为A，导致第176位氨基酸残基由脯氨酸变为丝氨酸，第426位氨基酸残基由天冬氨酸变为谷氨酸。
优选的，上述L-异亮氨酸生产菌株，所述trc启动子的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.1所示；RBS核糖体结合位点的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；livJ基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示；IlvBN（eco）基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示；rhtA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示；tdh基因的核苷酸序列如序列表SEQID NO.7所示；ilvE基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示；pntAB基因簇的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示；ThrAfbrBC基因簇的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.10所示；ilvD基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.11所示；ilvAfbr基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.12所示；ilvIHfbr基因簇的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.13所示；ilvC基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.14所示；tdcB基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.15所示；ygaZH基因簇的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.16所示；lrp基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.17所示；avtA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.18所示；ald基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.19所示；IlvBNfbr（cgl）基因的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.20所示；cysK基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.21所示；gdh基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.22所示。
优选的，上述L-异亮氨酸生产菌株，E.coli W3110为E.coli W3110 ATCC 273250。
上述L-异亮氨酸生产菌株的构建方法，在出发菌株E.coli W3110基础上进行定向改造，具体步骤分为如下3个模块：
(1)增加前体物苏氨酸产量：包括敲除L-苏氨酸外转运蛋白基因rhtA；敲除苏氨酸分解代谢基因tdh；提高苏氨酸操纵子thrAfbrBC转录水平，提高L-异亮氨酸生成途径的前体供应；
（2）提高还原力：提高吡啶核苷酸转氢酶基因pntAB的转录水平，提高了NADPH的供应，引入来源于B.subtilis 168的葡萄糖 1-脱氢酶基因gdh，提高了NADPH的供应，敲除支链氨基酸氨基转移酶基因ilvE，减少了NADPH的消耗；
（3）增加L-异亮氨酸产量：敲除L-异亮氨酸内转运蛋白基因livJ，敲除自身乙酰乳酸合酶基因ilvBN（eco），提高自身二羟基酸脱水酶基因ilvD、酮酸还原异构酶基因ilvC、乙酰乳酸合酶基因ilvIHfbr、苏氨酸脱氢酶基因ilvAfbr、苏氨酸脱氢酶基因tdcB、L-异亮氨酸外转运蛋白基因ygaZH转录水平，增加L-异亮氨酸产量，提高自身转录结合调节蛋白基因lrp转录水平，促进ilvIHfbr、ygaZH表达，提高引入来源于Corynebacterium glutamicumK051的半胱氨酸合酶基因cysK转录水平，提高L-异亮氨酸合成途径各关键酶转录水平，提高引入来源于Corynebacterium glutamicum K051的乙酰乳酸合酶基因ilvBNfbr（cgl），提高引入来源于B.subtilis 168的丙氨酸脱氢酶ald基因和自身缬氨酸-丙酮酸转氨酶avtA基因转录水平。
上述L-异亮氨酸生产菌株在发酵生产L-异亮氨酸方面的应用。
优选的，上述L-异亮氨酸生产菌株的应用，在适宜发酵条件下以所述工程菌在培养基中发酵得到L-异亮氨酸。
优选的，上述L-异亮氨酸生产菌株的应用，培养基包括但不限于：碳源、氮源、无机盐、维生素等。发酵条件包括发酵温度、发酵pH、发酵溶氧条件、发酵压力、发酵时间等。所述培养基均可通过常规方法获得并用于L-异亮氨酸生产，发酵条件可以调整以期适应菌株生产特性。
优选的，上述L-异亮氨酸生产菌株的应用，具体步骤如下：
①菌种活化：取L-异亮氨酸生产菌株XX16划线接种于活化斜面，37℃培养12h，并传代一次；
②种子培养：用接种环刮取一环斜面种子接种于装有种子培养基的三角瓶中，纱布封口，36℃，200r/min培养10 h；
③发酵培养：按10%-15%接种量接种菌种活化后制备的种子液到装有发酵培养基的三角瓶中，纱布封口，温度维持在37±0.2℃，220 r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水来维持pH在7.0-7.2；添加葡萄糖溶液补充菌体所需的碳源，发酵周期30h。
优选的，上述L-异亮氨酸生产菌株的应用，所述步骤②中采用的种子培养基为：葡萄糖20 g/L，酵母粉3 g/L，蛋白胨3 g/L，(NH4)2SO41 g/L，K2HPO4·3H2O 3 g/L，MgSO4·7H2O2 g/L，柠檬酸2 g/L，谷氨酸3g/L，蛋氨酸0.5g/L，FeSO4·7H2O 10 mg/L，MgSO4·7H2O 10mg/L，其余为水。
优选的，上述L-异亮氨酸生产菌株的应用，所述步骤③采用的发酵培养基为：酵母粉4 g/L，蛋白胨3g/L，(NH4)2SO44 g/L，K2HPO4·3H2O 4 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，谷氨酸4g/L，蛋氨酸0.3 g/L，柠檬酸3g/L，MnSO4·7H2O 10 mg/L，FeSO4·7H2O 30 mg/L，玉米浆20ml/L，其余为水。
上述培养基均可采用标准方法制备获得。
有益效果：
上述L-异亮氨酸生产菌株，不含有质粒，遗传稳定，无需添加抗性物质，具有良好的L-异亮氨酸合成能力，生产成本低，性能稳定，产酸效率高，具有良好的经济效益；通过缺失livJ、rhtA、tdh、ilvE、ilvBN（eco）基因，上调pntAB、thrA fbr BC、ilvD、ilvA fbr 、ilvIH fbr 、ilvC、tdcB、ygaZH、lrp、avtA基因的转录水平，异源表达来源于B.subtilis168的ald、gdh基因、来源于Corynebacterium glutamicumK051的ilvBN fbr （cgl）、cysK基因，有效提高了L-异亮氨酸合成效率，提高了L-异亮氨酸生产水平，具有广泛的工业应用前景。具体来讲：
（1）通过提高pntAB、gdh基因的转录水平，提高了NADPH的供应，通过敲除ilvE基因减少了NADPH的消耗，为L-异亮氨酸合成提供了大量的还原力；
（2）引入来源于B.subtilis 168的丙氨酸脱氢酶ald基因和自身缬氨酸-丙酮酸转氨酶avtA基因形成人工操纵子替代敲除的支链氨基酸氨基转移酶基因ilvE作用，将KMV还原胺化为L-异亮氨酸；
（3）由于在E.coli W3110中ilvBN（eco）基因主要参与副产物亮氨酸、缬氨酸代谢合成途径，而在Corynebacterium glutamicum K051中ilvBNfbr（cgl）主要参与L-异亮氨酸代谢合成途径。所以敲除ilvBN（eco）基因，过表达ilvBNfbr（cgl）基因可以进一步减少副产物亮氨酸、缬氨酸的合成，提高L-异亮氨酸的产量。
附图说明
图1为L-异亮氨酸基因工程菌从头合成途径改造过程图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例中涉及到的百分号“%”，若未特别说明，指质量百分比，溶液的百分比指100mL中含有溶质的克数，液体之间的百分比，是指在25℃时溶液的体积比例。
如图1所示，根据整个菌株改造过程的代谢路径对菌种进行改造，获得L-异亮氨酸生产菌株XX16，改造过程主要包括如下3个模块：
(1)增加前体物苏氨酸产量：包括敲除L-苏氨酸外转运蛋白基因rhtA；敲除苏氨酸分解代谢基因tdh；提高苏氨酸操纵子thrAfbrBC转录水平，提高L-异亮氨酸生成途径的前体供应；
（2）提高还原力：提高吡啶核苷酸转氢酶基因pntAB的转录水平，提高了NADPH的供应，引入来源于B.subtilis 168的葡萄糖1-脱氢酶基因gdh，提高了NADPH的供应，敲除支链氨基酸氨基转移酶基因ilvE，减少了NADPH的消耗；
（3）增加L-异亮氨酸产量：敲除L-异亮氨酸内转运蛋白基因livJ，敲除自身乙酰乳酸合酶基因ilvBN（eco），提高自身二羟基酸脱水酶基因ilvD、酮酸还原异构酶基因ilvC、乙酰乳酸合酶基因ilvIHfbr、苏氨酸脱氢酶基因ilvAfbr、苏氨酸脱氢酶基因tdcB、L-异亮氨酸外转运蛋白基因ygaZH转录水平，增加L-异亮氨酸产量，提高自身转录结合调节蛋白基因lrp转录水平，促进ilvIHfbr、ygaZH表达，提高引入来源于Corynebacterium glutamicumK051的半胱氨酸合酶基因cysK转录水平，提高L-异亮氨酸合成途径各关键酶转录水平，提高引入来源于Corynebacterium glutamicum K051的乙酰乳酸合酶基因ilvBNfbr（cgl），提高引入来源于B.subtilis 168的丙氨酸脱氢酶ald基因和自身缬氨酸-丙酮酸转氨酶avtA基因转录水平。
上述基因操作采用的基因编辑方法参照文献（Li Y，Lin Z，Huang C，et al.Metabolic engineering of Escherichia coli using CRISPR-Cas9 meditated genomeediting. Metabolic Engineering，2015，31：13-21.），本发明涉及到的专业名词，若无特别备注，均可在该文章中得到解释。本发明所指的“敲除”是指将目的基因失活，“引入”是指将外源基因与启动子、终止子连接后插入到工程菌基因组中。
E.coli W3110为E.coli W3110 ATCC 273250（购买获得），涉及到的基因序列如下：
trc启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；RBS核糖体结合位点的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；linker基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；livJ基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示；IlvBN（eco）基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示；rhtA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示；tdh基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示；ilvE基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示；pntAB基因簇的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示；ThrAfbrBC基因簇的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.10所示；ilvD基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.11所示；ilvAfbr基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.12所示；ilvIHfbr基因簇的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.13所示；ilvC基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.14所示；tdcB基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.15所示；ygaZH基因簇的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.16所示；lrp基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.17所示；avtA基因的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.18所示；ald基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.19所示；IlvBNfbr（cgl）基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.20所示；cysK基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.21所示；gdh基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.22所示。
涉及到的菌株构建过程中用到的引物见表1。
表1菌株构建过程中所涉及的引物
| 引物名称 | 序列号 | 引物序列（5’-3’） |
| livJ-US | SEQ ID NO.23 | AATTTCCCCTCCGGCAAAACG |
| livJ-UA | SEQ ID NO.24 | AGGTGGTCCAAACGAATGCGGCCGCCTTTAGCGTTGATATCC |
| livJ-DS | SEQ ID NO.25 | GGATATCAACGCTAAAGGCGGCCGCATTCGTTTGGACCACCT |
| livJ-DA | SEQ ID NO.26 | GCGCTACGCTTATCAGGCC |
| pGRB-livJ-s | SEQ ID NO.27 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTACAGCAATACGGCGAAGGTCGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-livJ-a | SEQ ID NO.28 | TTCTAGCTCTAAAACGACCTTCGCCGTATTGCTGTACTAGTATTATACCTAGGACT |
| ilvBN（eco）-US | SEQ ID NO.29 | CCCTGTAAAGCTGTGCTTGT |
| ilvBN（eco）-UA | SEQ ID NO.30 | GGTCATTACGCCCGGATGGCCCTGAGCGATAAAGCCCG |
| ilvBN（eco）-DS | SEQ ID NO.31 | CGGGCTTTATCGCTCAGGGCCATCCGGGCGTAATGACC |
| ilvBN（eco）-DA | SEQ ID NO.32 | CAAATACACACCTGCACACCG |
| pGRB-ilvBN（eco）-s | SEQ ID NO.33 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTGATTAACGCTGCCAAACGCCGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-ilvBN（eco）-a | SEQ ID NO.34 | TTCTAGCTCTAAAACGGCGTTTGGCAGCGTTAATCACTAGTATTATACCTAGGACT |
| rhtA-US | SEQ ID NO.35 | CGGAAGTACCTGCGGTGAAAG |
| rhtA-UA | SEQ ID NO.36 | TTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAGACTATTGGTAACCAGACCGGC |
| rhtA-DS | SEQ ID NO.37 | CTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATGGGTCTACGCTGACAGTACG |
| rhtA-DA | SEQ ID NO.38 | CCTGGCGATTCAGCAACTCTAC |
| ilvBNfbr（cgl）-S | SEQ ID NO.39 | GTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGAATGTGGCAGCTTCTCAAC |
| ilvBNfbr（cgl）-A | SEQ ID NO.40 | CAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTAGATCTTGGCCGGAGCCTG |
| pGRB-rhtA-s | SEQ ID NO.41 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTCGATTTAACCGGCTGTGCGCGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-rhtA-a | SEQ ID NO.42 | TTCTAGCTCTAAAACGCGCACAGCCGGTTAAATCGACTAGTATTATACCTAGGACT |
| tdh-US | SEQ ID NO.43 | GTCAGTTCCGTGAGCAAATGTCG |
| tdh-UA | SEQ ID NO.44 | GTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAGGCACCGGGATGGTTTTTTG |
| tdh-DS | SEQ ID NO.45 | CTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATAAGGCTTGTTCATTAAAGGTATTTACGG |
| tdh-DA | SEQ ID NO.46 | GGTGCTGTTCATCATAAATTACCGAC |
| pGRB-tdh-s | SEQ ID NO.47 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTGGCGAAGATGTGCTGGTTTCGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-tdh-a | SEQ ID NO.48 | TTCTAGCTCTAAAACGAAACCAGCACATCTTCGCCACTAGTATTATACCTAGGACT |
| cysK-s | SEQ ID NO.49 | GTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGATTGGAGCACCACCCGA |
| cysK-a | SEQ ID NO.50 | CAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTAGTCGCGGATGTCTTCGTAAAGAA |
| ilvE-US | SEQ ID NO.51 | GGAGAAATTATCATGATGCAACATCAGG |
| ilvE-UA | SEQ ID NO.52 | GAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAATGGCGGAATACAACCGGTC |
| ilvE-DS | SEQ ID NO.53 | GGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCGCAGCGTAGACGGTATTCAG |
| ilvE-DA | SEQ ID NO.54 | TGGCCCATGGCAATCCCATC |
| pGRB-ilvE-s | SEQ ID NO.55 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTGATTATCGCTGCTTTCCCGTGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-ilvE-a | SEQ ID NO.56 | TTCTAGCTCTAAAACACGGGAAAGCAGCGATAATCACTAGTATTATACCTAGGACT |
| gdh-s | SEQ ID NO.57 | GTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGTATCCGGATTTAAAAGGAAAAGTCGTC |
| gdh-a | SEQ ID NO.58 | GACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTAACCGCGGCCTGCCTG |
| yjiV-US | SEQ ID NO.59 | GACTGTGGAAGCCCTGTATACG |
| yjiV-UA | SEQ ID NO.60 | AATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACTGTCCCTTGTCGACTGTCTGT |
| yjiV-DS | SEQ ID NO.61 | AAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATTGAACGAGTTTATTCTGCCGG |
| yjiV-DA | SEQ ID NO.62 | TGGCGACATTCCCTTCCTT |
| pntAB-s | SEQ ID NO.63 | CCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGCGAATTGGCATACCAAGAG |
| pntAB-a | SEQ ID NO.64 | CAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTACAGAGCTTTCAGGATTGCATCCAC |
| pGRB-yjiV-s | SEQ ID NO.65 | GAACCAACTATCTACCAGCGTTAACAGATCGTTTAGATCCGA |
| pGRB-yjiV-a | SEQ ID NO.66 | GTAGGTCCACTTGAGACGGTTATATAATCGCCATCACTTTCC |
| ycgH-US | SEQ ID NO.67 | TAAACTCGTCAGCGGCACAA |
| ycgH-UA | SEQ ID NO.68 | GAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAGGTAGGCGTTTCTGTTGATTCTG |
| ycgH-DS-4# | SEQ ID NO.69 | ATGCACAGGAGACTTTCTGATGCGCTGGTTGATTTCTTCTAGGGTCATAGTAATCCAGCAACTGCGTGTCGGATTATCGTTCG |
| ycgH-DS-1# | SEQ ID NO.70 | CTGAACAACATCATATTTAAATGAACATAACTCAATTTGTAGGCTAGCATAACCCCTTGGGGCGCGTGTCGGATTATCGTTCG |
| ycgH-DS | SEQ ID NO.71 | GACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATGCGTGTCGGATTATCGTTCG |
| ycgH-DA | SEQ ID NO.72 | GATTCAGGTTGCCATTTACGC |
| thr1-s | SEQ ID NO.73 | GTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGCGAGTGTTGAAGTTCGG |
| thr1-a-4# | SEQ ID NO.74 | AGTTGCTGGATTACTATGACCCTAGAAGAAATCAACCAGCGCATCAGAAAGTCTCCTGTGCATGTTTTCCAGATTAAGGCCATGTACATTG |
| thr2-S | SEQ ID NO.75 | CTTACGTGTCTGCGGTGTTG |
| thr2-A-1# | SEQ ID NO.76 | GCCCCAAGGGGTTATGCTAGCCTACAAATTGAGTTATGTTCATTTAAATATGATGTTGTTCAGGCCTGCCAGATGTCGCC |
| thr3-S | SEQ ID NO.77 | TCGACGGCAGAAGCCAGG |
| thr3-A | SEQ ID NO.78 | GATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTACTGATGATTCATCATCAATTTACGCAACG |
| pGRB-ycgH-s | SEQ ID NO.79 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTTATGCGTCTGAACGACCGTGGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-ycgH-a | SEQ ID NO.80 | TTCTAGCTCTAAAACCACGGTCGTTCAGACGCATAACTAGTATTATACCTAGGACT |
| pGRB-4#-s | SEQ ID NO.81 | ATGCACAGGAGACTTTCTGATGCGCTGGTTGATTTCTTCTAGGGTCATAGTAATCCAGCAACT |
| pGRB-4#-a | SEQ ID NO.82 | AGTTGCTGGATTACTATGACCCTAGAAGAAATCAACCAGCGCATCAGAAAGTCTCCTGTGCAT |
| pGRB-1#-s | SEQ ID NO.83 | CTGAACAACATCATATTTAAATGAACATAACTCAATTTGTAGGCTAGCATAACCCCTTGGGGC |
| pGRB-1#-a | SEQ ID NO.84 | GCCCCAAGGGGTTATGCTAGCCTACAAATTGAGTTATGTTCATTTAAATATGATGTTGTTCAG |
| yeeP-US | SEQ ID NO.85 | GGTCAGGAGGTAACTTATCAGCG |
| yeeP-UA | SEQ ID NO.86 | GTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAATGGCAGGGCTCCGTTTT |
| yeeP-DS-4# | SEQ ID NO.87 | ATGCACAGGAGACTTTCTGATGCGCTGGTTGATTTCTTCTAGGGTCATAGTAATCCAGCAACTGAACTGGATTTTCTTCTGAACCTGT |
| yeeP-DS-1# | SEQ ID NO.88 | CTGAACAACATCATATTTAAATGAACATAACTCAATTTGTAGGCTAGCATAACCCCTTGGGGCGAACTGGATTTTCTTCTGAACCTGT |
| yeeP-DS | SEQ ID NO.89 | GGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATGAACTGGATTTTCTTCTGAACCTGT |
| yeeP-DA | SEQ ID NO.90 | ACGATGTCAGCAGCCAGC |
| pGRB-yeeP-s | SEQ ID NO.91 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTTGAACAGTTTACCGGTGCGGGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-yeeP-a | SEQ ID NO.92 | TTCTAGCTCTAAAACCCGCACCGGTAAACTGTTCAACTAGTATTATACCTAGGACT |
| yciQ-US | SEQ ID NO.93 | TTACTTGAAGCATTGGGCGAAC |
| yciQ-UA | SEQ ID NO.94 | AATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACCAGTCAAGATGCCAGGGTTC |
| yciQ-DS | SEQ ID NO.95 | AAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATGTCTGACAAGAACCAGCAAATCCT |
| yciQ-DA | SEQ ID NO.96 | ATAGCTTCACCGTGGGCATAAC |
| ilvD-s | SEQ ID NO.97 | CGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGCCTAAGTACCGTTCCGC |
| ilvD-a | SEQ ID NO.98 | CAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTAACCCCCCAGTTTCGATTTATCGC |
| pGRB-yciQ-s | SEQ ID NO.99 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTAAACAACGTTTCTTGCCTCAGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-yciQ-a | SEQ ID NO.100 | TTCTAGCTCTAAAACTGAGGCAAGAAACGTTGTTTACTAGTATTATACCTAGGACT |
| yeeL-US | SEQ ID NO.101 | TTCATCGGGACGAGTGGAGA |
| yeeL-UA | SEQ ID NO.102 | TCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACCATAGCATCGCCAATCTGATCGGG |
| yeeL-DS | SEQ ID NO.103 | AAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATACCCAAAGGTGAAGATA |
| yeeL-DA | SEQ ID NO.104 | CATTCCCTCTACAGAACTAG |
| ilvAfbr-s | SEQ ID NO.105 | CATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGGCTGACTCGCAACCC |
| ilvAfbr-a | SEQ ID NO.106 | AACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGCTAACCCGCCAAAAAGAACCTGA |
| pGRB-yeeL-s | SEQ ID NO.107 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTAACACAGCAATACGGTACGCGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-yeeL-a | SEQ ID NO.108 | TTCTAGCTCTAAAACGCGTACCGTATTGCTGTGTTACTAGTATTATACCTAGGACT |
| mbhA-US | SEQ ID NO.109 | GCCAGCACGAACATAATCCC |
| mbhA-UA | SEQ ID NO.110 | GGTCTGTTTCCTGCTAGCACTATACCTAGGACTGAGCTAGCCGTAAACACGGTGGCAGGTTTTGG |
| mbhA-DS | SEQ ID NO.111 | AAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATGACCAAAAGTGCGTCCGATAC |
| mbhA-DA | SEQ ID NO.112 | CGGCGTAATCACAAACTGGC |
| ilvIHfbr-s | SEQ ID NO.113 | CCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGGAGATGTTGTCTGGAGCC |
| ilvIHfbr-a | SEQ ID NO.114 | AAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTCAACGCATTATTTTATCGCCGCG |
| pGRB-mbhA-s | SEQ ID NO.115 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTGCGTGATGTGAATGAGAAAAGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-mbhA-a | SEQ ID NO.116 | TTCTAGCTCTAAAACTTTTCTCATTCACATCACGCACTAGTATTATACCTAGGACT |
| ycdN-US | SEQ ID NO.117 | GATTTTGACGCCACCAACACC |
| ycdN-UA | SEQ ID NO.118 | AATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACCAATCCACATCACACAATCCAT |
| ycdN-DS | SEQ ID NO.119 | AAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATGAAGGGATTTTTGGCTATCAGGA |
| ycdN-DA | SEQ ID NO.120 | CATATCGTATTCGCCAGGCTG |
| ilvC-s | SEQ ID NO.121 | GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGGCTAACTACTTCAATACACTGAATCTGCG |
| ilvC-a | SEQ ID NO.122 | CAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTAACCCGCAACAGCAATACGTTTC |
| pGRB-ycdN-s | SEQ ID NO.123 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTGCGTGGAAATCATCATGGCTGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-ycdN-a | SEQ ID NO.124 | TTCTAGCTCTAAAACAGCCATGATGATTTCCACGCACTAGTATTATACCTAGGACT |
| ygaY-US | SEQ ID NO.125 | ACCCAACCTTACGCAACCAG |
| ygaY-UA | SEQ ID NO.126 | GTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAATTGTTCGATAACCGCAGCAT |
| ygaY-DS | SEQ ID NO.127 | AAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCGCTGGCGTGCTTTGAA |
| ygaY-DA | SEQ ID NO.128 | GGCGTAACTCAGCAGGCAG |
| tdcB-s | SEQ ID NO.129 | CTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGCATATTACATACGATCTGCCGG |
| tdcB-a | SEQ ID NO.130 | ACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTAAGCGTCAACGAAACCGGTG |
| pGRB-ygaY-s | SEQ ID NO.131 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTCACTGATGGCGCTGGCATTAGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-ygaY-a | SEQ ID NO.132 | TTCTAGCTCTAAAACTAATGCCAGCGCCATCAGTGACTAGTATTATACCTAGGACT |
| ylbE-US | SEQ ID NO.133 | ACCCAACCTTACGCAACCAG |
| ylbE-UA | SEQ ID NO.134 | GTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAATTGTTCGATAACCGCAGCAT |
| ylbE-DS | SEQ ID NO.135 | AAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCGCTGGCGTGCTTTGAA |
| ylbE-DA | SEQ ID NO.136 | GGCGTAACTCAGCAGGCAG |
| ygaZH-s | SEQ ID NO.137 | GTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGGAAAGCCCTACTCCACAG |
| ygaZH-a | SEQ ID NO.138 | GATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTATATAATCGCCATCACTTTCCAGGC |
| pGRB-ylbE-s | SEQ ID NO.139 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTACACTGGCTGGATGTGCAACGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-ylbE-a | SEQ ID NO.140 | TTCTAGCTCTAAAACGTTGCACATCCAGCCAGTGTACTAGTATTATACCTAGGACT |
| ilvG-US | SEQ ID NO.141 | ACCGAGGAGCAGACAATGAATAA |
| ilvG-UA | SEQ ID NO.142 | AATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAGGTGATGGCAACAACAGGGA |
| ilvG-DS | SEQ ID NO.143 | CTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCTATCTACGCGCCGTTGTTGTT |
| ilvG-DA | SEQ ID NO.144 | GCGCTGGCTAACATGAGGAA |
| lrp-s | SEQ ID NO.145 | GTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGGTAGATAGCAAGAAGCGCC |
| lrp-a | SEQ ID NO.146 | CAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTAGCGCGTCTTAATAACCAGACG |
| pGRB-ilvG-s | SEQ ID NO.147 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTTATCGGCACTGACGCATTTCGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-ilvG-a | SEQ ID NO.148 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTGGAAGAGTTGCCGCGCATCAGTTTTAGAGCTAGAA |
| avtA-s | SEQ ID NO.149 | CGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGACATTCTCCCTTTTTGGTGACAA |
| avtA-a | SEQ ID NO.150 | TTTTTACCCTTTCTGCACGCGGTCAGCCTGTTAGTGACTTTCAGCCCAGGCT |
| ald-s | SEQ ID NO.151 | CAGGCTGACCGCGTGCAGAAAGGGTAAAAAATGATCATAGGGGTTCCTAAAGAGATAAAAAAC |
| ald-a | SEQ ID NO.152 | CGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTAAGCACCCGCCACAGATG |
| yjgX-US | SEQ ID NO.153 | GGAAGTCAACGGGTTATGCG |
| yjgX-UA | SEQ ID NO.154 | GTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAAAAATCACCACGAATACCAGAATCGC |
| yjgX-DS | SEQ ID NO.155 | GACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATACAGTGTCTTCCCTGAGCCG |
| yjgX-DA | SEQ ID NO.156 | GGCGAAGGATACCATCAAGC |
| pGRB-yjgX-s | SEQ ID NO.157 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTTCGCGACCACCGTAACTGGCGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-yjgX-a | SEQ ID NO.158 | TTCTAGCTCTAAAACGCCAGTTACGGTGGTCGCGAACTAGTATTATACCTAGGACT |
实施例1
本实施例旨在说明菌株XX16的具体构建步骤。特别的，实施例中若有同类型基因操作方法，则仅提供1次，并做注释，不再多加赘述。
①敲除livJ基因：以E.coliW3110基因组为模板，分别以livJ-US、livJ-UA和livJ-DS、livJ-DA，通过pcr扩增得到上、下游同源臂，接着，以上下游同源臂为模板，以livJ-US、livJ-DA为引物，通过重叠pcr扩增得到重叠片段；以pGRB-livJ-s、pGRB-livJ-a为引物，退火得到gRNA片段，并将其与pGRB载体连接，得到livJ-pGRB；制备E.coliW3110电转化感受态细胞，将重叠片段与livJ-pGRB一同电转化进入感受态细胞，并筛选得到阳性转化子，获得菌株XX01。
②敲除ilvBN（eco）基因：具有①中相同操作方法，不同之处在于，所用引物为ilvBN（eco）-US、ilvBN（eco）-UA、ilvBN（eco）-DS、ilvBN（eco）-DA、pGRB-ilvBN（eco）-s、pGRB-ilvBN（eco）-a。感受态细胞为XX01，获得菌株XX02。
③敲除rhtA基因并在该位点整合来源于Corynebacterium glutamicum K051的ilvBNfbr（cgl）基因：以E.coliW3110基因组为模板，分别以rhtA-US、rhtA-UA和rhtA-DS、rhtA-DA，通过pcr扩增得到上、下游同源臂，以Corynebacterium glutamicum K051基因组为模板，以ilvBNfbr（cgl）-S、ilvBNfbr（cgl）-A为引物，通过pcr扩增得到目的基因片段；接着，以上下游同源臂、目的基因片段为模板，以rhtA-US、rhtA-DA为引物，通过重叠pcr扩增得到重叠片段；以pGRB-rhtA-s、pGRB-rhtA-a为引物，退火得到gRNA片段，并将其与pGRB载体连接，得到rhtA-pGRB；制备XX02电转化感受态细胞，将目的片段与rhtA-pGRB一同电转化进入感受态细胞，并筛选得到阳性转化子，获得菌株XX03。
④敲除tdh基因并在该位点整合来源于Corynebacterium glutamicum K051的cysK基因：具有③中相同操作，不同之处在于，所用引物分别为tdh-US、tdh-UA、tdh-DS、tdh-DA、pGRB-tdh-s、pGRB-tdh-a、cysK-s、cysK-a。感受态细胞为XX03，获得菌株XX04。
⑤敲除ilvE基因并在该位点整合来源于B.subtilis 168的gdh基因：具有③中相同操作，不同之处在于，使用B.subtilis 168基因组获得基因片段，引物分别为ilvE-US、ilvE-UA、ilvE-DS、ilvE-DA、pGRB-ilvE-s、pGRB-ilvE-a、gdh-s、gdh-a。感受态细胞为XX04，获得菌株XX05。
⑥在yjiV假基因位点使用trc启动子控制pntAB基因过表达：以E.coliW3110基因组为模板，分别以yjiV-US、yjiV-UA和yjiV-DS、yjiV-DA、pntAB-s、pntAB-a通过pcr扩增得到上、下游同源臂和目的基因片段，接着，以上下游同源臂、目的基因片段为模板，以yjiV-US、yjiV-DA为引物，通过重叠pcr扩增得到重叠片段；以pGRB-yjiV-s、pGRB-yjiV-a为引物，退火得到gRNA片段，并将其与pGRB载体连接，得到yjiV-pGRB；制备XX05电转化感受态细胞，将目的片段与yjiV-pGRB一同电转化进入感受态细胞，并筛选得到阳性转化子，获得菌株XX06。
⑦在ycgH假基因位点使用trc启动子控制thrAfbrBC基因过表达：
（1）以E.coliW3110基因组为模板，分别以ycgH-US、ycgH-UA和ycgH-DS-4#、ycgH-DA、thr1-s、thr1-a-4#通过pcr扩增得到上、下游同源臂和目的基因片段，接着，以上下游同源臂、目的基因片段为模板，以ycgH-US、ycgH-DA为引物，通过重叠pcr扩增得到重叠片段；以pGRB-ycgH-s、pGRB-ycgH-a为引物，退火得到gRNA片段，并将其与pGRB载体连接，得到ycgH-pGRB；制备XX06电转化感受态细胞，将目的片段与ycgH-pGRB一同电转化进入感受态细胞，并筛选得到阳性转化子，获得菌株XX07-1。
（2）分别以thr2-S、thr2-A-1#和ycgH-DS-1#、ycgH-DA通过pcr扩增得到上、下游同源臂，接着，以上下游同源臂为模板，以thr2-S、ycgH-DA为引物，通过重叠pcr扩增得到重叠片段；以pGRB-4#-s、pGRB-4#-a为引物，退火得到gRNA片段，并将其与pGRB载体连接，得到4#-pGRB；制备XX06-1电转化感受态细胞，将目的片段与4#-pGRB一同电转化进入感受态细胞，并筛选得到阳性转化子，获得菌株XX07-2。
（3）分别以thr3-S、thr3-A和ycgH-DS、ycgH-DA通过pcr扩增得到上、下游同源臂，接着，以上下游同源臂为模板，以thr3-S、ycgH-DA为引物，通过重叠pcr扩增得到重叠片段；以pGRB-1#-s、pGRB-1#-a为引物，退火得到gRNA片段，并将其与pGRB载体连接，得到1#-pGRB；制备XX06-2电转化感受态细胞，将目的片段与1#-pGRB一同电转化进入感受态细胞，并筛选得到阳性转化子，获得菌株XX07-3。
⑧在yeeP假基因位点使用trc启动子控制thrAfbrBC基因过表达：具有⑦中相同操作方法，不同之处在于，所用引物ycgH-US更换为yeeP-US、ycgH-UA更换为yeeP-UA、ycgH-DS-4#更换为yeeP-DS-4#、ycgH-DS-1#更换为yeeP-DS-1#、ycgH-DS更换为yeeP-DS、ycgH-DA更换为yeeP-DA，感受态细胞依次为XX07-3、XX08-1、XX08-2，获得菌株XX08-3。
⑨在yciQ假基因位点使用trc启动子控制ilvD基因过表达：具有⑥中相同操作方法，不同之处在于，所用引物为yciQ-US、yciQ-UA和yciQ-DS、yciQ-DA、ilvD-s、ilvD-a、pGRB-yciQ-s、pGRB-yciQ-a，感受态细胞为XX08-3，获得菌株XX09。
⑩依次在yeeL、mbhA、ycdN、ygaY、ylbE、ilvG假基因位点分别整合ilvAfbr、ilvIHfbr、ilvC、tdcB、ygaZH、lrp基因：具有⑥中相同操作方法，得到菌株XX10、XX11、XX12、XX13、XX14、XX15。
⑪在yjgX假基因位点整合avtA-ald人工操纵子基因：以E.coliW3110基因组为模板，以avtA-s、avtA-a为引物通过pcr扩增得到目的片段avtA，以B.subtilis 168基因组为模板，以ald-s、ald-a为引物通过pcr扩增得到目的片段ald，接着，以目的片段avtA、ald为模板，以avtA-s、ald-a为引物，通过重叠pcr扩增得到重叠片段avtA-ald；接着，以E.coliW3110基因组为模板，分别以yjgX-US、yjgX-UA和yjgX-DS、yjgX-DA，通过pcr扩增得到上、下游同源臂，接着，以上、下游同源臂和重叠片段avtA-ald为模板，以yjgX-US、yjgX-DA为引物，通过重叠pcr扩增得到重叠片段yigX-avtA-ald；以pGRB-yjgX-s、pGRB-yjgX-a为引物，退火得到gRNA片段，并将其与pGRB载体连接，得到yjgX-pGRB；制备XX15电转化感受态细胞，将目的片段yigX-avtA-ald与yjgX-pGRB一同电转化进入感受态细胞，并筛选得到阳性转化子，获得菌株XX16。
实施例2
本实施例旨在说明实施例1所得菌株XX16的摇瓶发酵应用，具体步骤为：
①菌种活化：基因工程菌XX16划线接种于活化斜面，37℃培养12h，并传代一次。
②种子培养：用接种环刮取一环斜面种子接种于装有30 mL种子培养基的500 mL三角瓶中，九层纱布封口，36℃，200r/min培养10 h，采用的种子培养基为：葡萄糖20 g/L，酵母粉3 g/L，蛋白胨3 g/L，(NH4)2SO41 g/L，K2HPO4·3H2O 3 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，柠檬酸2 g/L，谷氨酸3g/L，蛋氨酸0.5g/L，FeSO4·7H2O 10 mg/L，MgSO4·7H2O 10 mg/L，其余为水。
③发酵培养：按10%-15%接种量接种菌种活化后制备的种子液到装有发酵培养基的三角瓶中，九层纱布封口，温度维持在37±0.2℃，220 r/min振荡培养，发酵过程中通过补加25%的氨水来维持pH在7.0-7.2；添加60％葡萄糖溶液补充菌体所需的碳源，发酵周期30h，采用的发酵培养基为：酵母粉4 g/L，蛋白胨3g/L，(NH4)2SO44 g/L，K2HPO4·3H2O 4 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，谷氨酸4g/L，蛋氨酸0.3 g/L，柠檬酸3g/L，MnSO4·7H2O 10 mg/L，FeSO4·7H2O 30 mg/L，玉米浆20ml/L，其余为水。
该L-异亮氨酸生产菌株XX16经过500 mL摇瓶发酵实验验证，L-异亮氨酸产量达到9.28g/L。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，本技术领域技术人员以本发明的方法或以本方法为基础进行的菌种改造等改进和润饰均视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种人工操纵子，其特征在于：为avtA-ald人工操纵子，包括avtA、ald基因，具体为：
（1）操纵子基因顺序为trc启动子、RBS、avtA、ald、rrnB T1终止子；
（2）trc启动子、RBS核糖结合位点与avtA基因首尾直接相连；
（3）avtA、ald基因使用linker基因相连，所述linker基因的核苷酸序列如序列表SEQID NO.3所示；
（4）ald、rrnB T1终止子首尾直接相连。
2.一种L-异亮氨酸生产菌株，其特征在于：为基因组上具有权利要求1所述人工操纵子所有特征的菌株XX16，所述菌株以E.coli W3110作为底盘菌株，缺失了livJ、rhtA、tdh、ilvE、ilvBN（eco）基因，上调了pntAB、thrAfbrBC、ilvD、ilvAfbr、ilvIHfbr、ilvC、tdcB、ygaZH、lrp、avtA基因的转录水平，异源表达了来源于B.subtilis 168的ald、gdh基因、来源于Corynebacterium glutamicum K051的ilvBNfbr（cgl）、cysK基因。
3.根据权利要求2所述的L-异亮氨酸生产菌株，其特征在于：是由下述方法改造获得的：以E.coli W3110作为底盘菌株，敲除了菌株基因组上的livJ、rhtA、tdh、ilvE、ilvBN（eco）基因；利用trc启动子强化了pntAB基因转录，并整合到基因组yjiV假基因位点；利用trc启动子强化了苏氨酸操纵子thrAfbrBC基因转录，并整合到基因组ycgH假基因位点且双拷贝至yeeP假基因位点；利用trc启动子强化了ilvD基因转录，并整合到基因组yciQ假基因位点；利用trc启动子强化了ilvAfbr基因转录，并整合到基因组yeeL假基因位点；利用trc启动子强化了ilvIHfbr基因转录，并整合到基因组mbhA假基因位点；利用trc启动子强化了ilvC基因转录，并整合到基因组ycdN假基因位点；利用trc启动子强化了tdcB基因转录，并整合到基因组ygaY假基因位点；利用trc启动子强化了ygaZH基因转录，并整合到基因组ylbE假基因位点；利用trc启动子强化了lrp基因转录，并整合到基因组ilvG假基因位点；利用trc启动子强化了avtA基因和来源于B.subtilis 168的ald基因转录，并整合到基因组yjgX假基因位点形成avtA-ald人工操纵子；利用trc启动子强化了来源于Corynebacteriumglutamicum K051的ilvBNfbr（cgl）基因转录，并整合到基因组rhtA假基因位点；利用trc启动子强化了来源于Corynebacterium glutamicum K051的cysK基因转录，并整合到基因组tdh假基因位点；利用trc启动子强化了来源于B.subtilis 168的gdh基因转录，并整合到基因组ilvE假基因位点。
4.根据权利要求3所述的L-异亮氨酸生产菌株，其特征在于：所述trc启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；RBS核糖体结合位点的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；livJ基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示；IlvBN（eco）基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示；rhtA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示；tdh基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示；ilvE基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示；pntAB基因簇的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示；ThrAfbrBC基因簇的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.10所示；ilvD基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.11所示；ilvAfbr基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.12所示；ilvIHfbr基因簇的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.13所示；ilvC基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.14所示；tdcB基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.15所示；ygaZH基因簇的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.16所示；lrp基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.17所示；avtA基因的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.18所示；ald基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.19所示；IlvBNfbr（cgl）基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.20所示；cysK基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.21所示；gdh基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.22所示。
5.根据权利要求3所述的L-异亮氨酸生产菌株，其特征在于：E.coli W3110为E.coliW3110 ATCC 273250。
6.权利要求2-5之一所述L-异亮氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于：在出发菌株E.coli W3110基础上进行定向改造，具体步骤分为如下3个模块：
(1)增加前体物苏氨酸产量：包括敲除L-苏氨酸外转运蛋白基因rhtA；敲除苏氨酸分解代谢基因tdh；提高苏氨酸操纵子thrAfbrBC转录水平；
（2）提高还原力：提高吡啶核苷酸转氢酶基因pntAB的转录水平，引入来源于B.subtilis 168的葡萄糖 1-脱氢酶基因gdh，敲除支链氨基酸氨基转移酶基因ilvE；
（3）增加L-异亮氨酸产量：敲除L-异亮氨酸内转运蛋白基因livJ，敲除自身乙酰乳酸合酶基因ilvBN（eco），提高自身二羟基酸脱水酶基因ilvD、酮酸还原异构酶基因ilvC、乙酰乳酸合酶基因ilvIHfbr、苏氨酸脱氢酶基因ilvAfbr、苏氨酸脱氢酶基因tdcB、L-异亮氨酸外转运蛋白基因ygaZH转录水平，提高自身转录结合调节蛋白基因lrp转录水平，促进ilvIHfbr、ygaZH表达，提高引入来源于Corynebacterium glutamicum K051的半胱氨酸合酶基因cysK转录水平，提高引入来源于Corynebacterium glutamicum K051的乙酰乳酸合酶基因ilvBNfbr（cgl），提高引入来源于B.subtilis 168的丙氨酸脱氢酶ald基因和自身缬氨酸-丙酮酸转氨酶avtA基因转录水平。
7.权利要求2-5之一所述L-异亮氨酸生产菌株在发酵生产L-异亮氨酸方面的应用。
8.根据权利要求7所述L-异亮氨酸生产菌株的应用，其特征在于：具体步骤如下：
①菌种活化：取L-异亮氨酸生产菌株XX16划线接种于活化斜面，37℃培养12h，并传代一次；
②种子培养：用接种环刮取一环斜面种子接种于装有种子培养基的三角瓶中，纱布封口，36℃，200r/min培养10 h；
③发酵培养：按10%-15%接种量接种菌种活化后制备的种子液到装有发酵培养基的三角瓶中，纱布封口，温度维持在37±0.2℃，220 r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水来维持pH在7.0-7.2；添加葡萄糖溶液补充菌体所需的碳源，发酵周期30h。
9.根据权利要求8所述L-异亮氨酸生产菌株的应用，其特征在于：所述步骤②中采用的种子培养基为：葡萄糖20 g/L，酵母粉3 g/L，蛋白胨3 g/L，(NH4)2SO4 1 g/L，K2HPO4·3H2O3 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，柠檬酸2 g/L，谷氨酸3g/L，蛋氨酸0.5g/L，FeSO4·7H2O 10 mg/L，MgSO4·7H2O 10 mg/L，其余为水。
10.根据权利要求8所述L-异亮氨酸生产菌株的应用，其特征在于：所述步骤③采用的发酵培养基为：酵母粉4 g/L，蛋白胨3g/L，(NH4)2SO4 4 g/L，K2HPO4·3H2O 4 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，谷氨酸4g/L，蛋氨酸0.3 g/L，柠檬酸3g/L，MnSO4·7H2O 10 mg/L，FeSO4·7H2O30 mg/L，玉米浆20ml/L，其余为水。
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