CN118126922A - 一种l-苏氨酸生产菌株及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种L‑苏氨酸生产菌株及其构建方法与应用，所述菌株不含有质粒，缺失了tdh、ilvA、tdcB、ltaE、sstT基因，上调了pntAB基因，异源表达了来源于Clostridium acetobutylicum的gapC基因，用trc启动子过表达了aspC、ppc、thrAfbrBC、asd、rhtABC基因，所述菌株通过敲除L‑苏氨酸分解途径基因、加强途径关键酶的表达，优化L‑苏氨酸转运系统、提高还原力NADPH含量能够有效提高L‑苏氨酸合成效率，遗传稳定，无需添加抗性物质，具有良好的L‑苏氨酸合成能力，生产成本低，性能稳定，产酸效率高，具有良好的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术与发酵工程技术领域，尤其是一种L-苏氨酸生产菌株及其构建方法与应用。
背景技术
L-苏氨酸是人体八种必需氨基酸之一，在所有L-苏氨酸异构体中，L-苏氨酸是唯一天然存在且具有生理活性的氨基酸，主要应用于食品、饲料和医疗工业等方面，长期以来，全球市场对L-苏氨酸的需求正以每年10%-20%的涨幅快速增长，市场前景广阔。
目前L-苏氨酸的制备主要有化学合成、蛋白质水解法和微生物发酵法。其中化学合成法较为复杂、生产成本高且环境污染较大以及蛋白质水解提取法效率低、杂质多和环境污染较大的缺陷，已逐渐被摒弃。微生物发酵法是以葡萄糖作为微生物生长的能量来源，微生物从头合成L-苏氨酸，无需添加底物，减少了生产成本，发酵过程条件温和，具有工业化生产的潜力，成为首选生产L-苏氨酸的方式。
我国自20世纪90年代后才开始生产L-苏氨酸，迅猛发展的同时依然存在诸如低产量和低糖酸转化率以及生产成本较高等问题，传统生产L-苏氨酸的菌株发酵周期长，产酸与转化率较低、生产成本高，因此，构建一株产酸效率高、遗传稳定性好的L-苏氨酸生产菌种是目前亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种L-苏氨酸生产菌株。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述L-苏氨酸生产菌株的构建方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述L-苏氨酸生产菌株的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种人工操纵子，为rhtA-rhtB-rhtC人工操纵子，包括rhtA、rhtB、rhtC基因，具体为：
（1）操纵子基因顺序为trc启动子、rhtA、RBS1、rhtB、RBS2、rhtC、rrnB T1终止子；
（2）trc启动子与rhtA基因首尾直接相连；
（3）rhtA和rhtB通过RBS1基因相连；rhtB和rhtC通过RBS2基因相连；
（4）rhtC、rrnB T1终止子首尾直接相连。
上述人工操纵子的构建方法，由同一个trc启动子控制操纵子开始转录，由同一个rrnB T1终止子控制操纵子终止转录，通过优化基因连接方式与基因在操纵子中的存在位置获得。
优选的，上述人工操纵子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.19所示。
一种L-苏氨酸生产菌株，为菌株A.BU14，其基因组上具有上述rhtA-rhtB-rhtC人工操纵子的所有特征。
优选的，上述L-苏氨酸生产菌株，以E.coliW3110作为底盘菌株，缺失了tdh、ilvA、tdcB、ltaE、sstT基因，上调了pntAB基因，异源表达了来源于Clostridium acetobutylicum的gapC基因,同时，用trc启动子过表达了aspC、ppc、thrAfbrBC、asd、rhtABC基因。
优选的，上述L-苏氨酸生产菌株，是由下述方法改造获得的：以E.coliW3110作为底盘菌株，敲除了菌株基因组上的tdh、ilvA、tdcB、ltaE、sstT基因，利用trc启动子强化了来源于Clostridium acetobutylicum的gapC基因转录，并整合到基因组ltaE基因位点；利用trc启动子强化了pntAB基因转录强度，并整合到基因组tdcB基因位点；利用trc启动子强化了aspC基因转录强度，并整合到基因组yghX假基因位点且双拷贝至yeeP假基因位点；利用trc启动子强化了thrAfbrBC基因转录强度，并整合到基因组ycgH假基因位点且双拷贝至ilvG假基因位点；利用trc启动子强化了asd基因转录强度，并整合到基因组ygaY假基因位点且三拷贝至yghE和rph假基因位点；利用trc启动子强化了ppc基因转录，并整合到基因组yeeL假基因位点；利用trc启动子强化了人工操纵子rhtA-rhtB-rhtC基因转录，并整合到基因组yjgX假基因位点。
上述thrAfbrBC基因中thrAfbr基因是已经解除了苏氨酸对其的反馈抑制。
优选的，上述L-苏氨酸生产菌株，所述tdh基因的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.1所示，ilvA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，tdcB基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，pntAB基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示，ltaE基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示，gapC基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示，aspC基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示，ppc基因的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.8所示，thrAfbrBC基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示，asd基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.10所示，sstT基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.11所示，rhtA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.12所示，rhtB基因的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.13所示，rhtC基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.14所示，trc启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.15所示，RBS1基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.16所示，RBS2基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.17所示，rrnB T1终止子的核苷酸序列如序列表SEQID NO.18所示，人工操纵子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.19所示。
优选的，上述L-苏氨酸生产菌株，所述E.coliW3110为E.coliW3110ATCC 27325。
上述L-苏氨酸生产菌株的构建方法，在出发菌株E.coliW3110基础上进行定向改造，具体步骤如下：
（1）底盘菌改造：敲除L-苏氨酸分解途径基因：tdh、ilvA、tdcB、ltaE；引入来源于Clostridium acetobutylicum的gapC基因；
（2）加强途径关键酶的表达：使用trc启动子过表达了aspC、ppc、thrAfbrBC、asd，使得L-苏氨酸代谢途径中关键酶的高效表达，从而大大提高了L-苏氨酸的产量；
（3）优化L-苏氨酸转运系统：敲除sstT基因减少了L-苏氨酸转运进入胞内；通过分段整合基因的方法增强了人工操纵子rhtABC基因的表达，促使L-苏氨酸快速运至胞外；
（4）提高还原力NADPH含量：利用trc启动子过表达提高pntAB基因的转录水平，提高了NADPH的供应，增强了还原力，有利于终产物的高效产生。
优选的，上述L-苏氨酸生产菌株的构建方法，所述步骤（2）中调整thrAfbrBC、aspC、asd基因的拷贝数为2：2：3。
上述L-苏氨酸生产菌株在发酵生产L-苏氨酸方面的应用。
优选的，上述L-苏氨酸生产菌株的应用，在适宜发酵条件下以所述工程菌在培养基中发酵得到L-苏氨酸，培养基包括但不限于：碳源、氮源、无机盐、维生素等；发酵条件包括发酵温度、发酵pH、发酵溶氧条件、发酵压力、发酵时间等。所述培养基均可通过常规方法获得并用于L-苏氨酸生产，发酵条件可以调整以期适应菌株生产特性。
优选的，上述L-苏氨酸生产菌株的应用，具体步骤如下：
①斜面培养：取L-苏氨酸生产菌株接种在斜面培养基上，37℃培养12h，斜面培养基选用通用LB固体培养基；
②摇瓶种子培养：取固体斜面菌种接种至摇瓶培养基中进行发酵，培养温度37℃，培养时间12h，摇床转速220r/min，pH7.0；
③摇瓶发酵培养：发酵接种量为20%-25%，培养温度为37℃，pH7.0，培养时间24h，摇床转速220r/min。
优选的，上述L-苏氨酸生产菌株的应用，所述步骤②中采用的种子培养基为：葡萄糖25g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，KH2PO4·3H2O3g/L，硫酸铵1g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，其余为水。
优选的，上述L-苏氨酸生产菌株的应用，所述步骤③中采用的发酵培养基为：MgSO4·7H2O 1.5g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨3g/L，玉米浆20ml，硫酸铵3g/L，蛋氨酸0.1g/L，K2HPO4·3H2O 4g/L，谷氨酸2g/L，FeSO4·7H2O 20mg/L，MnSO410mg/L，VB1、VB3、VB5各2mg/L，其余为水。
上述培养基均可采用标准方法制备获得。
有益效果：
上述L-苏氨酸生产菌株，不含有质粒，遗传稳定，无需添加抗性物质，具有良好的L-苏氨酸合成能力，生产成本低，性能稳定，产酸效率高，具有良好的经济效益；该菌株缺失了tdh、ilvA、tdcB、ltaE、sstT基因，上调了pntAB基因，异源表达了来源于Clostridium acetobutylicum的gapC基因，用trc启动子过表达了aspC、ppc、thrAfbrBC、asd、rhtABC基因；所述菌株通过敲除L-苏氨酸分解途径基因、加强途径关键酶的表达，优化L-苏氨酸转运系统、提高还原力NADPH含量能够有效提高L-苏氨酸合成效率，提高L-苏氨酸生产水平，实现了L-苏氨酸的高效生产，具有优秀的工业应用前景。具体来说：
（1）通过敲除tdh、ltaE、ilvA、tdcB基因阻断或减少了L-苏氨酸分解代谢，同时敲除L-苏氨酸输入蛋白sstT基因，以及人工构建的操纵子L-苏氨酸转运蛋白rhtABC用同一个trc启动子进行过表达来实现L-苏氨酸的高效累积。
（2）通过提高pntAB基因的转录水平，引入来源于Clostridium acetobutylicum的gapC编码的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因,提高了NADPH的供应，为菌体生产提供了大量的还原力。
（3）通过引入已解除苏氨酸反馈抑制的操纵子基因thrAfbrBC，并同时调整thrAfbrBC、aspC、asd基因的拷贝数为2：2：3，使得L-苏氨酸代谢途径中关键酶的高效表达，代谢通路顺畅，产酸和转化率得到提升，从而大大提高了L-苏氨酸的产量。
附图说明
图1为L-苏氨酸生产菌株从头合成途径基因改造过程图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例中涉及到的百分号“%”，若未特别说明，指质量百分比，溶液的百分比指100mL中含有溶质的克数，液体之间的百分比，是指在25℃时溶液的体积比例。
实施例中所用的出发菌株为野生型E.coliW3110ATCC 27325（市售），相应启动子和基因等见序列表。涉及到的菌株构建过程中用到的引物见表1。
表1菌株构建过程中所涉及的引物
| 引物名称 | 序列号 | 引物序列（5’-3’） |
| tdh-pGRB-S | SEQ ID NO.20 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTGGCGAAGATGTGCTGGTTTCGTTTTAGAGCTAGAA |
| tdh-pGRB-A | SEQ ID NO.21 | TTCTAGCTCTAAAACGAAACCAGCACATCTTCGCCACTAGTATTATACCTAGGACT |
| tdh-U-S | SEQ ID NO.22 | GCCATTATTCCGGTCATGCTTGG |
| tdh-U-A | SEQ ID NO.23 | CCGCCATCTTGTACCAGGTTTCACCGACATATTCATGGCCCAC |
| tdh-D-S | SEQ ID NO.24 | GTGGGCCATGAATATGTCGGTGAAACCTGGTACAAGATGGCGG |
| tdh-D-A | SEQ ID NO.25 | GATTTCCAGAGCAGTCCAGGTT |
| ilvA-pGRB-S | SEQ ID NO.26 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTCCAACTGCTTGGCGGGCGTTGTTTTAGAGCTAGAA |
| ilvA-pGRB-A | SEQ ID NO.27 | TTCTAGCTCTAAAACAACGCCCGCCAAGCAGTTGGACTAGTATTATACCTAGGACT |
| ilvA-U-S | SEQ ID NO.28 | ATGCTCTACCCAACCAGCTTC |
| ilvA-U-A | SEQ ID NO.29 | GGTTCATGGTCGCCAAGTTCGAGCACTGCTCTTAAATATTCGGCAC |
| ilvA-D-S | SEQ ID NO.30 | GTGCCGAATATTTAAGAGCAGTGCTCGAACTTGGCGACCATGAACC |
| ilvA-D-A | SEQ ID NO.31 | ATTGAACTGTGGTTTCGACGCAA |
| tdcB-PGRB-S | SEQ ID NO.32 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTTGAAAACGTTCACGGCATGGGTTTTAGAGCTAGAA |
| tdcB-PGRB-A | SEQ ID NO.33 | TTCTAGCTCTAAAACCCATGCCGTGAACGTTTTCAACTAGTATTATACCTAGGACT |
| tdcB-U-S | SEQ ID NO.34 | TACCTGTGGCACAATATGCCG |
| tdcB-U-A | SEQ ID NO.35 | GTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAGCGCCACGAATTTTAAATGAACC |
| tdcB-D-S | SEQ ID NO.36 | TTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCTGGCATGTGCTGCATTATTAAGC |
| tdcB-D-A | SEQ ID NO.37 | AACGCCATAAATCCACAGCAGT |
| pntAB-S | SEQ ID NO.38 | CCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGCGAATTGGCATACCAAGAG |
| pntAB-A | SEQ ID NO.39 | CAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTACAGAGCTTTCAGGATTGCATCCAC |
| ltaE-PGRB-S | SEQ ID NO.40 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTTGCGCGCATCTTTAATGCCGGTTTTAGAGCTAGAA |
| ltaE-PGRB-A | SEQ ID NO.41 | TTCTAGCTCTAAAACCGGCATTAAAGATGCGCGCAACTAGTATTATACCTAGGACT |
| ltaE-U-S | SEQ ID NO.42 | GTGCAGATGAAACTGCCAGTGAA |
| ltaE-U-A | SEQ ID NO.43 | GTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAGTCCTGCAGAGCATTAACGGTAG |
| ltaE-D-S | SEQ ID NO.44 | GGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATACGTGCTGATTAACGCCTC |
| ltaE-D-A | SEQ ID NO.45 | GAGCACGCAGATGATCCGAC |
| gapC-S | SEQ ID NO.46 | TATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGGCAAAGATAGCTATTAATGGTTTTGG |
| gapC-A | SEQ ID NO.47 | CAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGCTATTTTGCTATTTTTGCAAAGTAAGC |
| yghX-pGRB-S | SEQ ID NO.48 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTTATATCGCCCTGGCACCTGAGTTTTAGAGCTAGAA |
| yghX-pGRB-A | SEQ ID NO.49 | TTCTAGCTCTAAAACTCAGGTGCCAGGGCGATATAACTAGTATTATACCTAGGACT |
| yghX-U-S | SEQ ID NO.50 | TCAAACGCTTTACGCAGGAT |
| yghX-U-A | SEQ ID NO.51 | AATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAGCTCATCTTTGCGGGCTT |
| yghX-D-S | SEQ ID NO.52 | AAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATATCCGCAAGCGACAGGC |
| yghX-D-A | SEQ ID NO.53 | CGTTGATTCGGGTGTCCAG |
| yghX-aspC-S | SEQ ID NO.54 | ATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGTTTGAGAACATTACCGCCGCTCCT |
| yghX-aspC-A | SEQ ID NO.55 | ACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTACAGCACTGCCACAATCGC |
| yeeL-pGRB-S | SEQ ID NO.56 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTAACACAGCAATACGGTACGCGTTTTAGAGCTAGAA |
| yeeL-pGRB-A | SEQ ID NO.57 | TTCTAGCTCTAAAACGCGTACCGTATTGCTGTGTTACTAGTATTATACCTAGGACT |
| yeeL-U-S | SEQ ID NO.58 | TTCATCGGGACGAGTGGAGA |
| yeeL-U-A | SEQ ID NO.59 | AATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACCATAGCATCGCCAATCTGA |
| yeeL-D-S | SEQ ID NO.60 | AAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATACCCAAAGGTGAAGATAAAGCC |
| yeeL-D-A | SEQ ID NO.61 | CATTCCCTCTACAGAACTAGCCCT |
| yeeL-ppc-S | SEQ ID NO.62 | CTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGAACGAACAATATTCCGCATTGC |
| yeeL-ppc-A | SEQ ID NO.63 | AACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTAGCCGGTATTACGCATACCTGC |
| ycgH-pGRB-S | SEQ ID NO.64 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTTATGCGTCTGAACGACCGTGGTTTTAGAGCTAGAA |
| ycgH-pGRB-A | SEQ ID NO.65 | TTCTAGCTCTAAAACCACGGTCGTTCAGACGCATAACTAGTATTATACCTAGGACT |
| ycgH-U-S | SEQ ID NO.66 | TAAACTCGTCAGCGGCACAAC |
| ycgH-U-A | SEQ ID NO.67 | AATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAGGTAGGCGTTTCTGTTGATTCTG |
| ycgH-D-S | SEQ ID NO.68 | GACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATGCGTGTCGGATTATCGTTCG |
| ycgH-D-A | SEQ ID NO.69 | GATTCAGGTTGCCATTTACGC |
| ycgH-D-S-1# | SEQ ID NO.70 | CTGAACAACATCATATTTAAATGAACATAACTCAATTTGTAGGCTAGCATAACCCCTTGGGGCGCGTGTCGGATTATCGTTCG |
| ycgH-D-S-4# | SEQ ID NO.71 | ATGCACAGGAGACTTTCTGATGCGCTGGTTGATTTCTTCTAGGGTCATAGTAATCCAGCAACTGCGTGTCGGATTATCGTTCG |
| thr1-s | SEQ ID NO.72 | TCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGCGAGTGTTGAAGTTCGG |
| thr1-A-1# | SEQ ID NO.73 | GCCCCAAGGGGTTATGCTAGCCTACAAATTGAGTTATGTTCATTTAAATATGATGTTGTTCAGCGATATGTTTATTCTTCAGCCAGCT |
| thr2-S | SEQ ID NO.74 | GAAGTGTTTGTGATTGGCGTCG |
| thr2-A-4# | SEQ ID NO.75 | AGTTGCTGGATTACTATGACCCTAGAAGAAATCAACCAGCGCATCAGAAAGTCTCCTGTGCATAAGCCTGGCAGTAACCGTTC |
| thr3-S | SEQ ID NO.76 | CTATTCCCGTCAGCCTGAGCT |
| thr3-A | SEQ ID NO.77 | ACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTACTGATGATTCATCATCAATTTACGCAAC |
| PGRB-1#-S | SEQ ID NO.78 | AGTCCTAGGTATAATACTAGT ATGAACATAACTCAATTTGTGTTTTAGAGCTAGAA |
| PGRB-1#-A | SEQ ID NO.79 | TTCTAGCTCTAAAACACAAATTGAGTTATGTTCATACTAGTATTATACCTAGGACT |
| PGRB-4#-S | SEQ ID NO.80 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTTGCGCTGGTTGATTTCTTCTGTTTTAGAGCTAGAA |
| PGRB-4#-A | SEQ ID NO.81 | TTCTAGCTCTAAAACAGAAGAAATCAACCAGCGCAACTAGTATTATACCTAGGACT |
| ygaY-pGRB-S | SEQ ID NO.82 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTCACTGATGGCGCTGGCATTAGTTTTAGAGCTAGAA |
| ygaY-pGRB-A | SEQ ID NO.83 | TTCTAGCTCTAAAACTAATGCCAGCGCCATCAGTGACTAGTATTATACCTAGGACT |
| ygaY-U-S | SEQ ID NO.84 | CCTACAAACCACATCGCACATT |
| ygaY-U-A | SEQ ID NO.85 | AATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAACACCGAAGCAACCCAAAAG |
| ygaY-D-S | SEQ ID NO.86 | AAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATTTGCTTGCCGCTCCACC |
| ygaY-D-A | SEQ ID NO.87 | GGAGTAGGGCTTTCCATAGAGTGT |
| ygaY-asd-S | SEQ ID NO.88 | AATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGAAAAATGTTGGTTTTATCGGCTGG |
| ygaY-asd-A | SEQ ID NO.89 | CAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTACGCCAGTTGACGAAGCATC |
| sstT-PGRB-S | SEQ ID NO.90 | AGTCCTAGGTATAATACTAGT TTAACCCATTGCTGGTGTGG GTTTTAGAGCTAGAA |
| sstT-PGRB-A | SEQ ID NO.91 | TTCTAGCTCTAAAACCCACACCAGCAATGGGTTAAACTAGTATTATACCTAGGACT |
| sstT-U-S | SEQ ID NO.92 | CATGAGCACCGTTTTCTCCCT |
| sstT-U-A | SEQ ID NO.93 | GATAAAGCCGACGGCAACCATGCGCCGACGAACAAAGTAC |
| sstT-D-S | SEQ ID NO.94 | GTACTTTGTTCGTCGGCGCATGGTTGCCGTCGGCTTTATC |
| sstT-D-A | SEQ ID NO.95 | GTGCCATCCTTAATGCCATTCG |
| yjgX-pGRB-S | SEQ ID NO.96 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTTCGCGACCACCGTAACTGGCGTTTTAGAGCTAGAA |
| yjgX-pGRB-A | SEQ ID NO.97 | TTCTAGCTCTAAAACGCCAGTTACGGTGGTCGCGAACTAGTATTATACCTAGGACT |
| yjgX-U-S | SEQ ID NO.98 | GGAAGTCAACGGGTTATGCG |
| yjgX-U-A | SEQ ID NO.99 | TTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAAAAATCACCACGAATACCAGAATC |
| yjgX-D-S | SEQ ID NO.100 | GGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATACAGTGTCTTCCCTGAGCCG |
| yjgX-D-A | SEQ ID NO.101 | GGCGAAGGATACCATCAAGC |
| yjgX-D-S-1# | SEQ ID NO.102 | CTGAACAACATCATATTTAAATGAACATAACTCAATTTGTAGGCTAGCATAACCCCTTGGGGCACAGTGTCTTCCCTGAGCC |
| yjgX-D-S-4# | SEQ ID NO.103 | ATGCACAGGAGACTTTCTGATGCGCTGGTTGATTTCTTCTAGGGTCATAGTAATCCAGCAACTACAGTGTCTTCCCTGAGCC |
| yjgX-rhtA-S | SEQ ID NO.104 | TAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGCCTGGTTCATTACGTAAAATGCC |
| yjgX-rhtA-A | SEQ ID NO.105 | CATGAATACTGTTTCCTTTAATTAATGTCTAATTCTTTTATTTTGCTCTCTTTGCG |
| yjgX-rhtB-S | SEQ ID NO.106 | AGGAAACAGTATTCATGATGACCTTAGAATGGTGGTTTGCC |
| yjgX-rhtB-A | SEQ ID NO.107 | AGCTGTTTCCTTCACGCATGCCTCGC |
| yjgX-rhtC-S | SEQ ID NO.108 | AGGAAACAGCTATGTTGATGTTATTTCTCACCGTCGC |
| yjgX-rhtC-A | SEQ ID NO.109 | GATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTCACCGCGAAATAATCAAATGAATGCC |
| ilvG-pGRB-S | SEQ ID NO.110 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTTATCGGCACTGACGCATTTCGTTTTAGAGCTAGAA |
| ilvG-pGRB-A | SEQ ID NO.111 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTGGAAGAGTTGCCGCGCATCAGTTTTAGAGCTAGAA |
| ilvG-U-S | SEQ ID NO.112 | ACCGAGGAGCAGACAATGAATAA |
| ilvG-U-A | SEQ ID NO.113 | AATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAGGTGATGGCAACAACAGGGA |
| ilvG-D-S | SEQ ID NO.114 | CTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCTATCTACGCGCCGTTGTTGTT |
| ilvG-D-A | SEQ ID NO.115 | GCGCTGGCTAACATGAGGAA |
| ilvG-D-S-1# | SEQ ID NO.116 | CTGAACAACATCATATTTAAATGAACATAACTCAATTTGTAGGCTAGCATAACCCCTTGGGGCCTATCTACGCGCCGTTGTTGT |
| ilvG-D-S-4# | SEQ ID NO.117 | ATGCACAGGAGACTTTCTGATGCGCTGGTTGATTTCTTCTAGGGTCATAGTAATCCAGCAACTCTATCTACGCGCCGTTGTTGT |
| yeeP-pGRB-S | SEQ ID NO.118 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTTGAACAGTTTACCGGTGCGGGTTTTAGAGCTAGAA |
| yeeP-pGRB-A | SEQ ID NO.119 | TTCTAGCTCTAAAACCCGCACCGGTAAACTGTTCAACTAGTATTATACCTAGGACT |
| yeeP-U-S | SEQ ID NO.120 | GGTCAGGAGGTAACTTATCAGCG |
| yeeP-U-A | SEQ ID NO.121 | AATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAATGGCAGGGCTCCGTTTTG |
| yeeP-D-S | SEQ ID NO.122 | CCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATGAACTGGATTTTCTTCTGAACCTGTCG |
| yeeP-D-A | SEQ ID NO.123 | ACGATGTCAGCAGCCAGC |
| yghE-pGRB-S | SEQ ID NO.124 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTGCTGAAAAAATATCGCCCACGTTTTAGAGCTAGAA |
| yghE-pGRB-A | SEQ ID NO.125 | TTCTAGCTCTAAAACGTGGGCGATATTTTTTCAGCACTAGTATTATACCTAGGACT |
| yghE-U-S | SEQ ID NO.126 | GTCAGGCACTGGCGAAAGAT |
| yghE-U-A | SEQ ID NO.127 | TTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACGCAAGCCATAAACCCACAAG |
| yghE-D-S | SEQ ID NO.128 | GCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATTTCCGACATCGAAATGCGTGG |
| yghE-D-A | SEQ ID NO.129 | AGGCGTTGTTGTGGCAGAT |
| rph-pGRB-S | SEQ ID NO.130 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTGGCTGGATCACCGCAGAGTAGTTTTAGAGCTAGAA |
| rph-pGRB-A | SEQ ID NO.131 | TTCTAGCTCTAAAACTACTCTGCGGTGATCCAGCCACTAGTATTATACCTAGGACT |
| rph-U-S | SEQ ID NO.132 | ATAGCGCAGGGTACATTCCACT |
| rph-U-A | SEQ ID NO.133 | GTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACCTTCTTCAATAGAGGCGGTACA |
| rph-D-S | SEQ ID NO.134 | TGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATTGCCGCAGAGACCGACAT |
| rph-D-A | SEQ ID NO.135 | ACAGCGGTTGTGGTGGCA |
实施例1
本实施例旨在说明菌株A.BU14的具体构建步骤。特别的，实施例中若有同类型基因操作方法，则仅提供1次，并做注释，不再多加赘述。
如图1所示，根据整个菌株改造过程的代谢路径对菌种进行改造，获得L-苏氨酸生产菌株A.BU14，改造过程主要包括如下4个模块：
（1）底盘菌改造：敲除L-苏氨酸分解途径基因：tdh、ilvA、tdcB、ltaE；引入来源于Clostridium acetobutylicum的gapC基因；
（2）加强途径关键酶的表达：使用trc启动子过表达了aspC、ppc、thrAfbrBC、asd，其中，调整thrAfbrBC、aspC、asd基因的拷贝数为2：2：3，使得L-苏氨酸代谢途径中关键酶的高效表达，从而大大提高了L-苏氨酸的产量；
（3）优化L-苏氨酸转运系统：敲除sstT基因减少了L-苏氨酸转运进入胞内；通过分段整合基因的方法增强了人工操纵子rhtABC基因的表达，促使L-苏氨酸快速运至胞外；
（4）提高还原力NADPH含量：利用trc启动子过表达提高pntAB基因的转录水平，提高了NADPH的供应，增强了还原力，有利于终产物的高效产生。
上述基因操作采用的基因编辑方法参照文献（Li Y，Lin Z，Huang C，et al.Metabolic engineering ofEscherichia coliusing CRISPR-Cas9 meditated genomeediting. Metabolic Engineering，2015，31：13-21.），本发明涉及到的专业名词，若无特别备注，均可在该文章中得到解释。本发明所指的“敲除”是指将目的基因失活，“引入”是指将外源基因与启动子、终止子连接后插入到工程菌基因组中。具体来说，步骤如下：
①敲除tdh基因：以E.coliW3110基因组为模板，分别以tdh-U-S、tdh-U-A和tdh-D-S、tdh-D-A，通过pcr扩增得到上、下游同源臂，接着，以上下游同源臂为模板，以tdh-U-S、tdh-D-A为引物，通过重叠pcr扩增得到重叠片段；以tdh-pGRB-S、tdh-pGRB-A为引物，退火得到gRNA片段，并将其与pGRB载体连接，得到tdh-pGRB；制备E.coliW3110电转化感受态细胞，将重叠片段与tdh-pGRB一同电转化进入感受态细胞，并筛选得到阳性转化子，获得菌株A.BU1。
②敲除ilvA基因：具有①中相同操作方法，不同之处在于，所用引物为ilvA-U-S、ilvA-U-A、ilvA-D-S、ilvA-D-A、ilvA-pGRB-S、ilvA-pGRB-A。感受态细胞为A.BU1，获得菌株A.BU2。
③敲除ltaE基因并在该位点整合来源于Clostridium acetobutylicum的gapC：以E.coliW3110基因组为模板，分别以ltaE-U-S、ltaE-U-A和ltaE-D-S、ltaE-D-A，通过pcr扩增得到上、下游同源臂，以Clostridium acetobutylicumATCC 824基因组为模板，以gapC-U-S、gapC-U-A为引物，通过pcr扩增得到目的基因片段；接着，以上下游同源臂、目的基因片段为模板，以ltaE-U-S、ltaE-D-A为引物，通过重叠pcr扩增得到重叠片段；以ltaE-pGRB-S、ltaE-pGRB-A为引物，退火得到gRNA片段，并将其与pGRB载体连接，得到ltaE-pGRB；制备A.BU2电转化感受态细胞，将目的片段与ltaE-pGRB一同电转化进入感受态细胞，并筛选得到阳性转化子，获得菌株A.BU3。
④敲除tdcB基因并在该位点整合来源于E.coli W3110的pntAB基因：具有③中相同操作，不同之处在于，使用E.coliW3110基因组获得基因片段，引物分别为tdcB-U-S、tdcB-U-A、tdcB-D-S、tdcB-D-A、tdcB-pGRB-S、tdcB-pGRB-A、pntAB-S、pntAB-A。感受态细胞为A.BU3，获得菌株A.BU4。
⑤敲除sstT基因：具有①中相同操作方法，不同之处在于，所用引物为sstT-U-S、sstT-U-A、sstT-D-S、sstT-D-A、sstT-pGRB-s、sstT-pGRB-a。感受态细胞为A.BU4，获得菌株A.BU5。
⑥在yghX假基因位点使用trc启动子控制aspC基因过表达：以大肠杆菌W3110基因组为模板，分别以yghX-U-S、yghX-U-A、yghX-D-S、yghX-D-A与yghX-aspC-S、yghX-aspC-A为引物，通过PCR扩增得到上游同源臂、下游同源臂与目的基因片段，再以其为模板，通过重叠PCR获得Ptrc-aspC（yghX）基因整合片段，所述基因整合片段由yghX上游同源臂、Ptrc-aspC目的基因和yghX下游同源臂组成；以yghX-pGRB-S和yghX-pGRB-A为引物，通过PCR退火程序得到含靶序列的gRNA片段，并将其与pGRB载体连接，得到yghX-pGRB;制备E.coliW3110电转化感受态细胞，将重叠片段与yghX-pGRB一同电转化进入感受态细胞，并筛选得到阳性转化子。感受态细胞为A.BU5获得菌株A.BU6。
⑦依次在yeeL、yeeP、ygaY、yghE、rph基因座过表达ppc、aspC、asd、asd、asd基因：具有⑥中相同操作方法，得到菌株A.BU7、A.BU8、A.BU9、A.BU10、A.BU11。
⑧在ycgH假基因位点使用trc启动子控制thrAfbrBC基因过表达：
（1）以E.coliW3110基因组为模板，分别以ycgH-U-S、ycgH-U-A和ycgH-D-S-1#、ycgH-D-A、thr1-S、thr1-A-1#通过pcr扩增得到上、下游同源臂和目的基因片段，接着，以上下游同源臂、目的基因片段为模板，以ycgH-U-S、ycgH-D-A为引物，通过重叠pcr扩增得到重叠片段；以pGRB-ycgH-S、pGRB-ycgH-A为引物，退火得到gRNA片段，并将其与pGRB载体连接，得到ycgH-pGRB；制备A.BU11电转化感受态细胞，将目的片段与ycgH-pGRB一同电转化进入感受态细胞，并筛选得到阳性转化子，获得菌株A.BU12-1。
（2）分别以thr2-S、thr2-A-4#和ycgH-D-S-4#、ycgH-D-A通过pcr扩增得到上、下游同源臂，接着，以上下游同源臂为模板，以thr2-S、ycgH-D-A为引物，通过重叠pcr扩增得到重叠片段；以pGRB-1#-S、pGRB-1#-A为引物，退火得到gRNA片段，并将其与pGRB载体连接，得到pGRB-1#；制备A.BU12-1电转化感受态细胞，将目的片段与pGRB-4#一同电转化进入感受态细胞，并筛选得到阳性转化子，获得菌株A.BU12-2。
（3）分别以thr3-S、thr3-A和ycgH-D-S、ycgH-D-A通过pcr扩增得到上、下游同源臂，接着，以上下游同源臂为模板，以thr3-S、ycgH-DA为引物，通过重叠pcr扩增得到重叠片段；以pGRB-4#-S、pGRB-4#-A为引物，退火得到gRNA片段，并将其与pGRB载体连接，得到pGRB-4#；制备A.BU12-2电转化感受态细胞，将目的片段与pGRB-4#一同电转化进入感受态细胞，并筛选得到阳性转化子，获得菌株A.BU12-3。
⑨在yjgX假基因位点使用trc启动子控制rhtABC基因过表达：具有与⑧中相同的操作方法，所用引物ycgH-U-S更换为yjgX-U-S、ycgH-U-A更换为yjgX-U-A、ycgH-D-S-1#更换为yjgX-D-S-1#、ycgH-D-S-4#更换为yjgX-D-S-4#、ycgH-D-S更换为yjgX-D-S、ycgH-D-A更换为yjgX-D-A，感受态细胞依次为A.BU12-3、A.BU13-1、A.BU13-2，获得菌株A.BU13-3。
⑩在ilvG假基因位点使用trc启动子控制thrAfbrBC基因过表达：具有与⑧中相同的操作方法，所用引物ycgH-U-S更换为ilvG-U-S、ycgH-U-A更换为ilvG-U-A、ycgH-D-S-1#更换为ilvG-D-S-1#、ycgH-D-S-4#更换为ilvG-D-S-4#、ycgH-D-S更换为ilvG-D-S、ycgH-D-A更换为ilvG-D-A，感受态细胞依次为A.BU13-3、A.BU14-1、A.BU14-2，获得菌株A.BU14。
实施例2
本实施例旨在说明工程菌A.BU14的摇瓶发酵应用，具体步骤为：
①斜面培养：取-80℃冰箱保藏菌种接种在斜面培养基上，37℃培养12h，固体斜面培养基选用通用LB培养基。
②摇瓶种子培养：取固体斜面菌种接种至摇瓶培养基中进行发酵。培养温度37℃，培养时间12h，摇床转速220r/min，pH7.0，种子培养基为葡萄糖25g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，KH2PO4·3H2O3g/L，硫酸铵1g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，其余为水。
③摇瓶发酵培养：发酵接种量为20%-25%，培养温度为37℃，pH7.0，培养时间24h，摇床转速220r/min；发酵培基为MgSO4·7H2O 1.5g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨3g/L，玉米浆20ml，硫酸铵3g/L，蛋氨酸0.1g/L，K2HPO4·3H2O 4g/L，谷氨酸2g/L，FeSO4·7H2O 20mg/L，MnSO410mg/L，VB1、VB3、VB5各2mg/L，其余为水。
实验以野生型E.coliW3110为对照组，经过24h发酵验证，野生型E.coliW3110未能积累L-苏氨酸，实施例1所述工程菌A.BU14积累了20.1g/L的L-苏氨酸，这证明了菌株的有效性。
实施例3
本实施例旨在说明工程菌A.BU14关键酶thrAfbrBC、aspC、asd基因的拷贝数为2：2：3的优化，具体步骤为：
首先参照实施例1构建菌株的过程中定向改造获得了一株产L-苏氨酸较高的菌株命名为A.BN1，该菌株拥有A.BU14所有过表达基因的单拷贝，即gapC、aspC、ppc、thrAfbrBC、asd、rhtABC基因均为单拷贝，以及敲除了tdh、ltaE、ilvA、tdcB、sstT基因。按照实施例2所述发酵培养方式通过摇瓶发酵的方法优化thrAfbrBC、aspC、asd基因的拷贝数。以下共设置了9组对照试验，9组摇瓶发酵24h的数据结果如表2所示。
表2 thrAfbrBC、aspC、asd基因的拷贝数对L-苏氨酸产量的影响
| 第1组 | 第2组 | 第3组 | 第4组 | 第5组 | 第6组 | 第7组 | 第8组 | 第9组 | |
| thrAfbrBC基因拷数 | 1 | 2 | 3 | 2 | 3 | 3 | 3 | 2 | 2 |
| aspC基因拷贝数 | 1 | 2 | 3 | 3 | 2 | 3 | 2 | 3 | 2 |
| asd基因拷贝数 | 1 | 2 | 3 | 3 | 3 | 2 | 2 | 2 | 3 |
| 菌体生物OD600nm | 40.6 | 38.7 | 29.8 | 32.5 | 33.2 | 31.6 | 35.2 | 33.4 | 37.6 |
| L-苏氨酸产量g/L | 13.8 | 18.8 | 20.6 | 20.1 | 20.4 | 20.2 | 20.2 | 19.5 | 20.1 |
通过第1组～第3组对照试验可以发现，随着thrAfbrBC、aspC、asd基因的拷贝数成组增加，虽然L-苏氨酸的产量呈不断上升趋势，但是菌体生物量呈不断下降趋势且趋势大于L-苏氨酸产量的上升趋势，原因可能是由于某个或多个基因的过度表达造成了菌体代谢的负担；通过第4组～第9组对照试验可以发现，在这6组对照试验中，虽然第5组的L-苏氨酸产量是最高的，但是其菌体生物量依旧不是很高，而第7组和第9组的菌体生物量和L-苏氨酸产量相差不是很多且都较高，于是综合比较之下，当调整thrAfbrBC、aspC、asd基因的拷贝数为2：2：3时，此时菌体不但具备较高的L-苏氨酸产量且菌体生物量也维持在一个较高的水平，成为一个较为优选的选择。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，本技术领域技术人员以本发明的方法或以本方法为基础进行的菌种改造等改进和润饰均视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种人工操纵子，其特征在于：包括rhtA、rhtB、rhtC基因，具体为：
（1）操纵子基因顺序为trc启动子、rhtA、RBS1、rhtB、RBS2、rhtC、rrnB T1终止子；
（2）trc启动子与rhtA基因首尾直接相连；
（3）rhtA和rhtB通过RBS1基因相连；rhtB和rhtC通过RBS2基因相连；
（4）rhtC、rrnB T1终止子首尾直接相连。
2.一种L-苏氨酸生产菌株，其特征在于：基因组上具有权利要求1所述rhtA-rhtB-rhtC人工操纵子的所有特征。
3.根据权利要求2所述的L-苏氨酸生产菌株，其特征在于：以E.coli W3110作为底盘菌株，缺失了tdh、ilvA、tdcB、ltaE、sstT基因，上调了pntAB基因，异源表达了来源于Clostridium acetobutylicum的gapC基因,同时，用trc启动子过表达了aspC、ppc、thrAfbrBC、asd、rhtABC基因。
4.根据权利要求3所述的L-苏氨酸生产菌株，其特征在于：是由下述方法改造获得的：以E.coli W3110作为底盘菌株，敲除了菌株基因组上的tdh、ilvA、tdcB、ltaE、sstT基因，利用trc启动子强化了来源于 Clostridium acetobutylicum的gapC基因转录，并整合到基因组ltaE基因位点；利用trc启动子强化了pntAB基因转录强度，并整合到基因组tdcB基因位点；利用trc启动子强化了aspC基因转录强度，并整合到基因组yghX假基因位点且双拷贝至yeeP假基因位点；利用trc启动子强化了thrAfbrBC基因转录强度，并整合到基因组ycgH假基因位点且双拷贝至ilvG假基因位点；利用trc启动子强化了asd基因转录强度，并整合到基因组ygaY假基因位点且三拷贝至yghE和rph假基因位点；利用trc启动子强化了ppc基因转录，并整合到基因组yeeL假基因位点；利用trc启动子强化了人工操纵子rhtA-rhtB-rhtC基因转录，并整合到基因组yjgX假基因位点。
5.根据权利要求2-4之一所述的L-苏氨酸生产菌株，其特征在于：所述tdh基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，ilvA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，tdcB基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，pntAB基因的核苷酸序列如序列表SEQID NO.4所示，ltaE基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示，gapC基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示，aspC基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示，ppc基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示，thrAfbrBC基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示，asd基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.10所示，sstT基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.11所示，rhtA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.12所示，rhtB基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.13所示，rhtC基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.14所示，trc启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.15所示，RBS1基因的核苷酸序列如序列表SEQID NO.16所示，RBS2基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.17所示，rrnB T1终止子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.18所示，人工操纵子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.19所示，所述E.coli W3110为E.coli W3110ATCC 27325。
6.权利要求2-5之一所述L-苏氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于：在出发菌株E.coli W3110基础上进行定向改造，具体步骤如下：
（1）底盘菌改造：敲除L-苏氨酸分解途径基因：tdh、ilvA、tdcB、ltaE；引入来源于Clostridium acetobutylicum的gapC基因；
（2）加强途径关键酶的表达：使用trc启动子过表达了aspC、ppc、thrAfbrBC、asd；
（3）优化L-苏氨酸转运系统：敲除sstT基因；通过分段整合基因的方法增强人工操纵子rhtABC基因的表达；
（4）提高还原力NADPH含量：利用trc启动子过表达提高pntAB基因的转录水平。
7.根据权利要求6所述的L-苏氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于：所述步骤（2）中调整thrAfbrBC、aspC、asd基因的拷贝数为2：2：3。
8.权利要求2-5之一所述L-苏氨酸生产菌株在发酵生产L-苏氨酸方面的应用。
9.根据权利要求8所述的L-苏氨酸生产菌株的应用，其特征在于：具体步骤如下：
①斜面培养：取L-苏氨酸生产菌株接种在斜面培养基上，37℃培养12h，斜面培养基选用通用LB固体培养基；
②摇瓶种子培养：取固体斜面菌种接种至摇瓶培养基中进行发酵，培养温度37℃，培养时间12h，摇床转速220r/min，pH7.0；
③摇瓶发酵培养：发酵接种量为20%-25%，培养温度为37℃，pH7.0，培养时间24h，摇床转速220r/min。
10.根据权利要求9所述的L-苏氨酸生产菌株的应用，其特征在于：所述步骤②中采用的种子培养基为：葡萄糖25g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，KH2PO4·3H2O3g/L，硫酸铵1g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，其余为水；所述步骤③中采用的发酵培养基为：MgSO4·7H2O 1.5g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨3g/L，玉米浆20ml，硫酸铵3g/L，蛋氨酸0.1g/L，K2HPO4·3H2O 4g/L，谷氨酸2g/L，FeSO4·7H2O 20mg/L，MnSO4 10mg/L，VB1、VB3、VB5各2mg/L，其余为水。
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