CN117947075B - 一种精氨酸生产菌株及其构建方法与应用 - Google Patents

一种精氨酸生产菌株及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种精氨酸生产菌株及其构建方法与应用，所述菌株缺失了speA、adiA、astA、argR、argA、ndh、amn、gdhA、yahk、fecE基因，上调了pntAB基因，异源表达了来源于B.subtilis168的pyraA‑carB E949*基因与来源于Corynebacterium glutamicum K051的lysE基因,所述生产菌携带了中拷贝质粒pMarg，所述质粒异源表达了来源于Corynebacterium glutamicum K051的argC、argJ、argB、argD、argF、argG、argH、gdh基因；所述菌株能够有效提高精氨酸合成效率，提高精氨酸生产水平。

Description

一种精氨酸生产菌株及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术与发酵工程技术领域，尤其是一种精氨酸生产菌株及其构建方法与应用。
背景技术
L-精氨酸属20种常见氨基酸之一，可经由酶催化反应转化L-瓜氨酸、L-鸟氨酸等为多种衍生物，具有多种生理功能。2021年L-精氨酸的全球市场规模为 1.35 亿美元，这一数据依旧在持续增长，预计到 2028年将达到1.59亿美元。
近年来，利用合成生物学技术构建L-精氨酸及其衍生物微生物细胞工厂已经取得了巨大进展。如专利CN 115806929 A中提供的精氨酸生产菌，能够利用大肠杆菌高效合成精氨酸，但是，精氨酸合成路径冗长，涉及到的关键酶众多，需要大量的基因组整合才能达到效果，这并不利于菌株的稳定性。除此之外，精氨酸生物合成需要大量的ATP与NADPH，由于菌株代谢途径稳定，无法提供多余能量与还原力，盲目提高HMP途径又会导致代谢流紊乱，因此如何提高ATP与NADPH而不影响菌株正常代谢是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种质粒。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供应用上述质粒获得的精氨酸生产菌株。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述精氨酸生产菌株的构建方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述精氨酸生产菌株的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种质粒，为质粒pMarg，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.15所示。
优选的，上述质粒，携带复制起始位点、四环素抗性基因、tac启动子、终止子等质粒元件，同时携带了来源于Corynebacterium glutamicum K051的argC、argJ、argB、argD、 argF、argG、argH、gdh基因，基因均选用tac启动子强化转录。
一种精氨酸生产菌株，为菌株R.YF11，缺失了speA、adiA、astA、argR、argA、ndh、 amn、gdhA、yahk、fecE基因，上调pntAB基因，异源表达了来源于B.subtilis168的pyraA-carBE949*基因与来源于Corynebacterium glutamicumK051的lysE基因,同时携带了中拷贝质粒pMarg，所述质粒异源表达了来源于Corynebacterium glutamicumK051的argC、argJ、 argB、argD、argF、argG、argH、gdh基因。
优选的，上述精氨酸生产菌株，以E.coliW3110作为底盘菌株，敲除了菌株基因组上的speA、adiA、astA、argR、argA、ndh、amn、gdhA、yahk、fecE基因；利用trc启动子强化来源于B.subtilis168的pyraA-carB E949*基因转录，并整合到基因组astA基因位点；利用trc启动子强化pntAB基因转录强度，并整合到基因组argA基因位点，利用Bba-J23102启动子强化来源于Corynebacterium glutamicumK051的lysE基因转录，并整合到基因组ndh基因位点。
优选的，上述精氨酸生产菌株，所述E.coli W3110为E.coliW3110 ATCC 27325。
优选的，上述精氨酸生产菌株，所述speA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，adiA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，astA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，argR基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示，argA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示，pyraA-carB E949*基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示，lysE基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示，fecE基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示，amn基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示，ndh基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.10所示，yahK基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.11所示，pntAB终止子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.12所示，ArgCJBDF基因簇的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.13所示，argGH基因簇的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.14所示，pMarg质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.15所示，Trc启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.16所示，Bba-J23102启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.17所示，tac启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.18所示，gdh基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.19所示，gdhA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.20所示。
上述精氨酸生产菌株的构建方法，在出发菌株E.coliW3110基础上进行定向改造，具体步骤如下：
(1)底盘菌改造：
敲除精氨酸分解途径基因：speA、adiA、astA；
敲除阻遏调控蛋白基因argR；
敲除自身乙酰鸟氨酸转移酶基因argA；敲除大肠杆菌自身的谷氨酸脱氢酶基因gdhA；
引入来源于B.subtilis168的pyraA-carBE949*码氨甲酰磷酸合成酶基因，引入来源于Corynebacterium glutamicumK051的精氨酸外转运蛋白基因lysE；
（2）优化ATP供给系统：
敲除fecE基因减少了ATP的浪费；
敲除amn基因加强了ATP的生成，敲除ndh基因减少了NADH的消耗，后者能够通过电子呼吸链产生大量ATP；
（3）提高还原力NADPH含量：
上调pntAB基因，提高pntAB基因的转录水平，提高NADPH的供应，通过敲除yahK基因减少了NADPH的浪费；
（4）pMarg质粒系统：pMarg质粒携带复制起始位点、四环素抗性、tac启动子、终止子等质粒元件，以该质粒高效表达来源于Corynebacterium glutamicumK051的argC、argJ、 argB、argD、argF、argG、argH、gdh基因。
优选的，上述精氨酸生产菌株的构建方法，所述步骤（4）中argC、argJ、argB、argD、 argF、argG、argH、gdh基因均选用tac启动子强化转录。
上述精氨酸生产菌株在发酵生产精氨酸方面的应用。
优选的，上述精氨酸生产菌株的应用，在培养基中发酵培养，以分离提取手段得到发酵液中的精氨酸产品。
优选的，上述精氨酸生产菌株的应用，培养基包括但不限于碳源、氮源、无机盐、维生素等；发酵条件包括发酵温度、发酵pH、发酵溶氧条件、发酵压力、发酵时间等；所述分离提取是指通过膜过滤、脱色、离子交换层析、结晶等常规手段得到纯品精氨酸的手段，提取对象是精氨酸生产菌株经过发酵培养后富含精氨酸的发酵液。
优选的，上述精氨酸生产菌株的应用，具体步骤如下：
①斜面培养：取精氨酸生产菌株接种在斜面培养基上，36-37℃培养12-16h，斜面培养基选用通用LB固体培养基；
②摇瓶种子培养：取固体斜面菌种接种至摇瓶培养基中进行发酵，培养温度36-37℃，培养时间12-20h，摇床转速200-240r/min，pH6.7-7.2；
③摇瓶发酵培养：发酵接种量为15-20%，培养温度为36-37℃，pH在6.7-7.2，培养时间24-36h，摇床转速200-240r/min。
优选的，上述精氨酸生产菌株的应用，所述步骤②中采用的种子培养基为葡萄糖20-30g/L，酵母粉3-5g/L，蛋白胨1.2-1.5g/L，MgSO4.7H2O 0.5-1g/L，KH2PO42-3g/L，硫酸铵1-2g/L，FeSO4.7H2O 10-20mg/L，其余为水。
优选的，上述精氨酸生产菌株的应用，所述步骤③采用的发酵培养基为：MgSO4.7H2O 1.5-2g/L，酵母粉4-5g/L，蛋白胨2-3g/L，硫酸铵10-20g/L，K2HPO4.3H2O 3-6g/L，谷氨酸1-3g/L，FeSO4.7H2O 20-30mg/L，MnSO410-15mg/L，VB1、VB3、VB5各2-3mg/L，其余为水。
上述培养基均可采用标准方法制备获得。
有益效果：
上述精氨酸生产菌株，基因工程菌具有良好的精氨酸合成能力，性能稳定，产酸效率高，该菌株缺失了speA、adiA、astA、argR、argA、ndh、amn、gdhA、yahk、fecE基因，上调了pntAB基因，异源表达了来源于B.subtilis168的pyraA-carB E949*基因与来源于Corynebacterium glutamicumK051的lysE基因,所述生产菌携带了中拷贝质粒pMarg，所述质粒异源表达了来源于Corynebacterium glutamicumK051的argC、argJ、argB、argD、argF、argG、argH、gdh基因，所述菌株通过优化ATP与NADPH供给，将关键酶利用高稳定性的质粒系统表达，能够有效提高精氨酸合成效率，提高精氨酸生产水平，实现了精氨酸的高效生产，具有优秀的工业应用前景。具体来说：
（1）通过敲除fecE基因减少了ATP的浪费，通过敲除amn基因加强了ATP的生成，通过敲除ndh基因减少了NADH的消耗，进一步提高了NADH通过电子呼吸链生成ATP的量。该步骤大大提高了精氨酸合成所需关键能量物质ATP的含量。
（2）通过提高pntAB基因的转录水平，提高了NADPH的供应，通过敲除yahK基因减少了NADPH的浪费，为精氨酸合成提供了大量的还原力。
（3）由于生产菌株携带质粒pMarg，因此需要添加抗性来消除质粒容易丢失的特性，考虑到成本与食品安全性，本申请敲除了基因组上编码谷氨酸脱氢酶的gdhA基因，并将来源于Corynebacterium glutamicumK051的谷氨酸脱氢酶基因gdh与精氨酸合成相关基因argC、argJ、argB、argD、argF、argG、argH一同使用质粒表达，一方面大幅度提高了关键基因的表达强度，另一方面由于基因组上并不存在谷氨酸脱氢酶，因此菌株生长所需的谷氨酸以及其下游代谢产物均需要质粒上的异源gdh表达提供，这也就导致质粒存在，则菌株生长，质粒丢失，则菌株死亡。在这种状态下，本申请应用工程菌株进行发酵时无需添加任何抗生素，消除了质粒带来的弊端，同时得到了质粒的优势。
附图说明
图1为质粒pMarg结构示意图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例中涉及到的百分号“%”，若未特别说明，指质量百分比，溶液的百分比指100mL中含有溶质的克数，液体之间的百分比，是指在25℃时溶液的体积比例。
实施例中所用的出发菌株为野生型E.coliW3110 ATCC 27325（购买获得），相应启动子和基因等见序列表。涉及到的菌株构建过程中用到的引物见表1。
通过下述4个模块构建精氨酸生产菌株：
(1)底盘菌改造：以E.coliW3110为出发菌株，敲除精氨酸分解途径基因：speA、 adiA、astA；敲除阻遏调控蛋白基因argR；敲除自身乙酰鸟氨酸转移酶基因argA；敲除自身的谷氨酸脱氢酶基因gdhA；引入来源于B.subtilis168的pyraA-carB E949*码氨甲酰磷酸合成酶基因；引入来源于Corynebacterium glutamicumK051的精氨酸外转运蛋白基因lysE。
（2）优化ATP供给系统：敲除fecE基因减少了ATP的浪费；敲除amn基因加强了ATP的生成，敲除ndh基因减少了NADH的消耗，后者能够通过电子呼吸链产生大量ATP。
（3）提高还原力NADPH含量：提高pntAB基因的转录水平，提高了NADPH的供应，通过敲除yahK基因减少了NADPH的浪费。
（4）pMarg质粒系统：如图1所示，pMarg质粒携带复制起始位点、四环素抗性、tac启动子、终止子等质粒元件，以该质粒高效表达了来源于Corynebacterium glutamicumK051的argC、argJ、argB、argD、argF、argG、argH、gdh基因，基因均选用tac启动子强化转录。
上述基因操作采用的基因编辑方法参照文献（Li Y，Lin Z，Huang C，et al.Metabolic engineering of Escherichia coli using CRISPR-Cas9 meditated genomeediting. Metabolic Engineering，2015，31：13-21.），本发明涉及到的专业名词，若无特别备注，均可在该文章中得到解释。本发明所指的“敲除”是指将目的基因失活，“引入”是指将外源基因与启动子、终止子连接后插入到工程菌基因组中。
表1菌株构建过程中所涉及的引物
引物名称 序列号 引物序列（5’-3’）
speA-US SEQ ID NO.21 AAAGAAACCGGTTGCGCAGT
speA-UA SEQ ID NO.22 CACGTCAACCGCTTCGGTATGGATTCCCTCGCACGTTTGAA
speA-DS SEQ ID NO.23 TTCAAACGTGCGAGGGAATCCATACCGAAGCGGTTGACGTG
speA-DA SEQ ID NO.24 GGCATTGGAAACCAGTGAGTTATC
pGRB-speA-s SEQ ID NO.25 AGTCCTAGGTATAATACTAGTGTTCGGCCTGGCTGCGACTCGTTTTAGAGCTAGAA
pGRB-speA-a SEQ ID NO.26 TTCTAGCTCTAAAACGAGTCGCAGCCAGGCCGAACACTAGTATTATACCTAGGACT
adiA-US SEQ ID NO.27 TACAGCCCGAAAAGGCCGGAA
adiA-UA SEQ ID NO.28 GGATACGGGATAACTGAGTTTGCCTTTTTCCCGATCGCCCAACAG
adiA-DS SEQ ID NO.29 CTGTTGGGCGATCGGGAAAAAGGCAAACTCAGTTATCCCGTATCC
adiA-DA SEQ ID NO.30 TGAAAACGTTGCCATACTCAAAAGGC
pGRB-adiA-s SEQ ID NO.31 AGTCCTAGGTATAATACTAGTTGCCATAAATCCATCGAACAGTTTTAGAGCTAGAA
pGRB-adiA-a SEQ ID NO.32 TTCTAGCTCTAAAACTGTTCGATGGATTTATGGCAACTAGTATTATACCTAGGACT
astA-US SEQ ID NO.33 TGGCGTTAAACAGCGTCACGACT
astA-UA SEQ ID NO.34 TTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAATCATGATGAACCTCGGCTAACAAAGTG
astA-DS SEQ ID NO.35 GGAGGCGGCAGTCACTATATGAATGACTTTATGGATTAACGGTGACTGGAT
astA-DA SEQ ID NO.36 TCATCGCCGTCACTTCGGTTG
pAC-S1 SEQ ID NO.37 CCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGAAGAGACGATTAGTACTGGAA
pAC-A1 SEQ ID NO.38 CGTGGAACCGCTTAGCAATGGCAAGCCCTTCTTTGTCCTTATCAGCTACTGTTAAAAGCAC
pAC-S2 SEQ ID NO.39 GTGCTTTTAACAGTAGCTGATAAGGACAAAGAAGGGCTTGCCATTGCTAAGCGGTTCCACG
pAC-A2 SEQ ID NO.40 CCAGTCACCGTTAATCCATAAAGTCATTCATATAGTGACTGCCGCCTCC
pGRB-astA -s SEQ ID NO.41 AGTCCTAGGTATAATACTAGTTAGCGAGACAGGCACCGTGGGTTTTAGAGCTAGAA
pGRB-astA-a SEQ ID NO.42 TTCTAGCTCTAAAACCCACGGTGCCTGTCTCGCTAACTAGTATTATACCTAGGACTTATC
argR-US SEQ ID NO.43 GCGACCTTAATCCACAAAATTGCCG
argR-UA SEQ ID NO.44 CGACGGGGCAGAGATTAAAGCTCGAGCTTCGCATAAGTCACCC
argR-DS SEQ ID NO.45 GGGTGACTTATGCGAAGCTCGAGCTTTAATCTCTGCCCCGTCG
argR-DA SEQ ID NO.46 TACGCTTAATGCAGCAACAGTGGTT
pGRB-argR-s SEQ ID NO.47 AGTCCTAGGTATAATACTAGTACGTACACGCAATGCCAAAAGTTTTAGAGCTAGAA
pGRB-argR-a SEQ ID NO.48 TTCTAGCTCTAAAACTTTTGGCATTGCGTGTACGTACTAGTATTATACCTAGGACT
ndh-US SEQ ID NO.49 TGTTTTTTGATCTCACCCGGTAAAGTCG
ndh-UA SEQ ID NO.50 CTAGCACAGTACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAATGTTGCCATTTCCAGCCCACCA
ndh-DS SEQ ID NO.51 CGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCTTCTCCACCGTCGGTAGCCTGAT
ndh-DA SEQ ID NO.52 CCTTCTTTGCAGTTATGCCAATCATG
lysE-s SEQ ID NO.53 TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTACTGTGCTAGCAGGAAACAGACCATGGTGATCATGGAAATCTTCATTACA
lysE-a SEQ ID NO.54 ACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGCTAACCCATCAACATCA
pGRB-ndh-s SEQ ID NO.55 AGTCCTAGGTATAATACTAGTTCCGCCAACCTGGGCGCGAAGTTTTAGAGCTAGAA
pGRB-ndh-a SEQ ID NO.56 TTCTAGCTCTAAAACTTCGCGCCCAGGTTGGCGGAACTAGTATTATACCTAGGACT
argA-US SEQ ID NO.57 CGGCATTACTGATAAAAAAGTCGCTC
argA-UA SEQ ID NO.58 GAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAGTGTTTTGGCGTCGGTCACA
argA-DS SEQ ID NO.59 ACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCAGGAACGTGGATTTACCCC
argA-DA SEQ ID NO.60 TCGCTGTATGCCGATGAGCG
pntAB-s SEQ ID NO.61 GCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGCGAATTGGCATACCAAGAGAACG
pntAB-a SEQ ID NO.62 GAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTACAGAGCTTTCAGGATTGCATCCAC
pGRB-argA-s SEQ ID NO.63 AGTCCTAGGTATAATACTAGTCAGCCGCTGGGCGTCGATGAGTTTTAGAGCTAGAA
pGRB-argA-a SEQ ID NO.64 TTCTAGCTCTAAAACTCATCGACGCCCAGCGGCTGACTAGTATTATACCTAGGACT
argC-s SEQ ID NO.65 GCGCTTTGATATACGCCGAGATCTAAGATAAGTATGGCAACACTGGAACAGACATGACTAACCGCATCGTTCTTGCATACTCCGG
argF SEQ ID NO.66 TTTTTCCGGCTTCATTAAAGAAAGTTAAAATGCCGCCAGCGGAACTGGCGGCTGTGGGATTACCTCGGCTGGTTGGCCAGCAG
argG-s SEQ ID NO.67 GCGCTTTGATATACGCCGAGATCTAAGATAAGTATGGCAACACTGGAACAGACATGACTAACCGCATCGTTCTTGCATACTCCGG
argH-a SEQ ID NO.68 GGGCACGTGCGGGGGTACGTCGATAAGGTTTAATTGTCGGATGCGCCGTCAGAGTGGCGTATCCGATGAATCACCACAGGC
gdh-s SEQ ID NO.69 ATGCAAATCCGCACACAACATTTCAAAAGACAGGATTGGGTAAATGACAGTTGATGAGCAGGTCTCTAACT
gdh-a SEQ ID NO.70 GTGACCTGCCCGTTGATTTTCAGAGAAGGGGAATTAGATGACGCCCTGTGCCAGCATCG
fecE-US SEQ ID NO.71 TACTAGCTGTCGCCATGACATCTAC
fecE-UA SEQ ID NO.72 CCATAACATGTCCGTTTGCCATTACTCAGTTCGTAAAGTCATTTATCGCATTCTC
fecE-DS SEQ ID NO.73 GAGAATGCGATAAATGACTTTACGAACTGAGTAATGGCAAACGGACATGTTATGG
fecE-DA SEQ ID NO.74 TTTCTAAAATTTTAACTTCGCGTTTTTCGTTGC
pGRB-fecE -s SEQ ID NO.75 AGTCCTAGGTATAATACTAGTTCAGCGCCAGCGCGCATTTCGTTTTAGAGCTAGAA
pGRB-fecE -a SEQ ID NO.76 TTCTAGCTCTAAAACGAAATGCGCGCTGGCGCTGAACTAGTATTATACCTAGGACT
amn-US SEQ ID NO.77 TGGCGCTGGAGTCGGTTATC
amn-UA SEQ ID NO.78 ACAGTAGTGTCCCGTATGGCACTTGCACTGAGATATGCGCACC
amn-DS SEQ ID NO.79 GGTGCGCATATCTCAGTGCAAGTGCCATACGGGACACTACTGT
amn-DA SEQ ID NO.80 TTCAGCATATTATATCATAACAGGAAAAATCTCGTC
pGRB-amn-s SEQ ID NO.81 AGTCCTAGGTATAATACTAGTGCACGGTTGCGCCATTATACGTTTTAGAGCTAGAA
pGRB-amn-a SEQ ID NO.82 TTCTAGCTCTAAAACGTATAATGGCGCAACCGTGCACTAGTATTATACCTAGGACT
yahK-US SEQ ID NO.83 GAGGAATATGCCCTTATTGACGTTGTG
yahK-UA SEQ ID NO.84 GCGTTTCATGATCAGGTTGAAAACTTCGATCGGAATGGCAAACGCCA
yahK-DS SEQ ID NO.85 TGGCGTTTGCCATTCCGATCGAAGTTTTCAACCTGATCATGAAACGC
yahK-DA SEQ ID NO.86 TGTGAAGTATTGTGTACTGGAGGGCG
pGRB-yahK-s SEQ ID NO.87 AGTCCTAGGTATAATACTAGTTCGGCGGTCTGGGACATATGGTTTTAGAGCTAGAA
pGRB-yahK-a SEQ ID NO.88 TTCTAGCTCTAAAACCATATGTCCCAGACCGCCGAACTAGTATTATACCTAGGACT
实施例1
本实施例旨在说明菌株R.YF11的具体构建步骤。特别的，实施例中若有同类型基因操作方法，则仅提供1次，并做注释，不再多加赘述。
①敲除speA基因：以E.coliW3110基因组为模板，分别以speA-US、speA-UA和speA-DS、speA-DA，通过pcr扩增得到上、下游同源臂，接着，以上下游同源臂为模板，以speA-US、speA-DA为引物，通过重叠pcr扩增得到重叠片段；以pGRB-speA-s、pGRB-speA-a为引物，退火得到gRNA片段，并将其与pGRB载体连接，得到speA-pGRB；制备E.coliW3110电转化感受态细胞，将重叠片段与speA-pGRB一同电转化进入感受态细胞，并筛选得到阳性转化子，获得菌株R.YF1。
②敲除adiA基因：具有①中相同操作方法，不同之处在于，所用引物为adiA-US、adiA-UA、adiA-DS、adiA-DS、pGRB-adiA-s、pGRB-adiA-a。感受态细胞为R.YF1，获得菌株R.YF2
③敲除astA基因并在该位点整合来源于B.subtilis168的pyraA-carB E949*：以B.subtilis168基因组为模板，分别以astA-US、astA-UA和astA-DS、astA-DA，通过pcr扩增得到上、下游同源臂，以E.coliW3110基因组为模板，以pAC-S1、pAC-A1、pAC-S2、pAC-A2为引物，通过pcr扩增得到目的基因片段；接着，以上下游同源臂、目的基因片段为模板，以astA-US、astA-DA为引物，通过重叠pcr扩增得到重叠片段，由于引物设计时已将trc启动子连接到了引物的5’段，因此重叠片段带有trc启动子，即上游同源臂-trc启动子-目的基因下游同源臂重叠片段；以pGRB-astA-s、pGRB-astA-a为引物，退火得到gRNA片段，并将其与pGRB载体连接，得到astA-pGRB；制备R.YF2电转化感受态细胞，将目的片段与speA-pGRB一同电转化进入感受态细胞，并筛选得到阳性转化子，获得菌株R.YF3。
④敲除argR基因：具有①中相同操作方法，不同之处在于，所用引物为argR-US、argR-UA、argR-DS、argR-DS、pGRB-argR-s、pGRB-argR-a。感受态细胞为R.YF3，获得菌株R.YF4。
⑤以敲除ndh基因并在该位点整合来源于Corynebacterium glutamicumK051的lysE基因：具有③中相同操作，不同之处在于，使用Corynebacterium glutamicumK051基因组获得基因片段，引物分别为ndh-US、ndh-UA、ndh-DS、ndh-DS、pGRB-ndh-s、pGRB-ndh-a、lysE-s、lysE-a。由于引物设计时已将Bba-J23102启动子连接到了引物的5’段，因此重叠片段带有Bba-J23102启动子，即上游同源臂-Bba-J23102启动子-目的基因下游同源臂重叠片段，感受态细胞为R.YF4，获得菌株R.YF5。
⑥敲除argA基因并在该位点整合自身pntAB基因：具有③中相同操作，不同之处在于使用E.coliW3110基因组获得基因片段，引物分别为argA-US、argA-UA、argA-DS、argA-DS、pGRB-argA-s、pGRB-argA-a、pntAB-s、pntAB -a。感受态细胞为R.YF5，获得菌株R.YF6。
⑦依次敲除fecE、amn、yahK、gdhA基因：具有①中相同操作方法，得到菌株R.YF7、R.YF8、R.YF9、R.YF10。
⑧转化质粒pMarg得到工程菌R.YF11：将完整质粒pMarg转化进入R.YF10感受态细胞的，转化方法为电转化（也可以是化学转化等方法）得到工程菌R.YF11。
实施例2
本实施例旨在说明实施例1中质粒pMarg的构建方法，具体步骤如下：
分别以Corynebacterium glutamicumK051基因组为模板，以argC-s、argF为引物，扩增得到argCJBDF基因簇；以argG-s、argH-a为引物，扩增得到argGH基因簇；以gdh-s、gdh-a为引物，扩增得到gdh基因片段。
将基因片段与质粒线性化载体通过重组酶连接，即可得到完整质粒。连接方法可选用任意重组酶，本实施例中选用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的ClonExpress®快速克隆技术进行过表达质粒的构建。
实施例3
本实施例旨在说明工程菌R.YF11的摇瓶发酵应用，具体步骤为：
①斜面培养：菌种接种在斜面培养基上，36-37℃培养14h，斜面培养基选用通用LB固体培养基。
②摇瓶种子培养：取固体斜面菌种接种至摇瓶培养基中进行发酵。培养温度36-37℃，培养时间16h，摇床转速220r/min，pH6.7-7.2，种子培养基为葡萄糖25g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨1.4g/L，MgSO4.7H2O 0.8g/L，KH2PO42.5g/L，硫酸铵1.5g/L，FeSO4.7H2O 15mg/L，其余为水。
③摇瓶发酵培养：发酵接种量为15-20%，培养温度为36-37℃，pH在6.7-7.2，培养时间30h，摇床转速220r/min；采用的发酵培养基为：MgSO4.7H2O 1.8g/L，酵母粉4.5g/L，蛋白胨2.5g/L，硫酸铵15g/L，K2HPO4.3H2O 4.5g/L，谷氨酸2g/L，FeSO4.7H2O 25mg/L，MnSO413mg/L，VB1、VB3、VB5各2.5mg/L，其余为水。
以野生型E.coliW3110为对照组，经过36h发酵验证，野生型E.coliW3110未能积累精氨酸，实施例1所述工程菌R.YF11积累了28.3g/L精氨酸，证明了该菌株的有效性。
实施例4
本实施例旨在说明菌株R.YF11在相同培养条件下，有无四环素抗性对pMarg质粒稳定性与精氨酸生产能力的影响。分A、B两组实验，其中：
A组采用实施例3中完全相同的培养方法，B组与A组不同之处在于，在斜面、种子、发酵培养基中均添加30mg/L四环素抗生素。发酵进行共36h，在12h、24h、36h取样，分别检测质粒丢失率、精氨酸产量与生物量参数，其中质粒丢失率样本量为随机选取的400个单菌落，分别在抗性/无抗性平板培养后计数检测。结果如下表2所示：
表2质粒稳定性验证
12h 24h 36h
A/B精氨酸产量（g/L） 4.4/4.2 18.5/18.6 28.7/28.5
A/B质粒丢失率（%） 0/0 0.25/0 0.5/0.5
A/B生物量（OD600nm） 11.2/10.3 24.3/20.1 32.2/28.6
结果可见，pMarg质粒稳定性与四环素抗性并无直接关系，同样并不会影响精氨酸产量，但四环素的存在会在一定程度降低生物量，因此不添加抗性是更好的选择。
实施例5
本实施例旨在说明从精氨酸发酵液中分离提取得到高纯度精氨酸的操作工艺。
1、取实施例4中所得A组发酵液，4000-4500r/min离心10-15分钟，取上清。
2、取步骤1中上清使用0.3-0.5%活性炭脱色。
3、取步骤2中脱色后清夜进行阳离子离子交换树脂吸附，氨水洗脱。
4、取步骤3中洗脱液浓缩结晶，获得精氨酸产品。
结果显示，精氨酸提取收率为85.2%，赖氨酸产品纯度可达99%。
上述步骤均可采用行业常用分离提取设备、工艺替代。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，本技术领域技术人员以本发明的方法或以本方法为基础进行的菌种改造等改进和润饰均视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种精氨酸生产菌株，其特征在于：以E.coli W3110 ATCC 27325作为底盘菌株，敲除了菌株基因组上的speA、adiA、astA、argR、argA、ndh、amn、gdhA、yahk、fecE基因；利用trc启动子强化来源于B.subtilis168的pyraA-carB E949*基因转录，并整合到基因组astA基因位点；利用trc启动子强化pntAB基因转录强度，并整合到基因组argA基因位点，利用Bba-J23102启动子强化来源于Corynebacterium glutamicum K051的lysE基因转录，并整合到基因组ndh基因位点,同时携带了质粒pMarg，所述质粒异源表达了来源于Corynebacterium glutamicum K051的argC、argJ、argB、argD、argF、argG、argH、gdh基因；其中，所述speA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，adiA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，astA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，argR基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示，argA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示，pyraA-carB E949*基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示，lysE基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示，fecE基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示，amn基因的核苷酸序列如序列表SEQID NO.9所示，ndh基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.10所示，yahK基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.11所示，pntAB基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.12所示，argCJBDF基因簇的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.13所示，argGH基因簇的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.14所示，质粒pMarg的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.15所示，trc启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.16所示，Bba-J23102启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.17所示，gdh基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.19所示，gdhA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.20所示。
2.权利要求1所述精氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于：在出发菌株E.coliW3110基础上进行定向改造，具体步骤如下：
(1)底盘菌改造：
敲除精氨酸分解途径基因：speA、adiA、astA；
敲除阻遏调控蛋白基因argR；
敲除自身乙酰鸟氨酸转移酶基因argA；敲除大肠杆菌自身的谷氨酸脱氢酶基因gdhA；
引入来源于B.subtilis168的氨甲酰磷酸合成酶基因pyraA-carBE949*，引入来源于Corynebacterium glutamicumK051的精氨酸外转运蛋白基因lysE；
（2）优化ATP供给系统：
敲除fecE基因减少了ATP的浪费；
敲除amn基因加强了ATP的生成，敲除ndh基因减少了NADH的消耗，后者能够通过电子呼吸链产生大量ATP；
（3）提高还原力NADPH含量：
上调pntAB基因，提高pntAB基因的转录水平，提高NADPH的供应，通过敲除yahK基因减少了NADPH的浪费；
（4）转化pMarg质粒系统：pMarg质粒携带复制起始位点、四环素抗性、tac启动子、终止子质粒元件，以该质粒高效表达来源于Corynebacterium glutamicum K051的argC、argJ、 argB、argD、argF、argG、argH、gdh基因。
3.根据权利要求2所述精氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于：所述步骤（4）中argC、 argJ、argB、argD、argF、argG、argH、gdh基因均选用tac启动子强化转录，所述tac启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.18所示。
4.权利要求1所述精氨酸生产菌株在发酵生产精氨酸方面的应用。
5.根据权利要求4所述的精氨酸生产菌株的应用，其特征在于：在培养基中发酵培养，以分离提取手段得到发酵液中的精氨酸产品。
6.根据权利要求4或5所述的精氨酸生产菌株的应用，其特征在于：具体步骤如下：
①斜面培养：取精氨酸生产菌株接种在斜面培养基上，36-37℃培养12-16h，斜面培养基选用通用LB固体培养基；
②摇瓶种子培养：取固体斜面菌种接种至摇瓶培养基中进行发酵，培养温度36-37℃，培养时间12-20h，摇床转速200-240r/min，pH6.7-7.2；
③摇瓶发酵培养：发酵接种量为15-20%，培养温度为36-37℃，pH在6.7-7.2，培养时间24-36h，摇床转速200-240r/min。
7.根据权利要求6所述的精氨酸生产菌株的应用，其特征在于：所述步骤②中采用的种子培养基为葡萄糖20-30g/L，酵母粉3-5g/L，蛋白胨1.2-1.5g/L，MgSO4.7H2O 0.5-1g/L，KH2PO42-3g/L，硫酸铵1-2g/L，FeSO4.7H2O 10-20mg/L，其余为水；所述步骤③采用的发酵培养基为：MgSO4.7H2O 1.5-2g/L，酵母粉4-5g/L，蛋白胨2-3g/L，硫酸铵10-20g/L，K2HPO4.3H2O3-6g/L，谷氨酸1-3g/L，FeSO4.7H2O 20-30mg/L，MnSO4 10-15mg/L，VB1、VB3、VB5各2-3mg/L，其余为水。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4430430A (en) * 1980-06-13 1984-02-07 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-arginine by fermentation
CN109957518A (zh) * 2017-12-26 2019-07-02 中国科学院上海生命科学研究院 一株高产l-精氨酸菌株
CN110964683A (zh) * 2019-12-02 2020-04-07 天津科技大学 生产l-精氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用
CN112501098A (zh) * 2020-12-11 2021-03-16 上海陶宇晟生物技术有限责任公司 具有降解苯丙氨酸能力的工程益生菌
CN115806929A (zh) * 2022-12-14 2023-03-17 天津科技大学 一种生产l-精氨酸的基因工程菌及其应用
CN116731946A (zh) * 2023-07-18 2023-09-12 天津科技大学 利用具有过表达cynT基因的大肠杆菌生产L-精氨酸的方法及其所用重组菌

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2700715T3 (pl) * 2012-08-20 2019-03-29 Evonik Degussa Gmbh Sposób fermentacyjnego wytwarzania L-aminokwasów z zastosowaniem ulepszonych szczepów z rodziny Enterobacteriaceae

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4430430A (en) * 1980-06-13 1984-02-07 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-arginine by fermentation
CN109957518A (zh) * 2017-12-26 2019-07-02 中国科学院上海生命科学研究院 一株高产l-精氨酸菌株
CN110964683A (zh) * 2019-12-02 2020-04-07 天津科技大学 生产l-精氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用
CN112501098A (zh) * 2020-12-11 2021-03-16 上海陶宇晟生物技术有限责任公司 具有降解苯丙氨酸能力的工程益生菌
CN115806929A (zh) * 2022-12-14 2023-03-17 天津科技大学 一种生产l-精氨酸的基因工程菌及其应用
CN116731946A (zh) * 2023-07-18 2023-09-12 天津科技大学 利用具有过表达cynT基因的大肠杆菌生产L-精氨酸的方法及其所用重组菌

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Reduction of acetate synthesis, enhanced arginine export, and supply of precursors, cofactors, and energy for improved synthesis of L-arginine by Escherichia coli;Hai-De Wang等;《Appl Microbiol Biotechnol . 》;20230425;第107卷(第11期);3593-3603 *
杨冬美 ; 李华 ; 李由然 ; 张梁 ; 丁重阳 ; 李赢 ; 顾正华 ; 石贵阳 ; .大肠杆菌TdcC、SstT和LIV-1系统缺失对胞外L-苏氨酸积累的影响.微生物学通报.2016,44(01),20-29. *
系统代谢工程改造大肠杆菌生产L-精氨酸;蒋帅;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》;20210815(第08期);B018-63 *

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