CN116731946A - 利用具有过表达cynT基因的大肠杆菌生产L-精氨酸的方法及其所用重组菌 - Google Patents

利用具有过表达cynT基因的大肠杆菌生产L-精氨酸的方法及其所用重组菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了利用具有过表达cynT基因的大肠杆菌生产L‑精氨酸的方法及其所用重组菌。本发明属于生物技术领域，特别涉及利用具有过表达cynT基因的大肠杆菌生产L‑精氨酸的方法及其所用重组菌。本发明的重组肠杆菌是使受体肠杆菌过表达碳酸酐酶编码基因得到的重组菌，通过向受体大肠杆菌中导入碳酸酐酶编码基因，本发明得到的重组大肠杆菌的L‑精氨酸产量显著提高，本研究为合成生物基L‑精氨酸提供了新思路。

Description

利用具有过表达cynT基因的大肠杆菌生产L-精氨酸的方法及 其所用重组菌
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及利用具有过表达cynT基因的大肠杆菌生产L-精氨酸的方法及其所用重组菌。
背景技术
L-精氨酸在医药、工业、食品、化妆品、畜牧业等领域有广泛的应用具有重要的经济和社会价值。
目前，L-精氨酸的生产方法主要有三种：微生物发酵法、化学合成法、酶催化法。其中，微生物发酵法具有生产原料来源广泛、生产工艺相对简单、对环境影响相对较小、产品纯度高等优势，现已成为L-精氨酸生产的主流方法。
选育具有L-精氨酸生产能力的高效菌株是微生物发酵法工业化应用的关键。目前选育L-精氨酸生产菌株的方法主要有两种：1)非理性的诱变筛选：该方法主要通过物理或化学方法对野生型底盘微生物进行诱变处理，结合L-精氨酸结构类似物抗性筛选方法，选育对L-精氨酸具有拮抗作用的诱变菌株。经过多轮诱变，最终筛选出具有L-精氨酸合成能力的优良生产菌株。2)理性代谢工程改造：该方法主要利用高效的基因编辑技术对底盘微生物中目标代谢产物合成网络进行系统的代谢工程改造，以最大化重定向碳代谢流量至L-精氨酸合成途径，主要包括阻断代谢产物合成途径、解除由产物合成引起的关键酶反馈抑制调控机制、加强合成途径代谢流量、优化底盘细胞辅酶供应平衡、修饰产物跨膜运输系统等。随着基因工程技术的飞速发展，理性的代谢工程改造构建高效L-精氨酸生产菌株的方法逐渐取代了诱变筛选育种方法，成为选育高效稳定L-精氨酸生产菌株的主流方法。
提高底盘微生物L-精氨酸生产性能是理性代谢工程育种持续性的目标。在对底盘微生物代谢网络进行系统的重构过程中，靶基因表达强度的增强或减弱是提高L-精氨生产性能的常用策略。例如，对L-精氨酸降解的一个或几个基因、L-精氨酸合成竞争途径的一个或几个基因、参与碳氮流量再分配的基因进行减弱表达可以显著促进L-精氨酸的合成；另外，通过提高产物合成途径关键酶表达、提高产物外排膜蛋白的表达、提高产物前体物合成途径的关键酶表达也对提高底盘微生物生产L-精氨酸具有显著的有益效果；
cynT基因编码碳酸酐酶，其催化CO2和H2O反应合成H2CO3。然而，针对cynT基因表达强度的增强对L-精氨酸生产的影响还未有研究，特别的，目前还未有关于利用过表达cynT基因的大肠杆菌生产L-精氨酸的报道。
发明内容
本发明所要解决的问题为如何提高微生物产L-精氨酸能力。
为了解决以上问题，本发明提供了一种重组肠杆菌。
本发明提供的重组肠杆菌，是使受体肠杆菌过表达碳酸酐酶编码基因得到的重组菌。
上述重组肠杆菌中，所述碳酸酐酶基因来源于大肠杆菌。
上述重组肠杆菌中，所述碳酸酐酶是下述任一蛋白质：
A1)碳酸酐酶编码基因编码氨基酸序列是序列5所述的蛋白质
A2)将A1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有75％以上的同一性且具有碳酸酐酶活性的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有碳酸酐酶活性的融合蛋白质。
上述重组肠杆菌中，所述碳酸酐酶的编码基因可为下述任一种：
C1)核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA分子；
C2)与C1)中限定的核苷酸序列具有75％以上的同一性，且编码所述碳酸酐酶的DNA分子；
C3)在严格条件下与C1)-C2)中任一限定的核苷酸序列杂交，且编码所述碳酸酐酶的DNA分子。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码碳酸酐酶的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的碳酸酐酶质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码碳酸酐酶质且具有碳酸酐酶功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码碳酸酐酶的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述重组肠杆菌中，所述使受体肠杆菌过表达碳酸酐酶编码基因可为将受体肠杆菌的ygaY基因替换为所述碳酸酐酶编码基因。
所述将受体肠杆菌的ygaY基因替换为所述碳酸酐酶编码基因的方法包括将所述碳酸酐酶编码基因整合入所述受体肠杆菌的ygaY基因位点，将所述受体肠杆菌的ygaY基因敲除。
ygaY基因是核苷酸序列为SEQ ID No.7。
上述重组肠杆菌可为重组大肠杆菌，上述肠杆菌可为大肠杆菌。
所述受体大肠杆菌可为野生的大肠杆菌或改造的大肠杆菌。
所述野生的大肠杆菌可为大肠杆菌W3110。
所述改造的大肠杆菌可为基因工程菌E.coli W3110(大肠杆菌E.coliW3110ARG10)。
所述重组大肠杆菌可为ARG-cynT和W3110-cynT、ARG-pZ8-cynT和W3110-pZ8-cynT。
所述重组大肠杆菌ARG-cynT的碳酸酐酶编码基因cynT表达量高于受体大肠杆菌ARG10。所述重组大肠杆菌W3110-cynT的碳酸酐酶编码基因cynT表达量高于受体大肠杆菌W3110。
所述重组大肠杆菌ARG-pZ8-cynT的碳酸酐酶编码基因表达量高于受体大肠杆菌ARG。所述重组大肠杆菌W3110-pZ8-cynT的碳酸酐酶编码基因表达量高于受体大肠杆菌W3110。
所述重组大肠杆菌不含有预测的转运体蛋白编码基因ygaY。
上述重组大肠杆菌中，所述预测的转运体ygaY基因编码下述任一种蛋白质：
B1)预测的转运体编码基因ygaY编码氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质；
B2)将B1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有预测的转运体蛋白活性的蛋白质；
B3)在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签得到的具有预测的转运体蛋白活性的融合蛋白质。
所述ygaY基因可为下述任一种：
M1)核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的DNA分子；
M2)与M1)中限定的核苷酸序列具有75％以上的同一性，且编码所述碳酸酐酶的DNA分子；
M3)在严格条件下与M1)-M2)中任一限定的核苷酸序列杂交，且编码所述碳酸酐酶的DNA分子。
前文所述重组大肠杆菌还含有启动所述碳酸酐酶编码基因转录的启动子。
所述启动子可为Ptrc启动子，所述Ptrc启动子为下述任一种DNA分子：
1)一条链的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1的DNA分子；
2)与1)的DNA分子具有80％以上同一性且具有启动子功能的DNA分子。
工程菌株ARG-cynT的氰酸转运蛋白编码基因cynT表达量高于受体大肠杆菌ARG。工程菌株W3110-cynT的氰酸转运蛋白编码基因cynT表达量高于受体大肠杆菌W3110。
本文所述载体是指能够把外源DNA或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体，所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)或病毒载体。
本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、产碱菌属(Alcaligenes sp.)、假单胞菌属(Pseudomonassp.)、芽胞杆菌属(Bacillus sp.)、短杆菌属(Brevibacterium sp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)、气杆菌属(Aerobacter sp.)、肠杆菌属(Enterobacteria sp.)、微球菌属(Micrococcus sp.)、沙雷氏菌属(Serratia sp.)、沙门氏菌属(Salmonellasp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)、普罗维登斯菌属(Providencia sp.)等但不限于此。
进一步地，所述细菌可为大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)或北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)。
本文所述细胞可为植物细胞或动物细胞。所述细胞可为任何可以合成目的氨基酸的生物细胞。
本发明还提供了前文所述重组大肠杆菌的构建方法。
本发明提供的构建前文所述重组大肠杆菌的构建方法为：通过调控前文所述碳酸酐酶的编码基因的表达，或调控所述碳酸酐酶的活性或含量，来调控微生物精氨酸产量，得到精氨酸产量变化的微生物。
上述方法中，所述调控所述碳酸酐酶的编码基因的表达或调控所述碳酸酐酶的活性或含量的方法为下述任一种：
D1)向目的微生物中导入所述碳酸酐酶的编码基因；
D2)向目的微生物中导入氨基酸序列是SEQ ID NO.3的编码基因。
在一个实施例中，前文所述重组大肠杆菌按照包括如下步骤的方法构建：将受体大肠杆菌的ygaY基因编码区的第215-405bp替换为所述碳酸酐酶编码基因。
所述ygaY基因编码预测的转运体蛋白质ygaY。
上述方法中，所述碳酸酐酶的编码基因可为下述任一种：
C1)核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA分子；
C2)与C1)中限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述碳酸酐酶的DNA分子；
C3)在严格条件下与C1)-C2)中任一限定的核苷酸序列杂交，且编码所述碳酸酐酶的DNA分子。
上述方法中，所述预测的转运体ygaY基因编码下述任一种蛋白质：
B1)预测的转运体编码基因ygaY编码氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质；
B2)将B1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有预测的转运体蛋白活性的蛋白质；
B3)在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签得到的具有预测的转运体蛋白活性的融合蛋白质。
本发明还提供了前文所述菌株，和/或所述的构建方法在下述任一种应用：
E1)在调控微生物精氨酸的产量中的应用；
E2)在制备精氨酸中的应用；
E3)在构建精氨酸的基因工程微生物中的应用。
本发明还提供了氨基酸序列为SEQ ID NO.5的碳酸酐酶在下述任一种应用：
F1)在调控微生物精氨酸的产量中的应用；
F2)在制备精氨酸中的应用；
F3)在构建精氨酸的基因工程微生物中的应用。
本发明还提供了前文所述菌株，和/或所述的构建方法在生产精氨酸或含有精氨酸的食品、药品和/或饲料中的应用。
本发明还提供了生物材料，包括下述任一种：
B1)编码前文所述重组菌中的所述碳酸酐酶的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子全细胞催化剂、或含有B2)所述表达盒的全细胞催化剂、或含有B3)所述重组载体的全细胞催化剂。
本发明还提供了制备L-精氨酸的方法，所述方法包括培养前文所述的重组大肠杆菌，得到发酵产物，从所述发酵产物中得到L-精氨酸。
利用本发明所述过表达cynT构建的重组微生物或重组细胞还可用于生产多种产物，包括但不限于赖氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、莽草酸、原儿茶酸、丁二酸、α酮戊二酸、柠檬酸、鸟氨酸和/或瓜氨酸。
本发明将大肠杆菌cynT基因的本源启动子替换为Ptrc，并整合至基因组ygaY假基因位点，由强启动子Ptrc启动cynT基因，以增强cynT基因表达强度，以实现更具成本效益的L-精氨酸发酵生产。以一株L-精氨酸工程菌株ARG10为出发菌株(专利：ZL201911211097.X)，增强cynT基因表达强度促使该菌株中L-精氨酸积累浓度从26.3g/L提升到30.2g/L，L-精氨酸产率提高了14.8％。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复实验。
下述实施例中的pREDCas9质粒已记载于：Jiang W,Bikard D,Cox D,Zhang F,Marrafni LA(2013)RNAguided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cassystems.Nat Biotechnol 31:233–239.https://doi.org/10.1038/nbt.2508，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的穿梭表达载体pZ8已记载于：黄勤勤，王慧梅，梁玲，黄钦耿，吴松刚等.lysC定点突变及lysC、asdA串联表达对谷氨酸棒杆菌L-苏氨酸积累的影响.生物技术通报[J].2019(035)002.公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的改造的大肠杆菌E.coli W3110 ARG10又称基因工程菌E.coliW3110 ARG10，按照CN 110964683 B的实施例1的方法构建。
下述实施例中的野生型菌株大肠杆菌W3110购于百奥莱博，货号BTN12-170201y。
下述实施例采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。
下述实施例中，各引物按照同源重组原理进行引物设计，引物合成和测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成，具体序列如下表1。
表1、本发明中使用的引物
本发明所用的菌株具体信息见表2。
表2、本发明所用的菌株和质粒
下述实施例中，斜面培养基组成为：葡萄糖1-5g/L，蛋白胨5-10g/L，牛肉膏5-10g/L，酵母粉1-5g/L，NaCl 1-2.5g/L，琼脂15-20g/L，其余为水，pH 7.0-7.2。
下述实施例中，种子培养基组成为：葡萄糖20-40g/L，酵母提取物2-5g/L，蛋白胨2-4g/L，K2HPO4 1-3g/L，MgSO4·7H2O 1-2g/L，FeSO4·7H2O 15-20mg/L，MnSO4·7H2O15-20mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各1-3mg/L其余为水，pH 7.0-7.2。
下述实施例中，发酵培养基组成为：葡萄糖20-40g/L，酵母提取物1-3g/L，蛋白胨2-3g/L，K2HPO4 3-6g/L，MgSO4·7H2O 1-2g/L，FeSO4·7H2O 15-20mg/L，MnSO4·7H2O15-20mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各1-3mg/L其余为水，pH 7.0-7.2。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中的部分实验方法的详细步骤如下：
I.基因编辑方法：参照文献(Li Y,Lin Z,Huang C,et al.Metabolicengineering of Escherichia coli using CRISPR–Cas9 meditated genomeediting.Metabolic engineering,2015,31:13-21.)进行。其中pREDCas9携带gRNA表达质粒pGRB的消除系统，λ噬菌体的Red重组系统及Cas9蛋白表达系统，奇霉素抗性(工作浓度：100mg/L)，32℃培养；pGRB包括启动子J23100，gRNA-Cas9结合区域序列和终止子序列，氨苄青霉素抗性(工作浓度：100mg/L)，37℃培养。
本发明的pGRB质粒构建方法具体步骤如下：
1.pGRB质粒构建
构建质粒pGRB的目的是为了转录相应的gRNA，从而与Cas9蛋白形成的复合体，并通过碱基配对和PAM识别目的基因靶位点，实现目的DNA双链断裂。采用包含靶序列的DNA片段与线性化的载体片段重组的方法构建pGRB质粒。
1.1靶序列设计
使用CRISPR RGEN Tools设计靶序列(PAM:5’-NGG-3’)
1.2包含靶序列的DNA片段的制备
设计引物：5’-线性化载体末端序列(15bp)-酶切位点-靶序列(不包括PAM序列)-线性化载体末端序列(15bp)-3’及其反向互补的引物，通过单链DNA的退火制备包含靶序列的DNA片段。本发明的靶序列具体为如下：5’-CTCAACTACCCACAGTTGTT-3’(用于敲除ygaY基因)，5’-ATTTGTGGTCATTCCAACTG-3’(用于敲除cynT基因)。
反应条件：预变性95℃，5min；退火30-50℃，1min。退火体系如下：
表3退火体系
1.3线性载体的制备
载体的线性化采用反向PCR扩增的方法。以引物YPpGRBF和YPpGRBR扩增质粒pGRB。
1.4重组反应
重组体系如下表4。所用重组酶均为II One Step Cloning Kit系列的酶，重组条件：37℃，30min。
表4、重组体系
1.5质粒的转化
取10μL步骤1.4中的重组反应液，加入到100mL DH5α化转感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴20min，42℃热激45-90s，立即冰浴2-3min，加入900μL SOC培养基，于37℃复苏1h。8000rpm离心2min，弃部分上清，留200μL左右将菌体重悬后涂布到含有100mg/L氨苄青霉素的平板，将平板倒置，于37℃过夜培养。待平板长出单菌落后通过菌落PCR鉴定，挑选阳性重组子。
1.6克隆鉴定
将PCR阳性菌落接种至含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中过夜培养后保菌，提取质粒，酶切鉴定，获得重组质粒pGRB-sgRNA。
重组质粒pGRB-sgRNA的结构描述如下：将pGRB载体的同源臂5’-GCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGT-3’和5’-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT-3’之间的小片段替换成核苷酸序列是包含5’-CTCAACTACCCACAGTTGTT-3’(用于敲除ygaY基因)或5’-ATTTGTGGTCATTCCAACTG-3’(用于敲除cynT基因)的靶序列的DNA片段，且保持pGRB载体的其他序列不变得到的重组表达载体。
II pREDCas9载体的转化与含pREDCas9的目的菌株感受态制备
1.pREDCas9的电转化
利用电转的方法将pREDCas9质粒电转至出发菌株的电转感受态中，将菌体复苏培养后涂布于含奇霉素(浓度为：100mg/L)的LB平板上，32℃过夜培养。抗性平板上生长单菌落用鉴定引物组pCasF/pCasR(具体序列见表1)进行菌落PCR，筛选阳性重组子。
2.含pREDCas9的目的菌株感受态制备
将含pREDCas9的目的菌株在32℃培养至OD600＝0.1～0.2时，添加0.1M的IPTG(使其终浓度为0.1mM)，继续培养至OD600＝0.6～0.7时进行感受态制备。添加IPTG的目的是使pREDCas9质粒上的重组酶诱导表达。感受态制备所需培养基及制备过程参照常规标准操作。
实施例1、基因工程菌ARG-cynT的构建
1.重组DNA片段的制备
用于cynT过表达的重组片段由cynT基因的上下游同源臂组成(ygaY::Ptrc-cynT)。利用引物设计软件primer5，以cynT基因的上下游序列为模板，设计上下游同源臂引物(扩增长度约400-800bp)，上游同源臂的引物为UP-ygaY-S/UP-ygaY-A(具体序列见表1)；下游同源臂的引物序列为cynT-S/cynT-A(具体序列见表1)；下游同源臂的引物为DN-ygaY-S/DN-ygaY-A(具体序列见表1)。通过PCR的方法分别扩增上下游同源臂和目的基因片段后，再经过重叠PCR制备重组片段ygaY::Ptrc-cynT。重组片段ygaY::Ptrc-cynT的核苷酸序列为序列表中序列4。
PCR的体系和方法如下表5。
表5、PCR扩增体系
重叠PCR的体系如下表6。
表6、重叠PCR扩增体系
注：模板由上下游同源臂的扩增片段和目的基因等摩尔组成，且总量不超过10ng。
PCR反应条件(宝生物PrimeSTAR HS酶)：预变性(95℃)5min；然后进行30轮循环：变性(98℃)10s，退火((Tm-3/5)℃)15s，72℃延伸(此酶活力1min延伸约1kb)；72℃继续延伸10min；维持(4℃)。
2.含有pREDCas9的电转感受态细胞的制备
含有pREDCas9的电转感受态细胞的制备方法具体参见前文实验方法II。
3.pGRB和重组DNA片段的转化
将前文实验方法I中制备得到的pGRB和本实施例步骤1中获得的重组DNA片段同时电转化至步骤2中含有pREDCas9的电转感受态细胞中。将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素(浓度为：100mg/L)和奇霉素(浓度为：100mg/L)的LB平板上，32℃过夜培养。利用专门设计的鉴定引物UP-ygaY-S和DN-ygaY-A(具体序列见表1)，进行菌落PCR验证，筛选阳性重组子并保存菌株。
4质粒的消除
1)pGRB的消除
将步骤3获得的阳性重组子置于含有0.2％阿拉伯糖的LB培养基中过夜培养，适量稀释后涂布于含有奇霉素抗性的LB平板上，32℃过夜培养。对点含有氨苄青霉素和奇霉素抗性的LB平板，挑选氨苄青霉素平板不生长，奇霉素抗性平板生长的单菌落保存菌株。
2)pREDCas9质粒的消除
将阳性重组子转接到无抗性的LB液体培养基中，42℃过夜培养，适量稀释后涂布于无抗性的LB平板上，37℃过夜培养。对点含有奇霉素抗性和无抗性的LB平板，挑选奇霉素抗性平板不生长，无抗性平板生长的单菌落保存菌株。
5.ygaY::Ptrc-cynT基因编辑
1)以大肠杆菌W3110基因组为模板，根据其ygaY基因(NCBI GeneID:2847696)的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-ygaY-S、UP-ygaY-A)和下游同源臂引物(DN-ygaY-S、DN-ygaY-A)，获得上同源臂UP-ygaY和下同源臂DN-ygaY。
2)以大肠杆菌W3110基因组为模板，根据cynT基因(NCBI GeneID:946548)上下游序列及Ptrc启动子序列设计扩增cynT基因所需的引物cynT-S和cynT-A，获得重组片段3。
3)将上述重组片段2和3通过重叠PCR的方法融合获得ygaY::Ptrc-cynT(上游同源臂-Ptrc-cynT-下游同源臂)。其中，上游同源臂的长度应为616bp，Ptrc启动子长度为74bp，cynT片段长度为660bp，下游同源臂的长度应为617bp，重叠片段的总长应为1967bp，重叠片段的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.4。
4)构建pGRB-ygaY：通过引物gRNA-ygaY-S和gRNA-ygaY-A的退火制得的含靶序列的DNA片段与质粒pGRB连接，构建重组质粒pGRB-ygaY。
重组质粒pGRB-ygaY的结构描述如下：是将pGRB的5’-GCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGT-3’和5’-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT-3’之间的片段替换为核苷酸序列序列5’-CTCAACTACCCACAGTTGTT-3’的DNA分子，保持pGRB的其它核苷酸不变得到的重组质粒。
5)制备工程菌株ARG10(来源于CN 110964683 B)和野生型菌株W3110的感受态细胞，具体参见前文实验方法II。
ygaY::Ptrc-cynT整合后阳性菌株的PCR验证应为1967bp，原菌PCR扩增应为1424bp。ygaY::Ptrc-cynT片段的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.4。
依次构建具有增强cynT基因表达强度的工程菌株ARG-cynT和W3110-cynT。
第一步：构建pGRB-cynT载体；第二步：PCR扩增ygaY::Ptrc-cynT整合片段；第三步：制备ARG10和W3110感受态细胞，转化pREDCas9；第四步：制备含pREDCas9的目的菌株ARG10和W3110感受态细胞，转化pGRB-cynT载体和ygaY::Ptrc-cynT整合片段；第五步：由于整合有ygaY::Ptrc-cynT的菌株ARG-cynT和W3110-cynT含有pGRB-cynT载体，故消除pGRB-cynT载体；第六步：在消除完pGRB-cynT载体的目的菌株ARG-cynT和W3110-cynT上消除pREDCas9载体，获得不含有pGRB-cynT和pREDCas9载体并具有增强cynT基因表达强度的工程菌株ARG-cynT和W3110-cynT。具体步骤见本实施例的步骤1到步骤5。
工程菌株ARG-cynT的碳酸酐酶编码基因cynT表达量高于受体大肠杆菌ARG10。工程菌株W3110-cynT的碳酸酐酶编码基因cynT表达量高于受体大肠杆菌W3110。
实施例2、基因工程菌ARG-pZ8-cynT和W3110-pZ8-cynT的构建
以穿梭表达载体pZ8构建cynT低拷贝重组表达载体pZ8-cynT，将其导入工程菌株ARG10和野生型菌株W3110，以pZ8载体上的tac启动子启动cynT的表达以提高L-精氨酸的产率。
1.重组表达载体pZ8-cynT的构建
根据cynT基因(NCBI GeneID:946548)上下游序列设计扩增cynT基因所需的引物cynT-pS和cynT-pA(具体序列见表1)。以大肠杆菌W3110基因组为模板，以cynT-pS和cynT-pA引物PCR扩增cynT基因并纯化回收，获得cynT片段的核苷酸序列为序列表中SEQ IDNo.2。PCR体系及程序见具体参见前文实验方法中步骤I。
将pZ8载体以EcoR I和Sal I酶切纯化后，将上述cynT PCR纯化产物与线性化的pZ8载体重组，获得cynT和pZ8的重组载体pZ8-cynT。
重组载体pZ8-cynT的结构描述如下：是将pZ8的5’-TGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGAATTC-3’和5’-TCTCATCCGCCAAAACAGAAGCTTGGCTGCAGGTCGAC-3’之间的片段替换为核苷酸序列SEQ ID NO.2的DNA分子，保持pZ8的其它核苷酸不变得到的重组质粒。
重组载体pZ8-cynT转化DH5α感受态细胞，在卡那霉素抗性平板上以引物pZ8F/pZ8R(具体序列见表1)进行PCR扩增，筛选阳性转化子。具体的质粒转化方法参见前文实验方法中步骤I中1.5。
PCR产物经测序鉴定，pZ8-cynT质粒的阳性转化子PCR产物长度应为748bp，DH5α菌株PCR没有扩增出条带。
2.工程菌株ARG-pZ8-cynT和W3110-pZ8-cynT的构建
制备工程菌株ARG10和野生型菌株W3110的感受态细胞具体参见前文实验方法中步骤II。将重组载体pZ8-cynT分别转化出发菌株ARG10和野生型菌株W3110感受态细胞，在卡那霉素抗性平板上以引物pZ8F/pZ8R(具体序列见表1)进行PCR扩增，筛选阳性转化子，依次构建具有增强cynT基因表达强度的工程菌株ARG-pZ8-cynT和W3110-pZ8-cynT。
含有pZ8-cynT质粒的阳性菌株的PCR产物长度应为748bp，出发菌株PCR扩增不出条带。含有pZ8-cynT质粒的重组大肠杆菌ARG-pZ8-cynT的碳酸酐酶编码基因表达量高于受体大肠杆菌ARG10。含有pZ8-cynT质粒的重组大肠杆菌W3110-pZ8-cynT的碳酸酐酶编码基因表达量高于受体大肠杆菌W3110。
实施例3、基因工程菌ARG:ΔcynT的构建
1.重组质粒pGRB-cynT的获得
1)ΔcynT基因编辑
以大肠杆菌W3110基因组为模板，根据cynT基因(NCBI GeneID:946548)编码区外上下游序列设计上游同源臂引物(UP-cynT-S、UP-cynT-A(具体序列见表1))和下游同源臂引物(DN-cynT-S、DN-cynT-A)。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得ΔcynT(cynT上游同源臂-下游同源臂)。
2)构建pGRB-cynT
通过引物gRNA-cynT-S和gRNA-cynT-A的退火制得含靶序列的DNA片段(靶序列为核苷酸序列5‘-ATTTGTGGTCATTCCAACTG-3’)与质粒pGRB连接，构建重组质粒pGRB-cynT。
重组质粒pGRB-cynT的结构描述如下：是将pGRB的5’-GCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGT-3’和5’-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT-3’之间的片段替换为核苷酸序列5’-ATTTGTGGTCATTCCAACTG-3’的DNA分子，保持pGRB的其它核苷酸不变得到的重组质粒。
2.工程菌株ARG:ΔcynT和W3110:ΔcynT的构建
制备工程菌株ARG10和野生型菌株W3110的感受态细胞具体参见前文实验方法中步骤II。
将重组载体pGRB-cynT和ΔcynT分别转化出发菌株ARG10和野生型菌株W3110感受态细胞，在卡那霉素抗性平板上以引物UP-cynT-S/DN-cynT-A(具体序列见表1)进行PCR扩增，筛选阳性转化子，依次构建具有降低cynT基因表达强度的工程菌株ARG:ΔcynT和W3110:ΔcynT。
其中，上游同源臂的长度应为543bp，下游同源臂的长度应为519bp，重叠片段的总长应为1062bp。PCR验证时，cynT敲除成功的阳性菌株PCR扩增片段长度应为1062bp，原菌PCR扩增产物长度应为1722bp。ΔcynT片段的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.5。
实施例4、利用过表达cynT基因的工程菌株和敲除cynT基因的工程菌株发酵生产L-精氨酸
待测菌株为：过表达cynT基因修饰的ARG-cynT、ARG-pZ8-cynT、W3110-cynT、W3110-pZ8-cynT，cynT基因敲除菌株W3110:ΔcynT和出发菌株ARG10和W3110(对照菌株)。
发酵步骤具体如下：
1)斜面培养：取-80℃保藏菌种划线接种于活化斜面，37℃培养12h，并传代一次；
2)摇瓶种子培养：用接种环刮取一环斜面种子接种于装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中，九层纱布封口，37℃，200rpm培养7-10h；
3)摇瓶发酵培养：按种子培养液体积10-15％的接种量接种到装有发酵培养基的500mL三角瓶中(终体积为30mL)，九层纱布封口，37℃，200r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0-7.2；补加60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行；发酵周期26-30h。
将上述菌株进行摇瓶发酵培养，并测定发酵上清液中L-精氨酸浓度。L-精氨酸浓度测定方法参照行业标准GB 36897-2018。
表7 cynT工程菌株摇瓶发酵结果
菌株 OD600 精氨酸(g/L) 显著性分析
ARG10 38.48±1.28 26.3±0.96
ARG-cynT 37.05±1.55 30.2±0.35 P＜0.01(**)
ARG-pZ8-cynT 38.87±1.43 30.9±0.21 P＜0.01(**)
ARG:ΔcynT 38.54±1.36 24.4±0.02 P＜0.05(*)
W3110 47.46±1.35 0.001±0.0003
W3110-cynT 49.73±1.17 0.4±0.02 P＜0.001(***)
W3110-pZ8-cynT 48.94±1.38 0.4±0.02 P＜0.001(***)
W3110:ΔcynT 47.76±1.43 0.001±0.0001
结果如表7所示，经过26-30h发酵后，增强cynT基因表达强度并未对工程菌株ARG10的生长造成明显的影响。ARG-cynT中L-精氨酸浓度从26.3g/L提升到30.2g/L，L-精氨酸产率提高了14.8％；而ARG-pZ8-cynT中L-精氨酸浓度从26.3g/L提升到30.9g/L，L-精氨酸产率提高了17.5％；ARG:ΔcynT中L-精氨酸浓度从26.3g/L降低到24.4g/L，L-精氨酸产率降低了7.2％；而增强cynT表达的W3110也产0.4g/L的L-精氨酸。
结果显示，增强大肠杆菌中cynT基因表达强度可以显著提高工程菌株L-精氨酸生产性能，而敲除cynT基因没有影响菌株的正常生长，但显著降低了工程菌株L-精氨酸生产性能，再次说明cynT基因对于L-精氨酸产酸能力的提升作用。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.重组肠杆菌，其特征在于：所述重组肠杆菌是使受体肠杆菌过表达碳酸酐酶编码基因得到的重组菌。
2.根据权利要求1所述的重组肠杆菌，其特征在于：所述碳酸酐酶基因来源于大肠杆菌。
3.根据权利要求1或2所述的重组肠杆菌，其特征在于：所述碳酸酐酶是下述任一蛋白质：
A1)碳酸酐酶编码基因编码氨基酸序列是序列3所述的蛋白质；
A2)将A1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有碳酸酐酶活性的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有碳酸酐酶活性的融合蛋白质。
4.根据权利要求1-3任一所述的重组肠杆菌，其特征在于：所述碳酸酐酶的编码基因为下述任一种：
C1)核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA分子；
C2)与C1)中限定的核苷酸序列具有80％以上的同一性且编码所述碳酸酐酶的DNA分子；
C3)在严格条件下与C1)-C2)中任一限定的核苷酸序列杂交，且编码所述碳酸酐酶的DNA分子。
5.构建权利要求1-4中任一所述的重组肠杆菌的方法，所述方法为通过调控权利要求1-4中任一所述碳酸酐酶的编码基因的表达，或调控所述碳酸酐酶的活性或含量，来调控微生物精氨酸产量，得到精氨酸产量变化的微生物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述调控所述碳酸酐酶的编码基因的表达或调控所述碳酸酐酶的活性或含量的方法为下述任一种：
D1)向目的微生物中导入所述碳酸酐酶的编码基因；
D2)向目的微生物中导入氨基酸序列是SEQ ID NO.3的编码基因。
7.权利要求1-4任一所述肠杆菌，和/或如权利要求5或6所述的方法在下述任一种中的应用：
E1)在调控微生物精氨酸的产量中的应用；
E2)在制备精氨酸中的应用；
E3)在构建精氨酸的基因工程微生物中的应用。
8.氨基酸序列为SEQ ID NO.3的碳酸酐酶在下述任一种应用：
F1)在调控微生物精氨酸的产量中的应用；
F2)在制备精氨酸中的应用；
F3)在构建精氨酸的基因工程微生物中的应用。
9.权利要求1-4任一所述肠杆菌，和/或如权利要求5或6所述的方法在生产精氨酸或含有精氨酸的食品、药品和/或饲料中的应用。
10.生物材料，其特征在于，所述生物材料包括下述任一种：
B1)编码如权利要求1-4任一所述肠杆菌中所述碳酸酐酶的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子全细胞催化剂、或含有B2)所述表达盒的全细胞催化剂、或含有B3)所述重组载体的全细胞催化剂。
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