JP2022547432A - Ｌ－トリプトファン産生効率を向上させるトランスポーター遺伝子の大腸菌における使用 - Google Patents
Ｌ－トリプトファン産生効率を向上させるトランスポーター遺伝子の大腸菌における使用 Download PDFInfo
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Abstract
トランスポーターのコード遺伝子、及び該遺伝子を含有する菌株を用いたＬ－トリプトファンの効率的な生産方法を提供する。具体的には、枯草菌由来のｙｗｋＢ遺伝子を大腸菌ゲノムに異種発現させることにより、菌株のＬ－トリプトファン産生効率を向上させることができ、該菌株を用いて振とうフラスコ発酵を行うことにより、対照菌株よりも３５％向上した１５．２ｇ／ＬのＬ－トリプトファンを２４ｈ以内に蓄積することができる。【選択図】図４
Description
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１９年０９月０３日に中国国家知識産権局に提出された、特許出願番号２０１９１０８２８９１３．５であり、発明の名称が「Ｌ－トリプトファンの産生効率を向上させるトランスポーター遺伝子の大腸菌への使用」である先願の優先権を主張しており、当該先願の全文は引用により本願に組み込まれる。
本願は、２０１９年０９月０３日に中国国家知識産権局に提出された、特許出願番号２０１９１０８２８９１３．５であり、発明の名称が「Ｌ－トリプトファンの産生効率を向上させるトランスポーター遺伝子の大腸菌への使用」である先願の優先権を主張しており、当該先願の全文は引用により本願に組み込まれる。
本発明は、代謝工学及びバイオテクノロジーに関し、具体的には、大腸菌のＬ－トリプトファン組み換え菌（工学菌）のアミノ酸産生効率を効果的に向上させる枯草菌由来の代謝物トランスポーター遺伝子に関する。
トリプトファンは、生物体の成長や発育に重要な調節作用があり、また、良好な抗うつ、睡眠促進などの薬理学的な効果があるアミノ酸として、食品、医薬、動物飼料などの分野において重要な作用を発揮している。このアミノ酸に対する研究がさらに行われるにつれて、その応用分野は更に広くなり、これは、トリプトファンの市場の需要量を急激に増加させ、そのため、より効率的で安価なトリプトファンの生産プロセスの開発は注目を集めている。現在、トリプトファンの生産方法には、化学合成法、酵素反応法及び微生物直接発酵法があり、直接発酵法は、ブドウ糖などの低価な原料を基質として発酵するによりＬ－トリプトファンを直接生産する方法であり、この方法は、操作しやすく、コストが低く、収率が高く、周期が短く、環境汚染が小さいなどの利点があるが、微生物内の環境及び各代謝経路間の平衡に対する研究はまだ不十分であり、これにより、微生物発酵法の収率が低い。また、Ｌ－トリプトファン合成に関しては、その合成経路が長く、必要な前駆物質が多いため、生産量のさらなる向上を実現するには、代謝工学的手段を用いて微生物代謝のネットワークを系統的に変更する必要がある。
現在、代謝工学技術は、工業菌株の改良に広く応用されている。代謝工学は、主にＤＮＡ組換え、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した遺伝子編集などの技術を利用してアミノ酸合成に直接関与する経路酵素、重要な律速酵素及びアミノ酸合成に直接関与しない調節因子に対して最適化を行うことであり、これらの策に加えて、菌株の目的産物の運搬能力を向上させることもアミノ酸の生産効率を効果的に高めることができる。
現在、多種のアミノ酸分泌タンパク質のコード遺伝子が報告されており、これらはいずれも菌株の生産能力を有効に高めることができる。例えば、リジン分泌遺伝子であるｌｙｓＥの発現を増加させることにより、コリネバクテリウム属のリジン産生菌の産生能を向上させることができる（ＷＯ９７２３５９７Ａ２）。ｒｈｔＢ遺伝子を増強することにより、細菌のＬ－ホモセリン耐性を向上させることができる（欧州特許出願ＥＰ９９４１９０Ａ２）。ｒｈｔＣ遺伝子の追加コピーは、Ｌ－ホモセリン、Ｌ－トレオニン及びＬ－ロイシンの産生量を増加させることができる（欧州特許出願ＥＰ１０１３７６５Ａ１）。ｙａｈＮ、ｙｅａＳ、ｙｆｉＫ及びｙｇｇＡ遺伝子の追加コピーは、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－リジン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－アラニンなどの産生量を増加させることができる（欧州特許出願ＥＰ １０１６７１０Ａ２）。
芳香族アミノ酸産生菌の中で最も広く報告されている輸送タンパク質は、大腸菌自身の遺伝子ｙｄｄＧによってコードされている。その中でも、Ｖｅｒａ Ｄｏｒｏｓｈｅｎｋｏらは大腸菌ＭＧ１６５５を出発菌株とし、それぞれプラスミド又はゲノム組み込みにより異なる強度のｙｄｄＧ遺伝子を発現させた。試験管発酵実験により、Ｌ－トリプトファンの蓄積量は０．６μｇ／ｍＬ、Ｌ－フェニルアラニンの蓄積量は３００００μｇ／ｍＬであることを確認した。劉双平らは、遺伝子工学手段によりｙｄｄＧ遺伝子をプラスミドの形式で宿主大腸菌に導入した。発酵実験により、ｙｄｄＧ遺伝子を含有する菌株のＬ－フェニルアラニンの細胞外運搬能力は向上し、最終的にＬ－フェニルアラニンの産生量は６２ｇ／Ｌに達することを確認した。また、大腸菌のトリプトファン産生菌株ＳＶ１６４（ｐＧＨ５）を親株とし、強力なプロモーターで制御されたｙｄｄＧ遺伝子を細胞に導入し、ＳＶ１６４ＰＬ－ｙｄｄＧ（ｐＧＨ５）株を得る研究も行われている。この菌株を２０×２００ｍｍ試験管にて３７℃で４８ｈ（時間）振とう培養した結果、Ｌ－トリプトファンの産生量は４．１７ｇ／Ｌであり、出発菌より１２％程度向上した。
上記の記載からわかるように、ｙｄｄＧ遺伝子の過剰発現は、組み換え菌株の芳香族アミノ酸に対する耐性を向上させることができるが、この遺伝子によってコードされる膜タンパク質は、異なる芳香族アミノ酸に対する親和性の差が大きく、運搬効果が劣り、しかも、この遺伝子は大腸菌から由来しているため、菌体自己による制御を受けやすく、効率的な運搬機能を発揮できず、このため、工業的生産の要件を満たすのが困難である。
本発明は、Ｌ－トリプトファン産生菌株の産生効率を向上させ、該菌株を用いてＬ－トリプトファンを産生することを目的とする。上記目的を達成するために、本発明は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ）由来の代謝物トランスポーターのコード遺伝子ｙｗｋＢ（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９３６８７５）を宿主菌に導入することで、宿主菌のＬ－トリプトファン収率を向上させる。ｙｗｋＢは、膜タンパク質をコードする遺伝子であり、そのコード産物は想定代謝物運搬体であり、オーキシン排出キャリアファミリー（ＴＣ２．Ａ．６９）に属し、この遺伝子は、Ｌ－トリプトファンの合成に直接関与しないが、Ｌ－トリプトファン産生菌株に導入されると、細胞内の最終産物の濃度を効果的に低下させ、代謝経路酵素に対する最終産物のフィードバック抑制を解除し、これによって、より多くの炭素が目的のアミノ酸合成経路に供給され、最終的に製品の生産量を向上させる。
本発明による技術的解決手段１は、ｙｗｋＢ遺伝子で宿主菌を修飾するＬ－トリプトファン産生遺伝子組換え菌であって、前記遺伝子組換え菌は宿主菌よりも高いＬ－トリプトファン産生活性を有する遺伝子組換え菌である。
本発明に係る遺伝子組換え菌では、前記ｙｗｋＢ遺伝子は枯草菌由来であり、前記修飾は、ｙｅｅｐ偽遺伝子座へのｙｗｋＢ遺伝子の修飾である。
本発明に係る遺伝子組換え菌では、前記宿主細菌はＬ－トリプトファンを産生することができる宿主細菌であり、細菌の種類について、Ｌ－トリプトファンを産生する能力を有するか又はそのような能力を獲得することができる限り、特に限定されるものではなく、例示的には、前記宿主細菌は、Ｌ－トリプトファン産生能を有するグラム陰性細菌など、Ｌ－トリプトファン産生能を有する原核細菌であってもよく、さらに、前記宿主菌は、Ｌ－トリプトファン産生能を有する大腸菌であり、例えば、前記宿主菌とは、Ｌ－トリプトファン産生菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＲＰ ０３（この菌株は、大腸菌Ｗ３１１０を出発菌として遺伝子改変を行ったものであり、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＲＰ ０３（中国特許ＣＮ１０８７５３８６０Ａ）と同一の菌株である）を指す。
本発明にかかる遺伝子組換え細菌では、前記ｙｗｋＢ遺伝子は、以下のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である：
（Ａ）配列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
（Ｂ）配列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列に対して１つ又は複数のアミノ酸を欠失、置換又は挿入して修飾した配列を含むタンパク質であって、菌株によるＬ－トリプトファン及びＬ－トリプトファン構造類似体（例えば、５－ヒドロキシトリプトファンなど）の産生量を増加させる機能を有するタンパク質、
（Ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有し、代謝物トランスポーターの機能を有する、枯草菌由来のタンパク質（ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）。
（Ａ）配列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
（Ｂ）配列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列に対して１つ又は複数のアミノ酸を欠失、置換又は挿入して修飾した配列を含むタンパク質であって、菌株によるＬ－トリプトファン及びＬ－トリプトファン構造類似体（例えば、５－ヒドロキシトリプトファンなど）の産生量を増加させる機能を有するタンパク質、
（Ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有し、代謝物トランスポーターの機能を有する、枯草菌由来のタンパク質（ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）。
本発明にかかる遺伝子組換え細菌では、本発明では、ｙｗｋＢ遺伝子で宿主菌を修飾することは、ｙｗｋＢ遺伝子を宿主菌に導入することである。
コード遺伝子を宿主菌に導入する方法としては、相同組換えを利用して目的遺伝子を宿主菌に導入するか、具体的には当業者に公知の、原核宿主菌において発現し得る一般的なプラスミドであってもよい核酸発現構築体を用いて目的遺伝子を宿主菌に導入するか、遺伝子編集の手段を用いて目的遺伝子を宿主のクロマチンに挿入するなど、当業者によく知られた遺伝子工学手段が含まれるが、これに限定されない。
本発明にかかる遺伝子組換え細菌では、前記ｙｗｋＢ遺伝子は強力なプロモーターの制御下にあり、例示的には、前記強力なプロモーターは、ＢＢａ＿ｊ２３１０１プロモーター又はＢＢａ＿ｊ２３１０６プロモーターである。
具体的には、本発明における修飾は、大腸菌ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術を用いてトランスポーターのコード遺伝子ｙｗｋＢをＥ．ｃｏｌｉ ＴＲＰ ０３に導入し、さらにＢＢａ＿ｊ２３１０６プロモーターで制御されたこの遺伝子をｙｅｅｐ偽遺伝子座に組み込むことである。
前記ｙｗｋＢ遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される。
前記ｙｗｋＢ遺伝子のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｎｏ：２で示される。
前記ＢＢａ＿ｊ２３１０６プロモーターのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示される。
本発明の技術的解決手段２は、宿主菌にｙｗｋＢ遺伝子を組み込み、宿主菌よりも高い産生量のＬ－トリプトファンの産生活性を有する遺伝子組換え菌を得ることを含むＬ－トリプトファン産生遺伝子組換え菌の構築方法である。
本発明にかかる構築方法では、前記組み込みは、ｙｗｋＢ遺伝子をｙｅｅｐ偽遺伝子座に修飾することであり、例示的には、前記組み込みは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集の手段によって行われる。
本発明にかかる構築方法では、天津科技大学実験室に保存されているＥ．ｃｏｌｉ ＴＲＰ ０３トリプトファン産生菌を出発菌とし、以下のようにｙｗｋＢ遺伝子を組み込む：
（１）ｙｗｋＢ組み込み遺伝子断片の合成
ｙｅｅｐ偽遺伝子の上下流相同アーム断片、ｙｗｋＢ遺伝子断片、及びＢＢａ＿ｊ２３１０６プロモーター配列を構築し、前記ｙｗｋＢ組み込み遺伝子断片は、ｙｅｅｐ遺伝子上流相同アーム、ｙｅｅｐ遺伝子下流相同アーム、ＢＢａ＿ｊ２３１０６プロモーター断片、ｙｗｋＢ遺伝子断片を含む。
（２）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いて、ｙｗｋＢ組み込み遺伝子断片をＥ．ｃｏｌｉ ＴＲＰ ０３に発現させる。
（１）ｙｗｋＢ組み込み遺伝子断片の合成
ｙｅｅｐ偽遺伝子の上下流相同アーム断片、ｙｗｋＢ遺伝子断片、及びＢＢａ＿ｊ２３１０６プロモーター配列を構築し、前記ｙｗｋＢ組み込み遺伝子断片は、ｙｅｅｐ遺伝子上流相同アーム、ｙｅｅｐ遺伝子下流相同アーム、ＢＢａ＿ｊ２３１０６プロモーター断片、ｙｗｋＢ遺伝子断片を含む。
（２）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いて、ｙｗｋＢ組み込み遺伝子断片をＥ．ｃｏｌｉ ＴＲＰ ０３に発現させる。
本発明に係る構築方法では、前記ｙｗｋＢ遺伝子配列は、以下のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である：
（Ａ）配列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
（Ｂ）配列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列に対して１つ又は複数のアミノ酸を欠失、置換又は挿入して修飾した配列を含むタンパク質であって、菌株によるＬ－トリプトファン及びＬ－トリプトファン構造類似体（例えば、５－ヒドロキシトリプトファンなど）の産量を増加させる機能を有するタンパク質、
（Ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有する代謝物トランスポーターの機能を有する枯草菌由来のタンパク質（ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）。
（Ａ）配列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
（Ｂ）配列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列に対して１つ又は複数のアミノ酸を欠失、置換又は挿入して修飾した配列を含むタンパク質であって、菌株によるＬ－トリプトファン及びＬ－トリプトファン構造類似体（例えば、５－ヒドロキシトリプトファンなど）の産量を増加させる機能を有するタンパク質、
（Ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有する代謝物トランスポーターの機能を有する枯草菌由来のタンパク質（ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）。
本発明の技術的解決手段３は、上記のようなＬ－トリプトファン産生遺伝子組換え細菌の構築方法で得られた遺伝子組換え細菌である。
本発明の技術的解決手段４は、上記の本発明の技術的解決手段１に記載の遺伝子組換え細菌又は技術的解決手段２に記載の方法で得られた遺伝子組換え細菌を用いて発酵して、Ｌ－トリプトファンを産生するステップを含む、Ｌ－トリプトファンの生産方法である。
本発明に係るＬ－トリプトファンの生産方法では、以下のステップを含む：
１）菌種活性化
２）種子液調整
３）発酵培養。
１）菌種活性化
２）種子液調整
３）発酵培養。
例示的には、
ステップ１）において、斜面培養を採用し、すなわち、－８０℃保存菌種を活性化斜面にストリーク播種し、３７℃で１２ｈ培養して、１回継代し、
ステップ２）において、振とうフラスコによる種子培養を採用し、すなわち、播種ループで斜面種子を掻き取って３０ｍＬ種子培地を入れた５００ｍＬ三角フラスコに播種し、９層ガーゼで口を密封し、３７℃、２００ｒｐｍで８～１０ｈ培養し、
ステップ３）において、振とうフラスコによる発酵培養を採用し、すなわち、１０～１５％（ｖ／ｖ）の播種量で発酵培地を容れた５００ｍＬ三角フラスコに播種し（最終体積は３０ｍＬ）、９層ガーゼで口を密封し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎ（分）で振とう培養し、発酵過程でアンモニア水を補充することでｐＨを７．０～７．２に維持し、６０％（ｍ／ｖ）ブドウ糖溶液を補充することで発酵を進行させ（フェノールレッドを指示薬とし、発酵液の色が変化しない時に糖不足とみなし、糖不足時に６０％（ｍ／ｖ）ブドウ糖溶液を１～２ｍＬ補充して、発酵液中のブドウ糖濃度が初期値の２０～４０ｇ／Ｌになるようにする）、発酵期間は２２～２６ｈである。
ステップ１）において、斜面培養を採用し、すなわち、－８０℃保存菌種を活性化斜面にストリーク播種し、３７℃で１２ｈ培養して、１回継代し、
ステップ２）において、振とうフラスコによる種子培養を採用し、すなわち、播種ループで斜面種子を掻き取って３０ｍＬ種子培地を入れた５００ｍＬ三角フラスコに播種し、９層ガーゼで口を密封し、３７℃、２００ｒｐｍで８～１０ｈ培養し、
ステップ３）において、振とうフラスコによる発酵培養を採用し、すなわち、１０～１５％（ｖ／ｖ）の播種量で発酵培地を容れた５００ｍＬ三角フラスコに播種し（最終体積は３０ｍＬ）、９層ガーゼで口を密封し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎ（分）で振とう培養し、発酵過程でアンモニア水を補充することでｐＨを７．０～７．２に維持し、６０％（ｍ／ｖ）ブドウ糖溶液を補充することで発酵を進行させ（フェノールレッドを指示薬とし、発酵液の色が変化しない時に糖不足とみなし、糖不足時に６０％（ｍ／ｖ）ブドウ糖溶液を１～２ｍＬ補充して、発酵液中のブドウ糖濃度が初期値の２０～４０ｇ／Ｌになるようにする）、発酵期間は２２～２６ｈである。
［発明の効果］
本発明は、以下のような利点及び有益な効果を有する。
本発明は、枯草菌由来のトランスポーターのコード遺伝子ｙｗｋＢをＬ－トリプトファン組換え菌株に導入することにより、目的産物の産生量を大幅に増加させ、そして、この遺伝子ｙｗｋＢは枯草菌由来の遺伝子であるため、組換え菌に制御されることがなく、より機能を発揮しやすく、応用の将来性が期待できる。本発明により提供されるｙｗｋＢ遺伝子を含有するＬ－トリプトファン組換え菌株は、２４ｈフラスコ発酵後に１５．２ｇ／ＬのＬ－トリプトファンを蓄積することができ、出発株よりも３５％向上し、Ｌ－トリプトファンの工業的産生への適用の潜在力を示す。
本発明は、以下のような利点及び有益な効果を有する。
本発明は、枯草菌由来のトランスポーターのコード遺伝子ｙｗｋＢをＬ－トリプトファン組換え菌株に導入することにより、目的産物の産生量を大幅に増加させ、そして、この遺伝子ｙｗｋＢは枯草菌由来の遺伝子であるため、組換え菌に制御されることがなく、より機能を発揮しやすく、応用の将来性が期待できる。本発明により提供されるｙｗｋＢ遺伝子を含有するＬ－トリプトファン組換え菌株は、２４ｈフラスコ発酵後に１５．２ｇ／ＬのＬ－トリプトファンを蓄積することができ、出発株よりも３５％向上し、Ｌ－トリプトファンの工業的産生への適用の潜在力を示す。
実施例１：Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＲＰ ０５菌株の構築
１．遺伝子編集の方法
本発明で使用される遺伝子編集の方法は、文献（Li Y,Lin Z,Huang C,et al.Metabolic engineering of Escherichia coli using CRISPR-Cas9 meditated genome editing.Metabolic engineering,2015,31:13-21.）を参照して行われ、この方法で使用される２つのプラスミドマップは図１に示される。ここで、ｐＲＥＤＣａｓ９は、ｇＲＮＡ発現プラスミドｐＧＲＢの除去系、λファージのＲｅｄ組換え系、及びＣａｓ９タンパク質発現系を持っており、スペクチノマイシン耐性（作動濃度：１００ｍｇ／Ｌ）であり、３２℃で培養したものであり、ｐＧＲＢはｐＵＣ１８を骨格とし、プロモーターＪ２３１００、ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９結合領域配列とターミネーター配列を含み、アンピシリン耐性（作動濃度：１００ｍｇ／Ｌ）であり、３７℃で培養した。
１．遺伝子編集の方法
本発明で使用される遺伝子編集の方法は、文献（Li Y,Lin Z,Huang C,et al.Metabolic engineering of Escherichia coli using CRISPR-Cas9 meditated genome editing.Metabolic engineering,2015,31:13-21.）を参照して行われ、この方法で使用される２つのプラスミドマップは図１に示される。ここで、ｐＲＥＤＣａｓ９は、ｇＲＮＡ発現プラスミドｐＧＲＢの除去系、λファージのＲｅｄ組換え系、及びＣａｓ９タンパク質発現系を持っており、スペクチノマイシン耐性（作動濃度：１００ｍｇ／Ｌ）であり、３２℃で培養したものであり、ｐＧＲＢはｐＵＣ１８を骨格とし、プロモーターＪ２３１００、ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９結合領域配列とターミネーター配列を含み、アンピシリン耐性（作動濃度：１００ｍｇ／Ｌ）であり、３７℃で培養した。
この方法の具体的なステップは以下のとおりである。
１．１ ｐＧＲＢプラスミドの構築
プラスミドｐＧＲＢを構築する目的は、対応するｇＲＮＡを転写し、Ｃａｓ９タンパク質と複合体を形成し、そして塩基ペアリングとＰＡＭによって目的遺伝子の標的部位を識別し、目的ＤＮＡの二本鎖切断を実現することである。ｐＧＲＢプラスミドは、標的配列を含むＤＮＡ断片と、線状化ベクター断片との組換えの方法を用いて構築された。
１．１ ｐＧＲＢプラスミドの構築
プラスミドｐＧＲＢを構築する目的は、対応するｇＲＮＡを転写し、Ｃａｓ９タンパク質と複合体を形成し、そして塩基ペアリングとＰＡＭによって目的遺伝子の標的部位を識別し、目的ＤＮＡの二本鎖切断を実現することである。ｐＧＲＢプラスミドは、標的配列を含むＤＮＡ断片と、線状化ベクター断片との組換えの方法を用いて構築された。
１．１．１ 標的配列の設計
ＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓを用いて標的配列（ＰＡＭ：５’－ＮＧＧ－３’）を設計した。
ＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓを用いて標的配列（ＰＡＭ：５’－ＮＧＧ－３’）を設計した。
１．１．２ 標的配列を含むＤＮＡ断片の製造
プライマー設計：５’－線状化ベクター末端配列（１５ｂｐ）－酵素切断部位－標的配列（ＰＡＭ配列を除く）－線状化ベクター末端配列（１５ｂｐ）－３’及びその相補的リバースプライマーを用いて、一本鎖ＤＮＡのアニーリングにより標的配列を含むＤＮＡ断片を製造した。反応条件：予備変性９５℃、５ｍｉｎ、３０～５０℃アニーリング、１ｍｉｎ。アニーリング系は以下の通りであった。
プライマー設計：５’－線状化ベクター末端配列（１５ｂｐ）－酵素切断部位－標的配列（ＰＡＭ配列を除く）－線状化ベクター末端配列（１５ｂｐ）－３’及びその相補的リバースプライマーを用いて、一本鎖ＤＮＡのアニーリングにより標的配列を含むＤＮＡ断片を製造した。反応条件：予備変性９５℃、５ｍｉｎ、３０～５０℃アニーリング、１ｍｉｎ。アニーリング系は以下の通りであった。
１．１．３ 線状化ベクターの製造
ベクターの線状化にはインバースＰＣＲ増幅法を用いた。
ベクターの線状化にはインバースＰＣＲ増幅法を用いた。
１．１．４ 組換え反応
組換え系は下表のとおりであった。使用される組換え酵素はいずれもＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ（R） ＩＩ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔシリーズの酵素であり、組換え条件は、３７℃、３０ｍｉｎであった。
組換え系は下表のとおりであった。使用される組換え酵素はいずれもＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ（R） ＩＩ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔシリーズの酵素であり、組換え条件は、３７℃、３０ｍｉｎであった。
１．１．５ プラスミドの形質転換
反応液１０μＬをＤＨ５α化学的形質転換コンピテント細胞１００ｍＬに加え、軽く均一に混合した後、２０ｍｉｎ氷浴処理し、４２℃で４５～９０ｓ熱ショックした直後、２～３ｍｉｎ氷浴処理し、ＳＯＣを９００μＬ加え、３７℃で１ｈ蘇生した。８０００ｒｐｍで２ｍｉｎ遠心分離し、上澄みの一部を捨て、２００μＬ程度残して菌体を再懸濁させた後、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含有する平板（シャーレ）に塗布し、平板を逆さまにし、３７℃で一晩培養した。平板に単コロニーができた後、ＰＣＲによりコロニーを同定し、陽性組換え体を選別した。
反応液１０μＬをＤＨ５α化学的形質転換コンピテント細胞１００ｍＬに加え、軽く均一に混合した後、２０ｍｉｎ氷浴処理し、４２℃で４５～９０ｓ熱ショックした直後、２～３ｍｉｎ氷浴処理し、ＳＯＣを９００μＬ加え、３７℃で１ｈ蘇生した。８０００ｒｐｍで２ｍｉｎ遠心分離し、上澄みの一部を捨て、２００μＬ程度残して菌体を再懸濁させた後、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含有する平板（シャーレ）に塗布し、平板を逆さまにし、３７℃で一晩培養した。平板に単コロニーができた後、ＰＣＲによりコロニーを同定し、陽性組換え体を選別した。
１．１．６ クローン同定
ＰＣＲ陽性コロニーを１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含有するＬＢ培地に播種して一晩培養した後、菌を保存し、プラスミドを抽出し、酵素切断して同定した。
ＰＣＲ陽性コロニーを１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含有するＬＢ培地に播種して一晩培養した後、菌を保存し、プラスミドを抽出し、酵素切断して同定した。
１．２ 組換えＤＮＡ断片の製造
ノックアウト用組換え断片は、ノックアウトすべき遺伝子の上下流相同アーム（上流相同アーム－下流相同アーム）から構成され、組み込み用組換え断片は、組み込み部位の上下流相同アームと、組み込むべき遺伝子断片（上流相同アーム－目的遺伝子－下流相同アーム）とから構成される。プライマー設計ソフトｐｒｉｍｅｒ５を用いて、ノックアウトすべき遺伝子又は組み込むべき部位の上下流配列を鋳型として、上下流相同アームプライマー（増幅長約４００～５００ｂｐ）を設計し、組み込むべき遺伝子をテンプレートとし、組み込み遺伝子の増幅プライマーを設計した。ＰＣＲ方法により、上下流相同アームと目的遺伝子断片をそれぞれ増幅した後、オーバーラップＰＣＲによって組換え断片を製造した。ＰＣＲに使用されるＤＮＡポリメラーゼはＴａＫａＲａ社から購入し、高忠実度のＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとＰＣＲ産物に粘着末端を持つＥｘ．ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含み、そのＰＣＲ系及び方法は以下の表の通りであった。
ノックアウト用組換え断片は、ノックアウトすべき遺伝子の上下流相同アーム（上流相同アーム－下流相同アーム）から構成され、組み込み用組換え断片は、組み込み部位の上下流相同アームと、組み込むべき遺伝子断片（上流相同アーム－目的遺伝子－下流相同アーム）とから構成される。プライマー設計ソフトｐｒｉｍｅｒ５を用いて、ノックアウトすべき遺伝子又は組み込むべき部位の上下流配列を鋳型として、上下流相同アームプライマー（増幅長約４００～５００ｂｐ）を設計し、組み込むべき遺伝子をテンプレートとし、組み込み遺伝子の増幅プライマーを設計した。ＰＣＲ方法により、上下流相同アームと目的遺伝子断片をそれぞれ増幅した後、オーバーラップＰＣＲによって組換え断片を製造した。ＰＣＲに使用されるＤＮＡポリメラーゼはＴａＫａＲａ社から購入し、高忠実度のＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとＰＣＲ産物に粘着末端を持つＥｘ．ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含み、そのＰＣＲ系及び方法は以下の表の通りであった。
コロニーＰＣＲの系は次の表のとおりである。
オーバーラップＰＣＲの系は以下の表のとおりである。
ＰＣＲ反応条件：予備変性（９５℃）５ｍｉｎ；その後、変性（９８℃）１０ｓ（秒）、アニーリング（（Ｔｍ－３／５）℃）１５ｓ、７２℃伸長（この酵素活性では１ｍｉｎ 約１ｋｂ伸長）；７２℃でさらに１０ｍｉｎ伸長、（４℃）保持のように３０回のサイクルを行った。
１．３ プラスミド及び組換えＤＮＡ断片の形質転換
１．３．１ ｐＲＥＤＣａｓ９の形質転換
エレクトロポレーション法を利用してｐＲＥＤＣａｓ９プラスミドをＷ３１１０のエレクトロコンピテント細胞にエレクトロポレーションにより形質転換し、菌体を蘇生して培養した後、スペクチノマイシンを含有するＬＢ平板に塗布し、３２℃で一晩培養した。耐性平板上に成長させた単コロニーについて、同定プライマーを用いてコロニーＰＣＲを行い、陽性組換え体をスクリーニングした。
１．３．１ ｐＲＥＤＣａｓ９の形質転換
エレクトロポレーション法を利用してｐＲＥＤＣａｓ９プラスミドをＷ３１１０のエレクトロコンピテント細胞にエレクトロポレーションにより形質転換し、菌体を蘇生して培養した後、スペクチノマイシンを含有するＬＢ平板に塗布し、３２℃で一晩培養した。耐性平板上に成長させた単コロニーについて、同定プライマーを用いてコロニーＰＣＲを行い、陽性組換え体をスクリーニングした。
１．３．２ ｐＲＥＤＣａｓ９を含む目的菌株のエレクトロコンピテント細胞の製造
ＯＤ６００＝０．１～０．２まで３２℃で培養したときに、０．１Ｍ ＩＰＴＧを（最終濃度０．１ｍＭ）加え、ＯＤ６００＝０．６～０．７まで培養を持続すると、コンピテント細胞を製造した。ＩＰＴＧを加える目的は、ｐＲＥＤＣａｓ９プラスミド上のリコンビナーゼの発現を誘導することである。コンピテント細胞の製造に必要な培地及び製造プロセスは、従来の標準を参照したものである。
ＯＤ６００＝０．１～０．２まで３２℃で培養したときに、０．１Ｍ ＩＰＴＧを（最終濃度０．１ｍＭ）加え、ＯＤ６００＝０．６～０．７まで培養を持続すると、コンピテント細胞を製造した。ＩＰＴＧを加える目的は、ｐＲＥＤＣａｓ９プラスミド上のリコンビナーゼの発現を誘導することである。コンピテント細胞の製造に必要な培地及び製造プロセスは、従来の標準を参照したものである。
１．３．３ ｐＧＲＢ及び組換えＤＮＡ断片の形質転換
ｐＧＲＢとドナーＤＮＡ断片を同時にｐＲＥＤＣａｓ９を含有するエレクトロコンピテント細胞にエレクトロポレーションにより形質転換した。エレクトロポレーション後に蘇生して培養した菌体を、アンピシリンとスペクチノマイシンを含有するＬＢ平板に塗布し、３２℃で一晩培養した。上流相同アームの上流プライマー及び下流相同アームの下流プライマーを用いて、又は特定の同定プライマーを設計して、コロニーＰＣＲ検証を行い、陽性組換え体をスクリーニングし、菌を保存した。
ｐＧＲＢとドナーＤＮＡ断片を同時にｐＲＥＤＣａｓ９を含有するエレクトロコンピテント細胞にエレクトロポレーションにより形質転換した。エレクトロポレーション後に蘇生して培養した菌体を、アンピシリンとスペクチノマイシンを含有するＬＢ平板に塗布し、３２℃で一晩培養した。上流相同アームの上流プライマー及び下流相同アームの下流プライマーを用いて、又は特定の同定プライマーを設計して、コロニーＰＣＲ検証を行い、陽性組換え体をスクリーニングし、菌を保存した。
１．４ プラスミドの除去
１．４．１ ｐＧＲＢの除去
陽性組換え体を０．２％アラビノースを含有するＬＢ培地に入れて一晩培養し、適切に希釈してスペクチノマイシン耐性を有するＬＢ平板に塗布し、３２℃で一晩培養した。アンピシリンとスペクチノマイシン耐性を有するＬＢ平板を比較し、アンピシリン平板では成長せず、スペクチノマイシン耐性平板では成長した単コロニーを選別し、菌を保存した。
１．４．１ ｐＧＲＢの除去
陽性組換え体を０．２％アラビノースを含有するＬＢ培地に入れて一晩培養し、適切に希釈してスペクチノマイシン耐性を有するＬＢ平板に塗布し、３２℃で一晩培養した。アンピシリンとスペクチノマイシン耐性を有するＬＢ平板を比較し、アンピシリン平板では成長せず、スペクチノマイシン耐性平板では成長した単コロニーを選別し、菌を保存した。
１．４．２ ｐＲＥＤＣａｓ９プラスミドの除去
陽性組換え体を耐性のないＬＢ液体培地に移し、４２℃で一晩培養し、適切に希釈して耐性のないＬＢ平板に塗布し、３７℃で一晩培養した。スペクチノマイシン耐性を有するＬＢ平板と耐性のないＬＢ平板を比較し、スペクチノマイシン耐性平板では成長せず、非耐性平板では成長した単コロニーを選別し、菌を保存した。
陽性組換え体を耐性のないＬＢ液体培地に移し、４２℃で一晩培養し、適切に希釈して耐性のないＬＢ平板に塗布し、３７℃で一晩培養した。スペクチノマイシン耐性を有するＬＢ平板と耐性のないＬＢ平板を比較し、スペクチノマイシン耐性平板では成長せず、非耐性平板では成長した単コロニーを選別し、菌を保存した。
２．Ｌ－トリプトファン組換え菌株Ｅ．ｃｏｌｉＴＲＰ ０５の構築
２．１ ｙｗｋＢ遺伝子合成
（１）ＰＣＲ技術を用いてＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ゲノムを鋳型とし、ｙｅｅｐ偽遺伝子配列に基づき、遺伝子の両端に上流相同アームプライマー（ｙｅｅｐ－ｕｐ－Ｓ、ｙｅｅｐ－ｕｐ－Ａ）と下流相同アームプライマー（ｙｅｅｐ－ｄｏｗｎ－Ｓ、ｙｅｅｐ－ｄｏｗｎ－Ａ）を設計し、増幅してｙｅｅｐ上下流相同アームを得た。
（２）ＧＥＮＢＡＮＫにて公開されている枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｔｒ．１６８）の想定代謝物トランスポーターｙｗｋＢの遺伝子配列に基づいて、ＰＣＲプライマー（ｙｗｋＢ－Ｓ、ｙｗｋＢ－Ａ）を設計し、ｙｗｋＢ遺伝子の上流プライマーにＢＢａ ｊ２３１０６プロモーター配列を設計し、ＨＳ酵素によりその断片を増幅した。
（３）ステップ（１）、（２）で得られた増幅断片を鋳型とし、オーバーラップＰＣＲにより、ｙｅｅｐ遺伝子上流相同アーム、ｙｅｅｐ遺伝子下流相同アーム、ＢＢａ ｊ２３１０６プロモーター断片、ｙｗｋＢ遺伝子断片からなるＢＢａ ｊ２３１０６－ｙｗｋＢ遺伝子の組み込み断片を得た。
２．１ ｙｗｋＢ遺伝子合成
（１）ＰＣＲ技術を用いてＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ゲノムを鋳型とし、ｙｅｅｐ偽遺伝子配列に基づき、遺伝子の両端に上流相同アームプライマー（ｙｅｅｐ－ｕｐ－Ｓ、ｙｅｅｐ－ｕｐ－Ａ）と下流相同アームプライマー（ｙｅｅｐ－ｄｏｗｎ－Ｓ、ｙｅｅｐ－ｄｏｗｎ－Ａ）を設計し、増幅してｙｅｅｐ上下流相同アームを得た。
（２）ＧＥＮＢＡＮＫにて公開されている枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｔｒ．１６８）の想定代謝物トランスポーターｙｗｋＢの遺伝子配列に基づいて、ＰＣＲプライマー（ｙｗｋＢ－Ｓ、ｙｗｋＢ－Ａ）を設計し、ｙｗｋＢ遺伝子の上流プライマーにＢＢａ ｊ２３１０６プロモーター配列を設計し、ＨＳ酵素によりその断片を増幅した。
（３）ステップ（１）、（２）で得られた増幅断片を鋳型とし、オーバーラップＰＣＲにより、ｙｅｅｐ遺伝子上流相同アーム、ｙｅｅｐ遺伝子下流相同アーム、ＢＢａ ｊ２３１０６プロモーター断片、ｙｗｋＢ遺伝子断片からなるＢＢａ ｊ２３１０６－ｙｗｋＢ遺伝子の組み込み断片を得た。
２．２ ｙｗｋＢ遺伝子の組み込み
（１）ｐＧＲＢ－ｙｅｅｐの構築
１．１に記載の方法により標的配列を含むｐＧＲＢプラスミドを製造し、具体的には、１．１．２の方法によりプライマーｐＧＲＢ－ｙｅｅｐ－Ｓ及びｐＧＲＢ－ｙｅｅｐ－Ａを設計し、その後、アニールして標的配列を含むＤＮＡ断片を得て、１．１．３の方法によりプラスミドｐＧＲＢを線状化し、次に、１．１．４の方法により標的配列を含むプラスミドｐＧＲＢ－ｙｅｅｐを製造した。
（２）Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＲＰ ０３のコンピテント細胞を製造した。
（３）菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＲＰ ０５の取得
１．３に記載の方法に従って、すなわち、それぞれｐＲＥＤＣａｓ９プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＴＲＰ ０３に形質転換した後、陽性クローンをスクリーニングし、その後、ｐＲＥＤＣａｓ９プラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ ＴＲＰ ０３のコンピテント細胞を製造し、ｐＧＲＢ－ｙｅｅｐと２．１節のステップ（３）で製造した組換えＤＮＡ断片にエレクトロポレーションにより形質転換し、平板で１２～１６ｈ培養した後、コロニーＰＣＲ検証を行い、陽性組換え体をスクリーニングし、菌を保存し、１．４節に記載の方法によって、それぞれプラスミドｐＧＲＢ－ｙｅｅｐとｐＲＥＤＣａｓ９を除去し、最終的にＰＣＲ同定を行い、菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＲＰ ０５を得て、－８０℃で保存した。
（１）ｐＧＲＢ－ｙｅｅｐの構築
１．１に記載の方法により標的配列を含むｐＧＲＢプラスミドを製造し、具体的には、１．１．２の方法によりプライマーｐＧＲＢ－ｙｅｅｐ－Ｓ及びｐＧＲＢ－ｙｅｅｐ－Ａを設計し、その後、アニールして標的配列を含むＤＮＡ断片を得て、１．１．３の方法によりプラスミドｐＧＲＢを線状化し、次に、１．１．４の方法により標的配列を含むプラスミドｐＧＲＢ－ｙｅｅｐを製造した。
（２）Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＲＰ ０３のコンピテント細胞を製造した。
（３）菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＲＰ ０５の取得
１．３に記載の方法に従って、すなわち、それぞれｐＲＥＤＣａｓ９プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＴＲＰ ０３に形質転換した後、陽性クローンをスクリーニングし、その後、ｐＲＥＤＣａｓ９プラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ ＴＲＰ ０３のコンピテント細胞を製造し、ｐＧＲＢ－ｙｅｅｐと２．１節のステップ（３）で製造した組換えＤＮＡ断片にエレクトロポレーションにより形質転換し、平板で１２～１６ｈ培養した後、コロニーＰＣＲ検証を行い、陽性組換え体をスクリーニングし、菌を保存し、１．４節に記載の方法によって、それぞれプラスミドｐＧＲＢ－ｙｅｅｐとｐＲＥＤＣａｓ９を除去し、最終的にＰＣＲ同定を行い、菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＲＰ ０５を得て、－８０℃で保存した。
ここで、ＢＢａ＿ｊ２３１０６ ｙｗｋＢ遺伝子組み込み断片の構築、及び陽性菌株のＰＣＲ検証の電気泳動図は図２に示されている。ここで、上流相同アームの長さは５１２ｂｐ、下流相同アームの長さは５１３ｂｐ、ＢＢａ＿ｊ２３１０６ｙｗｋＢ遺伝子断片の長さは１０４０ｂｐ、ＢＢａ＿ｊ２３１０６ｙｗｋＢ遺伝子組み込み断片の全長は２０６５ｂｐであり、ＰＣＲ検証の時に、陽性菌ＰＣＲ増幅断片の長さは２０６５ｂｐ、元の菌ＰＣＲ増幅断片の長さは１３９６ｂｐであった。
３．菌株の改変過程で関連するプライマーは次の表のとおりである。
実施例２：大腸菌遺伝子組換え菌の振とうフラスコ発酵によるＬ―トリプトファン産生
大腸菌遺伝子組換え菌を用いてフラスコ発酵してＬ―トリプトファンを産生する具体的な操作は、以下の通りである。
斜面培養：―８０℃の保存菌種を採取し、活性化斜面にストリーク播種し、３７℃で１２ｈ培養し、１回継代した。
振とうフラスコ種子培養：播種ループで斜面種子を掻き取って３０ｍＬ種子培地を入れた５００ｍＬ三角フラスコに播種し、９層ガーゼで口を密封し、３７℃、２００ｒｐｍで８～１０ｈ培養した。
振とうフラスコ発酵培養：１０～１５％（ｖ／ｖ）の播種量で発酵培地を容れた５００ｍＬ三角フラスコに播種し（最終体積３０ｍＬ）、９層ガーゼで口を密封し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで振とう培養し、発酵過程でアンモニア水を補充することでｐＨを７．０～７．２に維持し、６０％（ｍ／ｖ）ブドウ糖溶液を補充することで発酵を進行させ（フェノールレッドを指示薬とし、発酵液の色が変化しない時に糖不足とみなし、糖不足時に６０％（ｍ／ｖ）ブドウ糖溶液を１～２ｍＬ補充して、発酵液中のブドウ糖濃度が初期値の２０～４０ｇ／Ｌになるようにする）、発酵周期は２２～２６ｈとした。
大腸菌遺伝子組換え菌を用いてフラスコ発酵してＬ―トリプトファンを産生する具体的な操作は、以下の通りである。
斜面培養：―８０℃の保存菌種を採取し、活性化斜面にストリーク播種し、３７℃で１２ｈ培養し、１回継代した。
振とうフラスコ種子培養：播種ループで斜面種子を掻き取って３０ｍＬ種子培地を入れた５００ｍＬ三角フラスコに播種し、９層ガーゼで口を密封し、３７℃、２００ｒｐｍで８～１０ｈ培養した。
振とうフラスコ発酵培養：１０～１５％（ｖ／ｖ）の播種量で発酵培地を容れた５００ｍＬ三角フラスコに播種し（最終体積３０ｍＬ）、９層ガーゼで口を密封し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで振とう培養し、発酵過程でアンモニア水を補充することでｐＨを７．０～７．２に維持し、６０％（ｍ／ｖ）ブドウ糖溶液を補充することで発酵を進行させ（フェノールレッドを指示薬とし、発酵液の色が変化しない時に糖不足とみなし、糖不足時に６０％（ｍ／ｖ）ブドウ糖溶液を１～２ｍＬ補充して、発酵液中のブドウ糖濃度が初期値の２０～４０ｇ／Ｌになるようにする）、発酵周期は２２～２６ｈとした。
発酵液中のＬ－トリプトファン濃度の測定：発酵液１ｍＬを収集し、１３０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離し、上澄み液を収集した。脱イオン水を使用して、収集した上澄み液を一定の倍数（０．１～０．５ｇ／Ｌ）に希釈し、０．２２μｍの精密ろ過後、Ｌ－トリプトファンの含有量を液相で測定し、そのクロマトグラフィー条件として、カラムＫｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８カラム（２５０ｍｍ×４６０ｍｍ，５μｍ）、移動相１０％アセトニトリル溶液、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度４０℃、検出波長２７８ｎｍ、試料注入量２０μＬ、ピーク発生時間約３．５ｍｉｎとし、そのピーク面積に基づいてプロットした検量線により発酵液中のＬ－トリプトファンの濃度を算出した。
Ｌ－トリプトファン検量線のプロット：Ｌ－トリプトファン濃度０．１ｇ／Ｌ、０．３ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌの溶液をそれぞれ準備し、上記のクロマトグラフィー条件で、対応する濃度のＬ－トリプトファンに対応するピーク面積を液相で測定し、Ｌ－トリプトファン濃度とピーク面積に関する検量線をプロットし、図３に示した。
Ｌ－トリプトファン検量線のプロット：Ｌ－トリプトファン濃度０．１ｇ／Ｌ、０．３ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌの溶液をそれぞれ準備し、上記のクロマトグラフィー条件で、対応する濃度のＬ－トリプトファンに対応するピーク面積を液相で測定し、Ｌ－トリプトファン濃度とピーク面積に関する検量線をプロットし、図３に示した。
活性化斜面培地の成分：ブドウ糖１～３ｇ／Ｌ、トリプトン５～１０ｇ／Ｌ、牛肉エキス５～１０ｇ／Ｌ、酵母エキス２～５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ２～５ｇ／Ｌ、寒天１５～３０ｇ／Ｌ、水：残量、ｐＨ ７．０～７．２、１２１℃のオートクレーブで２０ｍｉｎ滅菌；
種子培地の成分：ブドウ糖２０～４０ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １～５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １～５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５～２ｇ／Ｌ、酵母エキス２～５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １～３ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ １～３ｍｇ／Ｌ、ＶＨ ０．１～０．５ｍｇ／Ｌ、ＶＢ１ ０．５～１．０ｍｇ／Ｌ、微量元素混合液１～３ｍｌ／Ｌ、フェノールレッド１５～３０ｇ／Ｌ、水：残量、ｐＨ ７．０～７．２、１１５℃のオートクレーブで１５ｍｉｎ滅菌；
発酵培地の成分：ブドウ糖２０～４０ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２～６ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １～５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５～２ｇ／Ｌ、酵母エキス１～５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ３０～６０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １～５ｍｇ／Ｌ、ＶＨ ０．１～０．５ｍｇ／Ｌ、ＶＢ１ ０．５～１．０ｍｇ／Ｌ、微量元素混合液１～３ｍｌ／Ｌ、フェノールレッド１５～３０ｇ／Ｌ、水：残量、ｐＨ ７．０～７．２、１１５℃のオートクレーブで１５ｍｉｎ滅菌；
微量元素混合液の成分：Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ２．５ｇ／Ｌ、ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ ２．５ｇ／Ｌ、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ ２．５ｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ １．７５ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ １０ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．２５ｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３０．１２５ｇ／Ｌ。
種子培地の成分：ブドウ糖２０～４０ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １～５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １～５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５～２ｇ／Ｌ、酵母エキス２～５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １～３ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ １～３ｍｇ／Ｌ、ＶＨ ０．１～０．５ｍｇ／Ｌ、ＶＢ１ ０．５～１．０ｍｇ／Ｌ、微量元素混合液１～３ｍｌ／Ｌ、フェノールレッド１５～３０ｇ／Ｌ、水：残量、ｐＨ ７．０～７．２、１１５℃のオートクレーブで１５ｍｉｎ滅菌；
発酵培地の成分：ブドウ糖２０～４０ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２～６ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １～５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５～２ｇ／Ｌ、酵母エキス１～５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ３０～６０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １～５ｍｇ／Ｌ、ＶＨ ０．１～０．５ｍｇ／Ｌ、ＶＢ１ ０．５～１．０ｍｇ／Ｌ、微量元素混合液１～３ｍｌ／Ｌ、フェノールレッド１５～３０ｇ／Ｌ、水：残量、ｐＨ ７．０～７．２、１１５℃のオートクレーブで１５ｍｉｎ滅菌；
微量元素混合液の成分：Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ２．５ｇ／Ｌ、ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ ２．５ｇ／Ｌ、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ ２．５ｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ １．７５ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ １０ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．２５ｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３０．１２５ｇ／Ｌ。
以上のように構築したＬ－トリプトファン組換え菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＲＰ ０５を利用して、振とうフラスコ発酵を行い、天津科学技術大学代謝工学実験室に保存されているＬ－トリプトファン組換え菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＲＰ ０３と同等条件の発酵を対照とし、図４に示すその実験結果から、Ｌ－トリプトファン組換え菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＲＰ ０３の場合、Ｌ－トリプトファンは１１．２ｇ／Ｌまで蓄積され、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＲＰ ０５の場合は、Ｌ－トリプトファンは１５．２ｇ／Ｌまで蓄積され、対照菌より３５％向上した。
Claims (10)
- Ｌ－トリプトファン産生遺伝子組換え菌であって、
ｙｗｋＢ遺伝子で宿主菌を修飾して得た遺伝子組換え菌は、より高い産生量のＬ－トリプトファンを産生する活性を有し、
例示的には、前記ｙｗｋＢ遺伝子は枯草菌由来であり、前記修飾は、ｙｅｅｐ偽遺伝子座へのｙｗｋＢ遺伝子の修飾であり、
例示的には、前記宿主菌は原核細菌であり、好ましくは、グラム陰性菌であり、より好ましくは大腸菌であり、最も好ましくはＥ．ｃｏｌｉ ＴＲＰ ０３である、ことを特徴とするＬ－トリプトファン産生遺伝子組換え菌。 - 前記ｙｗｋＢ遺伝子は、以下のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である、請求項１に記載の遺伝子組換え細菌：
（Ａ）配列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
（Ｂ）配列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列に対して１つ又は複数のアミノ酸を欠失、置換又は挿入して修飾した配列を含むタンパク質であって、菌株によるＬ－トリプトファン及びＬ－トリプトファン構造類似体（例えば、５－ヒドロキシトリプトファンなど）の産生量を増加させる機能を有するタンパク質、
（Ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有する代謝物トランスポーターの機能を有する枯草菌由来のタンパク質（ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）。 - 前記ｙｗｋＢ遺伝子は、相同組換え、発現ベクター又は遺伝子編集の手段により、宿主菌に導入され、
前記発現ベクターは好ましくはプラスミドであり、例示的には、前記遺伝子編集の手段は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法を用いて前記アミノ酸配列遺伝子を宿主菌の染色体に導入することである、請求項１又は２に記載の遺伝子組換え菌。 - 前記ｙｗｋＢ遺伝子は強力なプロモーターの制御下にあり、例示的には、前記強力なプロモーターは、例えば、ＢＢａ＿ｊ２３１０１プロモーター又はＢＢａ＿ｊ２３１０６プロモーターであり、例えば、ＢＢａ＿ｊ２３１０６プロモーターのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示される、請求項１から３のいずれか１項に記載の遺伝子組換え菌。
- 宿主菌、例えばＥ．ｃｏｌｉ ＴＲＰ ０３トリプトファン産生菌を出発菌とする宿主菌にｙｗｋＢ遺伝子を組み込み、宿主菌よりも高い産生量のＬ－トリプトファンを産生する活性を有する遺伝子組換え菌を得る、ことを特徴とするＬ－トリプトファン産生遺伝子組換え菌の構築方法。
- 前記組み込みは、ｙｗｋＢ遺伝子をｙｅｅｐ偽遺伝子座に修飾することであり、例示的には、前記組み込みは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集の手段によって行われる、請求項５に記載の方法。
- 前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集の手段は、
（１）ｙｅｅｐ偽遺伝子の上下流相同アーム断片、ｙｗｋＢ遺伝子断片、及びＢＢａ＿ｊ２３１０６プロモーター配列を構築し、ｙｅｅｐ遺伝子上流相同アーム、ｙｅｅｐ遺伝子下流相同アーム、ＢＢａ＿ｊ２３１０６プロモーター断片、及びｙｗｋＢ遺伝子断片を含むｙｗｋＢ組み込み遺伝子断片を合成することと、
（２）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いて、ｙｗｋＢ組み込み遺伝子断片をＥ．ｃｏｌｉ ＴＲＰ ０３に発現させることとを含む、請求項６に記載の方法。 - 前記ｙｗｋＢ遺伝子配列は、以下のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である、請求項５から７のいずれか１項に記載の方法：
（Ａ）配列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
（Ｂ）配列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列に対して１つ又は複数のアミノ酸を欠失、置換又は挿入して修飾した配列を含むタンパク質であって、菌株によるＬ－トリプトファン及びＬ－トリプトファン構造類似体（例えば、５－ヒドロキシトリプトファンなど）の産生量を増加させる機能を有するタンパク質、
（Ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有する代謝物トランスポーターの機能を有する枯草菌由来のタンパク質（ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）。 - 請求項１から４のいずれか１項に記載の遺伝子組換え細菌又は請求項５から８のいずれか１項に記載の方法で得られた遺伝子組換え細菌を用いて発酵して、Ｌ－トリプトファンを産生するステップを含む、Ｌ－トリプトファンの生産方法。
- 菌種を活性化するステップ１）と、種子液を製造するステップ２）と、発酵培養のステップ３）とを含み、
例示的には、ステップ１）において、斜面培養を採用し、すなわち、－８０℃保存菌種を活性化斜面にストリーク播種し、３７℃で１２ｈ培養して、１回継代し、
ステップ２）において、振とうフラスコ種子培養を採用し、すなわち、播種ループで斜面種子を掻き取って３０ｍＬ種子培地を入れた５００ｍＬ三角フラスコに播種し、９層ガーゼで口を密封し、３７℃、２００ｒｐｍで８～１０ｈ培養し、
ステップ３）において、振とうフラスコ発酵培養を採用し、すなわち、１０～１５％（ｖ／ｖ）の播種量で発酵培地を容れた５００ｍＬ三角フラスコに播種し（最終体積は３０ｍＬ）、９層ガーゼで口を密封し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで振とう培養し、発酵過程でアンモニア水を補充することでｐＨを７．０～７．２に維持し、６０％（ｍ／ｖ）ブドウ糖溶液を補充することで発酵を進行させ（フェノールレッドを指示薬とし、発酵液の色が変化しない時に糖不足とみなし、糖不足時に６０％（ｍ／ｖ）ブドウ糖溶液を１～２ｍＬ補充して、発酵液中のブドウ糖濃度が初期値の２０～４０ｇ／Ｌになるようにする）、
発酵周期は２２～２６ｈである、請求項９に記載のＬ－トリプトファンの生産方法。
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