KR20230002331A - L-라이신을 생산하는 재조합 균주 및 이의 구축 방법과 응용 - Google Patents

L-라이신을 생산하는 재조합 균주 및 이의 구축 방법과 응용 Download PDF

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Abstract

코리네박테리움 글루타미쿰 중 NCgl2176 유전자 코딩 서열에 점 돌연변이를 도입하거나 또는 발현을 개선하는 방법, 및 코리네박테리움 글루타미쿰 중의 dapB 유전자의 프로모터 영역 서열에 대해 점 돌연변이를 수행하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 돌연변이의 균주에 의해 생산된 L-라이신의 발효 수율을 증가시킬 수 있다.

Description

L-라이신을 생산하는 재조합 균주 및 이의 구축 방법과 응용
본 발명은 2020년 8월 7일에 중국국가지식재산권국에 제출한 특허출원번호가 202010790877.0이고, 발명의 명칭이 "L-라이신을 생산하는 재조합 균주 및 이의 구축 방법과 응용"이며, 2020년 6월 8일에 중국국가지식재산권국에 제출한 특허출원번호가 202010514023.X이고, 발명의 명칭이 "dapB 유전자 개조의 재조합 균주 및 이의 구축 방법과 응용"의 우선권을 주장한다. 상기 두 선출원의 전문은 인용의 방식으로 본 발명에 결합된다.
본 발명은 유전공학 및 미생물 기술분야에 속하는 것으로서, 구체적으로는 L-라이신 생산 능력이 향상된 재조합 균주 및 이의 구축 방법과 응용에 관한 것이다.
L-라이신은 발달 촉진, 면역 강화 및 중추 신경 조직의 기능 향상 등과 같은 생리적 기능을 가지고 있으며, 인체와 동물이 스스로 합성할 수 없고 성장에 필요한 8가지 필수 아미노산 중의 하나이다. 현재, L-라이신은 세계에서 두 번째로 큰 아미노산 종류로서, 주요 생산 방법은 발효법이며, 코리네박테리움은 아미노산 생산에 사용되는 가장 중요한 균주인 바, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 플라붐(C.flavum), 코리네박테리움 크레나툼(C.crenatum), 코리네박테리움 페키넨스(Corynebacterium pekinense) 등을 포함하고, 이중 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 라이신의 중요한 생산 균주이다. L-라이신의 산업 생산량의 약 90%는 사료 산업에서 영양 강화제로 사용되며, 10%는 식품 산업에서 향미제 및 감미료 및 제약 산업에서는 제약 중간체로 사용된다.
L-라이신을 생산하기 위한 발효 방법의 개선에는 교반 및 산소 공급과 같은 발효 기술이 포함될 수 있거나; 또는 발효 중 당 농도와 같은 영양 배지의 구성을 포함하거나; 또는 발효액의 건조 및 펠렛화 또는 이온 교환 크로마토그래피와 같은 적절한 제품 형태로의 발효액의 가공을 포함하거나; 또는 관련 미생물의 고유한 성능 및 특성을 포함할 수 있다.
이러한 미생물의 성능 및 특성을 개선하는 방법에는 돌연변이 유발, 돌연변이체의 선택 및 스크리닝이 포함된다. 이러한 방식으로 얻은 균주는 대사 산물에 내성이 있거나 규제가 중요한 대사 산물에 대한 영양 요구체이며 L-라이신을 생성할 수 있다.
코리네박테리움 글루타미쿰을 예로 들면, C.glutamicum의 생합성경로에서 1 mol L-라이신을 합성하는 데 4 mol NADPH의 소모가 필요하다. 따라서, C.glutamicum 생합성경로에서 L-라이신의 축적을 향상하기 위해, C.glutamicum 대사경로에서 NADPH의 양을 증가하거나 L-라이신 합성 경로에서 NADPH의 수요량을 줄이는 것이 매우 중요한 전략이다.
디히드로디피콜리네이트 환원효소(Dihydrodipicolinate reductase, DHDPR)는 박테리아 및 고등 식물에서 디아미노피멜산과 L-라이신의 생합성에서 두 번째 핵심 효소이며 디히드로디피콜리네이트의 NAD(P)H 의존적 환원 반응을 촉매하여 헥사히드로디피콜리네이트를 생성한다. 상기 효소는 세포벽 형성에 관건적인 작용을 한다. DHDPR은 NADH 또는 NADPH를 보조 인자로 사용하고, 상이한 박테리아의 DHDPR은 상이한 보조인자에 대해 상이한 친화성을 갖는다. 예를 들어, E.coli 중 DHDPR은 NADH를 선호하는 반면 C.glutamicum 중 DHDPR은 주로 NADPH를 보조인자로 사용하여 L-라이신 합성에 참여한다. 다른 유기체에서 발견되는 DHDPR과 마찬가지로 C.glutamicum 중 DHDPR은 dapB 유전자에 의해 암호화되며 효소 활성은 합성 경로의 최종 생성물에 의해 조절되지 않지만 2,6-피리딘디카르복실산(2,6-PDC)에 의해 억제된다.
라이신의 수율은 일반적으로 라이신 생합성경로에서 하나 이상의 유전자를 증폭하거나 유전자에 변형된 프로모터를 적용함으로써 향상될 수 있는 생합성 경로의 효소 활성과 관련이 있다.
본 발명에서는 L-라이신 생성 미생물 또는 재조합 균주를 제공하는 바, 여기서 SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 개선되거나, 및/또는, SEQ ID NO:29로 표시되는 프로모터 영역의 -49번째, -51번째, -54번째 내지 -58번째 염기에 돌연변이가 발생한다. 본 발명에서는 상기 미생물 또는 재조합 균주를 사용하여 L-라이신의 생산 방법을 더 제공한다.
본 발명의 제1 양태에서는 코리네박테리움속에 속하는 L-라이신 생성 미생물 또는 재조합 균주를 제공하는 바, SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 개선된다. 본 발명에 따르면, 상기 개선된 발현은 상기 폴리뉴클레오티드 발현이 증진되거나, 또는 SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 점 돌연변이를 갖거나, 또는 SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 점 돌연변이를 갖고 발현이 증진되는 것이다.
상기 SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열은 유전자 NCgl2176이 코딩하는 단백질이다.
상기 미생물 또는 재조합 균주는 야생형 또는 모균주에 비하면 향상된 L-라이신 생산 능력을 구비한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열과 약 90% 또는 그 이상, 약 92% 또는 그 이상, 약 95% 또는 그 이상, 약 97% 또는 그 이상, 약 98% 또는 그 이상, 또는 약 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 본원 발명에서 사용되는 용어 "상동성"은 폴리뉴클레오티드 또는 두 가지 폴리펩타이드 모듈 사이의 동일성 백분율을 가리킨다. 본 분야의 기존의 방법을 사용하여 하나의 모듈과 다른 한 모듈 사이의 서열 상동성을 측정할 수 있다. 예를 들면, BLAST 알고리즘을 통해 이러한 서열 상동성을 측정할 수 있다.
발현 조절 서열의 치환 또는 돌연변이, 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 돌연변이 인입, 염색체 삽입 또는 벡터 도입을 거친 폴리뉴클레오티드 복제개수의 증가, 또는 그 조합 등을 통해 폴리뉴클레오티드의 발현을 향상시킬 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 발현 조절 서열은 변형될 수 있다. 발현 조절 서열은 이가 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어하고, 예를 들어 프로모터, 터미네이터, 인핸서, 사일런서 등을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 개시 코돈에 변화를 구비할 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 염색체의 특정 위치에 혼합시켜, 복제개수를 증가할 수 있다. 본문에서, 특정된 위치는 예를 들어 트랜스포슨 위치 또는 유전자간 위치를 포함할 수 있다. 이 밖에, 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 혼합하여, 상기 발현 벡터를 숙주 세포에 도입함으로써, 복제개수를 증가할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 점 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드를 미생물 염색체의 특정 위치에 혼합하여, 복제개수를 증가한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 프로모터 서열을 지닌 폴리뉴클레오티드 또는 프로모터 서열을 지닌 점 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드를 미생물 염색체의 특정 위치에 혼합하여, 상기 핵산 서열을 과발현한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 점 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 혼합하고, 상기 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하여, 복제개수를 증가한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 프로모터 서열을 지닌 폴리뉴클레오티드 또는 프로모터 서열을 지닌 점 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 혼합하고, 상기 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하여, 상기 핵산 서열을 과발현한다.
본 발명의 일 구체적인 실시형태에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 점 돌연변이를 갖고 있어, SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열의 176번째 라이신이 상이한 아미노산으로 치환되도록 한다.
본 발명에 따르면, 바람직하게는 176번째 라이신은 아스파라긴으로 치환된다.
본 발명에 따르면, SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열은, 여기서 176번째 라이신(K)이 아스파라긴(N)으로 치환된 아미노산 서열은 SEQ ID NO:4로 표시된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 점 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 528번째 염기의 돌연변이에 의해 형성된다.
본 발명에 따르면, 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 528번째 염기의 아데닌(A)에서 시토신(C)으로의 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 점 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본문에서 사용하는 용어 "작동 가능하게 연결"은 조절 서열과 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 기능성 연결을 조절하는 것을 가리키며, 이로써 조절 서열은 폴리뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 제어한다. 조절 서열은 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 향상시킬 수 있는 강력한 프로모터일 수 있다. 조절 서열은 코리네박테리움속에 속하는 미생물 유래의 프로모터 또는 다른 미생물 유래의 프로모터일 수 있다. 예를 들면, 프로모터는 trc 프로모터, gap 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, lac 프로모터, trp 프로모터, araBAD 프로모터 또는 cj7 프로모터일 수 있다.
본 발명의 일 구체적인 실시형태에서, 상기 프로모터는 SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(NCgl2176유전자)의 프로모터이다.
본문에서 사용하는 용어 "벡터"는 유전자의 조절 서열 및 유전자 서열을 함유하고 적합한 숙주 세포에서 표적 유전자를 발현하도록 구성된 폴리뉴클레오티드 구축체를 가리킨다. 또는, 벡터는 또한 상동 재조합을 위한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축체를 가리키며, 이로써 숙주 세포에 도입된 벡터는 숙주 세포의 게놈 중의 내인성 유전자의 조절 서열을 변경할 수 있거나, 또는 발현될 수 있는 표적 유전자를 숙주의 게놈의 특정 위치에 삽입할 수 있다. 이 점에서, 본 발명에서 사용하는 벡터는 선택 마커를 더 포함하여 벡터가 숙주 세포에 대한 도입 또는 벡터가 숙주 세포의 염색체에 대한 삽입을 결정할 수 있다. 선택 마커는 약물 내성, 영양 요구형, 세포 독성제에 대한 내성, 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능한 표현형을 부여하는 마커를 포함할 수 있다. 이러한 선별제를 사용하는 환경에서, 선택 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 상이한 표현형 특성을 나타낼 수 있기에 형질 전환된 세포를 선택할 수 있다.
본 발명의 일부 구체적인 실시형태에서, 사용되는 벡터는 pK18mobsacB 플라스미드, pXMJ19 플라스미드이다.
본문에서 사용하는 용어 "형질 전환"은 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하여, 폴리뉴클레오티드를 게놈외 요소로 하거나 또는 숙주 세포의 게놈에 삽입하여 복제할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 벡터의 형질 전환 방법은 핵산을 세포로 도입하는 방법을 포함할 수 있다. 이 밖에, 관련 기술에서 공개된 바와 같이, 숙주 세포에 따라 전기 펄스 방법을 구현할 수 있다.
본 발명에 따르면, 코리네박테리움속에 속하는 미생물 또는 재조합 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 브레비박테륨 플라붐(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 페키넨스(Corynebacterium pekinense)일 수 있다.
본 발명의 한 실시형태에서, 상기 코리네박테리움속에 속하는 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 YP97158이며, 기탁 번호는 CGMCC No.12856이고, 기탁 일자는 2016년 8월 16일이며, 기탁 기관은 중국 미생물 균종 기탁 관리 위원회 일반 미생물 센터로서, 주소는 베이징시 차오양구 베이천서로 1호원 3호이며, 연락처는 010-64807355이고, 중국 특허 출원 CN106367432A(출원 일자 2016년 9월 1일, 공개 일자 2017년 2월 1일)에 이미 기재되었다.
본 발명에 따르면, 상기 미생물 또는 재조합 균주는 L-라이신 생산량과 관련된 다른 개선을 구비할 수도 있는 바, 예를 들면, NADPH 생산과 관련된 유전자(예를 들면 포도당탈수소효소를 코딩하는 유전자, 글루콘산인산화효소를 코딩하는 유전자, 글리세르알데히드-3-인산 수소 이탈 효소를 코딩하는 유전자, 글루코스-6-인산탈수소효소를 코딩하는 유전자, 또는 6-포스포글루콘산 수소 이탈 효소를 코딩하는 유전자) 및/또는 L-라이신의 생합성 또는 분비에 관여하는 기타 유전자(예를 들면 아스파트산아미노기전달효소를 코딩하는 유전자, 아스파르트산인산화효소를 코딩하는 유전자, 아스파르트산세미알데히드 탈수소효소를 코딩하는 유전자, 디히드로디피콜리네이트 합성효소를 코딩하는 유전자, 디히드로디피콜리네이트 환원효소를 코딩하는 유전자, m-다이아미노피멜레이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자, 디아미노피멜레이트 탈카복실화효소를 코딩하는 유전자, lysE)의 발현을 증가 또는 감소시키거나, 또는 유전자가 외래 유전자로 치환될 수 있도록 한다.
본 발명의 두번째 양태에 따르면, 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하는 바, 상기 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 재조합 벡터를 포함하고 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 재조합 균주를 함유한다.
본 발명에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열이 함유된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 176번째 라이신은 상이한 아미노산으로 치환된다.
본 발명에 따르면, 바람직하게는 176번째 라이신은 아스파라긴으로 치환된다.
본 발명에 따르면, SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열 중의 176번째 라이신(K)은 아스파라긴(N)으로 치환된 후의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:4로 표시된다.
본 발명에 따르면, 바람직하게는 SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 상기 폴리펩티드의 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 528번째 염기의 돌연변이에 의해 형성된다.
본 발명에 따르면, 상기 돌연변이는 상기 위치의 염기/뉴클레오티드의 변화를 가리키며, 상기 돌연변이 방법은 돌연변이 유발, PCR 지정 돌연변이법, 및/또는 상동 재조합 등 방법 중의 적어도 하나에서 선택될 수 있다. 본 발명에서, 바람직하게는 PCR 지정 돌연변이법 및/또는 상동 재조합을 사용한다.
본 발명에 따르면, 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 528번째 염기의 아데닌(A)에서 시토신(C)으로의 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명에 따르면, 상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO:4로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 따르면, 상기 재조합 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 플라스미드에 도입하여 구축 완성된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 플라스미드는 pK18mobsacB 플라스미드이다.
본 발명의 다른 한 실시형태에서, 상기 플라스미드는 pXMJ19 플라스미드이다.
구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드 서열 및 상기 플라스미드는 NEBuider 재조합 시스템을 통해 재조합 벡터로 구축될 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 재조합 균주는 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 일 실시형태로서, 상기 재조합 균주의 출발 균주는 YP97158이다.
본 발명의 제3 양태에 따르면, 코리네박테리움 글루타미쿰 재조합 균주의 구축 방법을 더 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 구축 방법은 하기의 단계를 포함한다.
숙주 균주에서 SEQ ID NO:1로 표시되는 야생형 NCgl2176의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형하여, 528번째 염기에 돌연변이가 발생하도록 하여, 돌연변이 NCgl2176 코딩 유전자를 포함하는 코리네박테리움 재조합 균주를 얻는다.
본 발명의 구축 방법에 따르면, 상기 변형은 돌연변이유발, PCR 지정 돌연변이법, 및/또는 상동 재조합 등 방법 중의 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 구축 방법에 따르면, 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:1 중 528번째 염기의 아데닌(A)에서 시토신(C)으로의 돌연변이를 가리키고; 구체적으로, 돌연변이 NCgl2176 코딩 유전자를 포함하는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2로 표시된다.
부가적으로, 상기 구축 방법은 하기의 단계를 포함한다.
(1) SEQ ID NO:1로 표시되는 야생형 NCgl2176 유전자의 뉴클레오티드 서열을 변형하여, 그 528번째 염기가 돌연변이되도록 하여, 돌연변이된 NCgl2176 유전자 폴리뉴클레오티드 서열을 얻는다.
(2) 상기 돌연변이된 폴리뉴클레오티드 서열과 플라스미드를 연결하여, 재조합 벡터를 구축한다.
(3) 상기 재조합 벡터를 숙주 균주에 도입하여, 돌연변이 NCgl2176 코딩 유전자를 포함하는 코리네박테리움 재조합 균주를 얻는다.
본 발명의 구축 방법에 따르면, 상기 단계 (1)은 점 돌연변이된 NCgl2176 유전자를 구축하는 단계를 포함한다. 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈 서열에 따라, NCgl2176 유전자 단편을 증폭하는 두 쌍의 프라이머 P1과 P2 및 P3과 P4를 합성하여, PCR 지정 돌연변이법을 통해 야생형 NCgl2176 유전자 SEQ ID NO:1에 점 돌연변이를 인입하여, 점 돌연변이된 NCgl2176 유전자 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO:2을 얻고, NCgl2176A528C로 표시한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈은 ATCC13032 균주로부터 유래될 수 있고, 그 게놈 서열은 NCBI 웹사이트에서 획득할 수 있다.
본 발명의 한 실시형태에서, 상기 단계(1)에서, 상기 프라이머는 아래와 같다.
Figure pct00001
본 발명의 한 실시형태에서, 상기 PCR 증폭은 하기의 방식에 따라 수행한다. 94℃에서 30s 동안 변성, 52℃에서 30s 동안 어닐링, 및 72℃에서 40s 동안 연장(30개 순환).
본 발명의 한 실시형태에서, 상기 중첩 PCR 증폭은 하기의 방식에 따라 수행한다. 94℃에서 30s 동안 변성, 52℃에서 30s 동안 어닐링, 및 72℃에서 90s 동안 연장(30개 순환).
본 발명의 구축 방법에 따르면, 상기 단계(2)는, NEBuider 재조합 시스템을 통해, 분리 및 정제된 NCgl2176A528C 및 pK18mobsacB 플라스미드를 조립하여 재조합 플라스미드 pK18-NCgl2176A528C를 얻는 재조합 플라스미드의 구축 단계를 포함한다.
본 발명의 구축 방법에 따르면, 상기 단계(3)은 재조합 플라스미드 pK18-NCgl2176A528C를 숙주 균주로 형질 전환하여, 재조합 균주를 얻는 재조합 균주의 구축 단계를 포함한다.
본 발명의 한 실시형태에서, 상기 단계(3)의 형질 전환은 전기 형질 전환법이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 숙주 균주는 YP97158이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 재조합은 상동 재조합을 통해 구현된다.
본 발명의 제4 양태에 따르면, 코리네박테리움 재조합 균주의 구축 방법을 더 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 구축 방법은 하기의 단계를 포함한다.
NCgl2176 유전자의 상류 및 하류 상동 암 단편, NCgl2176유전자 코딩 영역 및 그 프로모터 영역 서열, 또는, NCgl2176A528C 유전자 코딩 영역 및 그 프로모터 영역 서열을 증폭하고, 상동 재조합 방식으로 숙주 균주의 게놈에 NCgl2176 또는 NCgl2176A528C 유전자를 인입하여, 상기 균주가 NCgl2176 또는 NCgl2176A528C 유전자를 과발현하는 것을 구현한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상류 상동 암 단편을 증폭하는 프라이머는 아래와 같다.
Figure pct00002
본 발명의 일 실시형태에서, 하류 상동 암 단편을 증폭하는 프라이머는 아래와 같다.
Figure pct00003
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 유전자 코딩 영역 및 그 프로모터 영역 서열을 증폭하는 프라이머는 아래와 같다.
Figure pct00004
본 발명의 일 실시형태에서, 전술한 P7/P12를 프라이머로 하여, 증폭하여 획득한 상류 상동 단편, 하류 상동 단편 및 자체 프로모터를 가진 NCgl2176 또는 NCgl2176A528C 세 개의 단편을 주형으로 혼합하고 증폭시켜, 통합된 상동 암 단편을 획득한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 사용된 PCR 시스템은 아래와 같다. 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각 2.5mM) 4μL, Mg2+(25mM)4μL, 프라이머(10pM) 각 2μL, Ex Taq(5U/μL) 0.25μL, 총 부피 50μL; PCR 증폭은 하기의 방식에 따라 수행된다. 94℃에서 5min 동안 초기 변성, 94℃에서 30s 동안 변성, 52℃에서 30s 동안 어닐링, 72℃에서 120s 동안 연장(30개 순환), 72℃에서 10min 동안 최종 연장.
본 발명의 일 실시형태에서, NEBuider 재조합 시스템을 사용하여, 셔틀 플라스미드 PK18mobsacB 및 통합된 상동 암 단편을 조립하여, 통합된 플라스미드를 획득한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 통합된 플라스미드는 숙주 균주에 형질 감염되고, 상동 재조합의 방식으로 숙주 균주의 게놈에 NCgl2176 또는 NCgl2176A528C 유전자를 인입한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 숙주 균주는 YP97158이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 숙주 균주는 SEQ ID NO:2로 표시된 폴리뉴클레오티드 서열을 지닌 균주이다.
본 발명의 제5 양태에 따르면, 코리네박테리움 재조합 균주의 구축 방법을 더 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 구축 방법은 하기의 단계를 포함한다.
NCgl 2176 유전자 코딩 영역 및 프로모터 영역 서열, 또는 NCgl 2176A528C 유전자 코딩 영역 및 프로모터 영역 서열을 증폭하여, 과발현 플라스미드 벡터를 구축하고, 상기 벡터를 숙주 균주에 도입하여, 상기 균주가 NCgl 2176 또는 NCgl2176A528C 유전자를 과발현하는 것을 구현한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 유전자 코딩 영역 및 그 프로모터 영역 서열을 증폭하는 프라이머는 아래와 같다.
Figure pct00005
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 PCR 시스템은 아래와 같다. 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각 2.5mM) 4μL, Mg2+(25mM) 4μL, 프라이머(10pM) 각 2μL, Ex Taq(5U/μL) 0.25μL, 총 부피 50μL; 상기 PCR 증폭은 하기의 방식에 따라 수행한다. 94℃에서 5min 동안 초기 변성, 94℃에서 30s 동안 변성, 52℃에서 30s 동안 어닐링, 72℃에서 90s 동안 연장(30개 순환), 72℃에서 10min 동안 최종 연장.
본 발명의 일 실시형태에서, NEBuider 재조합 시스템을 사용하여, 셔틀 플라스미드 pXMJ19 및 자체 프로모터를 지닌 NCgl2176 또는 NCgl2176A528C 단편을 조립하여, 과발현 플라스미드를 획득한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 숙주 균주는 YP97158이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 숙주 균주는 SEQ ID NO:2로 표시된 폴리뉴클레오티드 서열을 지닌 균주이다.
본 발명에 의해 획득된 재조합 균주는 L-라이신의 발효 생산에 단독으로 응용될 수 있고, 다른 L-라이신을 생산하는 박테리아와 혼합 발효되어 L-라이신을 생산할 수도 있다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면 프로모터 뉴클레오티드 서열을 제공하는 바, 이는 SEQ ID NO:29로 표시되는 프로모터 영역의 -49번째, -51번째, -54번째 내지 -58번째 염기에 돌연변이가 발생하여 형성된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명에 따르면, SEQ ID NO:29로 표시되는 프로모터 영역의 -49번째 뉴클레오티드는 시토신(C)에서 아데닌(A)으로 돌연변이되고, -51번째 뉴클레오티드는 구아닌(G)에서 티민(T)으로 돌연변이되며, -54번째 내지 -58번째 뉴클레오티드는 CTGCA에서 GGTGT로 돌연변이된다.
본 발명에 따르면, 상기 프로모터 뉴클레오티드 서열은,
(a) SEQ ID NO:30으로 표시되는 뉴클레오티드 서열이거나; 또는,
(b) SEQ ID NO:30으로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 또는 98% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열이며, (a)에 따른 프로모터의 강화된 활성을 유지하고, -49번째 뉴클레오티드는 아데닌(A)으로 유지되며, -51번째 뉴클레오티드는 티민(T)으로 유지되고, -54번째 내지 -58번째 뉴클레오티드는 GGTGT로 유지된다.
본 발명에서는 상기 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 더 제공하는 바, 상기 발현 카세트는 상기 프로모터 및 상기 프로모터에 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 포함한다. 본 발명의 한 실시형태에서, 상기 코딩 서열은 dapB 유전자의 코딩 서열이다.
본 발명에서는 본 발명의 프로모터 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 더 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 프로모터 뉴클레오티드 서열은 셔틀 플라스미드와 결찰되어 상기 재조합 벡터를 구축하고; 본 발명의 일 실시형태로서, 상기 셔틀 플라스미드는 pK18mobsacB 플라스미드이다.
본 발명에서는 상기 프로모터 뉴클레오티드 서열 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 균주를 더 제공한다.
본 발명의 재조합 균주에 따르면, 이는 SEQ ID NO:30으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 SEQ ID NO:30으로 표시되는 뉴클레오티드 서열은 dapB 유전자의 프로모터 영역이다. 부가적으로, 상기 SEQ ID NO:30으로 표시되는 뉴클레오티드 서열은 dapB 유전자 코딩 서열에 연결된다. 구체적으로, 상기 재조합 균주는 본 발명의 발현 카세트 또는 재조합 벡터를 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 재조합 균주는 발현 카세트 또는 재조합 벡터에 의해 형질 전환되어 얻어진다. 본 발명의 재조합 균주에 따르면, 상기 돌연변이된 프로모터 뉴클레오티드 서열을 숙주 균주에 도입하여 재조합하여 형성되고; 상기 숙주 균주는 본 분야의 알려진 L-라이신을 생산하는 균주로부터 선택될 수 있는 바, 예를 들면 코리네박테리움 중의 적어도 하나로부터 선택되며, 상기 코리네박테리움은 코리네박테리움 글루타미쿰, 브레비박테리움 플라붐, 코리네박테리움 크레나툼, 코리네박테리움 페키넨스(Corynebacterium pekinense)일 수 있고; 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰이다. 본 발명의 일 실시형태로서, 상기 숙주 균주는 YP97158이다.
본 발명의 재조합 균주에 따르면, pK18mobsacB 플라스미드를 벡터로 한다.
본 발명의 재조합 균주에 따르면, 다른 변형을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서는 L-라이신을 생산하는 재조합 균주의 구축 방법을 더 제공하는 바, 하기의 단계를 포함한다.
(1) SEQ ID NO:29로 표시되는 프로모터 영역을 변형하여, -49번째, -51번째 및 -54번째 내지 -58번째 염기를 돌연변이시켜, 돌연변이된 프로모터 영역을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 얻는다.
본 발명에 따르면, 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:29로 표시되는 프로모터 영역의 -49번째 뉴클레오티드가 시토신(C)에서 아데닌(A)으로 돌연변이되고, -51번째 뉴클레오티드가 구아닌(G)에서 티민(T)으로 돌연변이되며, -54번째 내지 -58번째 뉴클레오티드가 CTGCA에서 GGTGT로 돌연변이되는 것을 가리킨다. 구체적으로, 상기 돌연변이된 후의 프로모터 영역의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:30으로 표시된다. 부가적으로, 상기 구축 방법은 하기의 단계를 더 포함한다.
(2) 상기 돌연변이된 프로모터 영역 뉴클레오티드 서열을 플라스미드에 연결하여, 재조합 벡터를 구축한다.
(3) 상기 재조합 벡터를 숙주 균주에 도입하여, 돌연변이된 프로모터 영역을 포함하는 L-라이신 생산 재조합 균주를 얻는다.
본 발명에 따르면, 상기 단계(1)에서, 돌연변이의 방법은 돌연변이유발, PCR 지정 돌연변이 또는 상동 재조합을 포함하고, 바람직하게는 PCR 지정 돌연변이법을 포함한다.
본 발명에 따르면, 상기 단계(1)은, dapB 유전자의 프로모터 영역을 증폭하기 위한 두 쌍의 프라이머를 디자인한 후, PCR 기술을 통해 돌연변이된 프로모터 영역 뉴클레오티드 서열을 얻는 단계를 포함한다.
본 발명의 한 실시형태에서, 상기 단계(1) 중의 프라이머는 아래와 같다.
Figure pct00006
본 발명의 한 실시형태에서, 상기 단계(1)은, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 주형으로 하고, 프라이머 P1'과 P2', P3'과 P4'로 각각 PCR 증폭을 수행하여, 점 돌연변이를 포함하는 두 개의 DNA 단편을 획득하는 단계; 상기 두 개의 DNA 단편을 주형으로 하고, P1' 및 P4'를 프라이머로 중복 PCR 증폭(Overlap PCR)을 수행하여, 본 발명의 프로모터 영역 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:30)을 포함하는 DNA 단편을 얻는 단계를 포함한다.
본 발명에 따르면, 단계(1)에서, 중복 PCR 증폭(Overlap PCR)을 통해, 획득된 DNA 단편 양단은 각각 EcoR I 및 Sph I 제한 효소 위치를 포함한다.
본 발명에 따르면, 상기 단계(2)는, 중복 PCR 반응에 의해 증폭된 생성물을 분리 및 정제하고, 단편 이중 제한된(EcoR I/Sph I) 후, 마찬가지로 이중 제한된(EcoR I/Sph I) 후의 셔틀 플라스미드와 결찰시켜, 대립 치환된 재조합 벡터를 획득하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따르면, 상기 셔틀 플라스미드는 pK18mobsacB 플라스미드이고; 구축된 재조합 벡터는 pK18-P dapB(C(-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)이다.
본 발명의 한 실시형태에서, 상기 재조합 플라스미드는 카나마이신 내성 마커를 구비한다.
본 발명의 한 실시형태에서, 상기 단계(3)의 형질 전환은 전기 형질 전환법으로서; 예시적으로, 상기 단계(3)에서, 재조합 플라스미드를 균주 YP97158로 형질 전환시킨다.
본 발명에서는 본 발명에서 전술한 미생물 또는 재조합 균주가 L-라이신 제조 중의 응용을 더 제공하거나; 또는 L-라이신 발효량을 향상하는 방법을 제공하거나; 또는 L-라이신의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 응용 및 방법에 따르면, 상기 미생물을 배양하거나 또는 재조합 균주를 발효시키고, 상기 배양물로부터 L-라이신을 회수하여, L-라이신을 제조하는 단계를 포함한다. 본 발명의 응용 및 방법에 따르면, 본 발명의 재조합 균주를 단독으로 사용할 수 있고, L-라이신을 생산하는 다른 박테리아와 혼합하여 사용할 수도 있다.
본 분야에서 알려진 배양 조건 하에 적합한 배지에서 미생물을 배양할 수 있다. 배지는 탄소원, 질소원, 미량원소 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 배양 중에, 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 이 외에, 배양 시 기포의 발생을 방지하는 단계를 포함할 수 있는 바, 예를 들면 소포제를 사용하여 기포의 발생을 방지할 수 있다. 이 외에, 배양 시 기체를 배양물에 주입하는 단계를 포함할 수 있다. 기체는 배양물의 호기성 조건을 유지할 수 있는 모든 가스를 포함할 수 있다. 배양 중에, 배양물의 온도는 20 내지 45℃일 수 있다. 생성된 L-라이신은 황산 또는 염산으로 처리한 후 음이온 교환 크로마토그래피, 농축, 결정화 및 등전 침전과 같은 방법의 조합을 수행함으로써 배양물로부터 회수될 수 있다.
본 발명에서,
SEQ ID NO 1: NCgl2176 야생형 ORF 서열
Figure pct00007
SEQ ID NO 2: NCgl2176A528C ORF서열
Figure pct00008
SEQ ID NO 3: NCgl2176 야생형 코딩 단백질 아미노산 서열
Figure pct00009
SEQ ID NO 4: NCgl2176K176N 코딩 단백질 아미노산 서열
Figure pct00010
SEQ ID NO 29: 야생형 프로모터 서열
Figure pct00011
SEQ ID NO 30: 돌연변이된 프로모터 서열
Figure pct00012
본 발명의 유익한 효과는 하기와 같다.
본 발명에서는 NCgl2176 유전자를 약화 또는 넉아웃을 수행하여, 상기 유전자에 의해 코딩되는 생성물이 L-라이신 생산 능력에 미치는 영향을 확인하고, 코딩 서열에 점 돌연변이를 도입하거나, 또는 상기 유전자의 복제개수를 증가시키거나 과발현시켜 재조합 균주를 획득하는 것을 통해 획득된 균주는 비변형된 균주에 비해, 고농도의 L-라이신 생산에 유리했다.
또한, dapB 유전자의 프로모터 영역에 점 돌연변이를 인입하여, 재조합된 균주를 얻고, 획득된 균주는 돌연변이되지 않은 균주에 비해, L-라이신의 생산량을 크게 증가시켰고, 생성 효율을 더 향상시켰으며 생성 원가를 감소하여 보급 및 적용에 적합하다.
아래 구체적인 실시예에 결부하여 본 발명의 기술수단을 더 상세하게 설명한다. 반드시 이해해야 할 것은, 하기의 실시예는 단지 본 발명을 예시적으로 설명 및 해석하기 위한 것으로, 본 발명의 보호범위에 대한 한정으로 해석되지 않는다. 본 발명의 상기 내용에 기반하여 구현되는 기술은 모두 본 발명의 보호범위 내에 속한다. 별도로 설명하지 않는 한, 하기의 실시예에서 사용되는 원료 및 시제는 시판 상품이거나, 기존의 방법으로 제조 가능하며, 수행되는 동작은 모두 본 분야에서 알려진 것이거나, 시판 상품의 사용 수첩에 따라 수행할 수 있다.
하기의 실시예에서 상기 균주의 배양에 사용되는 기본 배지의 구성은 동일하고, 이 기본 배지에 상응하게 필요한 자당, 카나마이신 또는 클로로마이세틴 등을 첨가하고, 기본 배지 구성은 하기와 같다.
Figure pct00013
하기의 실시예 중 SSCP 전기 영동 PAGE의 제조 및 조건은 하기와 같다.
Figure pct00014
하기의 실시예 중 L-라이신의 발효 배지 배합 및 발효 제어 공정은 하기와 같다.
표 1 발효 배지 배합
Figure pct00015
표 2 발효 제어 공정
Figure pct00016
실시예 1: 점 돌연변이된 NCgl 2176유전자 코딩 영역을 포함하는 형질 전환 벡터 pK18-NCgl2176A528C의 구축
NCBI에서 공개한 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 서열에 따라, NCgl2176 유전자 코딩 영역 서열을 증폭하는 두 쌍의 프라이머를 디자인 및 합성하여, 대립 형질 치환의 방식으로 균주 YP97158(기탁 번호: CGMCC No.12856, 기탁 일자: 2016년 8월 16일, 기탁 기관: 중국 미생물 균종 기탁 관리 위원회 일반 미생물 센터, 베이징시 차오양구 베이천서로 1호원 3호, 연락처: 010-64807355, 중국특허출원 CN106367432A(출원일자 2016년 9월 1일, 공개일자 2017년 2월 1일)에 기재됨) 배경 중의 NCgl2176 유전자 코딩 영역(SEQ ID NO:1)에 점 돌연변이가 인입되고, 대응되는 코딩된 단백질 아미노산 서열은 SEQ ID NO:3이고, NCgl2176 유전자의 뉴클레오티드 서열의 528번째 A는 C로 변경되며(SEQ ID NO:2: NCgl2176A528C), 대응되는 코딩된 단백질 아미노산 서열의 176번째 라이신은 아스파라긴(SEQ ID NO:4: NCgl2176K176N)으로 변경된다.
프라이머는 하기와 같이 디자인된다(상하이 invitrogen회사에서 합성).
Figure pct00017
구축 방법: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 주형으로 하여, 각각 프라이머 P1과 P2, P3과 P4로 PCR 증폭을 수행한다.
PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각 2.5mM) 4μL, Mg2+(25mM) 4μL, 프라이머(10pM) 각 2μL, Ex Taq(5U/μL) 0.25μL, 총 부피 50μL.
상기 PCR 증폭은 하기의 방식으로 수행된다. 94℃에서 5min 동안 초기 변성, 94℃에서 30s 동안 변성, 52℃에서 30s 동안 어닐링, 72℃에서 40s 동안 연장(30개 순환), 72℃에서 10min 동안 최종 연장, 두 개의 크기가 각각 796bp 및 786bp이고, NCgl2176 유전자 코딩 영역을 포함하는 DNA 단편(NCgl2176 Up 및 NCgl2176 Down)을 획득한다.
상기 두 개의 DNA 단편은 아가로스 겔 전기 영동을 거쳐 분리 정제된 후, 상기 두 개의 DNA 단편을 주형으로 하여, P1 및 P4를 프라이머로 사용하고, 중복 PCR 증폭을 통해 길이가 약 1552bp인 단편을 얻는다.
PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각 2.5mM) 4μL, Mg2+(25mM) 4μL, 프라이머(10pM) 각 2μL, Ex Taq(5U/μL) 0.25μL, 총 부피 50μL.
상기 PCR 증폭은 하기의 방식으로 수행된다. 94℃에서 5min 동안 초기 변성, 94℃에서 30s 동안 변성, 52℃에서 30s 동안 어닐링, 72℃에서 90s 동안 연장(30개 순환), 72℃에서 10min 동안 최종 연장.
상기 DNA 단편(NCgl2176A528C)은 YP97158 NCgl2176 유전자 코딩 영역의 528번째 아데닌(A)이 시토신(C)으로 변화되도록 하고, 최종적으로 코딩된 단백질 176번째 아미노산이 라이신(K)에서 아스파라긴(N)으로 변화되도록 한다.
pK18mobsacB 플라스미드(Addgene에서 구매)를 Xba I로 효소 제한한 후, 아가로스 겔 전기 영동으로 NCgl2176A528C 및 선형화된 pK18mobsacB 플라스미드를 분리 및 정제하고, NEBuider 재조합 시스템을 통해 조립하여, 벡터 pK18-NCgl2176A528C를 획득하며, 상기 플라스미드는 카나마이신 내성 마커를 포함한다. 벡터 pK18-NCgl2176A528C는 시퀀싱 회사에 전송하여 시퀀싱하고, 정확한 점 돌연변이(A-C)를 포함하는 벡터 pK18-NCgl2176A528C를 보존한다.
실시예 2 점 돌연변이된 NCgl2176A528C를 포함하는 조작 균주의 구축
구축 방법: 대립 형질 치환을 위한 플라스미드 pK18-NCgl2176A528C를 전기 천공법을 통해 L-라이신 생산 균주 YP97158로 형질 전환시키고(구축 방법은 WO2014121669A1 참조 가능; 상기 균주 염색체에 야생형의 NCgl2176 유전자 코딩 영역이 보존됨을 시퀀싱하여 확인함), 배양하여 얻은 단일 콜로니는 각각 프라이머 P1 및 일반 프라이머 M13R을 통해 감정되어, 크기가 약 1559bp인 밴드형의 균주를 증폭하여 양성 균주로 할 수 있다. 양성 균주는 15% 자당을 포함하는 배지에서 배양되고, 배양하여 얻은 단일 콜로니는 각각 카나마이신 포함 및 카나마이신 불포함 배지에서 배양되며, 카나마이신 불포함 배지에서 성장하고, 카나마이신 포함 배지에서 성장하지 않은 균주를 하기의 프라이머(상하이 invitrogen회사에서 합성)를 사용하여 PCR로 감정한다.
Figure pct00018
상기 PCR 증폭 산물은 고온 변성, ice bath를 거친 후 sscp 전기 영동(플라스미드 pK18-NCgl2176A528C 증폭 단편을 양성 대조군으로 하고, YP97158 증폭 단편을 음성 대조군으로 하며, 물을 블랭크 대조군으로 함)을 수행하며, 단편 구조가 상이하므로, 전기 영동 위치가 상이하고, 따라서 단편 전기 영동 위치와 음성 대조군 단편 위치가 일치하지 않고 양성 대조군 단편 위치와 일치하는 균주는 대립 유전자 치환이 성공적인 균주이다. 프라이머 P5 및 P6으로 PCR 증폭을 통해 대립 유전자 치환을 성공한 균주의 표적 단편을 증폭시키고, PMD19-T 벡터 시퀀싱에 연결되며, 서열 대조를 통해 염기 서열에 돌연변이가 발생한 서열에 균주의 대립 유전자 치환 성공을 검증하여, YPL-4-011로 명명한다.
실시예 3 게놈에서 NCgl2176 또는 NCgl2176A528C 유전자를 과발현하는 조작 균주의 구축
NCBI에서 공개한 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 서열에 따라, 상류 및 하류 상동 암 단편 및 NCgl2176 또는 NCgl 2176A528C 유전자 코딩 영역 및 프로모터 영역 서열을 증폭하는 세 쌍의 프라이머를 디자인 및 합성하여, 상동 재조합의 방식으로 균주 YP97158에 NCgl2176 또는 NCgl 2176A528C 유전자를 인입한다.
프라이머는 하기와 같이 디자인된다(상하이 invitrogen회사에서 합성).
Figure pct00019
구축 방법: 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 또는 YPL-4-011을 주형으로 하고, 각각 프라이머 P7/P8, P9/P10, P11/P12로 PCR 증폭을 수행하여, 상류 상동 암 단편 약 720bp을 획득하며, NCgl2176 유전자 및 그 프로모터 단편은 약 1092bp이고, NCgl2176A528C 유전자 및 그 프로모터 단편은 약 1092bp이며, 하류 상동 암 단편은 약 653bp이다. 다시 P7/P12을 프라이머로 하여, 증폭된 3개의 단편(상류 상동 암 단편, NCgl2176 유전자 및 그 프로모터 단편, 하류 상동 암 단편; 또는, 상류 상동 암 단편, NCgl2176A528C 유전자 및 그 프로모터 단편, 하류 상동 암 단편)을 주형으로 혼합하여 증폭하여, 통합된 상동 암 단편을 획득한다.
PCR 반응 종료 후, 증폭된 산물에 대해 전기 영동 회수를 수행하고, 칼럼형 DNA 겔을 사용하여 키트(TIANGEN)를 회수하여 필요한 약 2504bp의 DNA 단편을 회수하며, NEBuider 재조합 시스템을 사용하여 Xba I제한 효소를 거쳐 회수된 셔틀 플라스미드 PK18mobsacB와 결찰하여, 통합된 플라스미드 PK18mobsacB-NCgl2176 또는 PK18mobsacB-NCgl2176A528C를 각각 획득하고, 플라스미드는 카나마이신 내성 마커를 포함하고, 카나마이신 스크리닝을 통해 플라스미드가 게놈에 통합된 재조합체를 얻을 수 있다.
PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각 2.5mM) 4μL, Mg2+(25mM) 4μL, 프라이머(10pM) 각 2μL, Ex Taq(5U/μL) 0.25μL, 충 부피 50μL.
상기 PCR 증폭은 하기의 방식으로 수행된다. 94℃에서 5min 동안 초기 변성, 94℃에서 30s 동안 변성, 52℃에서 30s 동안 어닐링, 72℃에서 120s 동안 연장(30개 순환), 72℃에서 10min 동안 최종 연장.
2개의 통합된 플라스미드를 각각 L-라이신 생산 균주 YP97158에 전기 형질 전환시키고, 배양하여 얻은 단일 콜로니를 P13/P14 프라이머를 통해 PCR 감정하며, PCR에 의해 증폭된 약 1609bp 크기의 단편을 포함하는 균주를 양성 균주로 하고, 증폭된 단편이 없는 균주를 원래 균주로 한다. 양성 균주는 15% 자당 스크리닝을 거친 후 각각 카나마이신 포함 및 카나마이신 불포함 배지에서 배양되고, 카나마이신 불포함 배지에서 성장하고, 카나마이신 포함 배지에서 성장하지 않은 균주에 대해 P15/P16 프라이머를 사용하여 PCR 감정을 수행하며, 크기가 약 1123bp인 균을 증폭하여 NCgl2176 또는 NCgl2176A528C 유전자를 YP97158 게놈의 균주에 통합하고, 이를 각각 YPL-4-012(점 돌연변이 불포함) 및 YPL-4-013(점 돌연변이 포함)으로 명명한다.
Figure pct00020
실시예 4 플라스미드에서 NCgl2176 또는 NCgl2176A528C 유전자를 과발현하는 조작 균주를 구축
NCBI에서 공개한 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 서열에 따라, NCgl2176 또는 NCgl2176A528C 유전자 코딩 영역 및 프로모터 영역 서열을 증폭하는 한 쌍의 프라이머를 디자인 및 합성하고, 프라이머는 하기와 같이 디자인된다(상하이 invitrogen회사에서 합성).
Figure pct00021
구축 방법: 각각 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 또는 YPL-4-011을 주형으로 하여, 프라이머 P17/P18로 PCR 증폭을 수행하여, NCgl2176 또는 NCgl2176A528C 유전자 및 그 프로모터 단편 1140bp을 획득하며, 증폭된 산물에 대해 전기 영동 회수를 수행하여, 컬럼형 DNA 겔 회수 키트를 사용하여 필요한 1140bp의 DNA 단편을 회수하고, NEBuider 재조합 시스템을 사용하여 EcoR I 효소 제한을 거쳐 회수된 셔틀 플라스미드 pXMJ19에 결찰됨으로써, 과발현 플라스미드 pXMJ19-NCgl2176 또는 pXMJ19-NCgl2176A528C를 획득한다. 플라스미드에 클로로마이세틴 내성 마커가 포함되고, 클로로마이세틴 스크리닝을 통해 플라스미드를 균주 내로 형질 전환시킬 수 있다.
PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각 2.5mM)4μL, Mg2+(25mM) 4μL, 프라이머(10pM) 각 2μL, Ex Taq(5U/μL) 0.25μL, 충 부피 50μL.
상기 PCR 증폭은 하기의 방식으로 수행된다. 94℃에서 5min 동안 초기 변성, 94℃에서 30s 동안 변성, 52℃에서 30s 동안 어닐링, 72℃에서 90s 동안 연장(30개 순환), 72℃에서 10min 동안 최종 연장.
플라스미드를 L-라이신 생산 균주 YP97158에 전기 형질 전환하고, 배양하여 얻은 단일 콜로니를 M13R(-48) 및 P18 프라이머를 통해 PCR 감정을 수행하며, PCR에 의해 증폭된 약 1147bp 크기의 단편을 포함하는 균주는 형질 전환된 균주로서, 각각 YPL-4-014(점 돌연변이 불포함) 및 YPL-4-015(점 돌연변이 포함)로 명명한다.
실시예 5 게놈에 NCgl2176 유전자가 결실된 조작 균주의 구축
NCBI에서 공개한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 서열에 따라, NCgl2176 유전자 코딩 영역 양단의 단편을 증폭하는 두 쌍의 프라이머를 합성하여, 상류 및 하류 상동 암 단편으로 사용한다. 프라이머는 하기와 같이 디자인된다(상하이 Invitrogen 회사에서 합성).
Figure pct00022
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 주형으로 하고, 각각 프라이머 P19/P20 및 P21/P22로 PCR 증폭을 수행하여, 상류 상동 암 단편 852bp 및 하류 상동 암 단편 787bp을 획득하며; 다시 프라이머 P19/P22로 중첩 PCR을 수행하여 전체 상동 암 단편 1639를 얻는다. PCR 반응 종료 후, 증폭된 산물에 대해 전기 영동 회수를 수행하고, 컬럼형 DNA 겔 회수 키트를 사용하여 필요한 1639bp의 DNA 단편을 회수하며, NEBuider 재조합 시스템을 통해 Xba I 효소 제한을 거쳐 회수된 셔틀 플라스미드 pk18mobsacB에 플라스미드에 결찰되어, 넉아웃 플라스미드를 획득한다. 상기 플라스미드에는 카나마이신 내성 마커가 포함된다.
넉아웃 플라스미드를 라이신 생산 균주 YP97158에 전기 형질 전환하고, 배양하여 얻은 단일 콜로니에 대해 각각 하기의 프라이머(상하이 Invitrogen 회사에서 합성)를 통해 PCR 감정을 수행한다.
Figure pct00023
상기 PCR로 크기가 1521bp 및 2556bp인 밴드형 균주를 증폭하여 양성 균주로 하고, 2556bp 밴드형 균주만 증폭된 것은 원래 균주이다. 양성 균주는 15% 자당 배지에서 스크리닝을 거친 후 각각 카나마이신 포함 및 카나마이신 불포함 배지에서 배양되고, 카나마이신 불포함 배지에서 성장하고, 카나마이신 포함 배지에서 성장하지 않은 균주에 대해 P23/P24 프라이머를 사용하여 PCR 감정을 수행하며, 크기가 1521bp로 증폭되는 밴드형 균주는 NCgl2176 유전자 코딩 영역이 넉아웃된 유전자 조작 균주이고, 이를 YPL-4-016으로 명명한다.
실시예 6 L-라이신 발효 실험
실시예 2 내지 실시예 5에서 구축된 균주 및 원시 균주 YP97158을 BLBIO-5GC-4-H 모델 발효기(상하이 바이룬 바이오테크놀로지 유한회사에서 구매)에 넣고 표 1에 시사된 배지 및 표 2에 시사된 제어 공정으로 발효 실험을 수행한다. 각 균주는 3번 반복하고 결과는 표 3과 같다.
표3 L-라이신 발효 실험 결과
Figure pct00024
결과는 표 3과 같은 바, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 NCgl2176유전자를 과발현하거나, 또는 NCgl2176 유전자 코딩 영역에 대해 점 돌연변이를 수행하고 NCgl2176A528C 및 과발현하는 것은, L-라이신 생산량의 향상에 유리하여, 유전자를 약화 또는 넉아웃하여, 라이신의 축적에 유리하다.
실시예 7 점 돌연변이된 dapB 유전자 프로모터 영역을 포함하는 형질 전환 벡터 pK18-PdapB(C(-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)의 구축
NCBI에서 공개한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 서열에 따라, dapB 유전자 프로모터 영역 서열을 증폭하는 두 쌍의 프라이머를 디자인 및 합성하여, 대립 형질 치환의 방식으로 균주 YP97158 배경 중의 dapB 유전자 프로모터 영역(SEQ ID NO:29)에 점 돌연변이를 인입시켜, dapB 유전자 프로모터 영역 뉴클레오티드 서열의 -49bp번 C를 A로 변환시키고, -51bp번 G를 T로 변환시키며, -54--58bp CTGCA를 GGTGT(SEQ ID NO:30)로 변환시킨다.
프라이머는 하기와 같이 디자인된다(상하이 invitrogen회사에서 합성).
Figure pct00025
구축 방법: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 주형으로 하여, 각각 프라이머 P1'과 P2', P3'과 P4'로 PCR 증폭을 수행한다.
PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각 2.5mM) 4μL, Mg2+(25mM) 4μL, 프라이머(10pM) 각 2μL, Ex Taq(5U/μL) 0.25μL, 충 부피 50μL.
상기 PCR 증폭은 하기의 방식으로 수행된다. 94℃에서 5min 동안 초기 변성, 94℃에서 30s 동안 변성, 52℃에서 30s 동안 어닐링, 72℃에서 60s 동안 연장, 30개 순환, 72℃에서 10min 동안 최종 연장.
점 돌연변이를 포함하는, 길이가 각각 665bp 및 644bp인 두 개의 DNA 단편(dapB Up 및 dapB Down 단편)을 획득한다. 상기 두 개의 DNA 단편은 아가로스 겔 전기 영동을 거쳐 분리 정제된 후, 정제된 두 개의 DNA 단편을 주형으로, P1' 및 P4' 프라이머로, Overlap PCR을 통해 길이가 약 1279bp인 단편(Up-Down 단편)을 증폭한다.
Overlap PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각 2.5mM) 4μL, Mg2+(25mM) 4μL, 프라이머(10pM) 각 2μL, Ex Taq(5U/μL) 0.25μL, 충 부피 50μL.
상기 Overlap PCR 증폭은 하기의 방식으로 수행된다. 94℃에서 5min 동안 초기 변성, 94℃에서 30s 동안 변성, 52℃에서 30s 동안 어닐링, 72℃에서 90s 동안 연장, 30개 순환, 72℃에서 10min 동안 최종 연장.
상기 Up-Down 단편은 아가로스 겔 전기 영동을 거쳐 분리 정제되고, 상기 단편은 dapB 유전자 프로모터 영역 및 그 상류와 하류 서열을 포함하며, 단편의 양단은 각각 EcoR I 및 Sph I 효소 제한 위치를 포함한다. 이 DNA 단편은 YP97158 dapB 유전자 프로모터 영역의 -49bp번의 C가 A로 변형되도록 하고, -51bp번의 G가 T로 변형되도록 하며, -54--58bp CTGCA가 GGTGT로 변형되도록 한다.
단편을 이중 제한 효소(EcoR I/Sph I)로 정제한 후, 마찬가지로 이중 제한 효소(EcoR I/Sph I)된 후의 셔틀 플라스미드 pK18mobsacB(Addgene회사에서 구매)에 결찰시켜, 대립 형질 치환을 위한 플라스미드 pK18-PdapB(C(-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)를 획득하고, 상기 플라스미드는 카나마이신 내성 마커를 포함한다. 벡터 pK18-PdapB(C(-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)를 시퀀싱 회사에 전송하여 시퀀싱하고, 정확한 점 돌연변이를 포함한 벡터 pK18-PdapB(C(-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)를 보존한다.
실시예 8 점 돌연변이를 포함한 pK18-PdapB(C(-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54-58)GGTGT)의 조작 균주의 구축
대립 형질 치환을 위한 플라스미드 pK18-PdapB(C(-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)를 L-라이신 생산 균주 YP97158에 전기 형질 전환시키고(시퀀싱을 거쳐 상기 균주 염색체에 야생형의 dapB 유전자 프로모터가 보존됨을 확인), 배양하여 얻은 단일 콜로니에 대해 각각 프라이머 P1' 및 일반 프라이머 M13F을 통해 감정하고, 1350bp 크기의 밴드형 균주를 증폭하여 양성 균주로 한다. 양성 균주를 15% 자당을 포함하는 배지에서 배양하고, 배양하여 얻은 단일 콜로니를 각각 카나마이신 포함 및 카나마이신 불포함 배지에서 배양한다.
카나마이신 불포함 배지에서 성장하고, 카나마이신 포함 배지에서 성장하지 않은 균주에 대해 하기의 프라이머(상하이 invitrogen회사에서 합성)를 사용하여 PCR 감정을 수행한다.
Figure pct00026
상기 PCR 증폭 산물은 고온 변성, ice bath를 거친 후 SSCP 전기 영동(플라스미드 pK18-PdapB(C(-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT) 증폭 단편은 양성 대조군으로, YP97158 증폭 단편은 음성 대조군으로, 물을 블랭크 대조군으로 함)을 수행하여, 단편 구조가 상이하므로, 전기 영동 위치가 상이하고, 따라서 단편 전기 영동 위치와 음성 대조군 단편 위치가 일치하지 않고 양성 대조군 단편 위치와 일치하는 균주는 대립 유전자 치환이 성공적인 균주이다. 다시 PCR 증폭을 통해 양성 균주의 표적 단편을 증폭하고, PMD19-T 벡터에 연결하여 시퀀싱하며, 서열 대조를 통해 염기 서열에 돌연변이가 발생한 서열에 균주의 대립 유전자 치환 성공을 검증하여, YPL-4-010으로 명명한다.
실시예 9 L-라이신 발효 실험
실시예 8에서 구축된 균주 YPL-4-010 및 원시 균주 YP97158을 BLBIO-5GC-4-H 모델 발효기(상하이 바이룬 바이오테크놀로지 유한회사에서 구매)에 넣고 표 1에 시사된 배지 및 표 2에 시사된 제어 공정으로 발효 실험을 수행한다. 각 균주는 3번 반복하고 결과는 표4와 같다.
표4 L-라이신 발효 실험 결과
Figure pct00027
주의: 형질 전환율(라이신의 총 질량/포도당의 총 모소량)×100%
결과는 표4와 같은 바, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 dapB 유전자 프로모터에 대해 점 돌연변이 PdapB(C(-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)를 수행하면, L-라이신 생산량의 향상에 유리하다.
상기와 같이, 본 발명의 실시형태를 설명하였다. 그러나, 본 발명은 상기 실시형태에 한정되지 않는다. 본 발명의 구상과 원칙 내에서 이루어진 모든 수정, 균등한 대체, 개선 등은 반드시 전부 본 발명의 보호범위 내에 속한다.
중국 미생물 균종 기탁 관리 위원회 일반 미생물 센터 CGMCC12856 20160816
SEQUENCE LISTING <110> HEILONGJIANG EPPEN BIOTECH CO., LTD. <120> RECOMBINANT STRAIN PRODUCING L-LYSINE AND CONSTRUCTION METHODS THEREFOR AND USE THEREOF <130> <160> 36 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1035 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 atggcatttg cagacattgt gcgcagcgtc gaaaaccgca ccaacgcagc gaccctcaac 60 tggtccatca aaaatggctg gaagcccgaa gtcaccggat tttccgggta cggctccggg 120 cgtcgagtgc gcgtccttgc gcgcgtgctc atgtccaacc ccgaaaattt gcttgtcgac 180 gccccctccc aatcaattac ccaacaagca cagcgcggtt ggcgccagtt cttcaccatc 240 caagtgccca acctgccagt aactgtcacc gttggtggga aaacagttac ctcatccacc 300 aacgacaacg gctacgttga cctcctggtg gaagaccaca accttgaccc cggctggcac 360 accatccaga tccaagccga aggttccacc cccgccgaag cccgcgtcct catcgtggaa 420 aacaccgccc gaatcggact catctccgac atcgacgaca ccatcatggt cacctggctt 480 ccccgagcac tcctcgccgc atggaactcg tgggttttgc acaccaaaac ccgaaaacca 540 gtccccggaa tgaaccgctt ctacgaagaa ctcctcaaag accaccccga cgcacccgtg 600 ttctacctct ccaccggcgc atggaacacc tttgaaaccc tccaagagtt catcaacaaa 660 cacgcactcc ccgacggccc catgctgctc accgactggg gaccaacccc cacaggacta 720 ttccgctcag gtcaagagca caagaaagtc caactgcgca acctgtttat cgaatacccc 780 gacatgaaat ggatcctcgt cggcgacgat ggccaacacg atcccctcat ctacggcgaa 840 gcagtcgaag aacaccccaa ccgcatcgca ggcgttgcaa tccgtgagct ctcccccggc 900 gaacatgtgc tctcccacgg aacaactgcg tcactgtcca ccatcacgac caacgggggc 960 caaggagtcc cagtagttca cggccgcgat ggatatgagt tgctgcagcg ctacgagacg 1020 aagccgttcg cctga 1035 <210> 2 <211> 1035 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 atggcatttg cagacattgt gcgcagcgtc gaaaaccgca ccaacgcagc gaccctcaac 60 tggtccatca aaaatggctg gaagcccgaa gtcaccggat tttccgggta cggctccggg 120 cgtcgagtgc gcgtccttgc gcgcgtgctc atgtccaacc ccgaaaattt gcttgtcgac 180 gccccctccc aatcaattac ccaacaagca cagcgcggtt ggcgccagtt cttcaccatc 240 caagtgccca acctgccagt aactgtcacc gttggtggga aaacagttac ctcatccacc 300 aacgacaacg gctacgttga cctcctggtg gaagaccaca accttgaccc cggctggcac 360 accatccaga tccaagccga aggttccacc cccgccgaag cccgcgtcct catcgtggaa 420 aacaccgccc gaatcggact catctccgac atcgacgaca ccatcatggt cacctggctt 480 ccccgagcac tcctcgccgc atggaactcg tgggttttgc acaccaacac ccgaaaacca 540 gtccccggaa tgaaccgctt ctacgaagaa ctcctcaaag accaccccga cgcacccgtg 600 ttctacctct ccaccggcgc atggaacacc tttgaaaccc tccaagagtt catcaacaaa 660 cacgcactcc ccgacggccc catgctgctc accgactggg gaccaacccc cacaggacta 720 ttccgctcag gtcaagagca caagaaagtc caactgcgca acctgtttat cgaatacccc 780 gacatgaaat ggatcctcgt cggcgacgat ggccaacacg atcccctcat ctacggcgaa 840 gcagtcgaag aacaccccaa ccgcatcgca ggcgttgcaa tccgtgagct ctcccccggc 900 gaacatgtgc tctcccacgg aacaactgcg tcactgtcca ccatcacgac caacgggggc 960 caaggagtcc cagtagttca cggccgcgat ggatatgagt tgctgcagcg ctacgagacg 1020 aagccgttcg cctga 1035 <210> 3 <211> 344 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 3 Met Ala Phe Ala Asp Ile Val Arg Ser Val Glu Asn Arg Thr Asn Ala 1 5 10 15 Ala Thr Leu Asn Trp Ser Ile Lys Asn Gly Trp Lys Pro Glu Val Thr 20 25 30 Gly Phe Ser Gly Tyr Gly Ser Gly Arg Arg Val Arg Val Leu Ala Arg 35 40 45 Val Leu Met Ser Asn Pro Glu Asn Leu Leu Val Asp Ala Pro Ser Gln 50 55 60 Ser Ile Thr Gln Gln Ala Gln Arg Gly Trp Arg Gln Phe Phe Thr Ile 65 70 75 80 Gln Val Pro Asn Leu Pro Val Thr Val Thr Val Gly Gly Lys Thr Val 85 90 95 Thr Ser Ser Thr Asn Asp Asn Gly Tyr Val Asp Leu Leu Val Glu Asp 100 105 110 His Asn Leu Asp Pro Gly Trp His Thr Ile Gln Ile Gln Ala Glu Gly 115 120 125 Ser Thr Pro Ala Glu Ala Arg Val Leu Ile Val Glu Asn Thr Ala Arg 130 135 140 Ile Gly Leu Ile Ser Asp Ile Asp Asp Thr Ile Met Val Thr Trp Leu 145 150 155 160 Pro Arg Ala Leu Leu Ala Ala Trp Asn Ser Trp Val Leu His Thr Lys 165 170 175 Thr Arg Lys Pro Val Pro Gly Met Asn Arg Phe Tyr Glu Glu Leu Leu 180 185 190 Lys Asp His Pro Asp Ala Pro Val Phe Tyr Leu Ser Thr Gly Ala Trp 195 200 205 Asn Thr Phe Glu Thr Leu Gln Glu Phe Ile Asn Lys His Ala Leu Pro 210 215 220 Asp Gly Pro Met Leu Leu Thr Asp Trp Gly Pro Thr Pro Thr Gly Leu 225 230 235 240 Phe Arg Ser Gly Gln Glu His Lys Lys Val Gln Leu Arg Asn Leu Phe 245 250 255 Ile Glu Tyr Pro Asp Met Lys Trp Ile Leu Val Gly Asp Asp Gly Gln 260 265 270 His Asp Pro Leu Ile Tyr Gly Glu Ala Val Glu Glu His Pro Asn Arg 275 280 285 Ile Ala Gly Val Ala Ile Arg Glu Leu Ser Pro Gly Glu His Val Leu 290 295 300 Ser His Gly Thr Thr Ala Ser Leu Ser Thr Ile Thr Thr Asn Gly Gly 305 310 315 320 Gln Gly Val Pro Val Val His Gly Arg Asp Gly Tyr Glu Leu Leu Gln 325 330 335 Arg Tyr Glu Thr Lys Pro Phe Ala 340 <210> 4 <211> 344 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 4 Met Ala Phe Ala Asp Ile Val Arg Ser Val Glu Asn Arg Thr Asn Ala 1 5 10 15 Ala Thr Leu Asn Trp Ser Ile Lys Asn Gly Trp Lys Pro Glu Val Thr 20 25 30 Gly Phe Ser Gly Tyr Gly Ser Gly Arg Arg Val Arg Val Leu Ala Arg 35 40 45 Val Leu Met Ser Asn Pro Glu Asn Leu Leu Val Asp Ala Pro Ser Gln 50 55 60 Ser Ile Thr Gln Gln Ala Gln Arg Gly Trp Arg Gln Phe Phe Thr Ile 65 70 75 80 Gln Val Pro Asn Leu Pro Val Thr Val Thr Val Gly Gly Lys Thr Val 85 90 95 Thr Ser Ser Thr Asn Asp Asn Gly Tyr Val Asp Leu Leu Val Glu Asp 100 105 110 His Asn Leu Asp Pro Gly Trp His Thr Ile Gln Ile Gln Ala Glu Gly 115 120 125 Ser Thr Pro Ala Glu Ala Arg Val Leu Ile Val Glu Asn Thr Ala Arg 130 135 140 Ile Gly Leu Ile Ser Asp Ile Asp Asp Thr Ile Met Val Thr Trp Leu 145 150 155 160 Pro Arg Ala Leu Leu Ala Ala Trp Asn Ser Trp Val Leu His Thr Asn 165 170 175 Thr Arg Lys Pro Val Pro Gly Met Asn Arg Phe Tyr Glu Glu Leu Leu 180 185 190 Lys Asp His Pro Asp Ala Pro Val Phe Tyr Leu Ser Thr Gly Ala Trp 195 200 205 Asn Thr Phe Glu Thr Leu Gln Glu Phe Ile Asn Lys His Ala Leu Pro 210 215 220 Asp Gly Pro Met Leu Leu Thr Asp Trp Gly Pro Thr Pro Thr Gly Leu 225 230 235 240 Phe Arg Ser Gly Gln Glu His Lys Lys Val Gln Leu Arg Asn Leu Phe 245 250 255 Ile Glu Tyr Pro Asp Met Lys Trp Ile Leu Val Gly Asp Asp Gly Gln 260 265 270 His Asp Pro Leu Ile Tyr Gly Glu Ala Val Glu Glu His Pro Asn Arg 275 280 285 Ile Ala Gly Val Ala Ile Arg Glu Leu Ser Pro Gly Glu His Val Leu 290 295 300 Ser His Gly Thr Thr Ala Ser Leu Ser Thr Ile Thr Thr Asn Gly Gly 305 310 315 320 Gln Gly Val Pro Val Val His Gly Arg Asp Gly Tyr Glu Leu Leu Gln 325 330 335 Arg Tyr Glu Thr Lys Pro Phe Ala 340 <210> 5 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 5 cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagcggc gaccgcatgg acaccg 56 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 6 ccggggactg gttttcgggt gttggtgtgc 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 7 gcacaccaac acccgaaaac cagtccccgg 30 <210> 8 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 8 cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtaccccg aggtctctca gaatcggt 58 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 9 gaaaacaccg cccgaatc 18 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 10 ggagtgcgtg tttgttgatg 20 <210> 11 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 11 cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagaatg cgttctggac tgagg 55 <210> 12 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 12 aacaccattg tccctgtttt gggcgaaatt ttcccggtgc accgagaaca gatg 54 <210> 13 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 13 cgggaaaatt tcgcccaaaa cagggacaat ggtgttatgg catttgcaga cattgtgcgc 60 <210> 14 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 14 cttgatttaa ttgcgccatc tcaggcgaac ggcttcgtct cgtag 45 <210> 15 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 15 ctacgagacg aagccgttcg cctgagatgg cgcaattaaa tcaag 45 <210> 16 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 16 cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccgc tatgacacct tcaacggatc 60 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 17 tccaaggaag atacacgcc 19 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 18 cctgagcgga atagtcctgt g 21 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 19 acgcacccgt gttctacct 19 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 20 cgttggaatc ttgcgttg 18 <210> 21 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 21 gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atcccccggg aaaatttcgc ccaaaacag 59 <210> 22 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 22 atcaggctga aaatcttctc tcatccgcca aaactcaggc gaacggcttc gtctcgtag 59 <210> 23 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 23 cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagtcaa agagggcgag ataat 55 <210> 24 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 24 gttcatgaga cacccagtag gacgacctac agaatactag tcagtg 46 <210> 25 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 25 cactgactag tattctgtag gtcgtcctac tgggtgtctc atgaac 46 <210> 26 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 26 cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccac cgcacgatgg ttcact 56 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 27 tcaaagaggg cgagataat 19 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 28 accgcacgat ggttcact 18 <210> 29 <211> 192 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 29 cttaagtctc atatttcaaa catagttcca cctgtgtgat taatccctag aacggaacaa 60 actgatgaac aatcgttaac aacacagacc aaaacggtca gttaggtatg gatatcagca 120 ccttctgaac gggtacgtct agactggtgg gcgtttgaaa aactcttcgc cccacgaaaa 180 tgaaggagca ta 192 <210> 30 <211> 192 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 30 cttaagtctc atatttcaaa catagttcca cctgtgtgat taatccctag aacggaacaa 60 actgatgaac aatcgttaac aacacagacc aaaacggtca gttaggtatg gatatcagca 120 ccttctgaac gggttgtggt ataatggtgg gcgtttgaaa aactcttcgc cccacgaaaa 180 tgaaggagca ta 192 <210> 31 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 31 ccggaattca ccatgccgga catgcggac 29 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 32 ccttctgaac gggttgtggt ataatggtgg 30 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 33 ccaccattat accacaaccc gttcagaagg 30 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 34 acatgcatgc gaatattgac gttgaggaag 30 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 35 agatcgtcgg actcattgac 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 36 caaacatagt tccacctgtg 20

Claims (16)

  1. 코리네박테리움속에 속하는 L-라이신 생성 미생물에 있어서,
    SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 개선되거나, 및/또는, SEQ ID NO:29로 표시되는 프로모터 영역의 -49번째, -51번째, -54번째 내지 -58번째 염기에 돌연변이가 발생하고;
    바람직하게는, 상기 개선된 발현은 SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 증진되거나, 또는 SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 점 돌연변이를 갖거나, 또는 SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 점 돌연변이를 갖고 발현이 증진되는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움속에 속하는 L-라이신 생성 미생물.
  2. 제1항에 있어서,
    SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 점 돌연변이는 SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열의 176번째 라이신이 상이한 아미노산으로 치환되도록 하고; 바람직하게는 176번째 라이신이 아스파라긴으로 치환되도록 하는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움속에 속하는 L-라이신 생성 미생물.
  3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움속에 속하는 L-라이신 생성 미생물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 점 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 528번째 염기의 돌연변이에 의해 형성되고;
    바람직하게는, 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 528번째 염기의 아데닌(A)에서 시토신(C)으로의 돌연변이를 포함하며;
    바람직하게는, 상기 점 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움속에 속하는 L-라이신 생성 미생물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    SEQ ID NO:29로 표시되는 프로모터 영역의 -49번째 뉴클레오티드는 시토신(C)에서 아데닌(A)으로 돌연변이되고, -51번째 뉴클레오티드는 구아닌(G)에서 티민(T)으로 돌연변이되며, -54번째 내지 -58번째 뉴클레오티드는 CTGCA에서 GGTGT로 돌연변이되고;
    바람직하게는, 상기 프로모터 뉴클레오티드 서열은,
    (a) SEQ ID NO:30으로 표시되는 뉴클레오티드 서열이거나; 또는,
    (b) SEQ ID NO:30으로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 또는 98% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열이며, (a)에 따른 프로모터의 강화된 활성을 유지하고, -49번째 뉴클레오티드는 아데닌(A)으로 유지되며, -51번째 뉴클레오티드는 티민(T)으로 유지되고, -54번째 내지 -58번째 뉴클레오티드는 GGTGT로 유지되는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움속에 속하는 L-라이신 생성 미생물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)이고; 바람직하게는 YP97158인 것을 특징으로 하는 코리네박테리움속에 속하는 L-라이신 생성 미생물.
  7. 폴리뉴클레오티드 서열에 있어서,
    SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 176번째 라이신은 상이한 아미노산으로 치환되며; 바람직하게는 176번째 라이신은 아스파라긴으로 치환되고;
    바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:4로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며;
    바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 528번째 염기의 돌연변이에 의해 형성되고; 바람직하게는 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 528번째 염기의 아데닌(A)에서 시토신(C)으로의 돌연변이이며;
    바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  8. SEQ ID NO:4로 표시되는 것을 특징으로 하는 아미노산 서열.
  9. 제7항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  10. 제7항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
  11. 프로모터 뉴클레오티드 서열에 있어서,
    SEQ ID NO:29로 표시되는 프로모터 영역의 -49번째, -51번째, -54번째 내지 -58번째 염기에 돌연변이가 발생하여 형성된 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
    바람직하게는, SEQ ID NO:29로 표시되는 프로모터 영역의 -49번째 뉴클레오티드는 시토신(C)에서 아데닌(A)으로 돌연변이되고, -51번째 뉴클레오티드는 구아닌(G)에서 티민(T)으로 돌연변이되며, -54번째 내지 -58번째 뉴클레오티드는 CTGCA에서 GGTGT로 돌연변이되는 것을 특징으로 하는 프로모터 뉴클레오티드 서열.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 프로모터 뉴클레오티드 서열은,
    (a) SEQ ID NO:30으로 표시되는 뉴클레오티드 서열이거나; 또는,
    (b) SEQ ID NO:30으로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 또는 98% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열이고, (a)에 따른 프로모터의 강화된 활성을 유지하고, -49번째 뉴클레오티드는 아데닌(A)으로 유지되며, -51번째 뉴클레오티드는 티민(T)으로 유지되고, -54번째 내지 -58번째 뉴클레오티드는 GGTGT로 유지되는 것을 특징으로 하는 프로모터 뉴클레오티드 서열.
  13. 프로모터의 발현 카세트에 있어서,
    상기 발현 카세트는 제11항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 프로모터 뉴클레오티드 서열, 및 상기 프로모터에 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 상기 코딩 서열은 dapB 유전자의 코딩 서열인 것을 특징으로 하는 프로모터의 발현 카세트.
  14. 재조합 벡터에 있어서,
    제11항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 프로모터 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 상기 프로모터 뉴클레오티드 서열은 pK18mobsacB 플라스미드와 연결되어 상기 재조합 벡터를 구축하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  15. 재조합 균주에 있어서,
    제11항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 프로모터 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 제13항에 따른 발현 카세트를 포함하거나, 제14항에 따른 재조합 벡터를 포함하고;
    바람직하게는, 상기 재조합 균주의 숙주 균주는 YP97158인 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
  16. L-라이신의 생산 방법에 있어서,
    제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 미생물 또는 제10항 또는 제15항에 따른 재조합 균주를 배양하고, 상기 배양물로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 L-라이신의 생산 방법.
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