CN112501097B - 一种改造yh66_06385基因的重组菌株及其构建方法与产l-异亮氨酸的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种对棒杆菌中YH66_06385基因编码序列引入点突变或改进其表达的方法，所述方法可以使带有所述突变的菌株提高L‑异亮氨酸的发酵产量。所述点突变是使YH66_06385基因序列第584位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)，使编码的相应氨基酸序列第195位精氨酸被谷氨酰胺所取代。

Description

一种改造YH66_06385基因的重组菌株及其构建方法与产L-异亮氨酸的应用
技术领域
本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种产L-异亮氨酸的重组菌株及其构建方法与应用。
背景技术
L-异亮氨酸对于人类和动物而言是必需氨基酸，主要在医药方面用作营养剂。
异亮氨酸具有2个不对称碳原子，所以在工业上用化学合成方法廉价地单独生产L型异亮氨酸比较困难。已经开发了将α-氨基丁酸和α-氧代丁酸等L-异亮氨酸生物合成的前体作为原料，通过生物转化制造L-异亮氨酸的方法。但是这些方法的原料昂贵，并不是工业上能廉价地制造L-异亮氨酸的有效方法。
使用廉价的碳源及氮源，用直接发酵法制造L-异亮氨酸的方法有多种，例如：以对于L-异亮氨酸的拮抗剂具有抗药性的棒状杆菌属、沙雷式菌属或埃希氏杆菌属的变异株作为L-异亮氨酸生产株的方法；以L-异亮氨酸生物合成的关键酶(如苏氨酸脱氨酶或其乙酰羟基酸合酶等)，通过重组DNA技术而增强的埃希氏杆菌属或棒状杆菌属的微生物作为L-异亮氨酸生产株的方法。
对发酵法生产L-氨基酸的改进可以涉及发酵技术如搅拌和供应氧气；或涉及营养培养基的组成，例如发酵过程中的糖浓度；或涉及将发酵液加工成合适的产品形式，例如通过干燥和造粒发酵液或离子交换色谱；或可以涉及相关微生物本身的固有性能性质。
用于改善这些微生物的性能性质的方法包括诱变、突变体的选择和筛选。以这种方式获得的菌株对抗代谢物具有抗性或对于具有调节重要性的代谢物是营养缺陷型并产生L-氨基酸等。
虽然已有较多方法可以提高L-异亮氨酸的生产能力，但是为了满足日益增加的需求，仍需要发展生产L-异亮氨酸的方法。
发明内容
本发明的目的是开发用于改善细菌的L-异亮氨酸生产能力的新技术，从而提供一种有效生产L-异亮氨酸的方法。
为了实现上述目的，本发明的发明人通过研究发现，对细菌中的基因YH66_06385或其同源基因，可以通过修饰该基因或改善其表达，能够改善细菌的L-异亮氨酸生产能力。基于这些发现，完成了本发明。
本发明提供了生成L-异亮氨酸的细菌，其中编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其同源序列的多核苷酸的表达改善。本发明还提供了通过使用所述微生物生产L-异亮氨酸的方法。
本发明的第一个方面提供了生成L-异亮氨酸的细菌，其具有编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其同源序列的多核苷酸的改善的表达。根据本发明，所述改善的表达是所述多核苷酸表达增强，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其同源序列的多核苷酸具有点突变，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其同源序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的。
所述SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其同源序列是基因YH66_06385或其同源基因编码的蛋白。
所述细菌与未修饰菌株相比具有增强的L-异亮氨酸生产能力。
在本发明中，术语“具有L-异亮氨酸生产能力的细菌”是指具有在培养基和/或细菌的细胞中以下述程度产生并累积目的L-异亮氨酸的能力，使得当细菌在培养基中培养时可以收集L-异亮氨酸的细菌。具有L-异亮氨酸生产能力的细菌可以是能够以比未修饰菌株可获得的量更大的量在培养基和/或细菌的细胞中积累目的L-异亮氨酸的细菌。
术语“未修饰菌株”是指尚未以使得具有特定特征的方式进行修饰的对照菌株。即，未修饰菌株的实例包括野生型菌株和亲本菌株。
具有L-异亮氨酸生产能力的细菌可以是能够在培养基中以优选1.5g/L以上，更优选2.0g/L以上的量积累目标L-异亮氨酸的细菌。
在本发明中，除非另有说明，术语“L-异亮氨酸”是指游离形式的L-异亮氨酸、其盐或其混合物。
所述多核苷酸可以编码与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有约90％或更高、约92％或更高、约95％或更高、约97％或更高、约98％或更高、或约99％或更高的序列同源性的氨基酸序列。如本文中使用的，术语“同源性”指两种多核苷酸或两种多肽模块之间的百分比同一性。可以通过使用本领域中已知的方法测定一种模块和另一种模块之间的序列同源性。例如，可以通过BLAST算法测定此类序列同源性。
可以如下增强多核苷酸的表达：通过取代或突变表达调节序列、对多核苷酸序列引入突变、通过经由染色体插入或载体导入的多核苷酸拷贝数的增加、或其组合等。
可以修饰多核苷酸的表达调节序列。表达调节序列控制与其可操作连接的多核苷酸的表达，并且例如可以包括启动子、终止子、增强子、沉默子等。多核苷酸可以具有起始密码子的变化。可以将多核苷酸掺入染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。在本文，特定的位点可以包括例如转座子位点或基因间位点。另外，可以将多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。
在本发明的一种实施方式中，通过将多核苷酸或者具有点突变的多核苷酸掺入微生物染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。
在本发明的一种实施方式中，通过将带有启动子序列的多核苷酸或者带有启动子序列的具有点突变的多核苷酸掺入微生物染色体的特定位点中，从而过表达所述核酸序列。
在本发明的一种实施方式中，将多核苷酸或者具有点突变的多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。
在本发明的一种实施方式中，将带有启动子序列的多核苷酸或者带有启动子序列的具有点突变的多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而过表达所述氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述多核苷酸可以包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中，编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的具有点突变，使得SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第195位精氨酸被不同的氨基酸所取代。
根据本发明，优选第195位精氨酸被谷氨酰胺所取代。
根据本发明，SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，其中第195位精氨酸被谷氨酰胺所取代后的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在本发明的一个实施方式中，所述具有点突变的多核苷酸序列是由SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第584位碱基发生突变而形成的。
根据本发明，所述突变包括SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第584位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)。
在本发明的一个实施方式中，所述具有点突变的多核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列。
如本文中使用的，术语“可操作连接”指调节序列和多核苷酸序列之间的功能性连接，由此调节序列控制多核苷酸序列的转录和/或翻译。调节序列可以是能提高多核苷酸的表达水平的强启动子。调节序列可以是源自属于棒杆菌属的微生物的启动子或者可以是源自其它微生物的启动子。例如，启动子可以是trc启动子、gap启动子、tac启动子、T7启动子、lac启动子、trp启动子、araBAD启动子或cj7启动子。
在本发明的一个具体实施方式中，所述启动子是编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸(YH66_06385基因)的启动子。
如本文中使用的，术语“载体”指含有基因的调节序列和基因序列并且配置为在合适的宿主细胞中表达靶基因的多核苷酸构建体。或者，载体又可以指多核苷酸构建体，其含有可用于同源重组的序列，从而由于对宿主细胞导入的载体，可以改变宿主细胞的基因组中的内源基因的调节序列，或者可以将可以表达的靶基因插入宿主的基因组的特定位点中。在这点上，本发明中使用的载体可以进一步包含选择标志物以确定载体对宿主细胞的导入或者载体对宿主细胞的染色体的插入。选择标志物可以包含赋予可选择表型，诸如药物抗性、营养缺陷型、针对细胞毒剂的抗性、或表面蛋白的表达的标志物。在用此类选择剂处理的环境中，由于仅表达选择标志物的细胞可以存活或者显示不同表型性状，可以选择经转化的细胞。
在本发明的一些具体实施方式中，使用的载体是pK18mobsacB质粒，pXMJ19质粒。
如本文中使用的，术语“转化”指将多核苷酸导入宿主细胞中，从而多核苷酸可以作为基因组外元件或者以插入宿主细胞的基因组中能复制。转化本发明中使用的载体的方法可以包括将核酸导入细胞的方法。另外，如相关技术中公开的，可以根据宿主细胞实施电脉冲方法。
根据本发明，所述细菌可以是属于棒杆菌属的微生物，例如嗜乙酰棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、醋谷棒杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)、美棒杆菌(Corynebacterium callunae)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)、解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)、玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)、生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)等。
在本发明的一个实施方案中，所述属于棒杆菌属的微生物是谷氨酸棒杆菌ATCC15168。
在本发明的一个实施方案中，所述属于棒杆菌属的微生物是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)YPILE001，该菌高产异亮氨酸，保藏信息如下：菌种名称：谷氨酸棒杆菌；拉丁名：Corynebacterium glutamicum；菌株编号：YPILE001；保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏机构简称：CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2020年8月17日；保藏中心登记入册编号：CGMCC No.20437。
根据本发明，所述细菌还可以具有与提高L-异亮氨酸产量有关的其他改进，例如，苏氨酸脱氨酶、乙酰羟基酸合酶等酶的活性或基因的增强或降低的表达，或者可以使基因被外来基因取代。
本发明的第二个方面，提供一种多核苷酸序列，由该多核苷酸序列编码的氨基酸序列，包括所述多核苷酸序列的重组载体，含有所述多核苷酸序列的重组菌株。
根据本发明，所述多核苷酸序列包括编码含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，其中第195位精氨酸被不同的氨基酸所取代。
根据本发明，优选第195位精氨酸被谷氨酰胺所取代。
根据本发明，SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，其中第195位精氨酸被谷氨酰胺所取代后的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
根据本发明，优选所述编码含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列含有如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列。
在本发明的一个实施方式中，所述多核苷酸序列是由SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第584位碱基发生突变而形成的。
根据本发明，所述突变是指所述位点的碱基/核苷酸发生变化，所述突变方法可以选自诱变、PCR定点突变法、和/或同源重组等方法中的至少一种。在本发明中，优选采用PCR定点突变法和/或同源重组。
根据本发明，所述突变包括SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第584位鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)。
在本发明的一个实施方式中，所述多核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列。
根据本发明，所述氨基酸序列包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
根据本发明，所述重组载体是将所述多核苷酸序列导入质粒构建而成。
在本发明的一个实施方式中，所述质粒为pK18mobsacB质粒。
在本发明的另一个实施方式中，所述质粒为pXMJ19质粒。
具体地，可以将所述多核苷酸序列和所述质粒通过NEBuider重组系统构建成重组载体。
根据本发明，所述重组菌株含有所述的多核苷酸序列。
作为本发明的一个实施方案，所述重组菌株的出发菌为ATCC 15168。
作为本发明的一个实施方案，所述重组菌株的出发菌为谷氨酸棒杆菌CGMCCNO.20437。
本发明的第三个方面，还提供一种生成L-异亮氨酸的重组菌株的构建方法。
根据本发明，所述构建方法包括如下步骤：
改造宿主菌株中如SEQ ID NO:1所示的野生型YH66_06385基因的多核苷酸序列，使其第584位碱基发生突变，得到包含突变YH66_06385编码基因的重组菌株。
根据本发明的构建方法，所述改造包括诱变、PCR定点突变法、和/或同源重组等方法中的至少一种。
根据本发明的构建方法，所述突变是指SEQ ID NO:1中第584位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)；具体地，所述包含突变YH66_06385编码基因的多核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
进一步地，所述构建方法包括如下步骤：
(1)改造如SEQ ID NO:1所示的野生型YH66_06385基因的核苷酸序列，使其第584位碱基发生突变，得到突变的YH66_06385基因多核苷酸序列；
(2)将所述突变的多核酸序列与质粒连接，构建重组载体；
(3)将所述重组载体导入宿主菌株，得到所述包含突变YH66_06385编码基因的重组菌株。
根据本发明的构建方法，所述步骤(1)包括：点突变的YH66_06385基因构建：根据未修饰菌株的基因组序列，合成两对扩增YH66_06385基因片段的引物P1和P2及P3和P4，通过PCR定点突变法在野生型YH66_06385基因SEQ ID NO:1中引入点突变，得到点突变的YH66_06385基因核苷酸序列SEQ ID NO:2，记为YH66_06385G584A。
在本发明的一个实施方式中，所述未修饰菌株基因组可以来源于ATCC15168菌株，其基因组序列可以从NCBI网站获取。
在本发明的一个实施方案中，所述步骤(1)中，所述引物为：P1:5'
CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCTCTGAGCAAGGAATCTC 3'(SEQ ID NO:5)
P2:5'GAGTGACTTCAGTTGGAAGGACTTGGCGCACAGCTTC 3'(SEQ ID NO:6)
P3:5'GAAGCTGTGCGCCAAGTCCTTCCAACTGAAGTCACTC 3'(SEQ ID NO:7)
P4:5'
CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCACGTCATGGGCATTAAAC3'(SEQ ID NO:8)
在本发明的一个实施方案中，所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸40s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
在本发明的一个实施方案中，所述重叠PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
根据本发明的构建方法，所述步骤(2)包括重组质粒的构建，包括：将分离纯化后的YH66_06385G584A和pK18mobsacB质粒，通过NEBuider重组系统组装，获得重组质粒。
根据本发明的构建方法，所述步骤(3)包括重组菌株的构建，将重组质粒转化至宿主菌株，得到重组菌株。
在本发明的一个实施方案中，所述步骤(3)的转化为电转化法。
在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是ATCC15168。
在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是谷氨酸棒杆菌CGMCC NO.20437。
在本发明的一个实施方式中，所述重组是通过同源重组实现的。
本发明的第四个方面，还提供一种生成L-异亮氨酸的重组菌株的构建方法。
根据本发明，所述构建方法包括如下步骤：
扩增YH66_06385的上下游同源臂片段、YH66_06385基因编码区及其启动子区序列，以同源重组的方式在宿主菌株的基因组中引入YH66_06385或YH66_06385G584A基因，以实现所述菌株过表达YH66_06385或YH66_06385G584A基因。
在本发明的一个实施方式中，扩增上游同源臂片段的引物是：
P7:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCTGAAAGACACCGAATCTG3'(SEQ IDNO:11)
P8:5'GTGGGTGACA ACGATCAGACATAGTGCTTC GAAGACAG3'(SEQ ID NO:12)
在本发明的一个实施方式中，扩增下游同源臂片段的引物是：
P11:5'CGATCGAGAA GGGGGCCTTCTACTCAAAC TCGAATTCG3'(SEQ ID NO:15)
P12:5'
CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGTGTGTGGAAACTTAATG 3'(SEQ IDNO:16)
在本发明的一个实施方式中，扩增所述基因编码区及其启动子区序列的引物是：
P9:5'CTGTCTTC GAAGCACTATGTCTGATCGT TGTCACCCAC3'(SEQ ID NO:13)
P10:5'CGAATTCGAG TTTGAGTAGA AGGCCCCCTT CTCGATCG 3'(SEQ ID NO:14)
在本发明的一个实施方式中，再以前述P7/P12为引物，以扩增的上游同源臂片段、下游同源臂片段、基因编码区及其启动子区序列片段的三个片段混合为模板进行扩增，获得整合同源臂片段。
在本发明的一个实施方式中，所采用的PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTPMixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL；PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸180s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
在本发明的一个实施方式中，采用NEBuider重组系统，将穿梭质粒PK18mobsacB和整合同源臂片段组装，获得整合质粒。
在本发明的一个实施方式中，将整合质粒转染宿主菌株，以同源重组的方式在宿主菌株的基因组中引入YH66_06385或YH66_06385G584A基因。
在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是ATCC15168。
在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是谷氨酸棒杆菌CGMCC NO.20437。
在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是携带有SEQ ID NO:2所示多核苷酸序列的菌株。
本发明的第五个方面，还提供一种生产L-异亮氨酸的重组菌株的构建方法。
根据本发明，所述构建方法包括如下步骤：
扩增YH66_06385基因编码区及启动子区序列，或YH66_06385G584A基因编码区及启动子区序列，构建过表达质粒载体，将所述载体转入宿主菌株中，以实现所述菌株过表达YH66_06385或YH66_06385G584A基因。
在本发明的一个实施方式中，扩增所述基因编码区及其启动子区序列的引物是：
P17:5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGTCTGATCGTTGTCACCCAC3'(SEQID NO:21)
P18:5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACA AGGCCCCCTT CTCGATCG 3'(SEQID NO:22)。
在本发明的一个实施方式中，所述PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTPMixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL；所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸120s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
在本发明的一个实施方式中，采用NEBuider重组系统，将穿梭质粒pXMJ19和带有自身启动子的YH66_06385或YH66_06385G584A片段组装，获得过表达质粒。
在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是ATCC15168。
在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是谷氨酸棒杆菌CGMCC NO.20437。
在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是携带有SEQ ID NO:2所示多核苷酸序列的菌株。
本发明获得重组菌株可以单独应用于发酵生产L-异亮氨酸中，也可以和其他产L-异亮氨酸的细菌混合发酵生产L-异亮氨酸。
本发明的另一个方面提供了生产L-异亮氨酸的方法，该方法包括培养所述细菌；并且从培养物中获得L-异亮氨酸。
可以在本领域中已知的培养条件下在合适的培养基中进行细菌的培养。培养基可以包含：碳源、氮源、微量元素、及其组合。在培养中，可以调节培养物的pH。此外，培养时可以包括防止气泡产生，例如通过使用消泡剂进行气泡产生的防止。此外，培养时可以包括将气体注射入培养物中。气体可以包括能够维持培养物的需氧条件的任何气体。在培养中，培养物的温度可以是20至45℃。可以从培养物回收生成的L-异亮氨酸，即用硫酸或氢氯酸等处理培养物，接着进行诸如阴离子交换层析、浓缩、结晶和等电点沉淀的方法的组合。
在本发明中：
SEQ ID NO:1：YH66_06385野生型ORF序列
Figure BDA0002831373950000121
SEQ ID NO:2：YH66_06385G584A ORF序列
Figure BDA0002831373950000131
SEQ ID NO:3：YH66_06385野生型编码蛋白氨基酸序列
MAIELNVGRK VTVTVPGSSA NLGPGFDTLG LALSVYDTVE VEIIPSGLEV EVFGEGQGEVPLDGSHLVVK AIRAGLKAAD AEVPGLRVVC HNNIPQSRGL GSSAAAAVAG VAAANGLADF PLTQEQIVQLSSAFEGHPDN AAASVLGGAV VSWTNLSIDG KSQPQYAAVP LEVQDNIRAT ALVPNFHAST EAVRRVLPTEVTHIDARFNV SRVAVMIVAL QQRPDLLWEG TRDRLHQPYR AEVLPVTSEW VNRLRNRGYA AYLSGAGPTAMVLSTEPIPD KVLEDARESG IKVLELEVAG PVKVEVNQP
SEQ ID NO:4：YH66_06385R195Q编码蛋白氨基酸序列
MAIELNVGRK VTVTVPGSSA NLGPGFDTLG LALSVYDTVE VEIIPSGLEV EVFGEGQGEVPLDGSHLVVK AIRAGLKAAD AEVPGLRVVC HNNIPQSRGL GSSAAAAVAG VAAANGLADF PLTQEQIVQLSSAFEGHPDN AAASVLGGAV VSWTNLSIDG KSQPQYAAVP LEVQDNIRAT ALVPNFHAST EAVRQVLPTEVTHIDARFNV SRVAVMIVAL QQRPDLLWEG TRDRLHQPYR AEVLPVTSEW VNRLRNRGYA AYLSGAGPTAMVLSTEPIPD KVLEDARESG IKVLELEVAG PVKVEVNQP
有益效果
本发明通过对YH66_06385基因的弱化或敲除，发现该基因编码的产物对L-异亮氨酸生产能力产生影响，通过在编码序列引入点突变，或者增加该基因的拷贝数或过表达获得重组菌株，所获得的菌株与未改造的菌株相比，有利于生产高浓度的谷氨酸。
保藏信息：菌种名称：谷氨酸棒杆菌；拉丁名：Corynebacterium glutamicum；菌株编号：YPILE001；保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏机构简称：CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2020年8月17日；保藏中心登记入册编号：CGMCC NO.20437。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备；所进行的操作都是本领域已知的，或者按照市售商品的用户手册进行。
以下实施例中培养所述菌株使用的基础培养基组成相同，在此基础培养基组成上添加相应需要的蔗糖、卡那霉素或氯霉素等，基础培养基组成如下：
成分 配方
葡萄糖 5g/L
多聚蛋白胨 10g/L
牛肉膏 10g/L
酵母粉 5g/L
氯化钠 55g/L
琼脂粉 20g/L
pH(NaOH调节) 7.0
培养条件 31℃
实施例1构建包含点突变的YH66_06385基因编码区的转化载体pK18-YH66_06385G584A
依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC15168基因组序列，设计并合成两对扩增YH66_06385基因编码区序列的引物，以等位基因置换的方式在谷氨酸棒杆菌CGMCC NO.20437菌株(经鉴定，该菌中含有野生型YH66_06385基因)中引入点突变，对应编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，YH66_06385基因的核苷酸序列第584位鸟嘌呤(G)变为腺嘌呤(A)(SEQID NO:2：YH66_06385G584A)，对应编码蛋白的氨基酸序列第195位精氨酸变为谷氨酰胺(SEQID NO:4：YH66_06385R195Q)。引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
P1:5'
CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCTCTGAGCAAGGAATCTC 3'(SEQ ID NO:5)
P2:5'GAGTGACTTCAGTTGGAAGGACTTGGCGCACAGCTTC 3'(SEQ ID NO:6)
P3:5'GAAGCTGTGCGCCAAGTCCTTCCAACTGAAGTCACTC 3'(SEQ ID NO:7)
P4:5'
CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCACGTCATGGGCATTAAAC3'(SEQ ID NO:8)
构建方法：以ATCC15168为模板，分别以引物P1和P2，P3和P4，进行PCR扩增。
PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。
所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸40s，30个循环，72℃过度延伸10min，获得两条大小分别为830bp和738bp，含有YH66_06385基因编码区的DNA片段(YH66_06385G584A Up和YH66_06385G584A Down)。
将上述两条DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，再以上述两条DNA片段为模板，以P1和P4为引物，通过重叠PCR扩增长为1568bp的片段YH66_06385G584A Up-Down片段。
PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。
所述重叠PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸90s，30个循环，72℃过度延伸10min。
此DNA片段导致谷氨酸棒杆菌CGMCC NO.20437中YH66_06385基因编码区的第584位鸟嘌呤(G)变为腺嘌呤(A)，最终导致编码蛋白的第195位氨基酸由精氨酸(R)变为谷氨酰胺(Q)。
将pK18mobsacB质粒(购自Addgene公司)用Xba I酶切后，用琼脂糖凝胶电泳分离纯化YH66_06385G584A Up-Down和线性化的pK18mobsacB质粒，再通过NEBuider重组系统组装，获得载体pK18-YH66_06385G584A，该质粒上含有卡那霉素抗性标记。并将载体pK18-YH66_06385G584A送测序公司测序鉴定，将含有正确点突变(G-A)的载体pK18-YH66_06385G584A保存备用。
实施例2构建包含点突变的YH66_06385G584A的工程菌株
构建方法：将等位替换质粒pK18-YH66_06385G584A通过电击转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC NO.20437中，对培养产生的单菌落分别通过引物P1和通用引物M13R进行鉴定，能扩增出大小约1568bp条带的菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用如下引物(上海invitrogen公司合成)进行PCR鉴定：
P5:5'AGATAATG CTGCGGCTTC 3'(SEQ ID NO:9)
P6:5'GAAAGGTACG CTGCATAG 3'(SEQ ID NO:10)
上述PCR扩增产物通过高温变性、冰浴后进行SSCP电泳(以质粒pK18-YH66_06385G584A扩增片段为阳性对照，ATCC15168扩增片段为阴性对照，水作为空白对照)，由于片段结构不同，电泳位置不同，因此片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致且与阳性对照片段位置一致的菌株为等位替换成功的菌株。以引物P5和P6再次通过PCR扩增等位替换成功的菌株目的片段，并连接到PMD19-T载体进行测序，通过比对碱基序列确定是否替换成功；并将来自谷氨酸棒杆菌CGMCC NO.20437替换成功的突变株命名为YPI 007。
SSCP电泳PAGE的制备及条件
Figure BDA0002831373950000171
Figure BDA0002831373950000181
实施例3构建基因组上过表达YH66_06385或YH66_06385G584A基因的工程菌株
依据NCBI公布的ATCC15168基因组序列，设计并合成三对扩增上下游同源臂片段及YH66_06385基因编码区及启动子区序列的引物，以同源重组的方式在谷氨酸棒杆菌CGMCC NO.20437中引入YH66_06385或YH66_06385G584A基因。
引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
P7:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCTGAAAGACACCGAATCTG3'(SEQ IDNO:11)
P8:5'GTGGGTGACA ACGATCAGACATAGTGCTTC GAAGACAG3'(SEQ ID NO:12)
P9:5'CTGTCTTC GAAGCACTATGTCTGATCGT TGTCACCCAC3'(SEQ ID NO:13)
P10:5'CGAATTCGAG TTTGAGTAGA AGGCCCCCTT CTCGATCG 3'(SEQ ID NO:14)
P11:5'CGATCGAGAA GGGGGCCTTCTACTCAAAC TCGAATTCG3'(SEQ ID NO:15)
P12:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGTGTGTGGAAACTTAATG 3'(SEQ ID NO:16)
构建方法：分别以ATCC15168和YPI007为模板，分别以引物P7/P8，P9/P10，P11/P12，进行PCR扩增，获得上游同源臂片段约738bp，YH66_06385和YH66_06385G584A基因编码区及启动子区片段约3843bp及下游同源臂片段约814bp。再以P7/P12为引物，以以上扩增的三个片段混合为模板进行扩增，获得整合同源臂片段。PCR反应结束后，对扩增的产物进行电泳回收，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒(TIANGEN)进行回收所需要的约5395bp的DNA片段，采用NEBuider重组系统与经Xba I酶切回收的穿梭质粒PK18mobsacB相连接，获得整合质粒PK18mobsacB-YH66_06385或PK18mobsacB-YH66_06385G584A，质粒上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得质粒整合到基因组上的重组子。
PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。
所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸180s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
将2个整合质粒分别电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC NO.20437中，对培养产生的单菌落通过P13/P14引物进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小约1287bp的片段的为阳性菌株，扩增不到片段的为原菌。阳性菌株经15％蔗糖筛选后分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用P15/P16引物进行PCR鉴定，扩增出大小约1177bp的菌为YH66_06385或YH66_06385G584A基因整合到谷氨酸棒杆菌CGMCC NO.20437基因组上的菌株，其被命名为YPI-008(不含突变点)和YPI-009(含突变点)。
P13:5'TCGACGCACTTTTGGCTTTG 3'(SEQ ID NO:17)
P14:5'GTCCGAGGTT TGCAGAAG 3'(SEQ ID NO:18)
P15:5'GTTGCTGGAC CAGTCAAGG3'(SEQ ID NO:19)
P16:5'GGGGATTTCG ATTGCTTAC 3'(SEQ ID NO:20)
实施例4构建质粒上过表达YH66_06385或YH66_06385G584A基因的工程菌株
依据NCBI公布的ATCC15168基因组序列，设计并合成一对扩增YH66_06385基因编码区及启动子区序列的引物，引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
P17:5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGTCTGATCGTTGTCACCCAC3'(SEQID NO:21)
P18:5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACA AGGCCCCCTT CTCGATCG 3'(SEQID NO:22)
构建方法：分别以ATCC15168或YPI007为模板，以引物P17/P18进行PCR扩增，获得YH66_06385或YH66_06385G584A基因及其启动子片段约3843bp，对扩增的产物进行电泳回收，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行回收所需要的3843bp的DNA片段，采用NEBuider重组系统与经EcoR I酶切、回收的穿梭质粒pXMJ19相连接，获得过表达质粒pXMJ19-YH66_06385或pXMJ19-YH66_06385G584A。质粒上含有氯霉素抗性标记，可以通过氯霉素筛选获得质粒转化到菌株中。
PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。
所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸120s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
将2个质粒分别电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC NO.20437中，对培养产生的单菌落通过M13R(-48)和P18引物进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小约3863bp的片段的为转入菌株，其被命名为YPI-010(不含点突变)和YPI-011(含点突变)。
实施例5构建基因组上缺失YH66_06385基因的工程菌株
根据NCBI公布的ATCC15168的基因组序列，合成两对扩增YH66_06385基因编码区两端片段的引物，作为上下游同源臂片段。引物设计如下(上海英俊公司合成)：
P19:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGGCGCTGACTATGCAGATTC 3'(SEQID NO:23)
P20:5'GGGCCTTCTT AGTGGCACGT CAGTAAAATT AGTCCCT 3'(SEQ ID NO:24)
P21:5'AGGGACTAATTTTACTGACGT GCCACTAAGA AGGCCC 3'(SEQ ID NO:25)
P22:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCAAACTCGACCTTCACGTC3'(SEQID NO:26)
构建方法：以ATCC15168为模板，分别以引物P19/P20和P21/P22进行PCR扩增，获得上游同源臂片段715bp及下游同源臂片段756bp。再用引物P19/P22进行重叠PCR得到整个同源臂片段1471bp。PCR反应结束后，对扩增的产物进行电泳回收，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行回收所需要的1471bp的DNA片段，并通过NEBuider重组系统与经Xba I酶切回收的穿梭质粒pk18mobsacB质粒相连接，获得敲除质粒。该质粒上含有卡那霉素抗性标记。
将敲除质粒电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC NO.20437中，对培养产生的单菌落分别通过如下引物(上海英俊公司合成)进行PCR鉴定：
P23:5'TTTTCACGC TAGTTCAGCC 3'(SEQ ID NO:27)
P24:5'GATCCGATCCTAGAAAAC3'(SEQ ID NO:28)
上述PCR扩增出大小1220bp及4816bp的条带的菌株为阳性菌株，只扩增出4816bp条带的菌株为原菌。阳性菌株在15％蔗糖培养基上筛选后分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用P23/P24引物进行PCR鉴定，扩增出大小为1220bp条带的菌株为YH66_06385基因编码区被敲除的基因工程菌株，其被命名为YPI-012。
实施例6L-异亮氨酸发酵实验
将实施例构建的菌株和原始菌株谷氨酸棒杆菌CGMCC NO.20437在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐(购自上海百仑生物科技有限公司)中以表1所示的培养基进行发酵实验。每个菌株重复三次，结果如表3所示。
表1发酵培养基配方
成分 配比
葡萄糖 90g/L
硫酸铵 12g/L
硫酸镁 0.87g/L
硫酸二氢钾 2g/L
酸化玉米浆 3mL/L
酵母粉 4g/L
消泡剂(2％泡敌) 4mL/L
<![CDATA[VB<sub>1</sub>]]> 0.006g/L
VH 0.003g/L
生物素 0.088g/L
表2发酵控制工艺
Figure BDA0002831373950000221
表3 L-异亮氨酸发酵实验结果
Figure BDA0002831373950000222
结果如表3所示，在高产异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌CGMCC NO.20437中，对YH66_06385基因过表达，或者对YH66_06385基因编码区进行点突变YH66_06385G584A及过表达，有助于L-异亮氨酸产量的提高，而对基因进行弱化或敲除，不利于L-异亮氨酸的积累。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
                         序列表
<110>  宁夏伊品生物科技股份有限公司
<120>  一种改造YH66_06385基因的重组菌株及其构建方法与产L-异亮氨酸的应用
<130>  CPCN20411403
<160>  28
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  930
<212>  DNA
<213>  Corynebacterium glutamicum
<400>  1
atggcaattg aactgaacgt cggtcgtaag gttaccgtca cggtacctgg atcttctgca  60
aacctcggac ctggctttga cactttaggt ttggcactgt cggtatacga cactgtcgaa 120
gtggaaatta ttccatctgg cctggaagtg gaagtttttg gcgaaggcca aggagaagtc 180
cctcttgatg gctcccacct ggtggttaaa gctattcgtg ctggcctgaa ggcagctgac 240
gctgaagtgc ctggattgcg agtggtgtgc cacaacaaca ttccgcagtc tcgtggtctt 300
ggttcctctg ctgcagcggc ggttgctggt gttgcagcag ctaatggttt ggcggatttc 360
ccgctgactc aagagcagat tgttcagttg tcctctgcct ttgaaggcca cccagataat 420
gctgcggctt ctgtgctggg tggagcagtg gtgtcgtgga caaatctgtc tatcgacggc 480
aagagccagc cacagtatgc tgctgtacca cttgaggtgc aggacaatat tcgtgcgact 540
gcgctggttc ctaatttcca cgcatccact gaagctgtgc gccgagtcct tccaactgaa 600
gtcactcaca tcgatgcgcg attcaacgtg tctcgcgttg cggtgatgat cgttgcgttg 660
cagcagcgtc ctgatctgct gtgggagggt actcgtgacc gactgcacca gccttatcgt 720
gcagaagtgt tgcccgttac ctccgaatgg gtaaaccgtc tgcgcaaccg tggctatgca 780
gcgtaccttt ctggtgctgg cccaaccgcc atggtgttgt ccaccgagcc gattccagac 840
aaggttttgg aagatgctcg cgagtctggc attaaggtgc ttgagctcga ggttgctgga 900
ccagtcaagg ttgaggtcaa ccagccgtag                                  930
<210>  2
<211>  930
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>

Claims (3)

1.一种生成L-异亮氨酸的细菌，其特征在于，具有编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的改善的表达；所述改善的表达是编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的表达增强，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的；所述编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的点突变，使得SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第195位精氨酸被谷氨酰胺所取代；
所述细菌的出发菌是谷氨酸棒杆菌CGMCC NO.20437。
2.如权利要求1所述的细菌，其特征在于，编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的序列如SEQ ID NO:1所示。
3.一种生产L-异亮氨酸的方法，所述方法包括：培养权利要求1-2任一项所述的细菌，并从所述培养物中回收L-异亮氨酸。
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