CN111944781A - 一种突变的高丝氨酸激酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及氨基酸技术领域，具体公开了一种突变的高丝氨酸激酶及其应用。本发明所述突变的高丝氨酸激酶第195位氨基酸发生突变。本发明通过诱变筛选获得了苏氨酸产量较佳的菌株，通过验证获得了高丝氨酸激酶R195Q突变对于苏氨酸以及异亮氨酸的合成是有效位点的结论，其编码基因被转导的微生物中苏氨酸以及异亮氨酸产生能力得到显著改善，同时能够更好的解除苏氨酸的反馈抑制作用。

Description

一种突变的高丝氨酸激酶及其应用
技术领域
本发明涉及氨基酸修饰技术领域，更具体的说是涉及一种突变的高丝氨酸激酶及其应用。
背景技术
L-苏氨酸和L-异亮氨酸，均是人体必需氨基酸。广泛应用于食品、饲料、化妆品与医药等行业。两者均是使用通过高丝氨酸激酶从高丝氨酸产生的高丝氨酸磷酸。因此，为了经由发酵方法产生氨基酸，必须将生物合成途径中使用的酶的活性保持在一定水平或更高水平，并且已经对其进行了深入研究。
L-苏氨酸合成途径中有3个关键酶受到反馈抑制作用，分别是天冬氨酸激酶(AK)，高丝氨酸脱氢酶(HD)，高丝氨酸激酶(HK)。异亮氨酸是苏氨酸的下游产物，所以对于异亮氨酸的合成路径来说，除上述3种酶之外，还有苏氨酸脱氢酶(TD)和乙酰羟丁酸合成酶(AHAS)。其中高丝氨酸激酶，编码基因为thrB，以竞争性抑制机制被L-苏氨酸抑制。这使得解除苏氨酸对高丝氨酸激酶的反馈抑制变得困难。最近，已有关于thrB对L-苏氨酸的反馈抑制的脱敏的报道。在2018年，Choong-Min Kang发表了一篇在thrB基因中引入突变位点A20G解除苏氨酸对thrB基因的反馈抑制。尽管如此但仍需要继续研究以发现更好的突变体。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种突变的高丝氨酸激酶，使得所述高丝氨酸激酶能够显著提高苏氨酸产量；
本发明的另外一个目的在于提供一种突变的高丝氨酸激酶，使得所述高丝氨酸激酶能够显著提高异亮氨酸产量；
本发明的另外一个目的在于提供一种突变的高丝氨酸激酶，使得所述高丝氨酸激酶能够同时显著提高苏氨酸和异亮氨酸产量；；
本发明的另外一个目的在于提供一种突变的高丝氨酸激酶，使得所述高丝氨酸激酶在解除苏氨酸的反馈抑制作用上具备更佳的效果；
本发明的另外一个目的在于提供上述高丝氨酸激酶在生产苏氨酸和/异亮氨酸中应用，以及在构建生产苏氨酸和/异亮氨酸工程菌中的应用。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种突变的高丝氨酸激酶，第195位氨基酸发生突变。
本发明通过对野生型棒杆菌属的菌株进行化学诱变筛选抗AHV菌株，所获得的87株突变菌株中有11株表现出优异的L-苏氨酸的生产能力。将上述11种菌株命名为SMI001至SMI011，而其中属SMI001的苏氨酸的产量最高，副产物最少，是苏氨酸的最佳生产菌。
鉴于SMI001在苏氨酸生产中的优异表现，本发明通过基因技术验证了其thrB的核苷酸序列中，鸟嘌呤(其是本发明SEQ ID NO:2所示序列的第584位核苷酸)突变为腺嘌呤，因此编码精氨酸残基的CGA密码子突变为编码谷氨酰胺残基的CAA密码子(即高丝氨酸激酶发生R195Q突变)。为此，本发明通过基因工程手段构建R195Q突变相关工程菌，验证了高丝氨酸激酶R195Q突变对于苏氨酸以及异亮氨酸的合成是有效位点，故在本发明具体实施方式中，所述突变的高丝氨酸激酶第195位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酰胺，其蛋白序列如SEQ ID NO:3所示。
同时，本发明还提供了所述突变的高丝氨酸激酶的编码基因，其可以是任何能够编码表达R195Q突变高丝氨酸激酶的序列，在本发明具体实施方式中，所述编码基因的序列如SEQ ID NO:2所示。
在本发明对高丝氨酸激酶R195Q突变是有效位点的试验中，发生R195Q突变的菌株往往表现出更高苏氨酸和异亮氨酸产量，以及降低如高丝氨酸、赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸等副产物的产量，同时能够更好的解除苏氨酸的反馈抑制作用。
由此，本发明提供了所述突变的高丝氨酸激酶或所述编码基因在生产苏氨酸和/或异亮氨酸中的应用，以及在构建生产苏氨酸和/或异亮氨酸的工程菌中的应用。作为优选，所述工程菌为棒状杆菌属，在本发明具体实施方式中以谷氨酸棒状杆菌为例进行说明。
依据上述应用，本发明提供了一种生产苏氨酸和/或异亮氨酸的工程菌，该工程菌高丝氨酸激酶第195位氨基酸发生突变或转化有编码表达第195位氨基酸发生突变的高丝氨酸的表达载体。在本发明具体实施方式中，高丝氨酸激酶第195位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酰胺。
为了进一步解除苏氨酸合成途径中关键酶受到的反馈抑制作用，本发明还包括工程菌的天冬氨酸激酶第311位氨基酸发生突变或工程菌转化有编码表达第331位氨基酸发生突变的天冬氨酸激酶的表达载体。在本发明具体实施方式中，天冬氨酸激酶第331位氨基酸由苏氨酸突变为异亮氨酸。此外，本发明还包括工程菌的高丝氨酸脱氢酶第378位氨基酸发生突变或工程菌转化有编码表达第378位氨基酸发生突变的高丝氨酸脱氢酶的表达载体。在本发明具体实施方式中，高丝氨酸脱氢酶第378位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸。
为了强化异亮氨酸合成的末段途经，本发明还包括工程菌的苏氨酸脱氢酶第383位氨基酸发生突变或工程菌转化有编码表达第383位氨基酸发生突变的苏氨酸脱氢酶的表达载体。在本发明具体实施方式中，苏氨酸脱氢酶第383位氨基酸由苯丙氨酸突变为缬氨酸。
同时，本发明还提供了一种生产苏氨酸和/或异亮氨酸的方法，利用本发明所述工程菌，包括通过基因工程手段进行高丝氨酸激酶R195Q突变的工程菌和本发明诱变筛选到的SMI001工程菌，采用苏氨酸生产培养基或异亮氨酸生产培养基进行发酵生产。
作为优选，所述苏氨酸生产培养基包括葡萄糖、硫酸铵、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H 2O、MnSO4·4H2O、生物素(100g/L)和硫胺素，pH值优选7.0-7.2；
更优选地，所述苏氨酸生产培养基为：葡萄糖(120g/L)，硫酸铵(30g/L)，KH2PO4(1.5g/L)，K2HPO4·3H2O(3.0g/L)，MgSO4·7H2O(0.5g/L)，FeSO4·7H2O(15mg/L)，MnSO4·4H2O(15mg/L)，生物素(100g/L)，硫胺素(1mg/L)，pH值7.0-7.2。
作为优选，所述异亮氨酸生产培养基包括葡萄糖、豆粕提取物、玉米浆干粉、MgSO4·7H2O、KH2PO4·12H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、VB1、(NH4)2SO4，蒸馏水配制，pH优选7.0；
更优选地，所述异亮氨酸生产培养基为：葡萄糖(100g/L)、豆粕提取物(9.75g/L)、玉米浆干粉(14.4g/L)、MgSO4·7H2O(2g/L)、KH2PO4·12H2O(2g/L)、FeSO4·7H2O(0.01g/L)、MnSO4·H2O(0.01g/L)、VB1(0.01g/L)、(NH4)2SO4(50g/L)，蒸馏水配制，pH调至7.0。
在发酵生产前，按照本领域的一般做法都会对菌种进行活化制备成种子液，然后再接种者发酵培养基中振荡培养生产氨基酸。其中，种子培养基优选包括葡萄糖，蛋白胨，酵母膏，尿素，KH2PO4，K2HPO4，MgSO4·7H2O，生物素，盐酸硫胺素，泛酸钙，烟酰胺，pH调至7.0。
由以上技术方案可知，本发明通过诱变筛选获得了苏氨酸产量较佳的菌株，通过验证获得了高丝氨酸激酶R195Q突变对于苏氨酸以及异亮氨酸的合成是有效位点的结论，其编码基因被转导的微生物中苏氨酸以及异亮氨酸产生能力得到显著改善，同时能够更好的解除苏氨酸的反馈抑制作用。
具体实施方式
本发明公开了一种突变的高丝氨酸激酶及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述突变的高丝氨酸激酶及其应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述突变的高丝氨酸激酶及其应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
应用本发明提供的突变的高丝氨酸激酶的出发菌株一般都是能够生产苏氨酸或异亮氨酸的工程菌，更进一步地是棒状杆菌属工程菌，为了获得进一步提升产量的效果，可以对其高丝氨酸激酶进行R195Q突变等相关修饰操作，包括但不限于通过质粒载体的形式；在本发明具体实施方式中，本发明还对工程菌的L-苏氨酸合成途径以及L-异亮氨酸合成途径中关键酶进行修饰，以便消除反馈抑制作用和强化合成途径，但这并不是必须的，在本发明已经证明了高丝氨酸激酶R195Q突变对于苏氨酸以及异亮氨酸的合成是有效位点后，只要是能够生产苏氨酸或异亮氨酸的工程菌，在对其高丝氨酸激酶作出对应修饰后，其都能够相对于原工程菌作出进一步改善。
对于相关氨基酸修饰的技术可以参照本领域的常规分子手段，一般是以修饰位点为中心设计了用于扩增5’上游区域的一对引物和用于扩增3’下游区域的一对引物，PCR后各自获得5’上游区域的DN A片段和3’下游区域的DNA片段。使用扩增5’上游区域的一对引物中的上游引物和扩增3’下游区域的一对引物中的下游引物，以上述两个片段为模板扩增得到包含基因修饰的DNA片段。
本发明具体实施例中所涉及的引物见下表1；
表1
引物名称 序列
PI-thrB-1f CGCGGATCCATGGCAATTGAACTGAACGTCG
PI-thrB-2r GCTCTAGACTACGGCTGGTTGACCTCAAC
PI-thrB-点 ATCCACTGAAGCTGTGCGCGAA
PI-thrB-F GTCTGATCGTTGTCACCCACT
PI-thrB-R TCGACGATGACGCAATGCAC
PI-hom-1f CGCGGATCCGAAGCTGATCCTACTGCAGACGTC
PI-hom-1r CAGGCTAGCCAATTCTGCCAAAACTTCCACGCGATCTTCCACATC
PI-hom-2f GATGTGGAAGATCGCGTGGAAGTTTTGGCAGAATTGGCTAGCCTG
PI-hom-2r GCTCTAGAAGCAGAGGAACCAAGACCAC
PI-hom-ID-点 GATGTGGAAGATCGCGTGCAAG
PI-hom-F CAATGATTGAGCGAAGCTCC
PI-hom-R GGTGGCCTTCAAAGGCAGAG
PI-ilvA-1f CGCGGATCCAAAAAGGCCACCTCGATTGAG
PI-ilvA-1r CCCTGAGTACGAATACTTGACCTAAACATAGCTGAAGGCCACCTC
PI-ilvA-2f GAGGTGGCCTTCAGCTATGTTTAGGTCAAGTATTCGTACTCAGGG
PI-ilvA-2r GCTCTAGAGGAAATAAAACCTATGCCAAAG
PI-lysC-1f CGCGGATCCTTGATGTCACTCCAGGTCGT
PI-lysC-1r TCGGAACGAGGGCAGGTGAAGATGATGTCGGTGGTGCCGTCTT
PI-lysC-2f AAGACGGCACCACCGACATCATCTTCACCTGCCCTCGTTCCGA
PI-lysC-2r GCTCTAGAGAGTAATGTCTTCTACCTCGA
PI-lysC-ID-点 ACGGCACCACCGACATCTTC
PI-lysC-F TATGCTCCTGACTGCTGGTG
PI-lysC-R GCCAAGCAGAAGAGTTATCCA
PI-thrB-f CGCGGATCCATGGCAATTGAACTGAACGTC
PI-thrB-r GCTCTAGACTACGGCTGGTTGACCTCAACCATCATCACCATCACCAT
PI-thrB(A20G)-1r CAAAGCCAGGTCCGAGGTTTCCAGAAGATCCAGGTACCGTGAC
PI-thrB(A20G)-2f GTCACGGTACCTGGATCTTCTGGAAACCTCGGACCTGGCTTTG
本发明所涉及原料、试剂、载体等，如无特殊说明均可通过市售途径获得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：通过人工修饰筛选抗AHV的微生物
在此实施例中，使用谷氨酸棒状杆菌ATCC14067作为亲本菌株，使用NTG(用N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍)对菌株ATCC14067进行诱变筛选抗AHV(2-氨基-3-羟基戊酸，苏氨酸类似物)的菌株。
诱变过程是将在种子培养基中培养15h的ATCC14067菌株转接到5ml的种子培养基中培养至OD560至1.7。离心培养基回收细胞，然后用80mM的柠檬酸盐缓冲液洗涤细胞两次，然后以5ml的相同的缓冲溶液悬浮细胞，加入终浓度为200ug/ml的NTG处理20min。之后用相同的缓冲液洗涤两次所得物。最终分别涂布在含有AHV终浓度为20mM、40mM和50mM的基本培养基上，培养2-4天获得具有AHV抗性的变异体。
种子培养基：葡萄糖(20g/L)，蛋白胨(10g/L)，酵母膏(5g/L)，尿素(1.5g/L)，KH2PO4(4g/L)，K2HPO4(8g/L)，MgSO4·7H2O(0.5g/L)，生物素(100μg/L)，盐酸硫胺素(1000μg/L)，泛酸钙(2000μg/L)，烟酰胺(2000μg/L)，pH调至7.0。
基本培养基：葡萄糖(5g/L)、KH2PO4(1g/L)、(NH4)2SO4(5g/L)、MgSO4·7H2O(0.4g/L)、NaCl(0.5g/L)、生物素(200μg/L)、硫胺素HCl(100μg/L)、泛酸钙(100μg/L)、烟酰胺(0.03g/L)、尿素(2g/L)、Na2B4O7·10H2O(0.09mg/L)、(NH4)6Mo7O27·4H2O(0.04mg/L)、ZnSO47H2O(0.01mg/L)、CuSO4·5H2O(0.01mg/L)、MnCl2·4H2O(0.01mg/L)、FeCl3·6H2O(1mg/L)、CaCl2(0.01mg/L)，蒸馏水配制，pH值调至7.2。
实施例2：用于AHV抗性的菌株的L-苏氨酸产生测试
通过实施例1方法获得87株突变菌株，对获得的87株突变体进行苏氨酸生产能力测试。将87株突变菌株和对照菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC14067接种到含有25ml种子培养基的锥形瓶(500ml)中，然后在30-31℃下、以110rpm振荡培养15-17h至OD值16-18，按10％的接种量转接至25ml含有苏氨酸产生培养基的锥形瓶(500ml)中，然后在30-31℃下、以135rpm振荡培养持续48小时。培养后使用HPLC检测各种氨基酸的含量。表1显示了11株菌株发酵液中主要氨基酸的浓度，所述11种菌株在87株菌株中显示出优异的L-苏氨酸的生产能力。将上述11种菌株命名为SMI001至SMI011。如表2中所示，11种菌株中SMI001的苏氨酸的产量最高，而副产物最少，是苏氨酸的最佳生产菌。
葡萄糖(120g/L)，硫酸铵(30g/L)，KH2PO4(1.5g/L)，K2HPO4·3H2O(3.0g/L)，MgSO4·7H2O(0.5g/L)，FeSO4·7H2O(15mg/L)，MnSO4·4H2O(15mg/L)，生物素(100g/L)，硫胺素(1mg/L)，pH值7.0-7.2。
表2优异的AHV抗性的菌株的L-苏氨酸产生测试
菌株 Thr(g/L) L-Ile(g/L) Hse(g/L) Lys(g/L) Gly(g/L) Ala(g/L)
ATCC14067 0.05 0 0 0.37 0.32 0.51
SMI001 6.78 2.71 0.36 0.08 1.25 0.37
SMI002 4.32 1.21 1.97 1.21 0.91 0.43
SMI003 5.41 1.27 0.56 1.34 1.53 0.59
SMI004 4.63 1.45 0.98 0.89 1.87 0.34
SMI005 4.97 1.01 0.07 2.19 0.71 0.32
SMI006 2.36 2.27 0.97 2.78 0.73 0.54
SMI007 0.43 0.43 1.32 5.38 0.56 1.67
SMI008 3.35 2.16 0.13 0.43 1.92 1.39
SMI009 1.73 1.23 2.43 1.34 0.84 1.48
SMI010 2.65 0.52 1.47 2.01 1.65 1.67
SMI011 3.19 1.31 0.86 0.67 1.59 1.57
实施例3：分析来源于SMI001的具有产生L-苏氨酸能力的菌株的基因thrB的核苷酸序列
本实施例尝试证实在变异体SMI001中是否发生编码高丝氨酸激酶(HK)的基因thrB的变异。通过参照NCBI菌株14067的thrB基因的序列(SEQ ID NO:1所示)，设计引物使用聚合酶链反应(以下称为“PCR”)方法对变异体的染色体DNA进行扩增。具体地，使用变异体的基因组为模板并使用引物PI-thrB-F和PI-thrB-R和PfuUltraTM高保真DNA聚合酶作为PCR反应的聚合酶。PCR条件如下：在95℃下变性30秒；在52℃下退火20秒；以及在72℃下聚合2分钟，并且重复总共30个循环。结果：可以扩增得到基因片段1471bp，其包括SEQ ID NO:2所示序列起始密码子上游的129bp至终止密码子下游的200bp。
使用上述制备的引物，对扩增得到的基因片段进行测序。在对应于SMI001中的thrB的核苷酸序列中，鸟嘌呤(其是SEQ ID NO:2所示序列的第584位核苷酸)突变为腺嘌呤，因此编码精氨酸残基的CGA密码子突变为编码谷氨酰胺残基的CAA密码子(即发生R195Q突变)。
实施例4：产生L-苏氨酸的棒杆菌属的微生物菌株的制备和评价
从野生型谷氨酸棒杆菌ATCC14067中发展出产生L-苏氨酸的菌株。
首先为了解决天冬氨酸激酶(苏氨酸合成途径中第一个关键基因)受苏氨酸的反馈抑制，用异亮氨酸取代第311位的苏氨酸，即lysCT311I(SEQ ID NO:4所示)。具体地，为了制备引入突变位点lysCT311I的菌株，以14067基因组为模板，使用使用引物对PI-lysC-1f/PI-lysC-1r和引物对PI-lysC-2f/PI-lysC-2r进行PCR。使用PfuUltraTM高保真DNA聚合酶作为PCR反应的聚合酶。PCR条件如下：在95℃下变性30秒；在55℃下退火20秒；以及在72℃下聚合0.5分钟，并且重复总共30个循环。结果，以lysC基因的修饰位点为中心，各自获得5’上游区域的DN A片段(613bp)和3’下游区域的DNA片段(551bp)。使用引物PI-lysC-1f/PI-lysC-2r以上述两个片段为模板扩增得到包含lysC基因修饰的DNA片段(1121bp)。以XbaI/BamHI处理得到的片段和载体pK18-mob-sacB，纯化并使用T4连接酶连接，化转T1感受态。将获得测序正确的重组质粒电转14067感受态，进过两轮筛选得到含有lysCT311I的菌株，取代的适当性主要通过在对应于修饰序列(PI-lysC-ID-点/PI-lysC-2r)的引物组合中选择扩增菌株来确定。另外，通过使用引物PI-lysC-F和PI-lysC-R分析修饰的序列，以二次确认取代的适当性，并命名为MHP-1。
为了解决高丝氨酸脱氢酶hom的反馈抑制，用谷氨酸取代hom基因第378位的甘氨酸，更具体地，为了引入突变位点homG378E(SEQ ID NO:5所示)，使用14067的基因组为模板以及引物PI-hom-1f/PI-hom-1r和PI-hom-2f/PI-hom-2r进行PCR。使用PfuUltraTM高保真DNA聚合酶作为PCR反应的聚合酶。PCR条件如下：在95℃下变性30秒；在55℃下退火20秒；以及在72℃下聚合1分钟，并且重复总共30个循环。结果，以hom基因的修饰位点为中心，各自获得5’上游区域的DN A片段(549bp)和3’下游区域的DNA片段(547bp)。使用引物PI-hom-1f/PI-hom-2r以上述两个片段为模板扩增得到包含hom基因修饰的DNA片段(1051bp)。以XbaI/BamHI处理得到的片段和载体pK18-mob-sacB，纯化并使用T4连接酶连接，化转T1感受态。将获得测序正确的重组质粒电转MHP-1感受态，进过两轮筛选得到含有homG378E的菌株，取代的适当性主要通过在对应于修饰序列(PI-hom-ID-点/PI-hom-2r)的引物组合中选择扩增菌株来确定。另外，通过使用引物PI-hom-F和PI-hom-R进行所选菌株的序列的分析，以二次确认取代的适当性，并命名为MHP-2。
为了验证thrB(R195Q)对苏氨酸产量的影响，使用SMI001基因组为模板并以PI-thrB-1f和PI-thrB-2r为引物进行PCR。使用PfuUltraTM高保真DNA聚合酶作为PCR反应的聚合酶。结果获得了包含thrB基因编码的序列。使用PCR纯化试剂盒纯化扩增的产物，然后将其用作插入DNA片段，用于载体的制备。使用XbaI和BamHI同时处理上述回收片段和载体pK18-mob-sacB，纯化回收。使用T4连接酶按照摩尔比片段：载体＝3：1连接两个小时，化转大肠感受态并筛选正确的转化子。将测序结果正确的重组质粒即pK18-thrB(R195Q)电转入MHP-2的电转感受态中。使用引物PI-thrB-点/PI-thrB-2r对二次重组子进行鉴定，片段大小619bp，扩增条件：条件下进行PCR：在94℃下变性1分钟，在58℃下退火30秒，以及使用Taq聚合酶在72℃下聚合0.5分钟，循环数30次。之后使用引物PI-thrB-F和PI-thrB-R对引入的突变位点进行测序。命名为MHP-3。
按照实施案例2的方式对制备的菌株MHP-2和MHP-3进行摇瓶发酵实验。分析培养基中L-苏氨酸的浓度。
表3制备的菌株产生L-苏氨酸能力的评价菌株
Figure BDA0002664880410000091
由表3L-苏氨酸的发酵数据可以看出引入thrBR195Q的菌株MHP-3的苏氨酸和异亮氨酸的产量较MHP-2分别提高46.1％％和34.3％，同时副产物高丝氨酸和赖氨酸的产量分别下降38.2％和26.9％。因此确认了thrBR195Q对于苏氨酸的合成是有效位点。
实施例5：产生L-异亮氨酸的棒杆菌属的微生物菌株的制备和评价
为评价thrB(R195Q)对异亮氨酸产量的影响，在产生苏氨酸的菌株MHP-2的基础上构建L-异亮氨酸的产生菌株。为了强化异亮氨酸合成的末端途径，制备用于增强修饰的ilvA(F383V)基因(SEQ ID NO:6所示)的表达的载体。以修饰位点为中心设计了用于扩增5’上游区域的一对引物PI-ilvA-1f/PI-ilvA-1r和用于扩增3’下游区域的一对引物PI-ilvA-2f/PI-ilvA-2r。使用PI-ilvA-1f和PI-ilvA-2r的引物，用两个扩增的DNA片段作为模板进行PCR。在95℃下变性5分钟后，在以下条件下进行总共30个循环的PCR：在95℃下变性30秒；在55℃下退火20秒；以及在72℃下聚合60秒。此后，在72℃下进行聚合反应10分钟。结果，扩增了DNA片段(1408bp)，其包括编码ilvA变体的ilvA基因的修饰，其中第383位的苯丙氨酸被缬氨酸取代。以XbaI/BamHI处理得到的片段和载体pXMJ19，并使用T4连接酶制备重组质粒pXMJ19-ilvAF383V。将重组质粒电转菌株MHP-2和MHP-3，分别获得质粒过表达ilvAF383V的菌株，将其命名为MHP-4和MHP-5。
按照实施案例2的方式对制备的菌株进行摇瓶发酵实验。并分析菌株MHP-4和MHP-5培养基中氨基酸的浓度。其结果如表4中所示。
L-异亮氨酸产生培养基：葡萄糖(100g/L)、豆粕提取物(9.75g/L)、玉米浆干粉(14.4g/L)、MgSO4·7H2O(2g/L)、KH2PO4·12H2O(2g/L)、FeSO4·7H2O(0.01g/L)、MnSO4·H2O(0.01g/L)、VB1(0.01g/L)、(NH4)2SO4(50g/L)，蒸馏水配制，pH调至7.0。
表4制备的菌株产生L-异亮氨酸能力的评价
Figure BDA0002664880410000101
由表2异亮氨酸的发酵数据可以看出：对比异亮生产菌株MHP-4，在基因thrB内引入突变位点R195Q，可提高异亮氨酸的产量41.5％，苏氨酸的产量提高28.7％，而高丝氨酸的产量下降42.8％。证实thrBR195Q是在异亮氨酸的合成改造中有效位点。
实施例6：高丝氨酸激酶活性的测定
使用引物PI-thrB-f/PI-thrB-r以14067和SMI001为模板分别扩增得到野生型HK和含有突变位点A195Q的HK。为了对比文献在thrB基因内引入突变位点A20G，基因thrBA20G序列如SEQ ID NO:7所示。以修饰位点为中心设计了用于扩增5’上游区域的一对引物PI-thrB-f/PI-thrB(A20G)-1r和用于扩增3’下游区域的一对引物PI-thrB(A20G)-2f/PI-thrB-r。使用PI-thrB-f和PI-thrB-r的引物，用两个扩增的DNA片段作为模板进行PCR。在95℃下变性5分钟后，在以下条件下进行总共30个循环的PCR：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合60秒。此后，在72℃下进行聚合反应10分钟。结果，扩增了DNA片段(930bp)，其包括编码HK变体的thrB基因的修饰，其中第20位的丙氨酸被甘氨酸取代。以BamHI/XbaI将获得的3种thrB基因片段与载体pET28a同时酶切，纯化，并试用T4连接酶连接转化大肠杆菌BL21,制备含有HIS标签的thrB过表达载体pET28a-thrB(wt)、pET28a-thrB(A195Q)和pET28a-thrB(A20G)。将三种菌种进行IPTG诱导表达，将离心后的菌体使用1xPBS悬浮破碎。使用Bio-Scale Mini Profinity IMAC滤芯和Profinia蛋白质纯化系统(Bio-Rad)纯化蛋白质HK用于酶活测定。使用ADP荧光测定试剂盒(Sigma-Aldrich)检测HK的活性变化。反应条件：将1mM高丝氨酸，2mM ATP(溶于10mM的tris缓冲液中，pH7.0)，10mM MgSO4，0.5M KCl和40nM酶液溶于浓度为250mM pH 7.8的Tris缓冲液中，27℃反应5min，温度调至99℃反应2min以终止反应。最终加入ADP分析缓冲液27℃反应30min。使用微板分光光度计在波长620nm条件下测定ADP的浓度。测定ADP浓度在0，10，20，50，100，和200μM时的浓度标准曲线。苏氨酸对thrB的反馈抑制的实验使用5，10，和20mM苏氨酸来进行。
表5 HK活性(μM ADP)与L-苏氨酸的脱敏作用的测量
Figure BDA0002664880410000111
由表5的酶活性分析可以看出，在thrB引入突变位点R195Q，对于HK的酶活性影响不大，但可以部分解除苏氨酸对thrB的反馈抑制作用。突变位点R195Q相较A20G可以更大程度的解除苏氨酸对HK的反馈抑制作用。
根据上述结果，证实了高丝氨酸激酶的氨基酸序列中第195位氨基酸是AHV变异体变构调节的重要位点，可部分解除苏氨酸的反馈抑制作用，并且引入此位点可提高苏氨酸和异亮氨酸的产量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 廊坊梅花生物技术开发有限公司
<120> 一种突变的高丝氨酸激酶及其应用
<130> MP2019811
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcaattg aactgaacgt cggtcgtaag gttaccgtca cggtacctgg atcttctgca 60
aacctcggac ctggctttga cactttaggt ttggcactgt cggtatacga cactgtcgaa 120
gtggaaatta ttccatctgg cctggaagtg gaagtttttg gcgaaggcca aggagaagtc 180
cctcttgatg gctcccacct ggtggttaaa gctattcgtg ctggcctgaa ggcagctgac 240
gctgaagtgc ctggattgcg agtggtgtgc cacaacaaca ttccgcagtc tcgtggtctt 300
ggttcctctg ctgcagcggc ggttgctggt gttgcagcag ctaatggttt ggcggatttc 360
ccgctgactc aagagcagat tgttcagttg tcctctgcct ttgaaggcca cccagataat 420
gctgcggctt ctgtgctggg tggagcagtg gtgtcgtgga caaatctgtc tatcgacggc 480
aagagccagc cacagtatgc tgctgtacca cttgaggtgc aggacaatat tcgtgcgact 540
gcgctggttc ctaatttcca cgcatccact gaagctgtgc gccgagtcct tccaactgaa 600
gtcactcaca tcgatgcgcg attcaacgtg tctcgcgttg cggtgatgat cgttgcgttg 660
cagcagcgtc ctgatctgct gtgggagggt actcgtgacc gactgcacca gccttatcgt 720
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<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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aacctcggac ctggctttga cactttaggt ttggcactgt cggtatacga cactgtcgaa 120
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<210> 3
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ala Ile Glu Leu Asn Val Gly Arg Lys Val Thr Val Thr Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Ser Ala Asn Leu Gly Pro Gly Phe Asp Thr Leu Gly Leu Ala
20 25 30
Leu Ser Val Tyr Asp Thr Val Glu Val Glu Ile Ile Pro Ser Gly Leu
35 40 45
Glu Val Glu Val Phe Gly Glu Gly Gln Gly Glu Val Pro Leu Asp Gly
50 55 60
Ser His Leu Val Val Lys Ala Ile Arg Ala Gly Leu Lys Ala Ala Asp
65 70 75 80
Ala Glu Val Pro Gly Leu Arg Val Val Cys His Asn Asn Ile Pro Gln
85 90 95
Ser Arg Gly Leu Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Val Ala Gly Val Ala
100 105 110
Ala Ala Asn Gly Leu Ala Asp Phe Pro Leu Thr Gln Glu Gln Ile Val
115 120 125
Gln Leu Ser Ser Ala Phe Glu Gly His Pro Asp Asn Ala Ala Ala Ser
130 135 140
Val Leu Gly Gly Ala Val Val Ser Trp Thr Asn Leu Ser Ile Asp Gly
145 150 155 160
Lys Ser Gln Pro Gln Tyr Ala Ala Val Pro Leu Glu Val Gln Asp Asn
165 170 175
Ile Arg Ala Thr Ala Leu Val Pro Asn Phe His Ala Ser Thr Glu Ala
180 185 190
Val Arg Gln Val Leu Pro Thr Glu Val Thr His Ile Asp Ala Arg Phe
195 200 205
Asn Val Ser Arg Val Ala Val Met Ile Val Ala Leu Gln Gln Arg Pro
210 215 220
Asp Leu Leu Trp Glu Gly Thr Arg Asp Arg Leu His Gln Pro Tyr Arg
225 230 235 240
Ala Glu Val Leu Pro Val Thr Ser Glu Trp Val Asn Arg Leu Arg Asn
245 250 255
Arg Gly Tyr Ala Ala Tyr Leu Ser Gly Ala Gly Pro Thr Ala Met Val
260 265 270
Leu Ser Thr Glu Pro Ile Pro Asp Lys Val Leu Glu Asp Ala Arg Glu
275 280 285
Ser Gly Ile Lys Val Leu Glu Leu Glu Val Ala Gly Pro Val Lys Val
290 295 300
Glu Val Asn Gln Pro
305
<210> 4
<211> 1266
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60
aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120
tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180
ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240
gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300
ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360
gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420
aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480
ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540
accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600
atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660
cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720
attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780
gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840
aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900
tcttctgtag aagacggcac caccgacatc atcttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960
cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020
gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080
accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1140
tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200
ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260
cgctaa 1266
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atgacctcag catctgcccc aagctttaac cccggcaagg gtcccggctc agcagtcgga 60
attgcccttc taggattcgg aacagtcggc actgaggtga tgcgcctgat gaccgagtac 120
ggtgatgaac ttgcgcaccg cattggtggc ccactggagg ttcgtggcat tgctgtttct 180
gatatctcaa agccacgtga aggcgttgca cctgagctgc tcactgagga cgcttttgca 240
ctcatcgagc gcgaggatgt tgacatcgtc gttgaggtta tcggtggcat tgagtaccca 300
cgtgaggtag ttctcgcagc tctgaaggcc ggcaagtctg ttgttaccgc caataaggct 360
cttgttgcag ctcactctgc tgagcttgct gatgcagcgg aagccgcaaa cgttgacctg 420
tacttcgagg ctgctgttgc aggcgcaatt ccagtggttg gcccactgcg tcgctccctg 480
gctggcgatc agatccagtc tgtgatgggc atcgttaacg gcaccaccaa cttcatcttg 540
gacgccatgg attccaccgg cgctgactat gcagattctt tggctgaggc aactcgtttg 600
ggttacgccg aagctgatcc tactgcagac gtcgaaggcc atgacgccgc atccaaggct 660
gcaattttgg catccatcgc tttccacacc cgtgttaccg cggatgatgt gtactgcgaa 720
ggtatcagca acatcagcgc tgccgacatt gaggcagcac agcaggcagg ccacaccatc 780
aagttgctgg ccatctgtga gaagttcacc aataaggaag gaaagtcggc catttctgct 840
cgcgtgcacc cgactctatt gcctgtgtcc cacccactgg cgtcggtaaa taagtccttt 900
aacgcaatct ttgttgaagc tgaagcagct ggtcgcctga tgttctacgg aaacggtgca 960
ggtggcgcgc caaccgcgtc tgctgtgctt ggcgacgtcg ttggtgccgc acgaaacaag 1020
gtgcacggtg gccgtgctcc aggtgagtcc acctacgcta acctgccgat cgctgatttt 1080
ggtgagacca ccactcgtta ccacctcgac atggatgtgg aagatcgcgt ggaagttttg 1140
gcagaattgg ctagcctgtt ctctgagcaa ggaatctccc tgcgtacaat ccgacaggaa 1200
gagcgcgatg atgatgcacg tctgatcgtt gtcacccact ctgcgctgga atctgatctt 1260
tcccgcaccg ttgaactgct gaaggctaag cctgttgtta aggcaatcaa cagtgtgatc 1320
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<212> DNA
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ttcctccata cgttccagca aagaatccaa tcctgatgct tcactcaagt gaatacccac 120
caacgcagta ccggtctcac ggttgttgcg cttgaggtac tcaaccagcg tgatgtcatc 180
atccggtccc aggatatctt ccaggaagtg acgcaactga ccaggctttt gcgggaagtt 240
caccaagaag tagtgcttca aaccgcggtg caccaaggag cgctcagcga tttccgcata 300
acgcagcaca tcgttgttgc caccagagat gatgcacacc acgacagaac caggtgcaaa 360
ggacatttcc ttcaacccag cgatagacag cgcgccagca ggctccgcga tgatgccttc 420
gttttggtaa agatcgagca tctcagtaca cacagcgccc tcggtcgcgc tcatcatgtg 480
cacgcgaccc tggttcttct ccacgatggt gtagttgaga tctccgacac gtttgactgc 540
tgcgccgtcc acaaagggat caacagtctc caaagtgatt ggtccaccat tgtgcaatgc 600
agcctgcatg gatgctgctc ccgctggttc gataccaacg atcgcagtgc gaggtgccat 660
atcagccatg tagctgacca cacctgcaag aagtccgcca ccgccgactg gaaccatcac 720
gtgatctgca ctcttgccca tggaagtcag ctgcgacaag atctcagcag ccactgtacc 780
ctgaccgatg acggtgttgc gagcatcgaa aggctcgatc agcgttgcgc cggtgcgctc 840
tgcatcttca tgcgctgcag ccgatgcttc gtcgaagtta ttgccagtga ccaccaagga 900
gacaaactct ccgccgtgaa ccatgatgcg gtcacgcttt tgctttggag tctgcacagg 960
aacatagatg cgtccctgaa cgcccaagga cttgcacaca taggccacgc cctgggcatg 1020
gttacctgca gatgcggcaa cgatacctgc atcgcgctgc tcctgagtga gctgcgctcc 1080
agagttcagc gcaccgcgga tcttgtagga acgaacatcc tgcagatcct cacgcttaag 1140
gtagatttcc gctccggttt cctcagaaag acgagggcaa tactgcaatg gagttggtgc 1200
aatgacggag gaaattcgtg cctgcgccgt ttgaatgtcg gcggcacgaa tcagctccgc 1260
tccgctagcc atcactcctg gacttttctc agacacgtat gtttcactca t 1311
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtggaaatta ttccatctgg cctggaagtg gaagtttttg gcgaaggcca aggagaagtc 180
cctcttgatg gctcccacct ggtggttaaa gctattcgtg ctggcctgaa ggcagctgac 240
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ggttcctctg ctgcagcggc ggttgctggt gttgcagcag ctaatggttt ggcggatttc 360
ccgctgactc aagagcagat tgttcagttg tcctctgcct ttgaaggcca cccagataat 420
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gtcactcaca tcgatgcgcg attcaacgtg tctcgcgttg cggtgatgat cgttgcgttg 660
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Claims (17)

1.一种突变的高丝氨酸激酶，其特征在于，第195位氨基酸发生突变。
2.根据权利要求1所述突变的高丝氨酸激酶，其特征在于，第195位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酰胺。
3.根据权利要求2所述突变的高丝氨酸激酶，其特征在于，蛋白序列如SEQ ID NO:3所示。
4.权利要求1-3任意一项所述突变的高丝氨酸激酶的编码基因。
5.根据权利要求4所述编码序列，其特征在于，所述编码基因的序列如SEQ ID NO:2所示。
6.权利要求1-3任意一项所述突变的高丝氨酸激酶或权利要求4-5任意一项所述编码基因在生产苏氨酸和/或异亮氨酸中的应用。
7.权利要求1-3任意一项所述突变的高丝氨酸激酶或权利要求4-5任意一项所述编码基因在构建生产苏氨酸和/或异亮氨酸的工程菌中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述工程菌为棒状杆菌属。
9.一种生产苏氨酸和/或异亮氨酸的工程菌，其特征在于，高丝氨酸激酶第195位氨基酸发生突变或转化有编码表达第195位氨基酸发生突变的高丝氨酸的表达载体。
10.根据权利要求9所述工程菌，其特征在于，高丝氨酸激酶第195位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酰胺。
11.根据权利要求9或10所述工程菌，其特征在于，还包括工程菌的天冬氨酸激酶第311位氨基酸发生突变或工程菌转化有编码表达第331位氨基酸发生突变的天冬氨酸激酶的表达载体。
12.根据权利要求11所述工程菌，其特征在于，天冬氨酸激酶第331位氨基酸由苏氨酸突变为异亮氨酸。
13.根据权利要求9-12任意一项所述工程菌，其特征在于，还包括工程菌的高丝氨酸脱氢酶第378位氨基酸发生突变或工程菌转化有编码表达第378位氨基酸发生突变的高丝氨酸脱氢酶的表达载体。
14.根据权利要求13所述工程菌，其特征在于，高丝氨酸脱氢酶第378位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸。
15.根据权利要求9-14任意一项所述工程菌，其特征在于，还包括对工程菌的苏氨酸脱氢酶第383位氨基酸发生突变或工程菌转化有编码表达第383位氨基酸发生突变的苏氨酸脱氢酶的表达载体。
16.根据权利要求15所述工程菌，其特征在于，苏氨酸脱氢酶第383位氨基酸由苯丙氨酸突变为缬氨酸。
17.一种生产苏氨酸和/或异亮氨酸的方法，其特征在于，利用权利要求9-16任意一项所述工程菌采用苏氨酸生产培养基或异亮氨酸生产培养基进行发酵生产。
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