CN111247250A

CN111247250A - 用于生产L-氨基酸的具有增强的α-葡萄糖苷酶活性的微生物和使用其生产L-氨基酸的方法

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Publication number: CN111247250A
Application number: CN201980001776.6A
Authority: CN
Inventors: 金径林; 卞效情; 李光雨; 金亨俊; 申容旭
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2019-04-09
Publication date: 2020-06-05
Anticipated expiration: 2039-04-09
Also published as: RU2732338C1; CL2021000629A1; KR102112240B1; BR112019019867A2; AU2019349396A1; US11293014B2; PH12021550347A1; EP3656863A1; IL281567A; KR20200036647A; WO2020067618A1; EP3656863A4; MX2021002814A; JP2021534765A; ZA202101456B; WO2020067618A8; PE20210686A1; BR112019019867B1; EP3656863A9; AU2019349396B2

Abstract

本公开涉及用于生产L‑氨基酸的具有增强的α‑葡萄糖苷酶活性的微生物和使用其生产L‑氨基酸的方法。根据本公开，生产L‑氨基酸的棒状杆菌属微生物具有增强的α‑葡萄糖苷酶活性，从而提高L‑氨基酸产量。因此，微生物可非常有用地用于L‑氨基酸生产。

Description

用于生产L-氨基酸的具有增强的α-葡萄糖苷酶活性的微生物和使用其生产L-氨基酸的方法

技术领域

本公开涉及用于生产L-氨基酸的具有增强的α-葡萄糖苷酶活性的微生物和使用其生产L-氨基酸的方法。

背景技术

L-氨基酸已经用于动物饲料、药物和化妆品工业，并且主要通过使用棒状杆菌属(genus Corynebacterium)或埃希氏菌属(genus Escherichia)进行发酵来生产。为生产L-氨基酸，已经进行了各种研究，如开发高效生产菌株和发酵工艺技术。具体地，已主要使用目标物质特异性接近(target material-specific approach)方法，如增加编码参与L-氨基酸生物合成的酶的基因的表达或去除生物合成不需要的基因(韩国专利注册号10-0838038)。

同时，已经进行了各种用于增加糖可用性的研究以提高微生物的目标物质生产能力，同时，一直需要考虑有效的培养基组分和微生物生长。例如，已经报道了用于制备突变微生物并使用其生产生物燃料的技术，所述突变微生物能够通过同时过表达ascB或chbF基因和利用纤维二糖和其它糖(如木糖、甘露糖和半乳糖)来增加纤维二糖的可用性(韩国专利注册号10-1484108)。然而，需要继续研究糖的可用性和微生物的L-氨基酸生产能力之间的相关性。

发明内容

技术问题

本发明人令人惊讶地证实了由于将α-葡萄糖苷酶(已知其分解异麦芽糖和麦芽糖)引入棒状杆菌属的菌株而不添加异麦芽糖和麦芽糖来提高作为目标物质的L-氨基酸的生产量的效果，从而完成本公开。

技术方案

本公开的目的是提供生产L-氨基酸的具有增强的α-葡萄糖苷酶活性的棒状杆菌属微生物。

本公开的另一目的是提供用于生产L-氨基酸的方法，其包括在培养基中培养微生物；和从培养基或微生物收集L-氨基酸。

本公开的又一目的是提供用于增加L-氨基酸的生产的方法，其包括增强微生物中α-葡萄糖苷酶的表达。

本公开的又一目的是提供用于增加L-氨基酸的生产的α-葡萄糖苷酶的应用。

有益效果

根据本公开，生产L-氨基酸的棒状杆菌属微生物具有增强的α-葡萄糖苷酶活性，从而提高L-氨基酸的产量。因此，该微生物可非常有用地用于L-氨基酸的生产。

附图说明

图1示例了确认谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌株中α-葡萄糖苷酶表达的SDS-PAGE结果。

最佳实施方式

具体地，将如下描述本公开。同时，本公开中公开的每种描述和实施方式也可应用到每种其它描述和实施方式。即，本公开中公开的各种组成部分的所有组合都属于本公开的范围。另外，下述具体描述可不限制本公开的范围。

为了实现目的，本公开的一个方面是生产L-氨基酸的具有增强的α-葡萄糖苷酶活性的棒状杆菌属微生物。本公开的棒状杆菌属微生物具有增强的α-葡萄糖苷酶活性以提高L-氨基酸生产能力。因此，本公开的棒状杆菌属微生物可非常有用地用于L-氨基酸生产。

在本公开中，术语“α-葡萄糖苷酶”是一种用于将糖分解成葡萄糖的葡萄糖苷酶，并指代具有分解α(1→4)键的特征的酶。在本公开中，α-葡萄糖苷酶可以是由aglA基因编码的具有α-葡萄糖苷酶活性的蛋白质，但只要α-葡萄糖苷酶具有对应于葡萄糖苷酶(其在棒状杆菌属微生物中增强以提高L-氨基酸的生产能力)的活性，其类型就没有特别限制。已知由aglA基因编码的具有α-葡萄糖苷酶活性的蛋白质具有异麦芽糖或麦芽糖分解活性(Glycobiology.2010Nov；20(11))，并且本领域技术人员通过已知的数据库(例如，NCBI、UniProt等)可容易获得α-葡萄糖苷酶的信息。在本公开中，α-葡萄糖苷酶可以是源自青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α-葡萄糖苷酶，且具体地，源自青春双歧杆菌的α-葡萄糖苷酶，但不限制于此。描述为本公开的实例的源自青春双歧杆菌的α-葡萄糖苷酶不限制于此，但可以是包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质。源自解淀粉欧文氏菌的α-葡萄糖苷酶不限制于此，但可以是包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的蛋白质。源自酿酒酵母的α-葡萄糖苷酶不限制于此，但可以是包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的蛋白质。包含SEQID NO:1的氨基酸序列的蛋白质可与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质和由SEQ IDNO:1的氨基酸序列组成的蛋白质组合使用。

进一步，尽管本公开公开了“包含特定序列号列出的氨基酸序列的蛋白质或多肽”，但如果蛋白质具有与包含对应序列号的氨基酸序列的多肽的活性相同或等同的活性，则显而易见的是，具有部分缺失、修饰、取代、保守取代或添加的氨基酸序列的蛋白质也包括在本公开的范围内。例如，如果蛋白质具有与包含对应序列号的氨基酸序列的多肽的活性相同或等同的活性，则显而易见的是，不排除在氨基酸序列之前或之后不修饰蛋白质功能的序列的添加、天然发生突变、其沉默突变或保守取代，且序列添加或突变包括在本公开的范围内。进一步，如果蛋白质具有与包含对应序列号的氨基酸序列的多肽的活性相同或等同的活性，则与对应序列号的氨基酸序列具有80％或更高，具体地90％或更高，更具体地95％或更高，且更具体地99％或更高同源性或同一性的氨基酸序列可包括在本公开的范围内。

例如，本公开中具有α-葡萄糖苷酶活性的蛋白质可以是包含源自青春双歧杆菌的α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)、源自解淀粉欧文氏菌的α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:28)、或源自酿酒酵母的α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:29)的蛋白质。如果本公开的α-葡萄糖苷酶是具有对应于α-葡萄糖苷酶的效果并增强棒状杆菌属微生物的活性以改善L-氨基酸的生产能力的蛋白质，则显而易见的是，α-葡萄糖苷酶包括在本公开中的具有α-葡萄糖苷酶活性的蛋白质中。具体地，只要本公开的α-葡萄糖苷酶具有α-葡萄糖苷酶活性并增强棒状杆菌属微生物的活性以改善L-氨基酸的生产能力，则与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:28、或SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有80％或更高，具体地90％或更高，更具体地95％或更高，且更具体地99％或更高同源性或同一性的氨基酸序列可包括在本公开的范围内。

在本公开中，术语“同源性或同一性”是指与两个给定氨基酸序列或碱基序列相关的程度，并且可表示为百分比。进一步，同源性和同一性通常可互换使用。

保守多核苷酸或多肽的同源性或同一性通过标准阵列算法确定，并且可一起使用由使用的程序建立的默认空位罚值(default gap penalties)。基本上，同源性或同一序列通常可在中等或高度严格的条件下根据整个序列或整个长度的至少约50％、60％、70％、80％或90％杂交。在杂交的多核苷酸中，还考虑了包含代替密码子的简并密码子的多核苷酸。

可利用已知的计算机算法(如“FASTA”程序)利用默认参数(例如，Pearson et al.(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85]:2444中)确定任意两个多核苷酸或多肽是否具有同源性、相似性、或同一性。可选地，如EMBOSS包(EMBOSS:The European Molecular BiologyOpen Software Suite,Rice et al.,2000,Trends Genet.16:276–277)(5.0.0版或更高版本)的Needleman程序所执行的，可利用Needleman–Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443–453)(包括GCG程序包(Devereux,J.,et al.,Nucleic AcidsResearch 12:387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,[S.][F.,][ET AL,J MOLECBIOL 215]:403(1990)；Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,[ED.,]AcademicPress,San Diego,1994，和[CARILLO ETA/.](1988)SIAM J Applied Math 48:1073)确定同源性、相似性、或同一性。例如，可利用National Center for Biotech InformationDatabase的BLAST或ClustalW确定同源性、相似性、或同一性。

多核苷酸或多肽的同源性、相似性、或同一性可通过利用GAP计算机程序(例如，Needleman et al.(1970),J Mol Biol.48:443)比较序列信息来确定。总之，GAP程序被定义为通过将相似的排列符号(即，核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列中较短者的符号总数而获得的值。GAP程序的默认参数可包括(1)一元数字比较矩阵(含有同一性(identity)值为1和非同一性值为0)和Gribskov et al.(1986)Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵，如Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas Of Protein Sequence And Structure,National Biomedical Research Foundation,pp.353–358(1979)公开(可选地，EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)的替代矩阵)；(2)每个空位的罚值为3.0，且每个空位中的每个符号另外0.10罚值，(可选地，空位开放罚值(gap opening penalty)10、空位延伸罚值(gap extension penalty)0.5)；和(3)端空位无罚值。因此，本公开中使用的术语“同源性”或“同一性”代表序列之间的相关性。

在本公开中，术语“保守取代”是指用具有相似结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸。该变异可具有例如一种或多种保守取代，同时仍具有一种或多种生物活性。这种氨基酸取代通常可基于残基的极性、电荷、溶解性，以及疏水的、亲水的和/或两亲的性质的相似性而发生。例如，带正电荷(碱性)的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电荷(酸性)的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸；芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；而疏水性氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。

进一步，编码α-葡萄糖苷酶的多核苷酸序列可以是编码具有α-葡萄糖苷酶活性并在棒状杆菌属微生物中具有增强的活性以改善L-氨基酸生产能力的蛋白质的多核苷酸序列。例如，编码α-葡萄糖苷酶的多核苷酸序列可以是编码源自青春双歧杆菌的α-葡萄糖苷酶(SEQ ID NO:1)、源自解淀粉欧文氏菌的α-葡萄糖苷酶(SEQ ID NO:28)和源自酿酒酵母的α-葡萄糖苷酶(SEQ ID NO:29)的多核苷酸。例如，多核苷酸序列可具有SEQ ID NO:2的碱基序列、SEQ ID NO:30的碱基序列和SEQ ID NO:31的碱基序列，但由于密码子简并性而可在编码区中修饰碱基序列。另外，通过考虑有机体中优选的密码子，可在不改变氨基酸序列的范围内在编码区中进行各种修饰来表达碱基序列。多核苷酸序列可以是包括编码蛋白质的多核苷序列或与其具有80％、90％、95％、或99％同源性或同一性的多核苷序列的多核苷酸。进一步，如果多核苷酸序列是编码具有同源性或同一性并且具有与蛋白质基本相同或对应效果的蛋白质的多核苷酸序列，则显而易见的是，部分缺失、修饰、取代或添加的多核苷酸序列包括在本公开的范围内。

另外，也可没有限制地包括由已知基因序列——例如，通过在严格条件下与多核苷酸序列的全部或部分互补的序列杂交以编码具有本公开的α-葡萄糖苷酶活性的蛋白质的序列——制备的探针。“严格条件”是指能够在多核苷酸之间特异性杂交的条件。这些条件具体地公开于文献(例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning,A LaboratoryManual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,NewYork,1989)中。例如，可包括杂交具有高同源性的基因——即，具有80％或更高，具体地90％或更高，更具体地95％或更高，更具体地97％或更高，和特别具体地99％或更高同源性的基因而不杂交具有低同源性的基因的条件，或普通Southern杂交的洗涤条件(其在盐浓度和温度对应于60℃、1×SSC、0.1％SDS下，具体地，60℃、0.1×SSC、0.1％SDS下，且更具体地68℃、0.1×SSC、0.1％SDS下洗涤一次，具体地，洗涤两次至三次)。尽管根据杂交的严格程度而可在碱基之间发生错配，但是杂交需要两个多核苷酸具有互补序列。术语“互补的”用于描述可彼此杂交的多核苷酸碱基之间的关系。例如，关于DNA，腺苷与胸腺嘧啶互补，而胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开还可包括与整个序列以及基本相似的核苷酸序列互补的分离核苷酸片段。具体地，具有同源性的多核苷酸利用包括在55℃的T_m值下杂交的杂交条件并且其可使用前述条件检测。另外，T_m值可以是60℃、63℃、或65℃，但不限制于此，并且可由本领域技术人员根据其目的而适当地调节。杂交多核苷酸的适当严格程度取决于多核苷酸的长度和互补程度，且该变量是本领域公知的(参见Sambrook et al.，同上，9.50–9.51,11.7–11.80)。

在本公开中，术语“活性增强”是指当原始微生物与天然状态或突变前状态的蛋白质活性(即，内源活性)进行比较时活性增加，且是包括通过将蛋白质引入不具有特定蛋白质活性的微生物而引入提供其活性的活性的概念。“内源活性”是指天然状态或非突变状态的原始微生物中显示的蛋白质的活性状态。

具体地，“活性增强”不特别限制于此，但可包括通过内源基因活性的增加、由于内部或外部因素引起的内源基因扩增、从外部引入基因、替换或修饰启动子、和通过突变增加酶的活性以及通过增强蛋白质本身的活性而获得超出其原始功能的效果来增强活性。例如，“活性增强”可通过在细胞中编码蛋白质的基因的拷贝数的增加、修饰编码多肽的基因表达调控序列的方法、通过用突变基因替换染色体上编码多肽的基因以增强多肽的活性或诱导编码多肽的染色体上的基因突变以增强多肽的活性来修饰染色体上编码多肽的基因的方法、和从外部引入基因或将基因插入染色体中的方法来进行，但不限制于这些方法。

基因拷贝数的增加没有特别限制，但可被进行为与载体可操作地连接或插入宿主细胞的染色体中。具体地，可将与编码本公开的蛋白质的多核苷酸可操作地连接并且无论宿主如何都复制和起作用的载体引入到宿主细胞中。可选地，可将与多核苷酸可操作地连接以将多核苷酸插入到宿主细胞中的染色体中的载体引入到宿主细胞的染色体中。可通过本领域已知的任何方法(例如，同源重组)进行向多核苷酸的染色体中的插入。由于可通过同源重组将本公开的载体插入到染色体中，因此载体可进一步包括用于确认插入染色体的选择标记(selection marker)。选择标记选择由载体转化的细胞以确认目标多核苷酸的插入，并且标记可用于提供选择性表型，如抗药性、辅源营养、对细胞毒性药物的抗性或表面蛋白的表达，但不限制于此。在用选择剂处理的环境中，由于只有表达选择标记的细胞存活或表现出不同的表达表型，因而可选择转化细胞。

本公开中的术语“载体”指代包含编码靶肽的多核苷酸序列的DNA构建体，编码靶肽的多核苷酸序列与合适的表达调控序列可操作地连接以在合适的宿主中表达靶蛋白。表达调控序列包括能够启动转录的启动子、用于调控这种转录的任何操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、和用于调控转录和翻译终止的序列，但不限制于此。载体可被转化到适当的宿主细胞中，并且然后无论宿主基因组如何都可复制或起作用或可被整合到基因组本身中。本公开中使用的载体没有特别限制，并且可使用本领域已知的任何载体。通常使用的载体的实例可包括天然或重组质粒、黏粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或黏粒载体，可使用pWE15、M13、λMBL3、λMBL4、λIXII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、Charon4A、Charon21A等，而作为质粒载体，可使用基于pDZ、基于pBR、基于pUC、基于pBluescriptII、基于pGEM、基于pTZ、基于pCL和基于pET的质粒。

另外，载体可包含编码信号肽的多核苷酸序列。在本公开中，术语“信号肽”指代这样的蛋白：其中靶蛋白可从细胞中分泌出来，并且可被应用以由编码靶蛋白的基因以整合或分离状态表达。只要本公开的信号肽可从细胞中分泌出来同时维持靶蛋白的功能，其类型就没有特别限制。例如，在本公开中，CgR0949、NCgl2101、CgR1834和ST2(分别为SEQ IDNO14至17)可用作信号肽的实例。此外，本领域技术人员选择已知的适当信号肽以用于α-葡萄糖苷酶的分泌表达。

在本公开中，术语“转化”指代将包括编码靶蛋白的多核苷酸的载体引入到宿主细胞中，以这样的一种方式在宿主细胞中表达多核苷酸编码的蛋白质。只要转化的多核苷酸可在宿主细胞中表达，就包括所有转化的多核苷酸，无论转化的多核苷酸被插入到宿主细胞的染色体中并置于其中还是位于染色体外。另外，多核苷酸包括编码靶蛋白的DNA和RNA。只要多核苷酸可被引入到宿主细胞中并表达，就可以任意形式引入多核苷酸。例如，可以表达盒的形式将多核苷酸引入到宿主细胞中，所述表达盒是包括自我表达所需的所有元件的基因组结构。表达盒通常可包括与多核苷酸可操作地连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点、和翻译终止信号。表达盒可以是可自我复制的表达载体。进一步，多核苷酸还可以原样引入到宿主细胞中，并可操作地连接至在宿主细胞中表达所需的序列。

另外，以上术语“可操作地连接”是指基因序列功能性地连接至启动和介导编码本公开的靶肽的多核苷酸转录的启动子序列。

接下来，增加多核苷酸的表达的表达调控序列的修饰不特别限制于此，但可通过由核酸序列的缺失、插入、非保守或保守取代或其组合诱导序列突变以进一步增强表达调控序列的活性来进行，或者可通过用具有较强活性的核酸序列替换来进行。具体地，可通过用强启动子替换来进行修饰。表达调控序列不特别限制于此，但可包括启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列、调控转录和翻译终止的序列等。

可将强启动子而不是原始启动子连接至多核苷酸表达单元的上部，但不限制于此。已知强启动子的实例可包括cj1至cj7启动子(韩国专利注册号0620092)，spl1、7、或13启动子(韩国专利注册号1783170)，PgapA启动子，lac启动子，trp启动子，trc启动子，tac启动子，λ噬菌体PR启动子，PL启动子和tet启动子。

进一步，染色体上多核苷酸序列的修饰不特别限制于此，但可通过由核酸序列的缺失、插入、非保守或保守取代或其组合诱导表达调控序列上的突变以进一步增强多核苷酸序列的活性来进行，或者可通过用具有更强活性的改进的核苷酸序列替换来进行。然而，其不限制于此。

在蛋白质活性的增强中，没有相应蛋白质的活性，或者其活性或浓度总体上可增加至基于野生型蛋白质或初始微生物菌株中的活性或浓度的1％、10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％、或500％、上至1000％或2000％，但不限制于此。

本公开的棒状杆菌属微生物具有增强的α-葡萄糖苷酶活性以提高上述L-氨基酸生产能力。因此，本公开的棒状杆菌属微生物可用于L-氨基酸生产。

本公开中的术语“L-氨基酸”是指形成活有机体身体的蛋白质的基本构成单元，其中氨基基团和羧基基团与相同的碳原子连接。L-氨基酸可以是选自以下中的至少一种：例如L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸。进一步，L-氨基酸可以是例如微生物的生物合成途径中的天冬氨酸衍生的L-氨基酸，并且可以是通过利用L-天冬氨酸作为底物或中间体生物合成的L-氨基酸。作为更详细的实例，天冬氨酸衍生的L-氨基酸可以是选自以下中的至少一种：L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-异亮氨酸，但不限制于此。

在本公开中，“生产L-氨基酸的微生物”可以是能够从培养基中的碳源生产和积累L-氨基酸的微生物。生产L-氨基酸的微生物类型没有特别限制，但可以属于肠杆菌属(genus Enterobacter)、埃希氏菌属、欧文氏菌属(genus Erwinia)、沙雷氏菌属(genusSerratia)、假单胞菌属(genus Pseudomonas)、普罗威登斯菌属(genus Providencia)、棒状杆菌属和短杆菌属(genus Brevibacterium)的微生物。更具体地，微生物可以是属于棒状杆菌属的微生物。本公开中的“棒状杆菌属”可具体地是谷氨酸棒状杆菌、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、热产氨棒状杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)、有效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)等，但不必须限制于此。更具体地，生产L-氨基酸的微生物可以是谷氨酸棒状杆菌，但不限制于此。

具有增强的α-葡萄糖苷酶活性的棒状杆菌属微生物可以比蛋白质活性增强之前的微生物(即，非修饰的微生物)更高的L-氨基酸产量生产L-氨基酸。

本公开的另一方面是生产L-氨基酸的方法，包括培养生产L-氨基酸的具有增强的α-葡萄糖苷酶活性的棒状杆菌属微生物。

用于生产L-氨基酸的方法可进一步包括从培养的培养基或微生物收集L-氨基酸。

具有增强的α-葡萄糖苷酶活性的微生物和L-氨基酸如上所述。

在本公开中，术语“培养”是指在适当调控的环境条件下使微生物生长。可在本领域已知的适当培养基和培养条件下进行本公开的培养过程。本领域技术人员可根据选择的菌株容易地调节和利用培养过程。具体地，培养可以是分批、连续和补料分批(fed-batch)的，但不限制于此。

培养基中包括的碳源可包括糖和碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂肪，如大豆油、向日葵油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇类，如甘油和乙醇；和有机酸，如乙酸。这些物质可单独使用或作为混合物使用，但不限制于此。培养基中包括的氮源可包括有机氮源，如蛋白胨、酵母提取物、肉汁(gravy)、麦芽汁、玉米沉积物(corn sediment)和大豆；和无机氮源，如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵，并且这些氮源可单独使用或组合使用。然而，来源不限制于此。培养基中包括的磷源可包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和对应的含钠盐，但不限制于此。进一步，在培养基中，可包括金属盐(如，硫酸镁或硫酸铁)，并且可包括氨基酸、维生素和合适的前体。可以分批或连续形式将这些培养基或前体添加到培养物中，但不限制于此。

在培养期间，通过适当的方法将化合物(如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸)添加到培养物中以调节培养物的pH。另外，在培养期间，可通过使用消泡剂(如，脂肪酸多环酯(fatty acid polyclinic ester))来抑制泡沫产生。进一步，可将氧气或含氧气体注入到培养物中以维持培养物的需氧状态，并且可不注入气体，或可注入氮气、氢气或二氧化碳气体以维持厌氧或微好氧状态。培养物的温度通常可以为25℃和40℃且具体地27℃至35℃。培养期可持续直至获得有用物质的期望输出量，且可特别为10至100小时。然而，本公开不限制于此。

根据本公开，可收集和/或另外纯化培养步骤中生产的L-氨基酸，并根据培养方法(例如，分批、连续或补料分批培养方法)利用本领域已知的适当方法从培养基收集期望的L-氨基酸，但本公开不限制于此。例如，可使用离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶和HPLC，并且可利用本领域已知的适当方法从培养基或培养的微生物收集期望的L-氨基酸。

本公开的又一方面提供用于增加L-氨基酸的生产的方法，包括增强微生物中α-葡萄糖苷酶的活性。

本公开的又一方面提供用于增加L-氨基酸生产的α-葡萄糖苷酶的应用。

“增加L-氨基酸的生产”可指增加L-氨基酸生产能力以比增强蛋白质活性之前的微生物(即，非修饰微生物)的更高的L-氨基酸生产量生产L-氨基酸。

具体实施方式

在下文中，将参考实施例更详细地描述本公开。然而，这些实施例仅是本公开的示例，并且本公开的范围不限于这些实施例。

实施例1：用于引入α-葡萄糖苷酶基因的载体的制备

为确认α-葡萄糖苷酶的aglA基因的效果，例如，制备用于将源自青春双歧杆菌的aglA基因(SEQ ID NO:2)插入谷氨酸棒状杆菌菌株的染色体中的载体。为扩增源自谷氨酸棒状杆菌的PgapA启动子，合成设计用于将EcoRI限制酶位点插入到PgapA启动子的5′端的启动子(SEQ ID NO:3)和设计用于将NdeI限制酶位点插入到3′端的引物(SEQ ID NO:4)。结果，获得了包括5′端的EcoRI限制酶位点和3′端的NdeI限制酶位点的PgapA启动子DNA片段。在PCR条件下，在94℃下变性5分钟后，94℃下变性30秒、56℃下退火30秒、和72℃下聚合30秒被重复30次，然后在72℃下进行聚合持续7分钟。

用于扩增PgapA启动子的引物

正向：5′-TCAGAATTCTTGGGATTACCATTGAAGCC-3′(SEQ ID NO:3)

反向：5′-TCACATATGGTGTCTCCTCTAAAGATTGT-3′(SEQ ID NO:4)

为了基于报道的碱基序列扩增源自青春双歧杆菌的aglA基因的ORF，合成设计用于将NdeI限制酶位点和用于蛋白质分泌的信号肽插入起始密码子位置的引物(SEQ IDNO.5至8)和设计使得SpeI限制酶位点被包括在终止密码子末端(bottom)的引物(SEQ IDNO:9)。

信号肽是帮助例如AglA酶在细胞外释放的蛋白质，选择并测试4种类型(SEQ IDNO.14至17)。信号肽的引物序列和氨基酸序列如下(表1)。

[表1]

通过使用青春双歧杆菌的基因组DNA作为模板，获得包括5′端的NdeI限制酶位点和每个信号肽以及3′端的SpeI限制酶位点的aglA ORF片段。在PCR条件下，在94℃下变性5分钟后，94℃下变性30秒、56℃下退火30秒、和72℃下聚合2分钟被重复30次，然后在72℃下进行聚合持续7分钟。

在用包含在两端的限制酶处理四种PCR扩增产物后，用限制酶EcoRI和SalI处理pDZ载体(韩国专利注册号10-0924065)以与获得的DNA片段连接以制备pDZ-PgapA-SP1-aglA(B.al)、pDZ-PgapA-SP2-aglA(B.al)、pDZ-PgapA-SP3-aglA(B.al)、和pDZ-PgapA-SP4-aglA(B.al)载体。

进一步，为了制备具有增强的α-葡萄糖苷酶活性的另一种微生物，确保了源自以下菌株的α-葡萄糖苷酶基因。具体地，通过使用解淀粉欧文氏菌CFBP1430的EAMY_1858(malL)基因组和酿酒酵母的IMA1基因组DNA作为模板获得了malL和Ima1 ORF片段(包括5′端的NdeI限制酶位点和每个信号肽以及3′端的SpeI限制酶位点)。在PCR条件下，在94℃下变性5分钟后，94℃下变性30秒、56℃下退火30秒、和72℃下聚合2分钟被重复30次，然后在72℃下进行聚合持续7分钟。

在用包含在两端的限制酶处理两种PCR扩增产物后，用限制酶EcoRI和SalI处理pDZ载体(韩国专利注册号10-0924065)以与获得的DNA片段连接以制备pDZ-PgapA-SP3-malL(E.am)和pDZ-PgapA-SP3-Ima1(S.ce)载体。

实施例2：引入α-葡萄糖苷酶的微生物的制备

为了将编码α-葡萄糖苷酶的基因引入谷氨酸棒状杆菌菌株，通过电脉冲方法(Vander Rest et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.52:541–545,1999)将实施例1中制备的6种载体转化到生产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株KCCM11016P(该微生物公开为KFCC10881，然后重新保藏于布达佩斯条约下的国际保藏机构，以获得保藏号KCCM11016P，韩国专利注册号10-0159812)中，并筛选其中通过同源染色体重组引入每个基因的菌落。为了通过PCR方法筛选菌落，使用SEQ ID NO.18和19的引物。

用于鉴定aglA基因转移的引物

正向：5′-GACCATTTATTCGCAACTGTG-3′(SEQ ID NO:18)

反向：5′-TCTGCAAGGCGTTCGGAATT-3′(SEQ ID NO.19)

转化的菌株被称为KCCM11016P::PgapA-SP1-aglA(B.al)、KCCM11016P::PgapA-SP2-aglA(B.al)、KCCM11016P::PgapA-SP3-aglA(B.al)KCCM11016P::PgapA-SP4-aglA(B.al)、KCCM11016P::PgapA-SP3-malL(E.am)和KCCM11016P::PgapA-SP3-Ima1(S.ce)。

实施例3：引入α-葡萄糖苷酶的生产赖氨酸的微生物的蛋白质表达的确认

亲株(mother strain)谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P被用作对照组，并通过以下实施例4中示例的方法培养实施例2中制备的6种类型KCCM11016P::PgapA-SP1-aglA(B.al)、KCCM11016P::PgapA-SP2-aglA(B.al)、KCCM11016P::PgapA-SP3-aglA(B.al)、KCCM11016P::PgapA-SP4-aglA(B.al)、KCCM11016P::PgapA-SP3-malL(E.am)和KCCM11016P::PgapA-SP3-Ima1(S.ce)，然后高速离心以获得上清液。通过SDS-PAGE方法使用一部分获得的上清液测量培养基中的α-葡萄糖苷酶的表达。结果，确认在70kDa位置表达的蛋白质(图1)。

实施例4：引入α-葡萄糖苷酶的生产赖氨酸的微生物的L-氨基酸生产能力的评价

亲株谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P被用作对照组，并通过以下方法将实施例2中制备的6种类型KCCM11016P::PgapA-SP1-aglA(B.al)、KCCM11016P::PgapA-SP2-aglA(B.al)、KCCM11016P::PgapA-SP3-aglA(B.al)、KCCM11016P::PgapA-SP4-aglA(B.al)、KCCM11016P::PgapA-SP3-malL(E.am)和KCCM11016P::PgapA-SP3-Ima1(S.ce)培养预定时间，然后测量赖氨酸浓度。结果示例于表2中。首先，将各菌株接种于含有25mL种子培养基(seed medium)的250mL角挡板烧瓶(corner-baffle flask)中，并在30℃下、以200rpm振荡培养20小时。此后，将1mL种子培养溶液接种到含有24mL生产培养基的250mL角挡板烧瓶中，并在32℃下以200rpm振荡培养72小时。种子培养基和生产培养基的组成如下。培养终止后，通过HPLC(Waters 2478)测量L-赖氨酸的浓度。

<种子培养基(pH 7.0)>

20g葡萄糖、10g蛋白胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、4g KH₂PO₄、8g K₂HPO₄、0.5gMgSO₄·7H₂O、100μg生物素、1000μg硫胺素HCl、2000μg泛酸钙、和2000μg尼古丁(基于1L蒸馏水)

<生产培养基(pH 7.0)>

100g葡萄糖、40g(NH₄)₂SO₄、2.5g大豆蛋白、5g玉米浆固体(corn steep solids)、3g尿素、1g KH₂PO₄、0.5g MgSO₄·7H₂O、100μg生物素、1000μg硫胺素HCl、2000μg泛酸钙、3000μg烟酰胺和30g CaCO₃(基于1L蒸馏水)。

[表2]

从结果可以看出，在引入α-葡萄糖苷酶表达能力的所有6种类型的生产赖氨酸的菌株中，赖氨酸生产能力与对照组相比增加了。具体地，在KCCM11016P::PgapA-SP3-aglA(B.al)中，显示生产能力的最高增加。在微生物的培养中，赖氨酸的生产能力由于除生物合成途径之外的基因的活性调控而增加至少3.2％和上至9.7％是非常有意义的结果。另外，通过确认在培养基中未添加异麦芽糖和麦芽糖(其预期用作α-葡萄糖苷酶的底物)的情况下L-氨基酸生产能力增加来证实通过增加本公开的α-葡萄糖苷酶活性而增强L-氨基酸生产能力的效果。根据此结果，在通过本领域技术人员的选择使用适当的信号肽的情况下，预期将显示更高的增加率。

制备的KCCM11016P::PgapA-SP2-aglA(B.al)被称为谷氨酸棒状杆菌CA01-7523，并于2018年3月5日保藏于布达佩斯条约下作为国际保藏机构的韩国微生物保藏中心(KCCM)，以获得保藏号KCCM12228P。

实施例5：引入α-葡萄糖苷酶的CJ3P菌株的制备和赖氨酸生产能力的分析

为了确认即使在另一种生产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株中也将显示相同的效果，通过将3种类型的变体[pyc(P458S)、hom(V59A)、lysC(T311I)]引入野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032菌株，以与实施例2中相同的方式将PgapA-SP3-aglA(B.al)引入具有L-赖氨酸生产能力的谷氨酸棒状杆菌CJ3P(Binder et al.Genome Biology 2012,13:R40)菌株中以制备引入有α-葡萄糖苷酶的菌株。制备的菌株被称为CJ3P::PgapA-SP3-aglA(B.al)。以与实施例4中相同的方式培养作为对照组的CJ3P菌株和CJ3P::PgapA-SP3-aglA(B.al)，并分析赖氨酸生产能力并示例于下表3中。

[表3]

赖氨酸生产能力分析

从分析赖氨酸浓度的结果确认在引入有α-葡萄糖苷酶的菌株中赖氨酸产量增加。另外，在微生物培养中，赖氨酸生产能力由于除生物合成途径之外的基因的活性调控而增加8.8％是非常有意义的结果。进一步，在通过本领域技术人员的选择使用适当信号肽的情况下，预期将显示更高的增加率。

实施例6：引入有α-葡萄糖苷酶的生产苏氨酸的菌株的制备和苏氨酸生产能力的分析

为了清楚地确认由α-葡萄糖苷酶的引入对L-苏氨酸生产能力的变化，将变体引入编码生产高丝氨酸的高丝氨酸脱氢酶的基因并增强，高丝氨酸是L-苏氨酸和L-异亮氨酸的生物合成途径的常见中间体。具体地，将已知hom(G378E)变体(R.Winkels,S.et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.45,612–620,1996)引入实施例5中使用的CJ3P::PgapA-SP3-aglA(B.al)菌株以制备菌株。进一步，制备其中将hom(G378E)变体引入对照CJ3P的菌株。通过以下方法制备用于变体引入的重组载体。

为了制备引入有hom(G378E)的载体，首先，合成引物(SEQ ID NO.20和21)，其中通过使用从野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032菌株提取的基因组DNA作为模板，将限制酶XbaI识别位点插入到hom基因的位置1131至1134的上游和下游约600bp位置处的5′片段和3′片段中。进一步，合成用于取代hom基因的碱基序列的引物(SEQ ID NO.22和23)。制备pDZ-hom(G378E)质粒，使得位于hom基因的5′和3′端的DNA片段(每个600bp)与pDZ载体(韩国专利注册号10-0924065)连接。

用于插入XbaI识别位点的引物

5′片段：5′-TCCTCTAGACTGGTCGCCTGATGTTCTAC-3′(SEQ ID NO:20)

3′片段：5′-GACTCTAGATTAGTCCCTTTCGAGGCGGA-3′(SEQ ID NO:21)

用于取代hom基因的引物

5′-GCCAAAACCTCCACGCGATC-3′(SEQ ID NO:22)

5′-ATCGCGTGGAGGTTTTGGCT-3′(SEQ ID NO:23)

通过使用野生型菌株的染色体作为模板，使用引物(SEQ ID NO.20和22)通过PCR制备5′端基因片段。在PCR条件下，在94℃下变性2分钟后，94℃下变性1分钟、56℃下退火1分钟、和72℃下聚合40秒被重复30次，然后在72℃下进行聚合持续10分钟。以相同的方式，使用引物(SEQ ID NO.21和23)通过PCR制备hom基因的3′端的基因片段。使用来自QuiagenCorporation的PCR纯化试剂盒纯化扩增的DNA片段，然后将其用作插入DNA片段用于制备载体。同时，使用输注克隆试剂盒(Infusion Cloning Kit)将用限制酶XbaI处理并在65℃下加热20分钟的pDZ载体与通过PCR扩增的插入DNA片段彼此连接，并然后转化到大肠杆菌(E.coli)DH5α中，并涂布在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上。筛选由使用SEQ IDNO.20和21的引物通过PCR而插入有靶基因的载体转化的菌落，然后通过公知的质粒提取方法获得质粒，以制备用于将hom(G378E)的碱基取代突变体引入到染色体中的载体pDZ-hom(G378E)。

此后，以与实施例2中相同的方式将制备的pDZ-hom(G378E)载体引入CJ3P和CJ3P::PgapA-SP3-aglA(B.al)菌株，以获得CJ3P::hom(G378E)和CJ3P::PgapA-SP3-aglA(B.al)-hom(G378E)菌株。以与实施例4中相同的方式培养两种获得的菌株，并分析苏氨酸生产浓度并将其示例于下表4中。

[表4]

苏氨酸生产浓度

从分析苏氨酸浓度的结果确认在引入有α-葡萄糖苷酶的菌株中苏氨酸浓度增加了。在微生物培养中，苏氨酸的生产能力由于除生物合成途径之外的基因的活性调控而增加30％是非常有意义的结果。进一步，在通过本领域技术人员的选择使用适当的信号肽的情况下，预期将显示更高的增加率。

实施例7：引入有α-葡萄糖苷酶的生产异亮氨酸的菌株的制备和异亮氨酸生产能力的分析

为了确认由α-葡萄糖苷酶的引入对L-异亮氨酸生产能力的效果，将变体引入编码已知L-苏氨酸脱水酶的基因并增强。具体地，将已知ilvA(V323A)变体(S.Morbach et al.,Appl.Enviro.Microbiol.,62(12):4345–4351,1996)引入实施例6中使用的CJ3P::PgapA-SP3-aglA(B.al)-hom(G378E)菌株以制备菌株。进一步，制备其中ilvA(V323A)变体被引入对照CJ3P::hom(G378E)的菌株。通过以下方法制备用于变体引入的重组载体。

为了制备引入有ilvA(V323A)的载体，首先，合成引物(SEQ ID NO.24和25)，其中通过使用从野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032菌株提取的基因组DNA作为模板将限制酶XbaI识别位点插入到hom基因的位置966至969上游和下游约600bp位置处的5′片段和3′片段中。进一步，合成用于取代ilvA基因的碱基序列的引物(SEQ ID NO.26和27)。制备pDZ-ilvA(V323A)质粒，使得位于ilvA基因的5′和3′端的DNA片段(每个600bp)与pDZ载体(韩国专利注册号10-0924065)连接。

用于插入XbaI识别位点的引物

5′片段：5′-ACGGATCCCAGACTCCAAAGCAAAAGCG-3′(SEQ ID NO:24)

3′片段：5′-ACGGATCCAACCAAACTTGCTCACACTC-3′(SEQ ID NO:25)

用于取代ilvA基因的引物

5′-ACACCACGGCAGAACCAGGTGCAAAGGACA-3′(SEQ ID NO:26)

5′-CTGGTTCTGCCGTGGTGTGCATCATCTCTG-3′(SEQ ID NO:27)

通过使用野生型菌株的染色体作为模板，利用引物(SEQ ID NO.24和26)通过PCR制备5′端基因片段。在PCR条件下，在94℃下变性2分钟后，94℃下变性1分钟、56℃下退火1分钟、和72℃下聚合40秒被重复30次后，然后在72℃下进行聚合持续10分钟。以相同的方式，利用引物(SEQ ID NO.25和27)通过PCR制备ilvA基因的3′端的基因片段。使用来自Quiagen Corporation的PCR纯化试剂盒纯化扩增的DNA片段，然后将其用作插入DNA片段用于制备载体。同时，使用输注克隆试剂盒将用限制酶XbaI处理并在65℃下加热20分钟的pDZ载体与通过PCR扩增的插入DNA片段彼此连接，然后转化到大肠杆菌DH5α中，并涂布在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上。筛选由使用SEQ ID NO.24和25的引物通过PCR而插入有靶基因的载体转化的菌落，然后通过公知的质粒提取方法获得质粒，以制备用于将ilvA(V323A)的碱基取代突变体引入到染色体中的载体pDZ-ilvA(V323A)。

此后，以与实施例2中相同的方式将制备的pDZ-ilvA(V323A)载体引入CJ3P::hom(G378E)和CJ3P::PgapA-SP3-aglA(B.al)-hom(G378E)菌株以获得CJ3P::hom(G378E)-ilvA(V323A)和CJ3P::PgapA-SP3-aglA(B.al)-hom(G378E)-ilvA(V323A)菌株。以与实施例4中相同的方式培养两种获得的菌株，并分析异亮氨酸生产浓度并将其示例于下表5中。

[表5]

异亮氨酸生产浓度

如表5的结果所示，确认在引入有α-葡萄糖苷酶的菌株中异亮氨酸浓度增加了。在微生物培养中，异亮氨酸的生产能力由于除生物合成途径之外的基因的活性调控而增加30％是非常有意义的结果。进一步，在通过本领域技术人员的选择使用适当信号肽的情况下，预期将显示更高的增加率。

本领域技术人员将理解，在不脱离其技术精神或基本特征的情况下，可以其它特定形式实现上述本公开。因此，应理解，上述实施方式在各种意义上旨在是示例性的，而不是限制性的。本公开的范围由以下描述的权利要求而不是详细描述表示，并且其应被解释为权利要求的含义和范围以及源自其等同物的所有改变或修改的形式都在公开的范围内。

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 用于产生L-氨基酸的具有增强的α-葡萄糖苷酶活性的微生物和使用其生产L-氨基酸的方法

<130> OPA19088

<150> KR 10-2018-0116540

<151> 2018-09-28

<160> 31

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 606

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自青春双歧杆菌的aglA

<400> 1

Met Thr Asn Phe Asn Arg Ser Thr Leu Ser Asp Thr Val Arg Ser Asn

1 5 10 15

Gly Ala Thr Pro Asn Pro Trp Trp Ala Asn Ala Val Val Tyr Gln Ile

20 25 30

Tyr Pro Arg Ser Phe Gln Asp Ser Asn Gly Asp Gly Ile Gly Asp Leu

35 40 45

Lys Gly Ile Thr Ser Arg Leu Asp Tyr Leu Ala Asp Leu Gly Val Asp

50 55 60

Val Leu Trp Leu Ser Pro Val Phe Lys Ser Pro Gln Asp Asp Asn Gly

65 70 75 80

Tyr Asp Ile Ser Asp Tyr Gln Asp Ile Asp Pro Leu Phe Gly Thr Met

85 90 95

Ala Asp Met Asp Glu Leu Leu Ala Glu Ala His Lys Arg Gly Leu Lys

100 105 110

Val Ile Met Asp Leu Val Val Asn His Thr Ser Asp Glu His Ala Trp

115 120 125

Phe Gln Ala Ser Arg Asp Lys Asn Asp Pro His Ala Asp Trp Tyr Trp

130 135 140

Trp Arg Pro Ala Lys Pro Gly His Glu Pro Gly Thr Pro Gly Ala Glu

145 150 155 160

Pro Asn Gln Trp Gly Ser Tyr Phe Gly Gly Ser Ala Trp Glu Tyr Asp

165 170 175

Pro Lys Arg Gly Glu Tyr Phe Phe His Gln Tyr Ser Lys Lys Gln Pro

180 185 190

Asp Leu Asn Trp Glu Asn Pro Glu Val Arg Lys Ala Val Tyr Lys Met

195 200 205

Met Asn Trp Trp Met Asp Arg Gly Ile Asp Gly Phe Arg Met Asp Val

210 215 220

Ile Thr Gln Ile Ser Lys Val Ile Asp Lys Asn Gly Lys Leu Pro Gly

225 230 235 240

Glu Ala Gly Ser Glu Ile Ala Asp Asn Pro Val Gly Glu Glu Gly Tyr

245 250 255

Ser Ser Pro Tyr Pro Phe Cys Ser Asp Gly Pro Arg Ile Asp Glu Phe

260 265 270

Leu Ala Glu Met Arg Arg Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Gly Tyr Met

275 280 285

Asn Val Gly Glu Ala Pro Gly Ile Thr Pro Ala Arg Asn Glu His Val

290 295 300

Thr Asp Pro Ala Asn Lys Glu Leu Asp Met Leu Phe Leu Phe Asp His

305 310 315 320

Val Gly Ile Asp Gln Glu Gly Ser Lys Trp Asn Thr Val Pro Phe Glu

325 330 335

Val Lys Asn Leu Arg Asp Arg Met Thr Glu Gln Gln Glu Ala Val Arg

340 345 350

Lys Ala Gly Trp Ala Ser Leu Phe Phe Cys Asn His Asp Gln Pro Arg

355 360 365

Val Val Ser Arg Trp Gly Asn Asp Ser Asp Arg Asp Ser Arg Glu Leu

370 375 380

Ser Ala Lys Ala Phe Gly Met Val Leu His Met His Arg Gly Thr Pro

385 390 395 400

Tyr Ile Tyr Glu Gly Glu Glu Leu Gly Met Thr Asn Ala His Phe Thr

405 410 415

Lys Leu Glu Gln Tyr Arg Asp Leu Glu Ala Leu Asn Gly Tyr Arg Gln

420 425 430

Arg Val Glu Glu Ala Lys Cys Gln Ser Ser Glu Ser Met Met Ala Ala

435 440 445

Leu Ala Leu Ile Gly Arg Asp Asn Ala Arg Thr Pro Met Gln Trp Asp

450 455 460

Ala Ser Lys Tyr Ala Gly Phe Thr Pro Ala Asp Ala Ala Ala Glu Pro

465 470 475 480

Trp Ile Ser Val Asn Pro Asn His Val Glu Ile Asn Ala Ala Glu Glu

485 490 495

Phe Asp Asp Pro Asp Ser Val Tyr Thr Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Ala

500 505 510

Met Arg His Asn Ser Ala Thr Ile Ser Thr Gly Glu Trp His Leu Leu

515 520 525

Ala Ala Asp Ser Asp Gln Val Tyr Ala Phe Thr Arg Thr Asn Gly Asp

530 535 540

Asp Thr Ile Leu Val Val Val Asn Leu Thr Asp Arg Ser Ala Ala Leu

545 550 555 560

Pro Ser Asp Val Ala Glu Leu Leu Ser Asp Gly Val Ser Asp Pro Gln

565 570 575

Val Leu Leu Ser Thr Tyr Asp Ala Met His Ser Val Lys Ser Ile Ala

580 585 590

Arg Gly Glu Leu Ala Arg Trp Glu Gly Val Val Ile Gln Leu

595 600 605

<210> 2

<211> 1821

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自青春双歧杆菌的aglA

<400> 2

atgacgaatt tcaatcgttc cactctttct gacaccgtcc gttcgaatgg cgccaccccg 60

aatccgtggt gggcgaacgc ggtggtctac cagatctatc cccgttcctt ccaggattcc 120

aatggcgatg gcatcggcga tctgaagggc atcaccagcc ggctcgacta tctcgcagat 180

ctcggcgtgg acgtgctatg gctgtccccg gtcttcaagt ccccgcagga cgacaacggc 240

tacgacatct ccgactacca ggacatcgat ccgctgttcg gcacaatggc cgatatggac 300

gagctgcttg ccgaagcgca caagcgcggc ctgaaggtca tcatggacct ggtcgtgaac 360

cacacgtccg acgagcatgc ctggttccag gcttcccgcg acaagaacga tcctcatgcg 420

gattggtatt ggtggcgtcc ggccaagccg ggccatgagc cgggcacgcc cggtgccgag 480

ccgaaccagt ggggctccta tttcggcggc tccgcatggg agtacgatcc gaagcgcggt 540

gaatacttct ttcaccagta ttccaagaag cagcccgacc tcaactggga gaatcccgag 600

gtgcgcaagg ccgtctacaa gatgatgaac tggtggatgg atcgcggcat cgacggcttc 660

cgcatggacg tgatcaccca gatttccaag gtcatcgaca agaacggcaa gttgccgggg 720

gaggcaggat ccgaaatcgc cgataatccg gttggagagg aaggttattc cagcccgtat 780

ccgttctgct ccgacggccc gcgcatcgac gagttcctcg ccgaaatgcg ccgtgaggta 840

ttcgaaggcc gtgaaggcta catgaatgtc ggcgaggctc cgggcatcac cccggcccgt 900

aacgagcacg tcaccgatcc ggccaacaag gaacttgaca tgctattcct gtttgaccat 960

gtcggcatcg accaggaagg ctccaagtgg aataccgtgc cgttcgaggt caaaaacctg 1020

cgcgaccgta tgaccgagca gcaggaggcc gtgaggaagg ccggttgggc cagcctgttc 1080

ttctgcaatc atgaccagcc gcgcgtggtc tcccgttggg gcaacgactc cgaccgcgat 1140

tcgcgcgaac tgagcgccaa ggcgttcggc atggtgctgc acatgcaccg cggcaccccg 1200

tacatttacg aaggcgagga actgggtatg accaacgccc acttcaccaa gctggaacaa 1260

taccgcgatc tggaagccct caacggctat cgccagcgcg tggaggaagc caagtgccag 1320

tcgtccgaat ccatgatggc cgccctcgcc ctcatcggcc gcgacaacgc gcgcaccccc 1380

atgcagtggg acgcctccaa gtatgccggt ttcaccccgg cggacgcggc agccgaaccg 1440

tggatcagcg tcaacccgaa tcatgtggaa atcaacgcgg ccgaggaatt cgacgatccg 1500

gattccgtgt acacgttcta caagaagctc atcgccatgc ggcacaacag cgccaccatc 1560

tccactggcg aatggcatct gctcgccgcc gacagcgatc aggtgtatgc tttcacgcgc 1620

accaatggcg acgacacgat tcttgtcgtg gtcaacctca ccgacaggtc cgcggcgctg 1680

ccttcggacg tggcggagct gctttccgac ggcgtgtccg atccgcaagt actgctcagc 1740

acctatgatg ctatgcatag tgttaaatcg atcgctcgtg gcgagctcgc tcgctgggag 1800

ggagtcgtga ttcagctctg a 1821

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PgapA-F

<400> 3

tcagaattct tgggattacc attgaagcc 29

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PgapA-R

<400> 4

tcacatatgg tgtctcctct aaagattgt 29

<210> 5

<211> 124

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增的aglA ORF SP1-F

<400> 5

tcacatatgc aaataaaccg ccgaggcttc ttaaaagcca ccgcaggact tgccactatc 60

ggcgctgcca gcatgtttat gccaaaggcc aacgcccttg gagcaacgaa tttcaatcgt 120

tcca 124

<210> 6

<211> 148

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增的aglA ORF SP2-F

<400> 6

tcacatatgc attcaaagga agagttaaca gtgcgtaaag gaatttcccg cgtcctctcg 60

gtagcggttg ctagttcaat cggattcgga actgtactga caggcaccgg catcgcagca 120

gctcaagaca cgaatttcaa tcgttcca 148

<210> 7

<211> 115

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增的aglA ORF SP3-F

<400> 7

tcacatatgc gtaagttccg caatactgca atcgcactgg tttcagctgc tgctatctcc 60

ctcggtggag ttactgctgc aaccgctcag gaagctacga atttcaatcg ttcca 115

<210> 8

<211> 94

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增的aglA ORF SP4-F

<400> 8

tcacatatga aaaagaatat cgcatttctt cttgcatcta tgttcgtttt ttctattgct 60

acaaacgcgt acgctacgaa tttcaatcgt tcca 94

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增的aglA ORF-R

<400> 9

tcaactagtt cagagctgaa tcacgactc 29

<210> 10

<211> 116

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增的mall ORF SP3-F

<400> 10

tcacatatgc gtaagttccg caatactgca atcgcactgg tttcagctgc tgctatctcc 60

ctcggtggag ttactgctgc aaccgctcag gaagcttcag gcatcaaact ttcttc 116

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增的mall ORF-R

<400> 11

tcaactagtt caatttagcc tatagatac 29

<210> 12

<211> 116

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增的Ima1 ORF SP3-F

<400> 12

tcacatatgc gtaagttccg caatactgca atcgcactgg tttcagctgc tgctatctcc 60

ctcggtggag ttactgctgc aaccgctcag gaagctacta tttcttctgc acatcc 116

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增的Ima1 ORF-R

<400> 13

tcaactagtt cattcgctga tatatattct t 31

<210> 14

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SP1 (CgR0949)

<400> 14

Met Gln Ile Asn Arg Arg Gly Phe Leu Lys Ala Thr Ala Gly Leu Ala

1 5 10 15

Thr Ile Gly Ala Ala Ser Met Phe Met Pro Lys Ala Asn Ala Leu Gly

20 25 30

Ala

<210> 15

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SP2 (NCgl2101)

<400> 15

Met His Ser Lys Glu Glu Leu Thr Val Arg Lys Gly Ile Ser Arg Val

1 5 10 15

Leu Ser Val Ala Val Ala Ser Ser Ile Gly Phe Gly Thr Val Leu Thr

20 25 30

Gly Thr Gly Ile Ala Ala Ala Gln Asp

35 40

<210> 16

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SP3 (CgR1834)

<400> 16

Met Arg Lys Phe Arg Asn Thr Ala Ile Ala Leu Val Ser Ala Ala Ala

1 5 10 15

Ile Ser Leu Gly Gly Val Thr Ala Ala Thr Ala Gln Glu Ala

20 25 30

<210> 17

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SP4 (ST2)

<400> 17

Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser

1 5 10 15

Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala

20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于确认的aglA-F

<400> 18

gaccatttat tcgcaactgt g 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于确认的aglA-R

<400> 19

tctgcaaggc gttcggaatt 20

<210> 20

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于插入的XbaI-F

<400> 20

tcctctagac tggtcgcctg atgttctac 29

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于插入的XbaI-R

<400> 21

gactctagat tagtcccttt cgaggcgga 29

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于取代的hom-F

<400> 22

gccaaaacct ccacgcgatc 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于取代的hom-R

<400> 23

atcgcgtgga ggttttggct 20

<210> 24

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于插入的XbaI-F (2)

<400> 24

acggatccca gactccaaag caaaagcg 28

<210> 25

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于插入的XbaI-R (2)

<400> 25

acggatccaa ccaaacttgc tcacactc 28

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于取代的ilvA-F

<400> 26

acaccacggc agaaccaggt gcaaaggaca 30

<210> 27

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于取代的ilvA-R

<400> 27

ctggttctgc cgtggtgtgc atcatctctg 30

<210> 28

<211> 599

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自解淀粉欧文氏菌的aglA

<400> 28

Met Ser Gly Ile Lys Leu Ser Ser Val Met Ala Leu Phe Phe Ala Pro

1 5 10 15

Phe Leu Ala Val Ser Ser Gly Gln Val Leu Ala Gly Lys Thr Asp Ile

20 25 30

Ala Thr Thr Gln Val Val His Lys Ser Asp Asp Phe Pro Ala Trp Trp

35 40 45

Lys Gln Ala Val Phe Tyr Gln Val Tyr Pro Arg Ser Phe Lys Asp Thr

50 55 60

Asn Gly Asp Gly Ile Gly Asp Ile Lys Gly Ile Ile Glu Lys Leu Asp

65 70 75 80

Tyr Leu Asn Asn Leu Gly Val Asp Ala Ile Trp Ile Asn Pro His Tyr

85 90 95

Asp Ser Pro Asn Thr Asp Asn Gly Tyr Asp Ile Arg Asp Tyr Arg Lys

100 105 110

Ile Met Lys Glu Tyr Gly Thr Met Glu Asp Phe Asp Arg Leu Ile Ala

115 120 125

Glu Met Asn Lys Arg Asn Met Arg Leu Met Ile Asp Ile Val Ile Asn

130 135 140

His Thr Ser Asp Gln His Arg Trp Phe Val Gln Ser Lys Ser Ser Lys

145 150 155 160

Asp Asn Pro Tyr Arg Glu Tyr Tyr Phe Trp Arg Asp Gly Lys Asn Gly

165 170 175

Gln Pro Pro Asn Asn Tyr Pro Ser Phe Phe Gly Gly Ser Ala Trp Glu

180 185 190

Lys Glu Asp His Ser Gly Gln Tyr Tyr Leu His Tyr Phe Ala Lys Gln

195 200 205

Gln Pro Asp Leu Asn Trp Asp Asn Pro Lys Val Arg Glu Asp Leu Tyr

210 215 220

Ala Met Leu Arg Phe Trp Leu Asp Lys Gly Val Ala Gly Leu Arg Phe

225 230 235 240

Asp Thr Val Ala Thr Tyr Ala Lys Ile Pro Asn Phe Pro Asp Leu Thr

245 250 255

Pro Ser Gln Arg Gln Asn Phe Ala Arg Thr Tyr Thr Glu Gly Pro Ser

260 265 270

Ile His Arg Tyr Ile Lys Glu Met Asn Arg Gln Val Phe Ser His Tyr

275 280 285

Asn Ile Ala Thr Ala Gly Glu Ile Phe Gly Val Pro Leu Glu Lys Ser

290 295 300

Ile Asn Tyr Phe Asp Arg Arg Arg Asn Glu Leu Asn Ile Ala Phe Thr

305 310 315 320

Phe Asp Leu Ile Arg Leu Asp Arg Asn Val Glu Glu Arg Trp Arg Glu

325 330 335

Lys Ala Trp Ser Leu Val Asp Phe Arg Gln Thr Ile Gly Lys Val Asp

340 345 350

Arg Ala Ala Gly Lys Tyr Gly Trp Asn Ala Phe Phe Leu Asp Asn His

355 360 365

Asp Asn Pro Arg Ala Val Ser His Phe Gly Asp Asp Arg Pro Gln Trp

370 375 380

Arg Gln Ala Ser Ala Lys Ala Leu Ala Thr Leu Ile Ile Thr Gln Arg

385 390 395 400

Ala Thr Pro Phe Ile Tyr Gln Gly Ser Glu Leu Gly Met Thr Asn Tyr

405 410 415

Pro Phe Lys Thr Ile Ala Asp Phe Asp Asp Ile Glu Val Lys Gly Phe

420 425 430

Trp Gln Asp Tyr Val Ser Ser Gly Arg Val Asp Pro Glu Asp Phe Met

435 440 445

Arg Asn Val Arg Leu Thr Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Pro Phe Gln

450 455 460

Trp Asp Glu Ser Ala His Ala Gly Phe Thr Ser Gly Thr Pro Trp Phe

465 470 475 480

Lys Val Asn Pro Asn Tyr Lys Leu Ile Asn Ala Ser Asp Gln Met Lys

485 490 495

Asp Ser Asp Ser Val Phe Asn Tyr Tyr Arg Lys Leu Ile Arg Leu Arg

500 505 510

His Ala Ile Pro Ala Leu Thr Tyr Gly Glu Tyr Lys Asp Leu Asp Pro

515 520 525

Tyr Asn Asp Thr Val Tyr Ala Phe Thr Arg Thr His Gly Asp Lys Arg

530 535 540

Tyr Leu Val Val Ile Asn Phe Lys Glu Asn Lys Val Asn Tyr Arg Leu

545 550 555 560

Pro Gly Gln Leu Ser Ile Arg Gln Thr Leu Ser Glu Ser Ser Ala Ser

565 570 575

Gln Arg Val Ala Asp Asn Ala His Glu Leu Leu Leu Gln Pro Trp Gln

580 585 590

Ser Gly Ile Tyr Arg Leu Asn

595

<210> 29

<211> 589

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自酿酒酵母的aglA

<400> 29

Met Thr Ile Ser Ser Ala His Pro Glu Thr Glu Pro Lys Trp Trp Lys

1 5 10 15

Glu Ala Thr Phe Tyr Gln Ile Tyr Pro Ala Ser Phe Lys Asp Ser Asn

20 25 30

Asp Asp Gly Trp Gly Asp Met Lys Gly Ile Ala Ser Lys Leu Glu Tyr

35 40 45

Ile Lys Glu Leu Gly Ala Asp Ala Ile Trp Ile Ser Pro Phe Tyr Asp

50 55 60

Ser Pro Gln Asp Asp Met Gly Tyr Asp Ile Ala Asn Tyr Glu Lys Val

65 70 75 80

Trp Pro Thr Tyr Gly Thr Asn Glu Asp Cys Phe Ala Leu Ile Glu Lys

85 90 95

Thr His Lys Leu Gly Met Lys Phe Ile Thr Asp Leu Val Ile Asn His

100 105 110

Cys Ser Ser Glu His Glu Trp Phe Lys Glu Ser Arg Ser Ser Lys Thr

115 120 125

Asn Pro Lys Arg Asp Trp Phe Phe Trp Arg Pro Pro Lys Gly Tyr Asp

130 135 140

Ala Glu Gly Lys Pro Ile Pro Pro Asn Asn Trp Lys Ser Tyr Phe Gly

145 150 155 160

Gly Ser Ala Trp Thr Phe Asp Glu Lys Thr Gln Glu Phe Tyr Leu Arg

165 170 175

Leu Phe Cys Ser Thr Gln Pro Asp Leu Asn Trp Glu Asn Glu Asp Cys

180 185 190

Arg Lys Ala Ile Tyr Glu Ser Ala Val Gly Tyr Trp Leu Asp His Gly

195 200 205

Val Asp Gly Phe Arg Ile Asp Val Gly Ser Leu Tyr Ser Lys Val Val

210 215 220

Gly Leu Pro Asp Ala Pro Val Val Asp Lys Asn Ser Thr Trp Gln Ser

225 230 235 240

Ser Asp Pro Tyr Thr Leu Asn Gly Pro Arg Ile His Glu Phe His Gln

245 250 255

Glu Met Asn Gln Phe Ile Arg Asn Arg Val Lys Asp Gly Arg Glu Ile

260 265 270

Met Thr Val Gly Glu Met Gln His Ala Ser Asp Glu Thr Lys Arg Leu

275 280 285

Tyr Thr Ser Ala Ser Arg His Glu Leu Ser Glu Leu Phe Asn Phe Ser

290 295 300

His Thr Asp Val Gly Thr Ser Pro Leu Phe Arg Tyr Asn Leu Val Pro

305 310 315 320

Phe Glu Leu Lys Asp Trp Lys Ile Ala Leu Ala Glu Leu Phe Arg Tyr

325 330 335

Ile Asn Gly Thr Asp Cys Trp Ser Thr Ile Tyr Leu Glu Asn His Asp

340 345 350

Gln Pro Arg Ser Ile Thr Arg Phe Gly Asp Asp Ser Pro Lys Asn Arg

355 360 365

Val Ile Ser Gly Lys Leu Leu Ser Val Leu Leu Ser Ala Leu Thr Gly

370 375 380

Thr Leu Tyr Val Tyr Gln Gly Gln Glu Leu Gly Gln Ile Asn Phe Lys

385 390 395 400

Asn Trp Pro Val Glu Lys Tyr Glu Asp Val Glu Ile Arg Asn Asn Tyr

405 410 415

Asn Ala Ile Lys Glu Glu His Gly Glu Asn Ser Glu Glu Met Lys Lys

420 425 430

Phe Leu Glu Ala Ile Ala Leu Ile Ser Arg Asp His Ala Arg Thr Pro

435 440 445

Met Gln Trp Ser Arg Glu Glu Pro Asn Ala Gly Phe Ser Gly Pro Ser

450 455 460

Ala Lys Pro Trp Phe Tyr Leu Asn Asp Ser Phe Arg Glu Gly Ile Asn

465 470 475 480

Val Glu Asp Glu Ile Lys Asp Pro Asn Ser Val Leu Asn Phe Trp Lys

485 490 495

Glu Ala Leu Lys Phe Arg Lys Ala His Lys Asp Ile Thr Val Tyr Gly

500 505 510

Tyr Asp Phe Glu Phe Ile Asp Leu Asp Asn Lys Lys Leu Phe Ser Phe

515 520 525

Thr Lys Lys Tyr Asn Asn Lys Thr Leu Phe Ala Ala Leu Asn Phe Ser

530 535 540

Ser Asp Ala Thr Asp Phe Lys Ile Pro Asn Asp Asp Ser Ser Phe Lys

545 550 555 560

Leu Glu Phe Gly Asn Tyr Pro Lys Lys Glu Val Asp Ala Ser Ser Arg

565 570 575

Thr Leu Lys Pro Trp Glu Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Glu

580 585

<210> 30

<211> 1800

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自解淀粉欧文氏菌的aglA

<400> 30

atgtcaggca tcaaactttc ttcagtcatg gcactcttct tcgccccatt tcttgctgtt 60

agttcaggtc aggtgctcgc aggaaagacg gatatcgcta ccacccaagt ggtgcataag 120

tccgatgact tcccggcatg gtggaagcaa gcggtgtttt accaggttta tccacgcagc 180

ttcaaagaca cgaacggtga tggtattggt gacattaagg gaatcatcga gaagctcgat 240

taccttaaca accttggcgt agatgcgatt tggattaacc cacactacga tagcccaaat 300

actgacaacg gctacgatat tcgtgattac cgcaagatca tgaaagagta cggaaccatg 360

gaagatttcg atcgtttgat cgcagaaatg aataagcgta acatgcgcct catgatcgac 420

atcgttatca accacacttc tgaccagcac cgctggttcg tgcagagcaa gtcgtctaag 480

gataacccgt atcgcgaata ctacttttgg cgcgatggaa agaacggcca accacctaac 540

aactatccgt ccttcttcgg tggttctgcg tgggaaaaag aggaccattc cgggcagtat 600

tatctacatt acttcgctaa acaacagcca gacctgaatt gggataaccc taaggttcgc 660

gaagatttgt acgcgatgct ccggttctgg ctcgacaaag gcgtcgctgg actgcggttc 720

gacaccgtag ccacctacgc taagatcccg aacttccctg acctcacgcc ctcgcaacga 780

cagaattttg cccgaactta taccgaaggt cccagtattc atcggtacat caaagaaatg 840

aacaggcaag tgttttctca ctacaatatc gctacagctg gggagatctt cggcgtcccg 900

ctggaaaagt cgattaacta tttcgaccgt cgacgcaatg aacttaacat tgcatttaca 960

tttgatctga ttcgtttgga tcgtaatgtc gaggaacgct ggcgtgaaaa agcctggtcc 1020

ctggttgatt ttcgccagac gatcggcaag gtagatcgtg cagccggaaa atacggctgg 1080

aacgcattct ttttggacaa ccacgacaac ccacgagctg tctcccactt cggcgatgac 1140

cggcctcaat ggcgccaggc gtctgcaaag gccctggcca ccctgattat cacccagagg 1200

gcgaccccgt ttatctacca gggctccgag ctgggcatga ctaattaccc tttcaagact 1260

atcgcggatt tcgatgacat tgaagtgaag ggtttttggc aggattatgt gagcagcggt 1320

cgagttgacc cagaggattt catgcgcaac gttcgtctaa ccagtcgcga caactcccgc 1380

acacccttcc aatgggacga atcggcccat gctggcttca cctccggcac gccctggttt 1440

aaggtgaacc ctaactataa gctcatcaat gcgtccgatc agatgaagga ttcagattcc 1500

gttttcaact actaccgcaa actcatccgc cttcgccacg ctattcctgc gttgacctac 1560

ggggagtata aagatctgga tccatacaat gacaccgtct acgcatttac ccgcacccac 1620

ggtgacaagc gatacctggt cgtgatcaac tttaaagaga acaaagtcaa ctatcgtttg 1680

cccggtcagc ttagcattcg ccagactctg tccgagtcat cggcatccca acgtgtagcc 1740

gacaatgctc acgagttgct cctgcaacca tggcaatccg gtatctatag gctaaattga 1800

1800

<210> 31

<211> 1770

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自酿酒酵母的aglA

<400> 31

atgactattt cttctgcaca tccagagaca gaaccaaagt ggtggaaaga ggccacgttc 60

tatcaaattt acccagcaag tttcaaagac tctaatgacg atggctgggg tgacatgaaa 120

gggattgcct ccaagctgga gtacatcaaa gagcttggtg ccgatgccat ttggatctca 180

ccattctacg actcgccaca agatgatatg ggttacgata ttgccaacta cgaaaaggtc 240

tggccaacat atggtacgaa tgaagactgc tttgccttga tcgaaaagac acataagctt 300

ggtatgaaat ttatcaccga cttggtcatc aatcactgtt ccagcgaaca tgaatggttc 360

aaagagagca gatcctcgaa gactaatcca aagcgtgact ggttcttctg gagacctcct 420

aaaggttatg acgccgaagg caagccaatt cctccaaaca attggaaatc ctattttggt 480

ggttccgcat ggaccttcga tgaaaagaca caagaattct acttgcgttt gttttgctcc 540

actcaacctg atttgaattg ggagaatgaa gactgtagaa aggcaatcta cgaaagtgcc 600

gttggatact ggttagacca tggtgtagac ggctttagaa ttgatgtcgg aagtttgtac 660

tccaaagttg taggtttacc agatgctcct gttgttgaca aaaactcgac ttggcaatcc 720

agtgatccat acacattgaa tggaccacgt attcacgagt tccatcaaga aatgaatcaa 780

ttcatcagaa acagagtgaa ggatggcagg gagattatga cagttggtga aatgcaacat 840

gcctccgacg aaactaagag actttatacg agtgcttcaa gacacgaact tagtgagtta 900

tttaactttt cccacactga tgtggggact tcacctttgt tccgttacaa cttggtccca 960

tttgaactga aggattggaa gattgccctt gctgagctgt tcaggtacat taatggtaca 1020

gattgttggt caacaatcta tctggaaaat cacgaccaac ctcgttcaat tacgagattt 1080

ggtgacgatt ctcccaagaa ccgtgttatt tctggtaagt tactctctgt gttgctaagt 1140

gccttgaccg gtactctata tgtgtatcag ggacaagagc ttggccaaat caatttcaag 1200

aactggcctg ttgaaaagta cgaggatgtc gaaatcagaa acaactacaa tgccattaaa 1260

gaagagcatg gggaaaactc agaggagatg aaaaagtttt tagaagccat tgcccttatc 1320

tccagggacc atgctagaac acctatgcaa tggtctcgtg aggagccaaa tgctggtttt 1380

tctggtccta gtgctaaacc atggttttac ttgaacgact ctttcagaga aggcattaac 1440

gtcgaagatg aaatcaagga tcccaactcg gttttgaact tctggaagga ggccttgaag 1500

tttagaaagg cgcataaaga cattactgtg tacggatacg atttcgagtt tattgattta 1560

gacaataaga agttgtttag cttcacaaag aagtacaaca ataaaacatt gtttgcggct 1620

ttgaacttta gctctgatgc gacagatttc aagattccaa atgatgattc atcgttcaag 1680

ttagagtttg gaaactatcc aaagaaggag gtagatgcct cttccagaac attgaagcca 1740

tgggaaggaa gaatatatat cagcgaatga 1770

Claims

1.生产L-氨基酸的具有增强的α-葡萄糖苷酶活性的棒状杆菌属(genusCorynebacterium)微生物。

2.权利要求1所述的微生物，其中所述α-葡萄糖苷酶源自青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

3.权利要求1所述的微生物，其中所述α-葡萄糖苷酶由aglA基因编码。

4.权利要求1所述的微生物，其中所述α-葡萄糖苷酶包括包含SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:28或SEQ ID NO:29的氨基酸序列的蛋白质。

5.权利要求1所述的微生物，其中所述L-氨基酸是选自L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-异亮氨酸中的至少一种。

6.权利要求1所述的微生物，其中所述棒状杆菌属微生物是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

7.用于生产L-氨基酸的方法，包括：在培养基中培养生产L-氨基酸的具有增强的α-葡萄糖苷酶活性的棒状杆菌属微生物。

8.权利要求7所述的用于生产L-氨基酸的方法，进一步包括：

从所述培养的培养基或微生物收集所述L-氨基酸。

9.权利要求7所述的用于生产L-氨基酸的方法，其中所述α-葡萄糖苷酶源自青春双歧杆菌、解淀粉欧文氏菌或酿酒酵母。

10.权利要求7所述的用于生产L-氨基酸的方法，其中所述α-葡萄糖苷酶由aglA基因编码。

11.权利要求7所述的用于生产L-氨基酸的方法，其中所述α-葡萄糖苷酶是由SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的氨基酸序列组成的蛋白质。

12.权利要求7所述的用于生产L-氨基酸的方法，其中所述L-氨基酸是选自L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-异亮氨酸中的至少一种。

13.用于增加L-氨基酸的生产的方法，包括增强微生物中α-葡萄糖苷酶的表达。

14.用于增加L-氨基酸的生产的α-葡萄糖苷酶的应用。