CN106795486B

CN106795486B - 棒状细菌转化体及使用该转化体的有机化合物的制造方法

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Publication number: CN106795486B
Application number: CN201580045551.2A
Authority: CN
Inventors: 乾将行; 须田雅子; 平贺和三; 小暮高久
Original assignee: Research Institute of Innovative Technology for the Earth RITE
Current assignee: Research Institute of Innovative Technology for the Earth RITE
Priority date: 2014-08-21
Filing date: 2015-08-20
Publication date: 2021-06-08
Anticipated expiration: 2035-08-20
Also published as: WO2016027870A1; JP6302073B2; EP3184626B1; EP3184626A1; CN106795486A; EP3184626A4; US20180044688A1; JPWO2016027870A1; US10208313B2

Abstract

实施了下述的(A)、(B)、(C)、及(D)的操作的棒状细菌转化体可以以糖类为原料高效地生产莽草酸等，所述操作为：(A)3‑脱氧‑D‑阿拉伯庚酮糖‑7‑磷酸(DAHP)合成酶活性的强化；(B)磷酸转移酶系统(PTS)介导的糖向细胞内的摄取的消失、阻遏或减少；(C)与磷酸转移酶系统不同的糖转运体介导的糖向细胞内的摄取活性及葡萄糖激酶活性的强化；(D)甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶(GAPDH)活性的强化。

Description

棒状细菌转化体及使用该转化体的有机化合物的制造方法

技术领域

本发明涉及实施了可以工业化生产莽草酸那样的操作的棒状细菌转化体、及使用该棒状细菌转化体的高效的有机化合物的制造方法。

背景技术

莽草酸是分子内具有3个不对称碳的光学活性体，被用作多种药品、农药、化妆品等的合成原料，特别是，被用作用于化学合成流感治疗药达菲(注册商标)的重要起始原料。近年，由于达菲对可能在全世界流行的禽流感显示出有效性，因此作为原料的莽草酸的需求在增加。此外莽草酸可以通过化学方法转变为对羟基苯甲酸、苯酚等有用的化学物质，还有望作为这些的合成原料。

以往，莽草酸通过从莽草(Illicium anisatum)、八角(Illicium verum)等植物的果实提取而得到，其提取、纯化方法繁杂，收率低，另外原料为天然物，因此存在难以稳定供给、大量供给的问题。

另一方面，莽草酸是细菌、酵母、植物等所具有的芳香族化合物生物合成途径的重要中间体，可以使用具有该途径的微生物通过发酵法来生产。目前，已经报道了利用大肠杆菌宿主生产莽草酸(专利文献1～7)，生成莽草酸的同时还副生成奎宁酸，其成为妨碍莽草酸纯化的主要因素。另外，由于均随着有氧增殖而生产莽草酸，因此作为原料的葡萄糖大多被用于菌体形成(增殖)，存在作为目标物的莽草酸的收率低的问题。例如，专利文献4、6中记载的莽草酸收率为27％，非常低。专利文献1中记载，来自葡萄糖的莽草酸的最大收率为43％，但该最大收率并未考虑由丙酮酸再生磷酸烯醇丙酮酸、通过非磷酸转移酶系统的葡萄糖摄取等的可能性等，因此认为莽草酸的最大理论收率实际上为86％。由此，上述27％这样的莽草酸相对于糖的收率相对于理论收率为31％这样的低收率。

专利文献8报道了：使用弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)，用对作为4-羟基苯甲酸类似物的4-羟基3-甲氧基苯甲酸具有耐性的突变株生产莽草酸，但突变点未知，莽草酸的生产浓度也低，相对于糖的收率也未知。

专利文献9、10报道了使用枯草杆菌(Bacillus subtilis)的芳香族氨基酸营养缺陷型突变株生产莽草酸，但突变点未知，莽草酸的生产浓度也低，相对于糖的收率也未知。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利4669613生物学的触媒によゐシキミ酸の合成

专利文献2：日本特表2002-535008生物学的触媒によゐシキミ酸の合成

专利文献3：US 6613552 Biocatalytic synthesis of shikimic acid

专利文献4：US 6472169 Biocatalytic synthesis of shikimic acid

专利文献5：EP1151126 Biocatalytic synthesis of shikimic acid

专利文献6：WO 02/29078 Biocatalytic synthesis of shikimic acid

专利文献7：WO 2000/044923 Biocatalytic synthesis of shikimic acid

专利文献8：日本特开2002-281993シキミ酸の製造方法

专利文献9：US 6436664 Method for producing shikimic acid

专利文献10：日本特开2000-287695シキミ酸製造法

非专利文献

非专利文献1：Biotechnology Progress(2003)19，808-814

非专利文献2：Microbial Cell Factories(2013)12：86

发明内容

发明所要解决的问题

本发明的课题在于，提供一种可以以糖类为原料高效生产莽草酸的微生物、及使用该微生物高效制造莽草酸等有机化合物的方法。

用于解决问题的方法

为了解决上述课题，本发明人们反复进行了研究，发现通过对棒状细菌实施以下的(A)～(D)的操作，从而由葡萄糖等以高浓度且高收率生成莽草酸。另外，还发现在莽草酸生产中一直成为问题的奎宁酸的副生成非常少。

(A)3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合成酶活性的强化

(B)磷酸烯醇丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)介导的糖向细胞内的摄取的消失、阻遏、或减少

(C)与磷酸烯醇丙酮酸-糖磷酸转移酶系统不同的糖转运体介导的糖向细胞内的摄取活性、及葡萄糖激酶活性的强化

(D)甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性的强化

另外发现，该棒状细菌在有氧且实质上不增殖的条件下反应时，莽草酸的生产效率特别高。

本发明是基于上述见解而完成的，提供以下的棒状细菌转化体及有机化合物的制造方法。

项1.一种棒状细菌转化体，实施了下述的(A)、(B)、(C)、及(D)的操作而得：

(A)3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合成酶活性的强化，

(B)磷酸烯醇丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)介导的糖向细胞内的摄取的消失、阻遏、或减少，

(C)与磷酸烯醇丙酮酸-糖磷酸转移酶系统不同的糖转运体介导的糖向细胞内的摄取活性、及葡萄糖激酶活性的强化，

(D)甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性的强化。

项2.根据项1所述的棒状细菌转化体，其中，二羟丙酮磷酸的磷酸酶活性消失、阻遏或减少。

项3.根据项1或2所述的棒状细菌转化体，其中，3-脱氢奎宁酸合成酶活性、3-脱氢奎宁酸脱水酶活性、及莽草酸脱氢酶活性中的任意一种以上得到强化。

项4.根据项1～3中任一项所述的棒状细菌转化体，其中，转酮醇酶活性、及转醛醇酶活性中的任意一种以上得到强化。

项5.根据项1～4中任一项所述的棒状细菌转化体，其中，莽草酸激酶活性、奎宁酸/莽草酸脱氢酶活性、及3-脱氢莽草酸脱水酶活性中的任意一种以上消失、阻遏或减少。

项6.根据项1～5中任一项所述的棒状细菌转化体，其具有葡萄糖和选自由木糖、阿拉伯糖及纤维二糖组成的组中的至少1种糖的利用能力。

项7.根据项1～6中任一项所述的棒状细菌转化体，其中，通过导入下述的(a)或(b)的DNA，3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶活性得到强化，

(a)由序列号1中记载的碱基序列组成的DNA，

(b)由与序列号1具有90％以上的同一性的碱基序列组成的、编码3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶的DNA。

项8.根据项1～7中任一项所述的棒状细菌转化体，其中，通过使编码磷酸烯醇丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)的构成因子的基因中、编码组氨酸-可磷酸化蛋白(Histidine-phosphorylatable protein：HPr)的ptsH、编码酶I(Enzyme I)的ptsI、及编码葡萄糖特异性酶II(Enzyme II)的ptsG基因中的一种以上破坏、缺失、或突变，从而PTS介导的糖向细胞内的摄取消失、阻遏、或减少。

项9.根据项1～8中任一项所述的棒状细菌转化体，其中，与PTS不同的糖转运体为肌醇转运体。

项10.根据项9所述的棒状细菌转化体，其中，通过导入下述的(c)或(d)的DNA，肌醇转运体介导的糖向细胞内的摄取活性得到强化，

(c)由序列号2中记载的碱基序列组成的DNA，

(d)由与序列号2具有90％以上的同一性的碱基序列组成的、编码肌醇转运体的DNA。

项11.根据项1～10中任一项所述的棒状细菌转化体，其中，通过导入下述的(e)或(f)的DNA，葡萄糖激酶活性得到强化，

(e)由序列号3、4、或5中记载的碱基序列组成的DNA，

(f)由与序列号3、4、或5具有90％以上的同一性的碱基序列组成的、编码葡萄糖激酶的DNA。

项12.根据项1～11中任一项所述的棒状细菌转化体，其中，通过导入下述的(g)或(h)的DNA，甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性得到强化，

(g)由序列号6中记载的碱基序列组成的DNA，

(h)由与序列号6具有90％以上的同一性的碱基序列组成的、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的DNA。

项13.根据项3～12中任一项所述的棒状细菌转化体，其中，3-脱氢奎宁酸合成酶活性的强化是通过下述的(i)或(j)的DNA的导入而实现的，3-脱氢奎宁酸脱水酶活性的强化是通过下述的(k)或(l)的DNA的导入而实现的，莽草酸脱氢酶活性的强化是通过下述的(m)或(n)的DNA的导入而实现的，

(i)由序列号7中记载的碱基序列组成的DNA，

(j)由与序列号7具有90％以上的同一性的碱基序列组成的、编码3-脱氢奎宁酸合成酶的DNA，

(k)由序列号8中记载的碱基序列组成的DNA，

(l)由与序列号8具有90％以上的同一性的碱基序列组成的、编码3-脱氢奎宁酸脱水酶的DNA，

(m)由序列号9中记载的碱基序列组成的DNA，

(n)由与序列号9具有90％以上的同一性的碱基序列组成的、编码莽草酸脱氢酶的DNA。

项14.根据项4～13中任一项所述的棒状细菌转化体，其中，转酮醇酶活性的强化是通过下述的(o)或(p)的DNA的导入而实现的，转醛醇酶活性的强化是通过下述的(q)或(r)的DNA的导入而实现的，

(o)由序列号10中记载的碱基序列组成的DNA，

(p)由与序列号10具有90％以上的同一性的碱基序列组成的、编码转酮醇酶的DNA，

(q)由序列号11中记载的碱基序列组成的DNA，

(r)由与序列号11具有90％以上的同一性的碱基序列组成的、编码转醛醇酶的DNA。

项15.根据项1～14中任一项所述的棒状细菌转化体，其中，棒状细菌为谷氨酸棒状杆菌。

项16.根据项15所述的棒状细菌转化体，其中，对谷氨酸棒状杆菌R(FERM BP-18976)、ATCC13032、或ATCC13869实施了上述操作。

项17.谷氨酸棒状杆菌SKM7(保藏编号：NITE BP-01903)。

项18.一种有机化合物的制造方法，其含有下述工序：在含有糖类的反应液中培养项1～17中任一项所述的棒状细菌转化体的工序，以及回收反应液中的选自由莽草酸、3-脱氢莽草酸、3-脱氢奎宁酸、原儿茶酸、分支酸、没食子酸(gallic acid)、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、邻氨基苯甲酸、对羟基苯甲酸、对氨基苯甲酸、苯酚、及邻苯二酚组成的组中的至少1种有机化合物的工序。

项19.根据项18中记载的方法，其中，在有氧且棒状细菌转化体不增殖的条件下培养棒状细菌转化体。

发明效果

通过使用对棒状细菌实施上述特定操作而得到的转化体，可以由葡萄糖等糖类以高浓度且高收率制造莽草酸。另外，由于在以往莽草酸纯化时分离成为问题的奎宁酸的副生成得以抑制，因此莽草酸的纯化容易进行。

另外，该棒状细菌转化体也高效地生产由莽草酸代谢生成的有机化合物、由糖到莽草酸的代谢途径中存在的化合物。

进而，就该棒状细菌转化体而言，通过在增殖抑制条件下且进行有氧反应，包括莽草酸在内的有机化合物的生产效率进一步提高。

因此，通过本发明，能够廉价、大量地生产作为抗流感药的原料有用的莽草酸等。

本发明中，从莽草酸生产效率的观点出发，重要的是使用棒状细菌作为宿主及通过人工操作将特定的基因组合。作为棒状细菌的其它优点，可以列举：棒状细菌与大肠杆菌不同，不生成内毒素；在限制增殖条件下也发生反应，因此无需在培养液中添加大肠杆菌的增殖通常需要的芳香族氨基酸、4-氨基苯甲酸、4-羟基苯甲酸等；在限制增殖条件下发生莽草酸生成反应，因此糖不用于增殖而是用于目标物质的生产，从而收率高。

附图说明

图1为示出棒状细菌中的从糖的摄取至莽草酸等的生产的代谢途径的图。

具体实施方式

以下对本发明进行详细说明。

为了使本发明易于理解，图1中示意性示出棒状细菌中的从糖的摄取至莽草酸等的生产的代谢途径。

(1)莽草酸生产能力得以提高的棒状细菌转化体

本发明的莽草酸生产能力得以提高的棒状细菌转化体是实施了下述的(A)、(B)、(C)、及(D)的操作的转化体：

(A)3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合成酶活性的强化，

(B)磷酸烯醇丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)介导的糖向细胞内的摄取的消失、阻遏或减少，

(C)与PTS不同的糖转运体介导的糖向细胞内的摄取活性、及葡萄糖激酶活性的强化，

(D)甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性的强化。

DAHP合成酶活性的强化

3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合成酶是由赤藓糖-4-磷酸(E4P)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)来生成作为芳香族化合物生物合成的共同途径的初始代谢产物DAHP的酶。

DAHP合成酶活性可以通过下述方式而强化：通过导入DAHP合成酶基因、或在棒状细菌的染色体上的DAHP合成酶基因的调控序列及基因编码区域中导入突变、或者进行序列置换，从而使该基因表达量增加或使该基因产物的活性增大。

其中，通过导入DAHP合成酶基因而强化DAHP合成酶活性的方式简便、效率高。

对所导入的DAHP合成酶基因的来源没有特别限定，从莽草酸生产效率高的观点出发，优选来自大肠杆菌(Eschelichia coli)的基因。

作为来自大肠杆菌的DAHP合成酶基因，更优选由序列号1的碱基序列组成的DNA(aroG^S180F)。本发明人们通过比较研究发现，该基因为在来自大肠杆菌的作为DAHP合成酶基因之一的aroG基因中导入有使该基因所编码的氨基酸序列的第180位的丝氨酸突变为苯丙氨酸的突变(S180F)的基因，其基因产物对包括芳香族氨基酸在内的芳香族化合物的反馈抑制显示出耐性，并且显示出高DAHP合成酶活性(未发表)。

另外，本发明中还可以使用如下DNA：由与序列号1具有90％以上、尤其是95％以上、尤其是98％以上的同一性的碱基序列组成、编码具有DAHP合成酶活性的多肽的DNA。

本发明中，碱基序列的同一性是通过GENETYX ver.8(GENETYX株式会社ゼネテイツクス制)算出的值。

另外，本发明中还可以使用如下DNA：与由序列号1的互补碱基序列组成的DNA在严格条件下杂交、且编码具有DAHP合成酶活性的多肽的DNA。

本发明中，“严格条件”是指：在6×SSC的盐浓度的杂交溶液中、在50～60℃的温度条件下杂交16小时且在盐浓度0.1×SSC的溶液中进行洗涤的条件。

本发明中，DNA所编码的蛋白质为DAHP合成酶这一点可如下确认：对该DNA所编码的蛋白质，测定DAHP合成酶活性。就DAHP合成酶活性而言，制备在含有20mM Bis-Tris丙烷缓冲液(pH6.8)、500μM磷酸烯醇丙酮酸(PEP)钠、500μM赤藓糖-4-磷酸、1mM氯化锰的试验用液中添加有受试酶的反应液，测定表示PEP的吸收(＝2800/M·cm)的232nm的吸光度的减少作为指标。将28℃下、1分钟内生成1μmol的DAHP的活性作为1单位的DAHP合成酶活性。

另外，本发明中，棒状细菌转化体的DAHP合成酶活性得到强化这一点通过测定棒状细菌转化体的细胞提取液中的DAHP合成酶活性来确认。

PTS介导的糖向细胞内的摄取的消失/阻遏/减少

磷酸烯醇丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)为仅存在于原核生物中的糖输送机制，其特征在于，使葡萄糖等糖向细胞内的摄取和糖的磷酸化偶联进行。在大肠杆菌、棒状细菌中，PTS在糖向细胞内的摄取中发挥着主要作用。PTS由作为通用组件的酶I(Enzyme I)(PEPProtein kinase，PEP蛋白激酶)、HPr(Histidine-phosphorylatable protein；组氨酸-可磷酸化蛋白)、及作为与各种糖的特异性输送相关的膜蛋白的酶II(Enzyme II)构成，是以来自糖酵解的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)为磷酸供体、通过这些构成因子间的磷酸传递而将糖以磷酸化体形式向细胞内输送的系统。但是，就PTS而言，随着葡萄糖向细胞内的输送，消耗作为包括莽草酸在内的芳香族化合物的共同前体之一的PEP。因此，为了高效生产莽草酸等芳香族化合物，优选利用不消耗PEP的与PTS不同的葡萄糖输送体系。

通过棒状细菌的染色体上的编码PTS的基因的破坏、缺失、或突变，可以使PTS介导的糖向细胞内的摄取消失、阻遏、或减少。

编码酶I的基因、编码Hpr的基因、及编码酶II的基因中的1个以上破坏、缺失、或突变即可，优选编码作为PTS的通用组件的Hpr蛋白的基因被破坏、缺失、或突变。

作为编码与葡萄糖输送相关的PTS的基因，可以列举：编码酶I的ptsI、编码Hpr的ptsH、编码酶II的ptsG等。这些中的1个以上破坏、缺失、或突变即可，优选编码作为PTS的通用组件的Hpr蛋白质的ptsH基因被破坏、缺失、或突变。

按照使基因的部分序列缺失从而不产生功能正常的蛋白质方式制作改变了的缺失型基因，用含有该基因的DNA转化细菌，在缺失型基因和染色体上的基因间引起同源重组，从而可以将染色体上的基因置换为缺失型或破坏型的基因。即使生成由缺失型或破坏型的基因编码的蛋白质，也具有与野生型蛋白质不同的立体结构，功能下降或消失。这种利用同源重组的基因置换来进行基因缺失或破坏的方法已经建立，包括使用含有温度敏感性复制起点的质粒、能进行接合转移的质粒的方法，利用在宿主内不具有复制起点的自杀载体的方法等(美国专利第6303383号、日本特开平05-007491号)。

本发明中，棒状细菌转化体的PTS介导的糖的输送活性消失、阻遏、或减少这一点可以如下确认：对于该转化体而言，以通过PTS输送的糖(葡萄糖、蔗糖、果糖等)为碳源的生长消失、阻遏、或被抑制，且这种表型通过导入正常的pts基因而恢复。

与PTS不同的糖输送体系介导的糖摄取活性的强化

已知在谷氨酸棒状杆菌中存在与PTS不同的葡萄糖输送体系(非PTS葡萄糖通透酶)，其在糖的摄取中不消耗PEP。通过破坏pts基因等阻遏了由PTS介导的糖摄取的谷氨酸棒状杆菌无法以葡萄糖为单一碳源进行增殖、或增殖能力显著降低，但使该菌株高表达非PTS葡萄糖通透酶时，以葡萄糖为单一碳源的增殖会恢复(Ikeda，M.，et al.，Identification and application of a different glucose uptake system thatfunctions as an alternative to the phosphotransferase system inCorynebacterium glutamicum.Appl.Microbiol.Biotechnol.90：1443-1451，Lindner，S.N.，et al.，Phosphotransferase system-independent glucose utilization inCorynebacterium glutamicum by inositol permeases and glucokinases.Appl.Environ.Microbiol.77：3571-3581)。

本发明中优选的是，对于阻断了基于PTS的糖输送的谷氨酸棒状杆菌而言，通过强化不会随着糖输送而消耗PEP的非PTS葡萄糖通透酶活性，来改善葡萄糖向细胞内的摄取及以葡萄糖为碳源的菌增殖。认为由此能够避免与葡萄糖的输送相伴的PEP消耗，使更多的PEP供于莽草酸等芳香族化合物的生物合成。

基于非PTS葡萄糖通透酶的葡萄糖向细胞内的摄取可以通过下述方式而强化：通过导入编码非PTS葡萄糖通透酶的基因、或在棒状细菌的染色体上的非PTS葡萄糖通透酶基因(调控序列或编码区域)中导入突变、或者进行碱基序列置换，使该基因表达量增加或使该基因产物的活性增大。

其中，通过导入非PTS葡萄糖通透酶基因而强化葡萄糖的摄取活性的方式简便、效率高。

对所导入的非PTS葡萄糖通透酶基因的来源没有特别限定，从莽草酸生产效率高的观点出发，优选棒状杆菌属细菌，尤其优选谷氨酸棒状杆菌。

非PTS葡萄糖通透酶只要在棒状细菌内发挥功能即可，可以列举：来自谷氨酸棒状杆菌的肌醇转运体(iolT1、iolT2)、来自大肠杆菌(Escherichia coli)的半乳糖通透酶(galP)、来自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的葡萄糖易化体蛋白(glf)等。其中，从莽草酸生产效率好的观点出发，优选强化来自谷氨酸棒状杆菌的肌醇转运体介导的糖摄取活性。

作为来自谷氨酸棒状杆菌的肌醇转运体基因，可以列举由序列号2的碱基序列组成的DNA(iolT1)。

另外，本发明中还可以使用如下DNA：由与序列号2具有90％以上、尤其是95％以上、尤其是98％以上的同一性的碱基序列组成的、编码具有肌醇转运体活性的多肽的DNA。

另外，本发明中还可以使用如下DNA：与由序列号2的互补碱基序列组成的DNA在严格条件下杂交、且编码具有肌醇转运体活性的多肽的DNA。

本发明中，DNA所编码的蛋白质为非PTS葡萄糖通透酶这一点可以以下述指标来确认：对于由于ptsH基因破坏等而丧失PTS依赖性葡萄糖输送能力、以葡萄糖为碳源的生长下降的宿主细胞，导入该DNA并使其表达的转化体的以葡萄糖为碳源的生长或葡萄糖消耗速度与转化前的细胞相比提高，而且，其效果不受由pts基因破坏等引起的PTS依赖性糖输送阻遏的影响。

另外，本发明中，棒状细菌转化体的非PTS葡萄糖通透酶活性得到强化这一点可以以下述指标来确认：对于因pts基因破坏等而PTS依赖性葡萄糖输送能力缺失的宿主细胞的以葡萄糖为碳源的生长或葡萄糖消耗速度而言，与基因导入前的菌株相比，该棒状细菌转化体的情况下更高。

葡萄糖激酶活性的强化

通过非PTS葡萄糖通透酶摄取到细胞内的葡萄糖与通过PTS进行的糖输送不同的是，其未被磷氧化。因此，为了使通过非PTS葡萄糖通透酶摄取到细胞内的葡萄糖能够通过糖酵解而代谢，首先需要通过葡萄糖激酶活性而转变成葡萄糖-6-磷酸。葡萄糖激酶是催化由葡萄糖向葡萄糖-6-磷酸转变的酶。

本发明中，在强化非PTS葡萄糖通透酶依赖性葡萄糖输送的同时，葡萄糖激酶活性得到强化。由此，特征在于，葡萄糖向细胞内的摄取以及其后续的糖酵解、戊糖磷酸途径的糖代谢得到促进。

葡萄糖激酶活性可以通过下述方式而强化：通过导入葡萄糖激酶基因而使其高表达、或者通过对染色体上的葡萄糖激酶基因(调控序列及基因编码区域)导入突变或进行序列置换而使该基因表达量增加或使该基因产物的活性增大。

在谷氨酸棒状杆菌R菌株的染色体上，作为葡萄糖激酶基因，至少存在cgR_2067(glk1)、cgR_2552(glk2)及cgR_1739(ppgK)这3种。其中，cgR_2067(glk1)及cgR_2552(glk2)与以ATP为良好底物的葡萄糖激酶具有高同源性；cgR_1739(ppgK)与以多聚磷酸为良好底物的葡萄糖激酶具有高同源性。本发明中，优选这些葡萄糖激酶基因中的1种以上得到强化，更优选3种全部得到强化。

通过导入葡萄糖激酶基因来进行葡萄糖激酶活性的强化的方式简便、效率好。

对所导入的葡萄糖激酶基因的来源没有特别限定，从莽草酸生产效率好的观点出发，优选棒状杆菌属细菌，其中优选谷氨酸棒状杆菌。

作为来自谷氨酸棒状杆菌的葡萄糖激酶基因，可以列举由序列号3、序列号4及序列号5的碱基序列组成的DNA(分别为glk1、glk2、及ppgK)。

另外，本发明中还可以使用如下DNA：由与序列号3、4、或5具有90％以上、尤其是95％以上、尤其是98％以上的同一性的碱基序列组成且编码具有葡萄糖激酶活性的多肽的DNA。

另外，本发明中还可以使用如下DNA：与由序列号3、4、或5的互补碱基序列组成的DNA在严格条件下杂交、且编码具有葡萄糖激酶活性的多肽的DNA。

本发明中，DNA所编码的蛋白质为葡萄糖激酶这一点可以通过测定该DNA所编码的蛋白质的葡萄糖激酶活性来确认。葡萄糖激酶活性通过如下操作测定：在33℃下，在含有100mM Tris盐酸缓冲液(pH7.5)、4mM氯化镁、1mM ATP、0.2mM NADP⁺、20mM葡萄糖、1U葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的反应用混合液中添加酶液而开始反应，通过Beckman DU800分光光度计(Beckman Coulter，Inc.制)监测表示NADPH生成的340nm的吸收(＝6220/M·cm)。将33℃下、1分钟内生成1μmol的NADPH的活性作为1单位的葡萄糖激酶活性。

另外，本发明中，棒状细菌转化体的葡萄糖激酶活性得到强化这一点通过测定该转化体的细胞提取液中的葡萄糖激酶活性来确认。

GAPDH活性的强化

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)是将甘油醛-3-磷酸转变为1，3-二磷酸甘油酸的酶。

本发明的棒状细菌转化体中，GAPDH活性得到强化。

本发明中，pts基因被破坏且强化了非PTS葡萄糖通透酶介导的葡萄糖的摄取及葡萄糖激酶活性的棒状细菌转化体中，作为糖酵解代谢中间体的二羟丙酮磷酸的去磷酸化代谢产物、即二羟基丙酮(DHA)显著累积。另外，甘油醛-3-磷酸及其上游的糖酵解代谢中间体的细胞内浓度在该棒状细菌转化体中显著增大。认为由GAPDH催化的反应阶段为该棒状细菌转化体中的依赖糖酵解代谢的糖消耗活性的限速步骤，其结果引起溢出代谢，引起DHA的累积。

因此，本发明的特征在于，通过强化该棒状细菌转化体的GAPDH活性，解除了糖代谢的限速、促进了糖消耗，同时提高了莽草酸生产能力。

本发明人们的研究组发现，利用棒状细菌在厌氧条件下生产物质时，GAPDH活性会由于厌氧条件下特异性累积的NADH而受到活性阻遏，通过糖酵解进行的糖消耗受到阻遏(Inui，M.et.al.，Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum duringlactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7：182-196(2004))。但是，此前并不知道通过在NADH保持为相对较低浓度的有氧条件下强化GAPDH活性、糖消耗被活化、与目标产物的高效生产有关。

本发明的特征在于，在NADH保持相对低浓度的有氧条件下，在依赖已得到强化的非PTS葡萄糖通透酶依赖性糖输送的棒状细菌转化体中，通过强化GAPDH活性，糖代谢活性显著提高，使目标化合物高效生产。

GAPDH活性可以通过下式方式而强化：通过导入GAPDH基因而使其高表达、或者通过在棒状细菌的染色体上的GAPDH基因(调控序列及基因编码区域)中导入突变、或者进行序列置换而使该基因表达量增加或使该基因产物的活性增大。

其中，通过导入GAPDH基因而进行GAPDH活性的强化的方式简便、效率好。

对所导入的GAPDH基因的来源没有特别限定，从莽草酸生产效率好的观点出发，优选棒状杆菌属细菌，其中优选谷氨酸棒状杆菌。

作为来自谷氨酸棒状杆菌的GAPDH基因，可以列举由序列号6的碱基序列组成的DNA(gapA)。

另外，本发明中还可以使用如下DNA：由与序列号6具有90％以上、尤其是95％以上、尤其是98％以上的同一性的碱基序列组成且编码具有GAPDH活性的多肽的DNA。

另外，本发明中还可以使用如下DNA：与由序列号6的互补的碱基序列组成的DNA在严格条件下杂交、且编码具有GAPDH活性的多肽的DNA。

本发明中，DNA所编码的蛋白质为GAPDH这一点可通过测定该DNA所编码的多肽的GAPDH活性来确认。GAPDH活性的测定可以通过如下操作进行：在33℃下，在含有25mM磷酸缓冲液(pH7.5)、25mM三乙醇胺(pH7.5)、0.2mM EDTA、5mM NAD⁺、5mM甘油醛-3-磷酸的反应用混合液中添加酶液而开始反应，通过Beckman DU800分光光度计(Beckman Coulter，Inc.制)监测表示NADH的生成的340nm的吸收(＝6220/M·cm)。将33℃下、1分钟内生成1μmol的NADH的活性作为1单位的GAPDH活性。

另外，本发明中，棒状细菌转化体的GAPDH活性得到强化这一点通过测定该棒状细菌转化体的细胞提取液中的GAPDH活性来确认。

二羟丙酮磷酸(DHAP)去磷酸化活性的消失/阻遏/减少

DHAP磷酸酶是催化DHAP去磷酸化从而使其转变为二羟基丙酮(DHA)的酶。

本发明的棒状细菌优选DHAP磷酸酶活性消失、阻遏、或减少。如上所述，对于糖向细胞内的摄取依赖于高表达的非PTS葡萄糖通透酶及葡萄糖激酶的棒状细菌莽草酸生产菌株而言，高产作为副产物的DHA。因此认为，通过阻断其的生成途径，能够将更多的碳供于莽草酸等芳香族化合物的生成。

谷氨酸棒状杆菌具有HAD(haloacid dehalogenase，卤酸脱卤酶)超家族磷酸酶(HdpA)作为催化DHAP的去磷酸化的酶。谷氨酸棒状杆菌的DHAP磷酸酶活性可以通过染色体上的DHAP磷酸酶基因(hdpA)的破坏、缺失、或突变而消失、阻遏、或减少。

另外，本发明中，棒状细菌转化体的DHAP磷酸酶活性消失、阻遏、或减少这一点可通过测定该转化体的细胞提取液中的DHAP磷酸酶活性来确认。DHAP磷酸酶活性可如下测定：在33℃下，在含有100mM Tris-苹果酸缓冲液(pH7.5)、5mM硫酸镁、5mM DHAP的反应用混合液中添加酶液而开始反应，按照公知方法(Gawronski，J.D.，et.al.，Microtiter assayfor glutamine synthetase biosynthetic activity using inorganic phosphatedetection.Anal.Biochem.327：114-118(2004))对由DHAP游离的无机磷酸离子进行比色定量。在该定量值减少或消失时，判定为二羟丙酮磷酸磷酸酶活性消失、阻遏、或减少。

3-脱氢奎宁酸(3-DHQ)合成酶活性、3-DHQ脱水酶活性及莽草酸脱氢酶活性的强化

作为芳香族化合物生物合成共同代谢途径上的最初代谢物质的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)是通过PEP和E4P的缩合而生成的。DAHP进一步通过基于3-DHQ合成酶、3-DHQ脱水酶、及莽草酸脱氢酶催化的连续反应而转变为莽草酸。3-DHQ合成酶是催化由DAHP转变为3-脱氢奎宁酸的酶，3-DHQ脱水酶为催化由3-DHQ转变为3-DHS的酶，莽草酸脱氢酶为催化由3-DHS转变为莽草酸的酶。本发明中，通过强化这些酶活性，能够强化由DAHP向莽草酸的碳流向、提高莽草酸等目标芳香族化合物的生产率。

本发明的棒状细菌优选这些酶活性中的任意1个以上得到强化，另外，更优选这些活性全部得到强化。

3-DHQ合成酶、3-DHQ脱水酶、莽草酸脱氢酶的各酶活性能够通过下式方式而强化：通过导入编码各酶的基因、或者在编码各酶的棒状细菌的染色体基因(分别为aroB、aroD、及aroE)的调控序列或基因编码区域中导入突变、或者进行序列置换而使该基因表达量增加或使该基因产物的活性增大。其中，通过导入该酶基因来进行该酶活性的强化的方式简便、效率好。

对所导入的各酶基因的来源没有特别限定，从莽草酸生产效率好的观点出发，优选棒状杆菌属细菌，其中优选谷氨酸棒状杆菌。

作为来自谷氨酸棒状杆菌的3-DHQ合成酶基因，可以列举由序列号7的碱基序列组成的DNA(aroB)；作为3-DHQ脱水酶基因，可以列举由序列号8的碱基序列组成的DNA(aroD)；作为莽草酸脱氢酶基因，可以列举由序列号9的碱基序列组成的DNA(aroE)。

另外，本发明中还可以使用如下DNA：与由序列号7、8、或9具有90％以上、尤其是95％以上、尤其是98％以上的同一性的碱基序列组成，且分别编码具有3-DHQ合成酶、3-DHQ脱水酶、或莽草酸脱氢酶活性的多肽的DNA。

另外，本发明中还可以使用如下DNA：与由序列号7、8、或9的互补碱基序列组成的DNA在严格条件下杂交、且分别编码具有3-DHQ合成酶、3-DHQ脱水酶、或莽草酸脱氢酶活性的多肽的DNA。

本发明中，DNA所编码的蛋白质为3-DHQ合成酶这一点可通过测定该DNA所编码的蛋白质的3-DHQ合成酶活性来确认。3-DHQ合成酶活性按照公知方法(Meudi，S.et al.，Dehydroquinate synthase from Escherichia coli，and its substrate 3-deoxy-D-arabino-heptulosonic acid 7-phosphate.Methods.Enzymol.142：306-314(1987))来测定。在33℃下，在含有50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)、0.2mM DAHP、0.2mM NAD⁺、1mM氯化钴(II)六水合物、3-DHQ脱水酶的粗酶液的反应用混合液中添加受试酶液而开始反应，通过Beckman DU800分光光度计(Beckman Coulter，Inc.制)监测表示通过与3-DHQ脱水酶的偶联反应生成的3-DHS的生成的234nm的吸收(＝12000/M·cm)。将33℃下1分钟内生成1μmol的3-DHQ的活性作为1单位的3-DHQ合成酶活性。

另外，本发明中，棒状细菌转化体的3-DHQ合成酶活性得到强化这一点通过测定该转化体的细胞提取液中的3-DHQ合成酶活性来确认。

本发明中，DNA所编码的蛋白质为3-DHQ脱水酶这一点可如下确认：对该DNA所编码的蛋白质，测定3-DHQ脱水酶活性。3-DHQ脱水酶活性按照公知方法(Chaudhuri，S.et al.，3-Dehydroquinate dehydratase from Escherichia coli.Methods.Enzymol.142：320-324(1987))进行。在33℃下，在含有50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)、0.5mM 3-DHQ的反应用混合液中添加受试酶液而开始反应，通过Beckman DU800分光光度计(Beckman Coulter，Inc.制)监测表示生成的3-DHS的生成的234nm的吸收(＝12000/M·cm)。将33℃下1分钟内生成1μmol的3-DHS的活性作为1单位的3-DHQ脱水酶活性。

另外，本发明中，棒状细菌转化体的3-DHQ脱水酶活性得到强化这一点通过测定该转化体的细胞提取液中的3-DHQ脱水酶活性来确认。

本发明中，DNA所编码的蛋白质为莽草酸脱氢酶这一点如下确认：对该DNA所编码的蛋白质，测定莽草酸脱氢酶活性。莽草酸脱氢酶活性的测定按照公知方法(Chaudhuri，S.et al.，Shikimate dehydratase from Escherichia coli.Methods.Enzymol.142：315-320(1987))进行。在33℃下在含有100mM Tris盐酸缓冲液(pH7.5)、0.2mM NADPH、0.5mM 3-脱氢莽草酸的反应用混合液中添加受试酶液而开始反应，通过Beckman DU800分光光度计(Beckman Coulter，Inc.制)监测与NADPH的消耗相伴的340nm吸收(＝6220/M·cm)的减少。将33℃下1分钟内生成1μmol的莽草酸的活性作为1单元的莽草酸脱氢酶活性。

另外，本发明中，棒状细菌转化体的莽草酸脱氢酶活性得到强化这一点通过测定该转化体的细胞提取液中的莽草酸脱氢酶活性来确认。

转酮醇酶、转醛醇酶活性的强化

糖代谢中，转酮醇酶催化2种反应。作为第一个反应，在非氧化性戊糖磷酸途径中，催化由D-木酮糖-5-磷酸(X5P)向甘油醛-3-磷酸(GAP)的转变和由D-核糖-5-磷酸(R5P)向景天庚酮糖-7-磷酸(S7P)的转变。这些反应是可逆的且是共轭的。另外，就第2个反应而言，转酮醇酶催化由D-果糖-6-磷酸(F6P)向赤藓糖-4-磷酸(E4P)的转变和由GAP向X5P的转变。这些反应是可逆的且是共轭的。

另外，在糖代谢中，转醛醇酶催化由GAP向E4P的转变和由S7P向F6P的转变。这些反应是共轭的。

从而，转酮醇酶、及转醛醇酶与作为芳香族化合物生物合成的前体之一的E4P的生成相关。认为通过强化这些酶活性，细胞内的E4P的供给增大，莽草酸等芳香族化合物的生产率提高。

本发明的棒状细菌优选这些酶活性中的任意一个得到强化，更优选两种活性得到强化。

转酮醇酶、及转醛醇酶的各酶活性可以通过下式方式而强化：通过导入各酶基因而使其高表达、或者通过对存在于棒状细菌的染色体上的各酶基因(调控序列及基因编码区域)导入突变、或者进行序列置换而使该基因表达量增加或该基因产物的活性增大。其中，通过导入各酶基因而强化酶活性的方式简便、效率好。

作为来自谷氨酸棒状杆菌的转酮醇酶基因，可以列举由序列号10的碱基序列组成的DNA(tkt)，作为转醛醇酶基因，可以列举由序列号11的碱基序列组成的DNA(tal)。

另外，本发明中还可以使用如下DNA：由与序列号10、或11具有90％以上、尤其是95％以上、尤其是98％以上的同一性的碱基序列组成且分别编码具有转酮醇酶、或转醛醇酶活性的多肽的DNA。

另外，本发明中还可以使用如下DNA：由与序列号10、或11的互补的碱基序列组成的DNA在严格条件下杂交、且分别编码具有转酮醇酶、或转醛醇酶活性的多肽的DNA。

本发明中，DNA所编码的蛋白质为转酮醇酶这一点可以如下确认：对该DNA所编码的蛋白质，测定转酮醇酶活性。转酮醇酶活性的测定按照公知方法(Ikeda，M.et al.，Cloning of the transketolase gene and the effect of its dosage on aromaticamino acid production in Corynebacterium glutamicum.Appl.Microbiol.Biotechnol.51：201-206(1999))来进行，在按照该方法能够检测到转酮醇酶活性时，判定为转酮醇酶。

另外，本发明中，棒状细菌转化体的转酮醇酶活性得到强化这一点通过测定该转化体的细胞提取液中的转酮醇酶活性来确认。

本发明中，DNA所编码的蛋白质为转醛醇酶这一点如下确认：对该DNA所编码的蛋白质，测定转醛醇酶活性。转醛醇酶活性按照公知方法(Lu，JL.et al.，Metabolicengineering and control analysis for production of aromatics：Role of transaldolase.Biotechnol.Bioeng.53：132-138(1997))来测定。

另外，本发明中，棒状细菌转化体的转醛醇酶活性得到强化这一点通过测定该转化体的细胞提取液中的转醛醇酶活性来确认。

莽草酸激酶活性、3-脱氢莽草酸(3-DHS)脱水酶活性及奎宁酸/莽草酸脱氢酶活性的消失、阻遏、减少

莽草酸激酶是在芳香族化合物共有代谢途径中催化由莽草酸向莽草酸-3-磷酸转变的酶，3-脱氢莽草酸脱水酶是催化由3-脱氢莽草酸向原儿茶酸转变的酶，奎宁酸/莽草酸脱氢酶是主要催化由莽草酸向3-脱氢莽草酸的转变的酶。

本发明的棒状细菌转化体优选这些活性中的1个以上消失、阻遏、或减少，更优选上述全部活性消失、阻遏、或减少。这些酶活性可以通过棒状细菌的染色体上的各酶基因的破坏、缺失、或突变而消失、阻遏、或减少。

本发明中，棒状细菌转化体的莽草酸激酶活性消失、阻遏、或减少这一点通过测定该转化体的细胞提取液中的莽草酸激酶活性来确认。莽草酸激酶活性按照公知方法(Feyter，RD.et al.，Shikimate kinases from大肠杆菌K12.Methods.Enzymol.142：355-361(1987))来测定，在该测定值减少或消失时，判定为莽草酸激酶活性减少、阻遏、或消失。

另外，棒状细菌转化体的3-DHS脱水酶活性消失、阻遏、或减少这一点通过测定该转化体的细胞提取液中的细胞提取液中的3-DHS脱水酶活性来确认。3-DHS脱水酶活性按照公知方法(Stroman，P.et al.，Purification and characterization of 3-dehydroshikimate dehydratase，an enzyme in the inducible quinic acid catabolicpathway of Neurospora crassa.J.Biol.Chem.253：4593-4598(1978))来测定，在该测定值减少或消失时，判定为3-DHS脱水酶活性减少、阻遏、或消失。

另外，棒状细菌转化体的奎宁酸/莽草酸脱氢酶活性消失、阻遏、或减少这一点通过测定该转化体的细胞提取液中的奎宁酸/莽草酸脱氢酶活性来确认。奎宁酸/莽草酸脱氢酶活性按照公知方法(Kubota，T.et al.，Characterization of shikimatedehydrogenase homologs of Corynebacterium glutamicum.Appl.Microbial.Biotechnol.97：8139-8149(2013))来测定，在该测定值减少或消失时，判定为奎宁酸/莽草酸脱氢酶活性减少、阻遏、或消失。

棒状细菌

棒状细菌为伯杰氏鉴定细菌学手册〔Bergey’s Manual of DeterminativeBacteriology、Vol.8、599(1974)〕中定义的一组微生物，只要是在通常的有氧条件下增殖则没有特别限定。若列举具体例子，可以列举：棒状杆菌属菌、短杆菌属菌、节杆菌属菌、分枝杆菌属菌、微球菌属菌等。就作为本发明的宿主微生物的棒状细菌而言，其中优选棒状杆菌属菌。

作为棒状杆菌属菌，可以列举：谷氨酸棒状杆菌、有效棒杆菌(Corynebacteriumefficiens)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、耐盐棒杆菌(Corynebacterium halotolerance)、解烷棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)等。

其中，作为本发明的宿主微生物，从安全且莽草酸生产率高的观点出发，优选谷氨酸棒状杆菌。作为合适的菌株，可以列举：谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)R菌株(FERM BP-18976)、ATCC13032菌株、ATCC13869菌株、ATCC13058菌株、ATCC13059菌株、ATCC13060菌株、ATCC13232菌株、ATCC13286菌株、ATCC13287菌株、ATCC13655菌株、ATCC13745菌株、ATCC13746菌株、ATCC13761菌株、ATCC14020菌株、ATCC31831菌株、MJ-233(FERM BP-1497)、MJ-233AB-41(FERM BP-1498)等。这些菌株基于布达佩斯条约进行了国际保藏，可以为公众所用。其中，优选R菌株(FERM BP-18976)、ATCC13032菌株、ATCC13869菌株。

需要说明的是，根据分子生物学的分类，黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、散枝短杆菌(Brevibacteriumdivaricatum)、百合棒状杆菌(Corynebacterium lilium)等棒状细菌的菌名也被统一为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)〔Liebl，W.et al.，Transfer ofBrevibacterium divaricatum DSM 20297^T，″Brevibacterium flavum″DSM 20411，″Brevibacterium lactofermentum″DSM 20412 and DSM 1412，and Corynebacteriumglutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns.Int.J.Syst.Bacteriol.41：255-260.(1991)、驹形和男等，コリネフオルム細菌の分類(棒状细菌的分类)，发酵和工业，45：944-963(1987)〕。

作为短杆菌属菌，可以列举产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)(例如ATCC6872菌株)等。该菌株基于布达佩斯条约进行了国际保藏，可以为公众所用。

作为节杆菌属菌，可以列举：球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)(例如ATCC8010菌株、ATCC4336菌株、ATCC21056菌株、ATCC31250菌株、ATCC31738菌株、ATCC35698菌株)。这些菌株基于布达佩斯条约进行了国际保藏，可以为公众所用。

作为分枝杆菌属菌，可以列举牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(例如ATCC19210菌株、ATCC27289菌株)。这些菌株基于布达佩斯条约进行了国际保藏，可以为公众所用。

作为微球菌属菌，可以列举：弗氏微球菌(Micrococcus freudenreichii)(例如No.239菌株(FERM P-13221))、藤黄微球菌(Micrococcus leuteus)(例如No.240菌株(FERMP-13222))、脲微球菌(Micrococcus ureae)(例如IAM1010菌株)、玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)(例如IFO3764菌株)。

另外，棒状细菌也可以是除了上述说明的操作以外破坏了例如乳酸(Lactate)脱氢酶(lactate dehydrogenase：ldh)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvatecarboxylase：ppc)、苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase：mdh)等基因的破坏菌株。其中，优选乳酸脱氢酶基因的破坏菌株。该基因破坏菌株由于乳酸脱氢酶基因已被破坏，从而由丙酮酸向乳酸的代谢途径被阻断。其中，优选谷氨酸棒状杆菌、特别是R(FERM BP-18976)菌株的乳酸脱氢酶基因的破坏菌株。

这样的基因破坏菌株可以通过基因工程方法按照常规方法来制作。例如，WO2005/010182A1中记载了乳酸脱氢酶基因破坏菌株及其制作方法。

戊糖利用能力

棒状细菌的野生菌株通常不能利用D-木糖、L-阿拉伯糖等戊糖，为了也由戊糖生成莽草酸等有机化合物，本发明的棒状细菌优选可以并行利用D-葡萄糖及戊糖(例如D-木糖、及L-阿拉伯糖中的1种以上)，更优选可以并行且同时利用。通常，在葡萄糖存在下，即使还存在其它糖，微生物也优先消耗葡萄糖。与此相对地，在微生物具有D-葡萄糖及戊糖的平行利用能力时，在存在两种糖的条件下则能够同时消耗戊糖与葡萄糖，结果是能够缩短生产目标物质所需的时间。

<D-木糖利用能力>

作为对棒状细菌赋予D-木糖利用能力的方法，可以列举例如：导入来自其它物种的D-木糖代谢相关基因的方法。

原核生物及部分霉菌中的从D-木糖向D-木酮糖-5-磷酸酯的代谢通过由催化从D-木糖向D-木酮糖的反应的木糖异构酶(xylA)、及催化从D-木酮糖向D-木酮糖-5-磷酸酯的反应的木酮糖激酶(xylB)这2个酶催化的两步反应来进行。通过将编码这些酶的各基因导入棒状细菌，对棒状细菌赋予D-木糖利用能力。

例如，本发明人们已经公开了如下技术：在棒状细菌中导入作为D-木糖代谢相关基因的来自大肠杆菌(Escherichia coli)的xylA基因及xylB基因，使其表达，从而赋予D-木糖的利用能力(Appl.Environ.Microbiol.，Vol.72，3418-3428(2006))。本发明中，也可以导入来自包括大肠杆菌在内的各种物种的xylA基因及xylB基因，对棒状细菌赋予D-木糖利用能力。

通常具有D-木糖代谢能力的微生物保有xylA基因及xylB基因。作为xylA基因及xylB基因，优选分别独立地使用来自选自由大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌(仅保有xylB基因)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、及根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)组成的组中的微生物的xylA基因及xylB基因。其中，更优选来自大肠杆菌的xylA基因及xylB基因。

<阿拉伯糖利用能力>

通过在棒状细菌中导入编码L-阿拉伯糖异构酶的基因(araA)、编码L-核酮糖激酶的基因(araB)、及编码L-核酮糖-5-磷酸酯-4-差向异构酶的基因(araD)，可以赋予阿拉伯糖利用能力。

具有L-阿拉伯糖代谢能力的微生物保有这些基因。可以使用例如来自大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌ATCC31831、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、耐盐芽孢杆菌(Bacillushalodurans)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、或耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的araA、araB及araD。

进而，通过导入编码L-阿拉伯糖输送体系的质子同向转运体(L-阿拉伯糖质子同向转运体)的基因(araE)，使阿拉伯糖的摄取能力提高，其结果是，可以进一步提高阿拉伯糖利用能力。细菌中，就以下所示的菌株等报道了araE基因序列、酶特性。枯草杆菌(J.Bacteriol.Vol.179，7705-7711(1997))、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)8017(J.Bacteriol.Vol.177，5379-5380(1995))、大肠杆菌(J.Biol.Chem.Vol.263，8003-8010(1988))。本发明中，优选使用来自谷氨酸棒状杆菌ATCC31831、大肠杆菌、枯草杆菌、产酸克雷伯菌、或鼠伤寒沙门氏菌的araE基因。

通过导入L-阿拉伯糖质子同向转运体基因，不仅L-阿拉伯糖，连D-木糖的摄取能力也提高，其结果是，可以进一步提高D-木糖利用能力。

<纤维二糖利用能力>

本发明的棒状细菌优选纤维二糖利用能力得到提高，由此，还能够由纤维二糖生产莽草酸等有机化合物。

例如，可以通过日本特开2004-089029号中记载的方法对棒状细菌进行突变处理，选择在以纤维二糖为唯一碳源的培养基上增殖的菌株，从而得到纤维二糖利用能力。作为这样得到的突变株，可以列举：FERM P-18977、FERM P-18978(日本特开2004-089029)。另外，作为人工纤维二糖利用性重组菌株，可以列举FERM P-18979(日本特开2004-089029号)。

用于基因导入的载体的构建

在通过基因导入来强化其所编码的蛋白质或酶的活性时，各DNA可以分别重组到宿主的染色体中、或克隆到可在宿主中扩增的合适载体中而导入宿主中。

作为质粒载体，含有在棒状细菌内担负自主复制功能的基因即可。作为其具体例子，可以列举：来自乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)2256的pAM330〔日本特开昭58-67699号公报〕、〔Miwa，K.et al.，Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria.Agric.Biol.Chem.48：2901-2903(1984)〕及〔Yamaguchi，R.et al.，Determination of the complete nucleotide sequence of the Brevibacteriumlactofermentum plasmid pAM330 and the analysis of its geneticinformation.Nucleic Acids Symp.Ser.16：265-267(1985)〕、来自谷氨酸棒状杆菌ATCC3058的pHM1519〔Miwa，K.et al.，Cryptic plasmids in glutamic acid-producingbacteria.Agric.Biol.Chem.48：2901-2903(1984)〕及pCRY30〔Kurusu，Y.et al.，Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria.Appl.Environ.Microbiol.57：759-764(1991)〕、来自谷氨酸棒状杆菌T250的pCG4〔日本特开昭57-183799号公报〕、〔Katsumata，R.et al.，Protoplast transformation of glutamate-producing bacteria with plasmid DNA.J.Bacteriol.159：306-311(1984)〕、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50〔日本特开昭62-166890〕、pEK0、pEC5、pEKEx1〔Eikmanns，B.J.et al.，Afamily of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors forcloning，controlled gene expression，and promoter probing.Gene，102：93-98(1991)〕等。

作为优选的启动子，可以列举：来自谷氨酸棒状杆菌R的甘油醛-3-磷酸脱氢酶A基因(gapA)的启动子PgapA、苹果酸脱氢酶基因(mdh)的启动子Pmdh、乳酸脱氢酶A基因(ldhA)的启动子PldhA等，其中优选PgapA。

作为优选的终止子，可以列举大肠杆菌rRNA操纵子的rrnB T1T2终止子、大肠杆菌的trpA终止子、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)的trp终止子等，其中优选rrnB T1T2终止子。

转化

转化方法可以没有限制地使用公知方法。作为这样的公知方法，可以列举例如：氯化钙·氯化铷法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖介导转染法、电穿孔法等。其中，对于棒状细菌，优选电脉冲法，电脉冲法可以通过公知方法来进行(Kurusu，Y.et al.，Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation.Agric.Biol.Chem.，54：443-447(1990))。

转化体可以使用通常用于微生物培养的培养基来培养。作为该培养基，通常可以使用含有碳源、氮源、无机盐类、及其它营养物质等的天然培养基或合成培养基。

作为碳源，可以列举：葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、淀粉、糖蜜、山梨醇、甘油等糖质或糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸或葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇。碳源可以单独使用1种，也可以将2种以上混合。培养基中的这些碳源的浓度通常可以设为约0.1～10(w/v％)。

作为氮源，可以列举：氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机或有机铵化合物，尿素，氨水，硝酸钠，硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用1种，此外也可以将2种以上混合使用。培养基中的氮源浓度虽然也根据所使用的氮化合物而不同，但通常可以设为约0.1～10(w/v％)。

作为无机盐类，可以列举例如：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、或碳酸钙等。这些无机盐可以单独使用1种，此外也可以将2种以上混合使用。培养基中的无机盐类浓度虽然也根据所使用的无机盐而不同，但通常可以设为约0.1～1(w/v％)。

作为营养物质，可以列举例如：肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物、或者动植物或微生物菌体的提取物以及这些的分解物等，通常可以设为约0.1～10(w/v％)。进而，根据需要还可以添加维生素类。作为维生素类，可以列举例如：生物素、硫胺素、吡哆醇、泛酸、肌醇、尼克酸等。

培养基的pH优选为约6～8。

作为优选的微生物培养基，可以列举：A培养基〔Inui，M.et al.，Metabolicanalysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinateproductions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7：182-196(2004)〕、BT培养基〔Omumasaba，C.A.et al.，Corynebacterium glutamicumglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite，ATP-dependentregulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8：91-103(2004)〕等。

培养温度可以设为约15～45℃，培养时间可以设为约1～7天。

(2)有机化合物的制造方法

通过含有以下的工序的方法，可以制造有机化合物：使上述说明的本发明的棒状细菌在含有糖类的反应液中反应的工序、和回收反应液中的有机化合物的工序。

作为有机化合物，除了莽草酸以外，还可以列举：3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)、3-脱氢奎宁酸(3-DHQ)、3-脱氢莽草酸(3-DHS)、莽草酸-3-磷酸(shikimate 3-phosphate)、5-烯醇式丙酮酰莽草酸3-磷酸(5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate)、原儿茶酸(protocatechuic acid)、没食子酸(gallic acid)、分支酸(chorismic acid)、预苯酸(prephenic acid)、苯基丙酮酸(phenylpyruvic acid)、异分支酸(isochorismicacid)、苯丙氨酸(phenylalanine)、L-DOPA(L-dihydroxyphenylalanine)、酪氨酸(tyrosine)、预酪氨酸(pretyrosine)、色氨酸(tryptophan)等芳香族氨基酸，叶酸(folate、(维生素M)(维生素B9))、甲基萘醌类(menaquinone(维生素K))、对羟基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid)或来自其的泛醌(ubiquinone(Coenzyme Q10))、对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid(维生素H))、对氨基苯酚(p-aminophenol)、4-氨基-4-脱氧分支酸(4-amino-4-deoxychorismate)、邻氨基苯甲酸(anthranilic acid)、阿罗酸(arogenate)、肠菌素、生育酚(tocopherol、维生素E)、苯酚(phenol)、邻苯二酚(catechol)、苯胺(aniline)、cis，cis-粘糠酸(cis，cis-muconate)、3-羧基-cis，cis-粘糠酸(3-carboxy-cis，cis-muconate)、粘糠酸内酯(muconolactone)、γ-羧基粘糠酸内酯(gamma-carboxymuconolactone)、β-酮己二酸(β-ketoadipate)、肉桂酸(cinnamic acid)、香豆酸(coumaric acid)、香豆素(coumarin)、类黄酮(flavonoid)、类异黄酮(isoflavonoid)、鞣酸(tannin)、苯乙烯基吡喃酮化合物(styrylpyrones)、2，3-二羟基苯甲酸(2，3-dihydroxybenzoic acid)、水杨酸(salycylic acid)等。其中，除了莽草酸以外，优选3-脱氢莽草酸、3-脱氢奎宁酸、原儿茶酸、分支酸、没食子酸(gallic acid)、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、邻氨基苯甲酸、对羟基苯甲酸、对氨基苯甲酸、苯酚、邻苯二酚。

作为糖类，优选葡萄糖，除了果糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖等单糖类以外，还可以使用可通过代谢生成葡萄糖的糖类。这样的糖类包括具有葡萄糖单元的寡糖或多糖类，可以列举：纤维二糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、木二糖等二糖类；糊精或可溶性淀粉等多糖类等。

另外，例如，作为含有这些原料化合物的原料，还可以使用糖蜜。另外，还可以使用将以下物质用糖化酶等糖化而得的、含有葡萄糖等多种糖的糖化液，所述物质为：秸秆(稻秸、大麦秸、小麦秸、黑麦秸、燕麦秸等)、甘蔗渣、玉米秸秆等不可食用的农产废弃物，柳枝稷、象草、芒草等能源作物，木屑，旧纸等。

微生物的增殖

在反应之前，优选将转化体在有氧条件、温度约25～40℃下培养约12～48小时而使其增殖。

培养用培养基

就反应前的转化体的有氧培养中使用的培养基而言，可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其它营养物质等的天然培养基或合成培养基。

作为碳源，还可以使用：糖类(葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖之类的单糖；蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、木二糖、海藻糖之类的二糖；淀粉之类的多糖；糖蜜等)；甘露醇、山梨醇、木酮糖、甘油之类的糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡糖酸之类的有机酸；乙醇、丙醇之类的醇；正构烷烃之类的烃等。

碳源可以单独使用1种，也可以将2种以上混合使用。

作为氮源，可以使用氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵之类的无机或有机铵化合物，尿素，氨水，硝酸钠，硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用1种，也可以将2种以上混合使用。氮源在培养基中的浓度虽然也根据所使用的氮化合物而不同，但通常可以设为约0.1～10(w/v％)。

作为无机盐类，可以列举：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。无机盐可以单独使用1种，也可以将2种以上混合使用。无机盐类在培养基中的浓度虽然也根据所使用的无机盐而不同，但通常可以设为约0.01～1(w/v％)。

作为营养物质，可以列举：肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物、动植物或微生物菌体的提取物以及这些分解物等。营养物质在培养基中的浓度虽然也根据所使用的营养物质而不同，但通常可以设为约0.1～10(w/v％)。

进而，根据需要还可以添加维生素类。作为维生素类，可以列举：生物素、硫胺素(维生素B1)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。

培养基的pH优选为约6～8。

作为具体的优选的棒状细菌用培养基，可以列举：A培养基〔Inui，M.et al.，Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinateproductions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7：182-196(2004)〕、BT培养基〔Omumasaba，C.A.et al.，Corynebacterium glutamicumglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite，ATP-dependentregulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8：91-103(2004)〕等。这些培养基中，可以将糖类浓度设为上述范围来使用。

反应液

作为反应液，可以使用含有碳源、氮源、及无机盐类等的天然反应液或合成反应液。

作为碳源，可以使用上述说明的原料化合物或含有其的糖蜜、糖化液等。另外，作为碳源，除了糖类以外，还可以使用：甘露醇、山梨醇、木酮糖、甘油之类的糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡糖酸之类的有机酸；乙醇、丙醇之类的醇；正构烷烃之类的烃等。

碳源可以单独使用1种，也可以将2种以上混合使用。

反应液中的原料化合物的浓度优选为约1～20(w/v％)，更优选为约2～10(w/v％)，进一步更优选为约2～5(w/v％)。

另外，含有原料化合物的总碳源浓度可以设为约2～5(w/v％)。

作为氮源，可以使用：氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵之类的无机或有机铵化合物，尿素，氨水，硝酸钠，硝酸钾等。另外，还可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用1种，也可以将2种以上混合使用。氮源在反应液中的浓度虽然也根据所使用的氮化合物而不同，但通常可以设为约0.1～10(w/v％)。

作为无机盐类，可以列举：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。无机盐可以单独使用1种，也可以将2种以上混合使用。无机盐类在反应液中的浓度虽然也根据所使用的无机盐而不同，但通常可以设为约0.01～1(w/v％)。

反应液的pH优选为约6～8。

作为具体的优选的棒状细菌用反应液，可以列举上述BT培养基等。这些培养基中，可以将糖类浓度设为上述范围来使用。

反应条件

反应温度、即转化体的生存温度优选为约15～50℃，更优选为约25～45℃。若在上述温度范围，则可以高效地制造有机化合物。

另外，反应时间优选为约1～7天，更优选为约1～3天。

培养可以为分批式、流加式、连续式中的任意种。其中，优选使用温度、pH、通气条件、氧浓度可控的分批式发酵槽(fed-batch fermentor)。

反应可以在有氧条件下进行，也可以在还原条件下进行。本发明的转化体本身的有机化合物生产能力在有氧条件下更高。作为培养基的溶解氧浓度(D.O.)，优选维持在约5％～30％的空气饱和时的D.O.。但是，由于在有氧的条件下转化体进行增殖，与原料化合物被菌体增殖而消耗的部分相应地，有机化合物的制造效率下降。

因此，本发明中，优选在有氧且转化体不增殖的条件下进行反应。本发明中，不增殖包含实质上不增殖、或几乎不增殖。优选例如以下方式：使用不影响通过转化体的目标化合物的生成反应、但缺乏或限制微生物的增殖所必需的化合物、如生物素、硫胺素等维生素类、金属盐、氮源等中的1种以上的反应液，来抑制转化体的增殖。本发明中，更优选使用不添加作为棒状细菌的有氧增殖所必需的维生素的、生物素的反应液。

另外，在还原条件下，棒状细菌实质上不增殖，因此与原料化合物未由于增殖而消耗的部分相应地，有机化合物的制造效率提高。

还原条件由反应液的氧化还原电位来规定。反应液的氧化还原电位优选为约-200mV～-500mV，更优选为约-150mV～-500mV。

反应液的还原状态可以简便地由刃天青指示剂(若为还原状态，则由蓝色褪色为无色)来推定，为了准确，可以使用氧化还原电位差计(例如BROADLEY JAMES公司制、ORPElectrodes)来测定。

处于还原条件下的反应液的制备方法可以没有限制地使用公知方法。例如，可以使用反应液用水溶液来代替蒸馏水等，将其作为反应液的液体介质，反应液用水溶液的制备方法可以参考例如硫酸还原微生物等绝对厌氧性微生物用培养液制备方法(Pfennig，N.et al.，(1981)：The dissimilatory sulfate-reducing bacteria，In TheProkaryotes，A Handbook on Habitats Isolation and Identification of Bacteria，Ed.by Starr，M.P.et al.，p926-940，Berlin，Springer Verlag.)、“农艺化学实验书第三卷、京都大学农学部农艺化学教室编、1990年第26次印刷、产业图书株式会社出版”等，来得到期望的还原条件下的水溶液。

具体而言，可以通过对蒸馏水等进行加热处理或减压处理将溶解气体除去，从而得到还原条件下的反应液用水溶液。此时，可以通过在约10mmHg以下、优选为约5mmHg以下、更优选为约3mmHg以下的减压下将蒸馏水等处理约1～60分钟左右、优选为约5～40分钟左右，从而除去溶解气体、特别是溶解氧，制作还原条件下的反应液用水溶液。

另外，也可以添加适当的还原剂(例如，硫代乙醇酸、抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、巯基乙酸、巯基乙酸、谷胱甘肽、硫化钠等)来制备还原条件下的反应液用水溶液。

将这些方法适当组合而成的方法也是有效的还原条件的反应液用水溶液的制备方法。

在还原条件下反应时，优选反应中也使反应液维持还原条件。为了维持反应过程中的还原条件，期望尽可能地防止混入来自反应体系外的氧，具体而言，可以列举：将反应体系用氮气等不活泼气体、二氧化碳等密封的方法。作为更有效地防止氧混入的方法，为了在反应过程中使本发明的有氧性细菌的菌体内的代谢功能高效地发挥，有时也需要添加反应体系的pH维持调整液、适当添加各种营养素溶解液，在这种情况下，预先从添加溶液中除去氧是有效的。

有机化合物的回收

通过以上述方式进行培养，在反应液中生产作为目标的有机化合物。通过回收反应液，可以回收作为目标的有机化合物，进而，还可以通过公知方法从反应液分离作为目标的有机化合物。作为这种公知方法，可以列举：离子交换树脂法、浓缩法、晶析法、膜分离法、有机溶剂提取法、各种吸附法等。

实施例

[实施例1]

莽草酸生产菌株的构建

(1)从微生物提取染色体DNA

从谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)R(FERM BP-18976)提取染色体DNA如下进行：在A培养基[在蒸馏水1L中溶解有(NH₂)₂CO 2g、(NH₄)₂SO₄ 7g、KH₂PO₄ 0.5g、K₂HPO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、0.06％(w/v)FeSO₄·7H₂O+0.042％(w/v)MnSO₄·2H₂O 1ml、0.02％(w/v)生物素溶液1ml、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物(vitamin assay casamino acid)7g]中，添加50％(w/v)葡萄糖溶液使其最终浓度为4％来作为碳源，用铂环接种细菌后，在33℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、Amersham公司制)按照操作说明书从所收集的菌体回收染色体DNA。

从大肠杆菌(大肠杆菌K-12 MG1655)提取染色体DNA如下进行：在LB培养基[在蒸馏水1L中溶解有胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl5g]中用铂环接种细菌后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep Cellsand Tissue DNA Isolation Kit、Amersham公司制)按照操作说明书从所收集的菌体回收染色体DNA。

(2)克隆载体的构建

(2-1)pCRB240克隆载体的构建

通过以下方法扩增含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gapA基因的启动子序列的DNA片段、及含有来自克隆载体pKK223-3(Pharmacia公司制)的rrnB T1T2双向终止子序列(此后记作终止子序列)的DNA片段。

PCR时，基于含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的gapA启动子的基因序列(序列号12：谷氨酸棒状杆菌gapA启动子序列)及克隆载体pKK223-3(序列号13：pKK223-3)分别合成了下述成对引物并使用。

谷氨酸棒状杆菌gapA启动子序列扩增用引物

(a-1)：5’-CTCTCTGCAGTCGCTCGTCTCATAAAAACGAC-3’(序列号14)

(b-1)：5’-CTCTAAGCTTGTCGACGGATCCGCATGCTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG-3’(序列号15)

需要说明的是，引物(a-1)中添加有Pst I限制酶位点，(b-1)中添加有Hin dIII限制酶位点。

pKK223-3 rrnB终止子序列扩增用引物

(a-2)：5’-CTCTGCATGCCTGTTTTGGCGGATGAGAGA-3’(序列号16)

(b-2)：5’-CTCTAAGCTTGTCGACGGATCCAAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG-3’(序列号17)

需要说明的是，引物(a-2)中添加有Sph I限制酶位点，(b-2)中添加有Hin dIII限制酶位点。

实际的PCR中，使用Veriti热循环仪(应用生物系统公司制)，使用PrimeSTAR HSDNA聚合酶(宝生物株式会社制)作为反应试剂，以下述条件来进行。

模板DNA使用由谷氨酸棒状杆菌R菌株提取的染色体DNA及pKK223-3质粒。

反应液：

将上述物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增谷氨酸棒状杆菌gapA启动子序列时，以引物(a-1)和(b-1)的组合来进行；扩增pKK223-3质粒rrnB终止子序列时，以引物(a-2)和(b-2)的组合来进行。

PCR循环：

将以上作为1个循环，进行30个循环。

将上述生成的反应液10μl通过0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，可以检测到含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的gapA启动子序列的约0.5-kb的DNA片段及含有来自pKK223-3质粒的rrnB终止子序列的约0.4-kb的DNA片段。DNA片段通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)来纯化。

将通过上述PCR扩增出的含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的gapA启动子序列的约0.5-kb DNA片段用限制酶PstI和Hin dIII切断后，通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化。另外，将含有pBL1 ori序列的克隆载体pCRB1[J MolMicrobiol Biotechnol.8(4)：243-254(2004)]用限制酶Pst I和Hin dIII切断，通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化后，利用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理。将含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的gapA启动子序列的DNA片段10μl和pCRB1质粒片段2μl混合，添加T4 DNA连接酶10×缓冲液1μl、T4 DNA连接酶(宝生物株式会社制)1单位等各成分，用灭菌蒸馏水调节到10μl，在15℃下反应3小时使其结合。

使用所得到的连接反应液，通过氯化钙法[Journal of Molecular Biology，53，159(1970)]转化大肠杆菌HST02，涂布在含有氯霉素50μg/ml的LB琼脂培养基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠、及1.5％琼脂]上。

通过常规方法对培养基上的增殖菌株进行液体培养，由培养液提取质粒DNA，将该质粒用限制酶分别切断，确认插入片段。其结果是，除了质粒pCRB1约4.1-kb的DNA片段以外，还确认到来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的gapA启动子序列约0.5-kb的插入片段。

将得到的含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的gapA启动子序列的质粒命名为Lgap4。

然后，将通过上述PCR扩增出的含有来自pKK223-3质粒的rrnB终止子序列的约0.4-kb DNA片段用限制酶Sph I和Hin dIII切断后，通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化。另外，将含有gapA启动子的克隆载体Lgap4用限制酶SphI和Hin dIII切断，通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化后，利用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理。将含有来自pKK223-3质粒的rrnB终止子序列的DNA片段10μl和Lgap4质粒片段2μl混合，添加T4 DNA连接酶10×缓冲液1μl、T4DNA连接酶(宝生物株式会社制)1单位等各成分，用灭菌蒸馏水调节到10μl，在15℃下反应3小时使其结合。

通过常规方法对培养基上的增殖菌株进行液体培养，由培养液提取质粒DNA，将该质粒用限制酶分别切断，确认插入片段。其结果是，除了质粒Lgap4约4.5-kb的DNA片段以外，还确认到来自pKK223-3质粒的rrnB终止子序列约0.4-kb的插入片段。

将得到的含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的gapA启动子序列及来自pKK223-3质粒的rrnB终止子序列的克隆载体命名为pCRB240。

(3)莽草酸生产基因表达质粒的构建

(3-1)pCRB237质粒的构建

通过以下的PCR法扩增含有来自大肠杆菌K-12菌株的编码3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合成酶基因的aroG基因的DNA片段。

PCR时，基于含有来自大肠杆菌K-12菌株的aroG基因的基因序列(序列号18：大肠杆菌aroG基因)分别合成了下述成对引物并使用。

大肠杆菌aroG基因扩增用引物

(a-3)：5’-CTCTGATATCATGAATTATCAGAACGACGATTTACGC-3’(序列号19)

(b-3)：5’-CTCTGATATCGACTTATCAGGCCTGTGGTG-3’(序列号20)

需要说明的是，引物(a-3)及(b-3)中添加有Eco RV限制酶位点。

模板DNA使用由大肠杆菌K-12 MG1655提取的染色体DNA。

反应液：

将上述物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增大肠杆菌aroG基因时，以引物(a-3)和(b-3)的组合来进行。

PCR循环：

变性过程：98℃ 10秒

退火过程：55℃ 5秒

延伸过程：72℃ 67秒

将以上作为1个循环，进行30个循环。

将上述生成的反应液10μl通过0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，可以检测到来自大肠杆菌K-12菌株的aroG基因约1.1-kb的DNA片段。DNA片段通过NucleoSpin Gel and PCRClean-Up(宝生物株式会社制)来纯化。

将通过上述PCR扩增出的含有来自大肠杆菌K-12菌株的aroG基因的约1.1-kb DNA片段用限制酶Eco RV切断后，通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化。另外，将含有gapA启动子的克隆载体pCRB210[国际公开WO2012/033112]用限制酶EcoRV切断，通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化后，利用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理。将含有来自大肠杆菌K-12菌株的aroG基因的DNA片段10μl和pCRB210质粒片段2μl混合，添加T4 DNA连接酶10×缓冲液1μl、T4DNA连接酶(宝生物株式会社制)1单位等各成分，用灭菌蒸馏水调节到10μl，在15℃下反应3小时使其结合。

使用所得到的连接反应液，通过氯化钙法[Journal of Molecular Biology，53，159(1970)]转化大肠杆菌HST02，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的LB琼脂培养基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠、及1.5％琼脂]上。

通过常规方法对培养基上的增殖菌株进行液体培养，由培养液提取质粒DNA，将该质粒用限制酶分别切断，确认插入片段。其结果是，除了质粒pCRB210约5.1-kb的DNA片段以外，还确认到来自大肠杆菌K-12菌株的aroG基因约1.1-kb的插入片段。

将含有来自大肠杆菌K-12菌株的aroG基因的质粒命名为pSKM1。

使用上述质粒pSKM1，通过反向PCR法制作将S180位点置换为苯丙氨酸(F)的突变体。

PCR时，为了在aroG基因的S180位点导入突变，基于(序列号18：大肠杆菌aroG基因)分别合成下述引物并使用。

大肠杆菌aroG基因突变导入用引物

(a-4)：5’-TTTGTCCGGTCGGCTTCAAAAATG-3’(序列号21)

(b-4)：5’-AAAGCCCTGATGCCAGTTC-3’(序列号22)

模板DNA使用含有来自大肠杆菌K-12菌株的aroG基因的质粒pSKM1。

反应液：

将上述物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

PCR循环：

变性过程：98℃ 10秒

退火过程：60℃ 5秒

延伸过程：68℃ 374秒

将以上作为1个循环，进行30个循环。

将上述生成的反应液10μl通过0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，可以检测到含有来自大肠杆菌K-12菌株的aroG基因的约6.2-kb的DNA片段。DNA片段通过NucleoSpin Gel andPCR Clean-Up(宝生物株式会社制)来纯化。

将纯化后的扩增产物用T4多核苷酸激酶(宝生物株式会社制)进行磷酸化处理后，通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化。使用所得到的进行了磷酸化处理的DNA片段通过DNA连接反应试剂盒(宝生物株式会社制)进行结合(自身连接)。使用所得到的连接反应液，通过氯化钙法[J.Mol.Biol.53：159-162(1970)]转化大肠杆菌HST02，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的LB琼脂培养基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠、及1.5％琼脂]上。

通过常规方法对培养基上的增殖菌株进行液体培养，由培养液提取质粒DNA，对该质粒的碱基序列进行测序解析，从而确认向aroG基因的S180位点导入了突变。

将得到的质粒命名为pCRB237。需要说明的是，将本质粒的基因重组的概要综合示于后述的表1。

(3-2)pCRB239质粒的构建

使用上述质粒pSKM1通过反向PCR法制作将P150位点置换为亮氨酸(L)的突变体。

PCR时，为了在aroG基因的P150位点导入突变，基于(序列号18：大肠杆菌aroG基因)分别合成下述引物并使用。

大肠杆菌aroG基因突变导入用引物

(a-5)：5’-TACAATATCTCGCTGACCTGATG-3’(序列号23)

(b-5)：5’-GGGTGATCATATCGAGAAACTC-3’(序列号24)

模板DNA使用含有来自大肠杆菌K-12菌株的aroG基因的质粒pSKM1。

反应液：

将上述物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

PCR循环：

变性过程：98℃ 10秒

退火过程：60℃ 5秒

延伸过程：68℃ 374秒

将以上作为1个循环，进行30个循环。

通过常规方法对培养基上的增殖菌株进行液体培养，由培养液提取质粒DNA，对该质粒的碱基序列进行测序解析，从而确认在aroG基因的P150位点导入了突变。

将得到的质粒命名为pCRB239。需要说明的是，将本质粒的基因重组的概要综合示于表1。

(3-3)pCRB238质粒的构建

通过以下的PCR法扩增含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的编码3-脱氢奎宁酸合成酶基因的aroB基因、编码3-脱氢奎宁酸脱水酶基因的aroD基因及编码莽草酸脱氢酶基因的aroE基因的DNA片段。

PCR时，基于含有aroB基因的基因序列(序列号25：谷氨酸棒状杆菌aroB基因)、含有aroD基因的基因序列(序列号26：谷氨酸棒状杆菌aroD基因)及含有aroE基因的基因序列(序列号27：谷氨酸棒状杆菌aroE基因)，分别合成了下述成对引物并使用。

谷氨酸棒状杆菌aroB基因扩增用引物

(a-6)：5’-CTCTGAATTCATGAGCGCAGCGCAGATTTT-3’(序列号28)

(b-6)：5’-CTCTCCCGGGAAGTGGATAACTTCTAGTCC-3’(序列号29)

需要说明的是，引物(a-6)中添加有Eco RI限制酶位点，(b-6)中添加有Sma I限制酶位点。

谷氨酸棒状杆菌aroD基因扩增用引物

(a-7)：5’-CTCTGAATTCATGCTTGGAAAAATTCTCCTCC-3’(序列号30)

(b-7)：5’-CTCTCCCGGGCTACTTTTTGAGATTTGCCA-3’(序列号31)

需要说明的是，引物(a-7)中添加有Eco RI限制酶位点，(b-7)中添加有Sma I限制酶位点。

谷氨酸棒状杆菌aroE基因扩增用引物

(a-8)：5’-CTCTCCCGGGATAAGGATCAACGAATAAAA-3’(序列号32)

(b-8)：5’-CTCTCTGCAGCTAGTGTTCTTCCGAGATGC-3’(序列号33)

需要说明的是，引物(a-8)中添加有SmaI限制酶位点，(b-8)中添加有PstI限制酶位点。

模板DNA使用由谷氨酸棒状杆菌R提取的染色体DNA。

反应液：

将上述物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增谷氨酸棒状杆菌aroB基因时，以引物(a-6)和(b-6)的组合来进行；扩增谷氨酸棒状杆菌aroD基因时，以引物(a-7)和(b-7)的组合来进行；扩增谷氨酸棒状杆菌aroE基因时，以引物(a-8)和(b-8)的组合来进行。

PCR循环：

将以上作为1个循环，进行30个循环。

将上述生成的反应液10μl通过0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，可以检测到谷氨酸棒状杆菌aroB基因约1.1-kb、谷氨酸棒状杆菌aroD基因约0.4-kb、谷氨酸棒状杆菌aroE基因约0.8-kb的DNA片段。各DNA片段通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)来纯化。

将通过上述PCR扩增出的含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的aroB基因的约1.1-kbDNA片段、含有aroD基因的约0.4-kb DNA片段、含有aroE基因的约0.8-kb DNA片段用限制酶Eco RI和Sma I(aroB基因及aroD基因)或SmaI和PstI(aroE基因)切断后，通过NucleoSpinGel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化。另外，将含有Ptac启动子的克隆载体pKK223-3(Pharmacia公司制)用限制酶Eco RI和Sma I(aroB基因及aroD基因)或Sma I和PstI(aroE基因)切断，通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化后，利用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理。将含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的aroB基因、aroD基因及aroE基因的各片段10μl和pKK223-3质粒片段2μl混合，添加T4DNA连接酶10×缓冲液1μl、T4 DNA连接酶(宝生物株式会社制)1单位等各成分，用灭菌蒸馏水调节到10μl，在15℃下反应3小时使其结合。

通过常规方法对各培养基上的增殖菌株进行液体培养，由培养液提取质粒DNA，将该质粒用限制酶分别切断，确认插入片段。其结果是，除了质粒pKK223-3约4.6-kb的DNA片段以外，还分别确认到来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的aroB基因约1.1-kb、aroD基因约0.4-kb、aroE基因约0.8-kb的插入片段。

将得到的含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的aroB基因的质粒命名为pSKM2、将含有aroD基因的质粒命名为pSKM3、将含有aroE基因的质粒命名为pSKM4。

然后，将上述质粒pSKM3用限制酶Kpn I和Sal I切断，进行琼脂糖电泳后，通过QIAquick凝胶提取试剂盒(株式会社Qiagen公司制)从琼脂糖凝胶回收含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的aroD基因的约0.7-kb的DNA片段。另外，将含有pCASE1 ori序列的克隆载体pCRB22[Appl Environ Microbiol.78(3)：865-875(2012)]用限制酶Kpn I和Sal I切断，通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化后，利用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理。将来自pSKM3的基因片段10μl和pCRB22质粒片段2μl混合，添加T4 DNA连接酶10×缓冲液1μl、T4 DNA连接酶(宝生物株式会社制)1单位等各成分，用灭菌蒸馏水调节到10μl，在15℃下反应3小时使其结合。

通过常规方法对培养基上的增殖菌株进行液体培养，由培养液提取质粒DNA，将该质粒将限制酶分别切断后，确认插入片段。

将含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的araD基因的质粒命名为pSKM5。

然后，将上述含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的aroB基因的质粒pSKM2用限制酶Sal I切断，进行琼脂糖电泳后，通过QIAquick凝胶提取试剂盒(株式会社Qiagen公司制)从琼脂糖凝胶回收含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的aroB基因的约1.7-kb的DNA片段。另外，将上述含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的aroD基因的质粒pSKM5用限制酶Sal I切断后，利用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理。将含有来自pSKM2的aroB基因的DNA片段10μl和pSKM5质粒片段2μl混合，添加T4 DNA连接酶10×缓冲液1μl、T4 DNA连接酶(宝生物株式会社制)1单位等各成分，用灭菌蒸馏水调节到10μl，在15℃下反应3小时反应后使其结合。

通过常规方法对培养基上的增殖菌株进行液体培养，由培养液提取质粒DNA，将该质粒用限制酶分别切断，确认插入片段。

将含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的aroB基因及araD基因的质粒命名为pSKM6。

然后，由上述含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的aroE基因的质粒pSKM4通过以下的PCR法扩增含有aroE基因的DNA片段。

PCR时，基于含有aroE基因的质粒pSKM4的基因序列(序列号34：pSKM4质粒序列)分别合成了下述成对引物并使用。

谷氨酸棒状杆菌aroE基因扩增用引物

(a-9)：5’-CTCTGGTACCGGCTGTGCAGGTCGTAAATC-3’(序列号35)

(b-9)：5’-CTCTGGTACCCTAGTGTTCTTCCGAGATGC-3’(序列号36)

需要说明的是，引物(a-1)及(b-1)中添加有KpnI限制酶位点。

模板DNA使用含有谷氨酸棒状杆菌aroE基因的质粒pSKM4。

反应液：

将上述物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

^*)扩增谷氨酸棒状杆菌aroE基因时，以引物(a-9)和(b-9)的组合来进行。

PCR循环：

变性过程：98℃ 10秒

退火过程：55℃ 5秒

延伸过程：72℃ 63秒

将以上作为1个循环，进行30个循环。

将上述生成的反应液10μl通过0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，可以检测到含有谷氨酸棒状杆菌aroE基因的约1.0-kb的DNA片段。DNA片段通过NucleoSpin Gel and PCRClean-Up(宝生物株式会社制)来纯化。

将通过上述PCR扩增出的含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的aroE基因的约1.0-kbDNA片段用限制酶KpnI切断后，通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化。另外，将上述含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的aroB基因及araD基因的质粒pSKM6用限制酶KpnI切断后，利用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理。将含有来自pSKM4的aroE基因的DNA片段10μl和pSKM6质粒片段2μl混合，添加T4 DNA连接酶10×缓冲液1μl、T4 DNA连接酶(宝生物株式会社制)1单位等各成分，用灭菌蒸馏水调节到10μl，在15℃下反应3小时使其结合。

将含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的aroB基因、aroD基因及aroE基因的质粒命名为pSKM7。

然后，由上述含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的aroB基因、aroD基因及aroE基因的质粒pSKM7通过以下的PCR法扩增含有aroB基因、aroD基因及aroE基因的DNA片段。

PCR时，基于含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的aroB基因、aroD基因及aroE基因的质粒pSKM7的基因序列(序列号37：pSKM7质粒序列)分别合成了下述成对引物并使用。

谷氨酸棒状杆菌aroB、aroD、aroE基因扩增用引物

(a-10)：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’(序列号38)

(b-10)：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’(序列号39)

模板DNA使用含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的aroB基因、aroD基因及aroE基因的质粒pSKM7。

反应液：

将上述物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的aroB基因、aroD基因及aroE基因时，以引物(a-10)和(b-10)的组合来进行。

PCR循环：

变性过程：98℃ 10秒

退火过程：55℃ 5秒

延伸过程：72℃ 215秒

将以上作为1个循环，进行30个循环。

将上述生成的反应液10μl通过0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，可以检测到含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的aroB基因、aroD基因及aroE基因的约3.6-kb的DNA片段。DNA片段通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)来纯化。

将纯化后的扩增产物用T4多核苷酸激酶(宝生物株式会社制)进行磷酸化处理后，通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化。另外，将含有pBL1ori序列的克隆载体pCRB1[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8(4)：243-254(2004)]用限制酶SmaI切断后，利用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理。将含有来自pSKM7的aroB基因、aroD基因及aroE基因的DNA片段10μl和pCRB1质粒片段2μl混合，添加T4 DNA连接酶10×缓冲液1μl、T4 DNA连接酶(宝生物株式会社制)1单位等各成分，用灭菌蒸馏水调节到10μl，在15℃下反应3小时使其结合。

将含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的aroB基因、aroD基因及aroE基因的质粒命名为pCRB238。需要说明的是，将本质粒的基因重组的概要综合示于表1。

[表1]

莽草酸生产相关基因表达质粒

质粒名	导入基因	基因来源	or i	抗药性标志
					pCRB237	aroG(S180F)	大肠杆菌	pCASE1	卡那霉素
pCRB239	aroG(P150L)	大肠杆菌	pCASE1	卡那霉素
					pCRB238	aroB，aroD，aroE	谷氨酸棒状杆菌	pBL1	氯霉素

(4)戊糖磷酸途径基因表达强化

(4)-1 tkt-tal基因无标记(マ一カ一レス)染色体导入用质粒的构建

通过以下的PCR法扩增含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的编码转酮醇酶基因的tkt基因及编码转醛醇酶基因的tal基因的DNA片段。

PCR时，基于含有tkt基因及tal基因的基因序列(序列号40：谷氨酸棒状杆菌tkt-tal基因)分别合成了下述成对引物并使用。

谷氨酸棒状杆菌tkt-tal基因扩增用引物

(a-11)：5’-CTCTCATATGACGCTGTCACCTGAAC-3’(序列号41)

(b-11)：5’-CTCTCATATGCTACTTCAGGCGAGCTTC-3’(序列号42)

需要说明的是，引物(a-11)及(b-11)中添加有NdeI限制酶位点。

模板DNA示于由谷氨酸棒状杆菌R菌株提取的染色体DNA。

反应液：

将上述物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增谷氨酸棒状杆菌tkt-tal基因时，以引物(a-11)和(b-11)的组合来进行。

PCR循环：

变性过程：98℃ 10秒

退火过程：55℃ 5秒

延伸过程：72℃ 225秒

将以上作为1个循环，进行30个循环。

将上述生成的反应液10μl通过0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，可以检测到含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的tkt-tal基因的约3.4-kb的DNA片段。DNA片段通过NucleoSpin Geland PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)来纯化。

将通过上述PCR扩增出的含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的tkt-tal基因的约3.4-kb DNA片段用限制酶NdeI切断后，通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化。另外，将含有PgapA启动子的克隆载体pCRB209[国际公开WO2012/033112]用限制酶NdeI切断，通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化后，利用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理。将含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的tkt-tal基因的DNA片段10μl和pCRB209质粒片段2μl混合，添加T4 DNA连接酶10×缓冲液1μl、T4 DNA连接酶(宝生物株式会社制)1单位等各成分，用灭菌蒸馏水调节到10μl，在15℃下反应3小时使其结合。

通过常规方法对培养基上的增殖菌株进行液体培养，由培养液提取质粒DNA，将该质粒用限制酶分别切断，确认插入片段。其结果是，除了质粒pCRB209约5.1-kb的DNA片段以外，还确认到含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的tkt-tal基因的约3.4-kb的插入片段。

将含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的tkt-tal基因的质粒命名为pSKM8。

然后，基于已报道的谷氨酸棒状杆菌R菌株的增殖中非必需的序列[Appl.Environ.Microbiol.71：3369-3372(2005)](SSI区域)，来确定在谷氨酸棒状杆菌R菌株的染色体中以无标记方式导入tkt-tal基因所必需的DNA区域。通过以下的PCR法扩增该DNA区域(SSI 9区域)。

PCR时，基于含有SSI 9区域的基因序列(序列号43：谷氨酸棒状杆菌SSI 9区域)分别合成了下述成对引物并使用。

谷氨酸棒状杆菌SSI 9区域扩增用引物

(a-12)：5’-CTCTCCTGCAGGTAATGGTGTCGACCGACATC-3’(序列号44)

(b-12)：5’-CTCTCCTGCAGGAAGTTAGATGTGGCTCCGAC-3’(序列号45)

引物(a-12)及(b-12)中添加有Sse8387I限制酶位点。

模板DNA使用由谷氨酸棒状杆菌R提取的染色体DNA。

反应液：

将上述物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的SSI9区域时，以引物(a-12)和(b-12)的组合来进行。

PCR循环：

变性过程：98℃ 10秒

退火过程：55℃ 5秒

延伸过程：72℃ 180秒

将以上作为1个循环，进行30个循环。

将上述生成的反应液10μl通过0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，可以检测到含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的SSI 9区域的约3.0-kb的DNA片段。DNA片段通过NucleoSpin Geland PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)来纯化。

将通过上述PCR扩增出的含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的SSI 9区域的约3.0-kbDNA片段用限制酶Sse8387I切断后，通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化。另外，将无标记基因导入用质粒pCRA725[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8：243-254(2004)、(日本特开2006-124440)]用限制酶EcoRV切断，通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化后，利用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理。将含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的SSI 9区域的基因片段10μl和pCRA725质粒片段2μl混合，添加T4 DNA连接酶10×缓冲液1μl、T4 DNA连接酶(宝生物株式会社制)1单位等各成分，用灭菌蒸馏水调节到10μl，在15℃下反应3小时使其结合。

通过常规方法对各培养基上的增殖菌株进行液体培养，由培养液提取质粒DNA，将该质粒用限制酶分别切断，确认插入片段。其结果是，除了质粒pCRA725约4.4-kb的DNA片段以外，还确认到来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的SSI 9区域约3.0-kb的插入片段。

将含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的SSI 9区域的质粒命名为pSKM9。

将上述质粒pSKM8用Bgl II和Sph I切断，进行琼脂糖电泳后，通过QIAquick凝胶提取试剂盒(株式会社Qiagen公司制)从琼脂糖凝胶回收含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的tkt-tal基因的约4.3kb的DNA片段后，通过DNA Blunting Kit(宝生物株式会社制)进行平滑化。另外，将上述质粒pSKM9用限制酶NaeI切断，通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化后，利用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理。将含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的tkt-tal基因的DNA片段10μl和pSKM9质粒片段2μl混合，添加T4 DNA连接酶10×缓冲液1μl、T4 DNA连接酶(宝生物株式会社制)1单位等各成分，用灭菌蒸馏水调节到10μl，在15℃下反应3小时使其结合。

将得到的来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的tkt-tal基因的SSI 9区域导入用质粒命名为pSKM10。

(5)与PTS不同的葡萄糖输送体系(非PTS葡萄糖通透酶)介导的糖摄取活性的强化

(5-1)iolT1基因无标记染色体导入用质粒的构建

通过以下的PCR法扩增含有来自谷氨酸棒状杆菌R的iolT1基因的DNA片段，所述iolT1基因编码作为非PTS葡萄糖通透酶的肌醇转运体基因。

PCR时，基于含有iolT1基因的序列(序列号46：谷氨酸棒状杆菌iolT1基因)分别合成了下述成对引物并使用。

谷氨酸棒状杆菌iolT1基因扩增用引物

(a-13)：5’-GGAGACCATATGGCTAGTACCTTCATTCAG-3’(序列号47)

(b-13)：5’-CCTATTGCATATGAGTGTGCTTCACTCCCG-3’(序列号48)

需要说明的是，引物(a-13)及(b-13)中添加有NdeI限制酶位点。

模板DNA使用由谷氨酸棒状杆菌R提取的染色体DNA。

反应液：

将上述物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的iolT1基因时，以引物(a-13)和(b-13)的组合来进行。

PCR循环：

变性过程：98℃ 10秒

退火过程：55℃ 5秒

延伸过程：72℃ 97秒

将以上作为1个循环，进行30个循环。

将上述生成的反应液10μl通过0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，可以检测到来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的iolT1基因约1.6-kb的DNA片段。各DNA片段通过NucleoSpin Gel andPCR Clean-Up(宝生物株式会社制)来纯化。

然后，基于已报道的谷氨酸棒状杆菌R菌株的增殖中非必需的序列[Appl.Environ.Microbiol.71：3369-3372(2005)](SSI区域)，来确定在谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)R菌株的染色体中以无标记方式导入iolT1基因所必需的DNA区域。通过以下的PCR法扩增该DNA区域(SSI 3区域)。

PCR时，基于含有SSI 3区域的基因序列(序列号49：谷氨酸棒状杆菌SSI 3区域)分别合成了下述成对引物并使用。

谷氨酸棒状杆菌SSI 3区域扩增用引物

(a-14)：5’-CTCTGTCGACGAGATCGTACTTCGTAGGC-3’(序列号50)

(b-14)：5’-CTCTGTCGACAGCTCGAAATCGAAGACCG-3’(序列号51)

需要说明的是，引物(a-14)及(b-14)中添加有SalI限制酶位点。

模板DNA使用由谷氨酸棒状杆菌R提取的染色体DNA。

反应液：

将上述物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的SSI3区域时，以引物(a-1)和(b-1)的组合来进行。

PCR循环：

变性过程：98℃ 10秒

退火过程：55℃ 5秒

延伸过程：72℃ 181秒

将以上作为1个循环，进行30个循环。

将上述生成的反应液10μl通过0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，可以检测到来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的SSI 3区域约3.0-kb的DNA片段。各DNA片段通过NucleoSpin Gel andPCR Clean-Up(宝生物株式会社制)来纯化。

将通过上述PCR扩增出的含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的SSI3区域的约3.0-kbDNA片段用限制酶SalI切断后，通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化。另外，将无标记基因导入用质粒pCRA725[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8：243-254(2004)、(日本特开2006-124440)]用限制酶SalI切断，通过NucleoSpin Gel andPCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化后，利用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理。将含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的SSI3区域的DNA片段10μl和pCRA725质粒片段2μl混合，添加T4 DNA连接酶10×缓冲液1μl、T4 DNA连接酶(宝生物株式会社制)1单位等各成分，用灭菌蒸馏水调节到10μl，在15℃下反应3小时使其结合。

通过常规方法对培养基上的增殖菌株进行液体培养，由培养液提取质粒DNA，将该质粒用限制酶分别切断，确认插入片段。其结果是，除了质粒pCRA725约4.4-kb的DNA片段以外，还确认到含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的SSI 3区域的约3.0-kb的插入片段。

将得到的含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的SSI 3区域的质粒命名为pSKM11。

然后，为了在上述质粒pSKM11的SSI3区域导入用于基因重组的限制酶位点(单一位点)而进行反向PCR法。

PCR时，基于含有SSI 3区域的基因序列(序列号49：谷氨酸棒状杆菌SSI 3)分别合成下述成对引物并使用。

谷氨酸棒状杆菌SSI 3区域限制酶位点导入用引物

(a-15)：5’-CTCTAGATCTACCAACTCCCAGAGCC-3’(序列号52)

(b-15)：5’-CTCTAGATCTTTGGCCAGGTCGAACAG-3’(序列号53)

需要说明的是，引物(a-15)及(b-15)中添加有BglII限制酶位点。

模板DNA使用含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的SSI3区域的质粒pSKM11。

反应液：

将上述物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的SSI3区域的质粒时，以引物(a-15)和(b-15)的组合来进行。

PCR循环：

变性过程：98℃ 10秒

退火过程：60℃ 5秒

延伸过程：68℃ 448秒

将以上作为1个循环，进行30个循环。

将上述生成的反应液10μl通过0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，可以检测到含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的SSI 3区域的约7.5-kb的DNA片段。DNA片段通过NucleoSpin Geland PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)来纯化。

将纯化后的扩增产物用BglII处理后，通过DNA连接反应试剂盒(宝生物株式会社制)进行结合(自身连接)。使用所得到的连接反应液，通过氯化钙法[J.Mol.Biol.53：159-162(1970)]转化大肠杆菌HST02，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的LB琼脂培养基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠、及1.5％琼脂]上。通过常规方法对培养基上的增殖菌株进行液体培养，由培养液提取质粒DNA，对该质粒的碱基序列进行测序解析，从而确认在SSI3区域中导入了BglII限制酶位点。

将得到的含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的SSI 3区域的质粒命名为pSKM12。

然后，为了在上述质粒pSKM12中导入tac启动子及rrnB终止子，将含有tac启动子的克隆载体pCRB214[FEBS Letters，586(23)：4228-4232(2012)]用Bam HI切断，进行琼脂糖电泳后，通过QIAquick凝胶提取试剂盒(株式会社Qiagen公司制)从琼脂糖凝胶回收连接有tac启动子及rrnB终止子序列的约0.7-kb的DNA片段。另外，将含有来自谷氨酸棒状杆菌株的SSI 3区域的质粒pSKM12用BglII切断，通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化后，利用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理。将由pCRB214回收的含有tac启动子及rrnB终止子的DNA片段10μl和pSKM12质粒片段2μl混合，添加T4DNA连接酶10×缓冲液1μl、T4 DNA连接酶(宝生物株式会社制)1单位等各成分，用灭菌蒸馏水调节到10μl，在15℃下反应3小时使其结合。

将得到的含有tac启动子序列、rrnB终止子序列及SSI3区域的质粒命名为pSKM13。

将通过上述PCR扩增出的含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的iolT1基因的约1.6-kbDNA片段用限制酶NdeI切断后，通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化。另外，将含有tac启动子序列、rrnB终止子序列及SSI3区域的克隆载体pSKM13用限制酶NdeI切断，通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化后，利用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理。将含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的iolT1基因的DNA片段10μl和pSKM13质粒片段2μl混合，添加T4 DNA连接酶10×缓冲液1μl、T4 DNA连接酶(宝生物株式会社制)1单位等各成分，用灭菌蒸馏水调节到10μl，在15℃下反应3小时使其结合。

通过常规方法对各培养基上的增殖菌株进行液体培养，由培养液提取质粒DNA，将该质粒用限制酶分别切断，确认插入片段。其结果是，除了质粒pSKM13约8.5-kb的DNA片段以外，还确认到来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的iolT1基因约1.6-kb的插入片段。

将得到的来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的iolT1基因的SSI3区域导入用质粒命名为pSKM14。

(6)葡萄糖激酶活性的强化

(6-1)葡萄糖激酶基因无标记染色体导入用质粒的构建

通过以下的PCR法扩增含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的编码葡萄糖激酶基因的glk1基因、glk2基因及ppgK基因的DNA片段。

PCR时，基于含有glk1基因的序列(序列号54：谷氨酸棒状杆菌glk1基因)、含有glk2基因的序列(序列号55：谷氨酸棒状杆菌glk2基因)及含有ppgK基因的序列(序列号56：谷氨酸棒状杆菌ppgK基因)分别合成了下述成对引物并使用。

谷氨酸棒状杆菌glk1基因扩增用引物

(a-16)：5’-CTCTGCATGCCACAAAAACCGGCC-3’(序列号57)

(b-16)：5’-CTCTGCATGCCTAGTTGGCTTCCAACACG-3’(序列号58)

需要说明的是，引物(a-16)及(b-16)中添加有SphI限制酶位点。

谷氨酸棒状杆菌glk2基因扩增用引物

(a-17)：5’-CTCTCATATGACTGATCCCACTTGCAC-3’(序列号59)

(b-17)：5’-CTCTCATATGGAGAACAGCGTTTTAGGTGC-3’(序列号60)

需要说明的是，引物(a-17)及(b-17)中添加有NdeI限制酶位点。

谷氨酸棒状杆菌ppgK基因扩增用引物

(a-18)：5’-CTCTCATATGGCGCGCGGCG-3’(序列号61)

(b-18)：5’-CTCTCATATGTTATGGGGTGAGGTGTTGG-3’(序列号62)

需要说明的是，引物(a-18)及(b-18)中添加有NdeI限制酶位点。

模板DNA使用由谷氨酸棒状杆菌R提取的染色体DNA。

反应液：

将上述物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的glk1基因时，以引物(a-16)和(b-16)的组合来进行；扩增glk2基因时，以引物(a-17)和(b-17)的组合来进行；扩增ppgK基因时，以引物(a-18)和(b-18)的组合来进行。

PCR循环：

将以上作为1个循环，进行30个循环。

将上述生成的反应液10μl通过0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，可以检测到含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的glk1基因的约1.0-kb的DNA片段、含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的glk2基因的约0.9-kb的DNA片段及含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的ppgK基因的约1.2-kb的DNA片段。各DNA片段通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)来纯化。

将通过上述PCR扩增出的含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的glk1基因的约1.0-kb用限制酶SphI切断后，通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化。另外，将含有gapA启动子的克隆载体pCRB240用限制酶SphI切断，通过NucleoSpinGel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化后，利用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理。将含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的glk1基因的DNA片段10μl和pCRB240质粒片段2μl混合，添加T4 DNA连接酶10×缓冲液1μl、T4 DNA连接酶(宝生物株式会社制)1单位等各成分，用灭菌蒸馏水调节到10μl，在15℃下反应3小时使其结合。

通过常规方法对培养基上的增殖菌株进行液体培养，由培养液提取质粒DNA，将该质粒用限制酶分别切断，确认插入片段。其结果是，除了质粒pCRB240约5.0-kb的DNA片段以外，还确认到来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的glk1基因约1.0-kb的插入片段。

将含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的glk1基因的质粒命名为pSKM15。

然后，将通过上述PCR扩增出的含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的glk2基因的约0.9-kb的DNA片段及含有ppgK基因的约1.2-kb的DNA片段用限制酶NdeI切断后，通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化。另外，将含有gapA启动子的克隆载体pCRB210[国际公开WO2012/033112]用限制酶NdeI切断，通过NucleoSpin Geland PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化后，利用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理。将含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的glk2基因或ppgK基因的DNA片段10μl和pCRB210质粒片段2μl混合，添加T4 DNA连接酶10×缓冲液1μl、T4 DNA连接酶(宝生物株式会社制)1单位等成分成分，用灭菌蒸馏水调节到10μl，在15℃下反应3小时使其结合。

通过常规方法对各培养基上的增殖菌株进行液体培养，由培养液提取质粒DNA，将该质粒用限制酶分别切断，确认插入片段。其结果是，除了质粒pCRB210约5.1-kb的DNA片段以外，在来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的glk2基因的情况下还确认到约0.9-kb的插入片段，在ppgK基因的情况下还确认到约1.2-kb的插入片段。

将得到的含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的glk2基因的质粒命名为pSKM16，将含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的ppgK基因的质粒命名为pSKM17。

然后，基于已报道的谷氨酸棒状杆菌R菌株的增殖中非必需的序列[Appl.Environ.Microbiol.71：3369-3372(2005)](SSI区域)，来确定在谷氨酸棒状杆菌R菌株的染色体中以无标记方式导入葡萄糖激酶基因所必需的DNA区域。通过以下的PCR法扩增该DNA区域(SSI 9、10、6区域)。

PCR时，基于含有SSI 9区域的基因序列(序列号63：谷氨酸棒状杆菌SSI 9区域)、含有SSI 10区域的基因序列(序列号64：谷氨酸棒状杆菌SSI 10区域)及含有SSI 6区域的基因序列(序列号65：谷氨酸棒状杆菌SSI 6区域)分别合成了下述成对引物并使用。

谷氨酸棒状杆菌SSI 9区域扩增用引物

(a-19)：5’-CTCTCCTGCAGGTCCAGTGTGGATCGCAAC-3’(序列号66)

(b-19)：5’-CTCTCCTGCAGGGAGGATATGGTGACTAGCTTG-3’(序列号67)

引物(a-19)及(b-19)中添加有Sse8387I限制酶位点。

谷氨酸棒状杆菌SSI 10区域扩增用引物

(a-20)：5’-CTCTCCTGCAGGCACCGTTGTCAGCTTCACT-3’(序列号68)

(b-20)：5’-CTCTCCTGCAGGCTGACTGTGGCATACCTCTA-3’(序列号69)

引物(a-20)及(b-20)中添加有Sse8387I限制酶位点。

谷氨酸棒状杆菌SSI 6区域扩增用引物

(a-21)：5’-CTCTCCTGCAGGTTGGGAACTTAGCTAGGTCG-3’(序列号70)

(b-21)：5’-CTCTCCTGCAGGTGGAATCAGGATCAGATGCG-3’(序列号71)

引物(a-21)及(b-21)中添加有Sse8387I限制酶位点。

模板DNA使用由谷氨酸棒状杆菌R提取的染色体DNA。

反应液：

将上述物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的SSI9区域时，以引物(a-19)和(b-19)的组合来进行；扩增SSI10区域时，以引物(a-20)和(b-20)的组合来进行；扩增SSI6区域时，以引物(a-21)和(b-21)的组合来进行。

PCR循环：

将以上作为1个循环，进行30个循环。

将上述生成的反应液10μl通过0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，可以检测到来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的SSI 9区域约3.2-kb的DNA片段、SSI 10区域约2.5-kb的DNA片段、SSI 6区域约3.1-kb的DNA片段。各DNA片段通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)来纯化。

将通过上述PCR扩增出的含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的SSI9区域的约3.2-kbDNA片段、含有SSI 10区域的约2.5-kb的DNA片段及含有SSI 6区域的约3.1-kb的DNA片段用限制酶Sse8387I切断后，通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化。另外，将无标记基因导入用质粒pCRA725[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.，8：243-254(2004)、(日本特开2006-124440)]用限制酶Sse8387I切断，通过NucleoSpin Gel andPCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化后，利用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理。将含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的SSI9区域的DNA片段、含有SSI 10区域的DNA片段、或含有SSI 6区域的DNA片段10μl分别与pCRA725质粒片段2μl混合，添加T4 DNA连接酶10×缓冲液1μl、T4 DNA连接酶(宝生物株式会社制)1单位等各成分，用灭菌蒸馏水调节到10μl，在15℃下反应3小时使其结合。

通过常规方法对培养基上的增殖菌株进行液体培养，由培养液提取质粒DNA，将该质粒用限制酶分别切断，确认插入片段。其结果是，除了质粒pCRA725约4.4-kb的DNA片段以外，还确认到含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的SSI9区域的约3.2-kb的DNA片段、含有SSI10区域的约2.5-kb的DNA片段及含有SSI 6的区域约3.1-kb的DNA片段的插入片段。

将得到的含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的SSI9区域的质粒命名为pSKM18，将含有SSI10区域的质粒命名为pSKM19，将含有SSI6区域的质粒命名为pSKM20。

为了在上述含有SSI9区域的质粒pSKM18及含有SSI6区域的质粒pSKM20中导入用于基因重组的限制酶位点(单一位点)而进行反向PCR法。

PCR时，基于含有SSI 9区域的基因序列(序列号63：谷氨酸棒状杆菌SSI 9区域)、含有SSI 6区域的基因序列(序列号65：谷氨酸棒状杆菌SSI 6区域)分别合成了下述成对引物并使用。

谷氨酸棒状杆菌SSI 9区域限制酶位点导入用引物

(a-22)：5’-CTCTGATATCCTTCCTAAACGATGAGCGAG-3’(序列号72)

(b-22)：5’-CTCTGATATCTTGGTCAGTTCAGTCTGGAG-3’(序列号73)

引物(a-22)及(b-22)中添加有Eco RV限制酶位点。

谷氨酸棒状杆菌SSI 6区域限制酶位点导入用引物

(a-23)：5’-CTCTAGTACTGCAGATCCATTTCATTGCGC-3’(序列号74)

(b-23)：5’-CTCTAGTACTTGGTGGAATTACACGCACC-3’(序列号75)

引物(a-23)及(b-23)中添加有ScaI限制酶位点。

模板DNA使用含有SSI9区域的质粒pSKM18及含有SSI6区域的质粒pSKM20。

反应液：

将上述物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的SSI9区域的质粒时，以引物(a-22)和(b-22)的组合来进行；扩增含有SSI6区域的质粒时，以引物(a-23)和(b-23)的组合来进行。

PCR循环：

将以上作为1个循环，进行30个循环。

将上述生成的反应液10μl通过0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，可以检测到含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的SSI9区域的约7.7-kb的DNA片段及含有SSI6区域的约7.6-kb的DNA片段。各DNA片段通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)来纯化。

将通过上述PCR扩增出的含有SSI 9区域的DNA片段用限制酶EcoRV处理，将含有SSI 6区域的DNA片段用限制酶ScaI处理，通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化后，通过DNA连接反应试剂盒(宝生物株式会社制)进行结合(自身连接)。使用所得到的连接反应液，通过氯化钙法[J.Mol.Biol.53：159-162(1970)]转化大肠杆菌HST02，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的LB琼脂培养基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠、及1.5％琼脂]上。

通过常规方法对培养基上的增殖菌株进行液体培养，由培养液提取质粒DNA，对该质粒的碱基序列进行测序解析，从而确认在SSI9区域中导入了EcoRV限制酶位点、在SSI6区域中导入了ScaI限制酶位点。

将得到的含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的SSI 9区域的质粒命名为pSKM21，将含有SSI 6区域的质粒命名为pSKM22。

将上述质粒pSKM15用限制酶PstI和Hin dIII切断，进行琼脂糖电泳后，从琼脂糖凝胶通过QIAquick凝胶提取试剂盒(株式会社Qiagen公司制)回收，将含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的glk1基因的约1.9-kb的DNA片段通过DNA Blunting Kit(宝生物株式会社制)进行平滑化。另外，将上述质粒pSKM21用限制酶Eco RV切断，通过NucleoSpin Gel and PCRClean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化后，利用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理。将含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的glk1基因的DNA片段10μl和pSKM21质粒片段2μl混合，添加T4 DNA连接酶10×缓冲液1μl、T4 DNA连接酶(宝生物株式会社制)1单位等各成分，用灭菌蒸馏水调节到10μl，在15℃下反应3小时使其结合。

将来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的glk1基因的染色体SSI 9区域导入用质粒命名为pSKM23。

将上述质粒pSKM16用限制酶SalI切断，进行琼脂糖电泳后，从琼脂糖凝胶通过QIAquick凝胶提取试剂盒(株式会社Qiagen公司制)回收含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的glk2基因的约1.9-kb的DNA片段。另外，将上述质粒pSKM19用限制酶XhoI切断，通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化后，利用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理。将含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的glk2基因的DNA片段10μl和pSKM19质粒片段2μl混合，添加T4 DNA连接酶10×缓冲液1μl、T4 DNA连接酶(宝生物株式会社制)1单位等各成分，用灭菌蒸馏水调节到10μl，在15℃下反应3小时使其结合。

将来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的glk2基因的染色体SSI 10区域导入用质粒命名为pSKM24。

将上述质粒pSKM17用限制酶XbaI和PstI切断，进行琼脂糖电泳后，从琼脂糖凝胶通过QIAquick凝胶提取试剂盒(株式会社Qiagen公司制)回收含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的ppgK基因的约1.9-kb的DNA片段后，通过DNA Blunting Kit(宝生物株式会社制)进行平滑化。另外，将上述质粒pSKM22用限制酶ScaI切断，通过NucleoSpin Gel and PCRClean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化后，利用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理。将含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的ppgK基因的DNA片段10μl和pSKM22质粒片段2μl混合，添加T4 DNA连接酶10×缓冲液1μl、T4 DNA连接酶(宝生物株式会社制)1单位等各成分，用灭菌蒸馏水调节到10μl，在15℃下反应3小时使其结合。

将来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的ppgK基因的染色体SSI6区域导入用质粒命名为pSKM25。

(7)谷氨酸棒状杆菌的染色体基因破坏用质粒的构建

(7-1)谷氨酸棒状杆菌R菌株qsuB基因、qsuD基因及hdpA基因破坏用质粒的构建

通过以下的PCR法扩增用于构建谷氨酸棒状杆菌R菌株的编码3-脱氢莽草酸脱水酶的染色体qsuB基因、编码奎宁酸/莽草酸脱氢酶的qsuD基因及编码二羟丙酮磷酸磷酸酶(HAD(haloacid dehalogenase，卤酸脱卤酶)超家族磷酸酶的hdpA基因的无标记破坏用质粒所必需的DNA片段。

PCR时，基于含有qsuB基因的序列(序列号76：谷氨酸棒状杆菌qsuB基因)、含有qsuD基因的序列(序列号77：谷氨酸棒状杆菌qsuD基因)及含有hdpA基因的序列(序列号78：谷氨酸棒状杆菌hdpA基因)分别合成了下述成对引物并使用。

谷氨酸棒状杆菌qsuB基因扩增用引物

(a-24)：5’-CTCTGTCGACCTCAGATTGGTTTCGCAGTC-3’(序列号79)

(b-24)：5’-CTGATTGCGCACCAAACCAAGAACGTATCCAAGCAGGTTC-3’(序列号80)

(a-25)：5’-TTGGTTTGGTGCGCAATCAG-3’(序列号81)

(b-25)：5’-CTCTGTCGACTCAACGGTAGGAAGCTCAG-3’(序列号82)

引物(a-24)及(b-25)中添加有SalI限制酶位点。

谷氨酸棒状杆菌qsuD基因扩增用引物

(a-26)：5’-CTCTGTCGACGTTCTTCGAAGTGGTGGAAC-3’(序列号83)

(b-26)：5’-GTGAGGCAGCTGACATCAAACGTTGAAGCCAAGGTAGAG-3’(序列号84)

(a-27)：5’-TTTGATGTCAGCTGCCTCAC-3’(序列号85)

(b-27)：5’-CTCTGTCGACTGATCACCTTAAAGGGCGAC-3’(序列号86)

引物(a-26)及(b-27)中添加有SalI限制酶位点。

谷氨酸棒状杆菌hdpA基因扩增用引物

(a-28)：5’-CTCTCTGCAGTTGTGGTAGACCTTGGGTG-3’(序列号87)

(b-28)：5’-AACACCATTGTCCCTGTTTTGG-3’(序列号88)

(a-29)：5’-TCGCCCAAAACAGGGACAATGGTGTTTATTCTGTAGGTCATGGCATTTGC-3’(序列号89)

(b-29)：5’-CTCTTCTAGAATTGCAACACCTGCGATGC-3’(序列号90)

引物(a-28)中添加有PstI，(b-29)中添加有XbaI限制酶位点。

模板DNA使用由谷氨酸棒状杆菌R提取的染色体DNA。

反应液：

将上述物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增DNA片段qsuB-1时，以引物(a-24)和(b-24))的组合来进行；扩增qsuB-2时，以引物(a-25)和(b-25))的组合来进行；扩增qsuD-1时，以引物(a-26)和(b-26))的组合来进行；扩增qsuD-2时，以引物(a-27)和(b-27))的组合来进行；扩增hdpA-1时，以引物(a-28)和(b-28))的组合来进行；扩增hdpA-2时，以引物(a-29)和(b-29)的组合来进行。

PCR循环：

变性过程：98℃ 10秒

退火过程：55℃ 5秒

延伸过程：72℃ 50秒

将以上作为1个循环，进行30个循环。

将上述生成的反应液通过0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，在qsuB-1的情况下可以检测到约0.8-kb的DNA片段；在qsuB-2的情况下可以检测到约0.8-kb的DNA片段；在qsuD-1的情况下可以检测到约0.7-kb的DNA片段；在qsuD-2的情况下可以检测到约0.8-kb的DNA片段；在hdpA-1的情况下可以检测到约0.9-kb的DNA片段；在hdpA-2的情况下可以检测到约0.9-kb的DNA片段。各DNA片段通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)来纯化。

可以将通过上述PCR扩增出的DNA片段qsuB-1、qsuD-1及hdpA-1的3’端约20-bp与DNA片段qsuB-2、qsuD-2及hdpA-2的5’端约20-bp按照序列重叠的方式来设计，通过使两DNA片段热变性后退火而使其连接。

实际的连接反应使用Veriti热循环仪(应用生物系统公司制)，使用PrimeSTAR HSDNA聚合酶(宝生物株式会社制)作为反应试剂，以下述条件来进行。

就DNA片段而言，以qsuB-1和qsuB-2、qsuD-1和qsuD-2、hdpA-1和hdpA-2的组合来混合使用。

反应液：

将上述物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

PCR循环：

变性过程：98℃ 10秒

退火过程：50℃ 5秒

延伸过程：68℃ 90秒

将上述作为1个循环，进行15个循环。

以连接反应后的反应液为模板，按照以下的条件进行第2次PCR。

反应液：

将上述物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的qsuB基因时，以引物(a-24)和(b-25))的组合来进行；扩增qsuD基因时，以引物(a-26)和(b-27))的组合来进行；扩增hdpA基因时，以引物(a-28)和(b-29)的组合来进行。

PCR循环：

将上述作为1个循环，进行20个循环。

将上述生成的反应液通过0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，在qsuB基因的情况下可以检测到约1.6-kb，在qsuD基因的情况下可以检测到约1.5-kb，在hdpA基因的情况下可以检测到约1.8-kb的DNA片段。各DNA片段通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)来纯化。

在通过上述PCR扩增出的含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的qsuB基因的DNA片段及含有qsuD基因的DNA片段的情况下用限制酶SalI切断，在含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的hdpA基因的DNA片段的情况下用限制酶PstI和XbaI切断，然后通过NucleoSpin Gel andPCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化。另外，将无标记基因破坏用质粒pCRA725[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8：243-254(2004)、(日本特开2006-124440)]用限制酶SalI(qsuB基因及qsuD基因)或PstI和XbaI(hdpA基因)切断后，利用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理。将含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的qsuB基因的DNA片段、含有qsuD基因的DNA片段或含有hdpA基因的DNA片段10μl和pCRA725质粒片段2μl混合，添加T4DNA连接酶10×缓冲液1μl、T4 DNA连接酶(宝生物株式会社制)1单位等各成分，用灭菌蒸馏水调节到10μl，在15℃下反应3小时使其结合。

将得到的连接反应液通过氯化钙法[J.Mol.Biol.53：159-162(1970)]转化大肠杆菌HST02，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的LB琼脂培养基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠、及1.5％琼脂]上。

通过常规方法对各培养基上的增殖菌株进行液体培养，由培养液提取质粒DNA，将该质粒用限制酶分别切断，确认插入片段。其结果是，除了质粒pCRA725约4.0-kb的DNA片段以外，在qsuB基因的情况下可以检测到约1.6-kb的DNA片段，在qsuD基因的情况下可以检测到约1.5-kb的DNA片段，在hdpA基因的情况下可以检测到约1.8-kb的DNA片段。

将得到的谷氨酸棒状杆菌R菌株qsuB基因破坏用质粒命名为pSKM26，将qsuD基因破坏用质粒命名为pSKM27，将hdpA基因破坏用质粒命名为pSKM28。

(7-2)谷氨酸棒状杆菌R菌株aroK基因破坏用质粒的构建

通过以下的PCR法扩增用于构建谷氨酸棒状杆菌R菌株的编码莽草酸激酶的染色体aroK基因的无标记破坏用质粒所必需的DNA片段。

PCR时，基于含有aroK基因的序列(序列号91：谷氨酸棒状杆菌aroK基因)分别合成了下述成对引物并使用。

谷氨酸棒状杆菌aroK基因扩增用引物

(a-30)：5’-AGGCATGCGGAGGTGCTCTCTCACGTAA-3’(序列号92)

(b-30)：5’-TCCCCCGGGCGAGCACTACCGCAACCT-3’(序列号93)

(a-31)：5’-TCCCCCGGGCCGGAGGATTTCAGTGCTT-3’(序列号94)

(b-31)：5’-AGGCATGCCACTGCAACGGCATTGCCGT-3’(序列号95)

需要说明的是，引物(a-30)及(b-31)中添加有SphI限制酶位点，(a-31)及(b-30)中添加有SmaI限制酶位点。

模板DNA使用由谷氨酸棒状杆菌R菌株提取的染色体DNA。

反应液：

将上述物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。

*)扩增aroK-1时，以引物(a-30)和(b-30))的组合来进行；扩增aroK-2时，以引物(a-31)和(b-31)的组合来进行。

PCR循环：

将以上作为1个循环，进行30个循环。

将上述生成的反应液10μl通过0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，可以检测到来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的aroK-1约1.0-kb及aroK-2约1.0-kb的DNA片段。各DNA片段通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)来纯化。

将通过上述PCR扩增出的含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的aroK基因的DNA片段aroK-1约1.0-kb及aroK-2约1.0-kb用限制酶SphI及SmaI切断后，通过NucleoSpin Gel andPCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化。另外，将无标记基因破坏用质粒pCRA725[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8：243-254(2004)、(日本特开2006-124440)]用限制酶SphI切断，通过NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(宝生物株式会社制)进行纯化后，利用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理。将含有来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的aroK基因的DNA片段2种各10μl和pCRA725质粒片段2μl混合，添加T4 DNA连接酶10×缓冲液1μl、T4DNA连接酶(宝生物株式会社制)1单位等各成分，用灭菌蒸馏水调节到10μl，在15℃下反应3小时使其结合。

通过常规方法对培养基上的增殖菌株进行液体培养，由培养液提取质粒DNA，将该质粒用限制酶分别切断，确认插入片段。其结果是，除了质粒pCRA725约4.4-kb的DNA片段以外，还确认到来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的aroK基因的一部分被删除的约2.0-kb的插入片段。

将得到的谷氨酸棒状杆菌R菌株aroK基因无标记破坏用质粒命名为pCRC329。

(8)通过染色体基因重组构建莽草酸生产株

无标记染色体基因导入用载体pCRA725是在谷氨酸棒状杆菌R内不能复制的质粒。使用谷氨酸棒状杆菌R菌株的ldhA基因破坏用质粒pCRA728[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8(4)：243-254(2004)]，通过电脉冲法[Agric.Biol.Chem.54：443-447(1990)及Res.Microbiol.144：181-185(1993)]转化谷氨酸棒状杆菌X5C1菌株[Appl Microbiol Biotechnol.81(4)：691-699(2008)]，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的A琼脂培养基[A液体培养基、及1.5％琼脂]上。将上述培养基上得到的单交换菌株涂布在含有10％(W/V)蔗糖的BT琼脂培养基[在蒸馏水1L中溶解有(NH₂)₂CO 2g、(NH₄)₂SO₄ 7g、KH₂PO₄ 0.5g、K₂HPO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、0.06％(w/v)FeSO₄·7H₂O+0.042％(w/v)MnSO₄·2H₂O 1ml、0.02％(w/v)生物素溶液1ml、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml，1.5％琼脂]上。

在质粒pCRA728与染色体上的同源区域的单交换菌株的情况下，通过pCRA728上的卡那霉素耐性基因的表达而显示卡那霉素耐性，通过枯草杆菌(Bacillus subtilis)的sacR-sacB基因的表达而显示含蔗糖培养基上的致死性；在双交换菌株的情况下，通过pCRA728上的卡那霉素耐性基因的脱落而显示卡那霉素敏感性，通过sacR-sacB基因的脱落而显示含蔗糖培养基上的增殖性。因此，无标记染色体基因破坏菌株显示出卡那霉素敏感性及含蔗糖培养基增殖性。

因此，选择显示出卡那霉素敏感性及含蔗糖培养基增殖性的菌株。将该谷氨酸棒状杆菌R菌株ldhA基因无标记破坏菌株命名为氨酸棒状杆菌X5C1ΔldhA菌株。

然后，使用阿拉伯糖同化基因染色体导入用质粒pCRD109[Appl MicrobiolBiotechnol.85(1)：105-115(2009)]，通过电脉冲法[Agric.Biol.Chem.，54：443-447(1990)及Res.Microbiol.，144：181-185(1993)]转化谷氨酸棒状杆菌X5C1ΔldhA菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的A琼脂培养基[A液体培养基、及1.5％琼脂]上。将上述培养基上得到的单交换菌株涂布在含有10％(W/V)蔗糖的BT琼脂培养基[BT液体培养基及1.5％琼脂]上。

从培养基上的增殖菌株中选择显示卡那霉素敏感性及含蔗糖培养基增殖性的菌株。将该阿拉伯糖同化基因染色体导入菌株命名为谷氨酸棒状杆菌A1X5C1ΔldhA菌株。

然后，使用阿拉伯糖转运体基因染色体导入用质粒pCRD108[Appl.Microbiol.Biotechnol.85(1)：105-115(2009)]，通过电脉冲法[Agric.Biol.Chem.54：443-447(1990)及Res.Microbiol.144：181-185(1993)]转化谷氨酸棒状杆菌A1X5C1ΔldhA菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的A琼脂培养基[A液体培养基、及1.5％琼脂]上。将上述培养基上得到的单交换菌株、涂布在含有10％(W/V)蔗糖的BT琼脂培养基[BT液体培养基及1.5％琼脂]上。

从培养基上的增殖菌株中选择显示卡那霉素敏感性及含蔗糖培养基增殖性的菌株。将该阿拉伯糖转运体同化基因染色体导入菌株命名为谷氨酸棒状杆菌A1X5C1araEΔldhA菌株。

然后，使用谷氨酸棒状杆菌菌株qsuB基因破坏用质粒pSKM26，通过电脉冲法[Agric.Biol.Chem.54：443-447(1990)及Res.Microbiol.144：181-185(1993)]转化谷氨酸棒状杆菌A1X5C1araEΔldhA菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的A琼脂培养基[A液体培养基、及1.5％琼脂]上。将上述培养基上得到的单交换菌株涂布在含有10％(W/V)蔗糖的BT琼脂培养基[BT液体培养基、及1.5％琼脂]上。

从培养基上的增殖菌株中选择显示卡那霉素敏感性及含蔗糖培养基增殖性的菌菌株。将该谷氨酸棒状杆菌R菌株qsuB基因破坏菌株命名为谷氨酸棒状杆菌SKM8菌株。

然后，使用谷氨酸棒状杆菌R菌株qsuD基因破坏用质粒pSKM27，通过电脉冲法[Agric.Biol.Chem.Vol.54，443-447(1990)及Res.Microbiol.Vol.144，181-185(1993)]转化谷氨酸棒状杆菌SKM8菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的A琼脂培养基[A液体培养基、及1.5％琼脂]上。将上述培养基上得到的单交换菌株涂布在含有10％(W/V)蔗糖的BT琼脂培养基[BT液体培养基及1.5％琼脂]上。

从培养基上的增殖菌株中选择显示卡那霉素敏感性及含蔗糖培养基增殖性的菌株。将该谷氨酸棒状杆菌R菌株qsuD基因无标记破坏菌株命名为谷氨酸棒状杆菌SKM9菌株。

然后，使用谷氨酸棒状杆菌R菌株aroK基因破坏用质粒pCRC329，通过电脉冲法[Agric.Biol.Chem.Vol.54、443-447(1990)及Res.Microbiol.Vol.144，181-185(1993)]转化谷氨酸棒状杆菌SKM9菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的A琼脂培养基[A液体培养基、及1.5％琼脂]上。将上述培养基上得到的单交换菌株涂布在含有10％(W/V)蔗糖及芳香族氨基酸的BT琼脂培养基[在BT液体培养基中添加有苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸各20μg/ml、对氨基苯甲酸10μg/ml，1.5％琼脂]上。

从培养基上的增殖菌株中选择显示卡那霉素敏感性及含蔗糖培养基增殖性的菌株。将该谷氨酸棒状杆菌R菌株aroK基因无标记破坏菌株命名为谷氨酸棒状杆菌SKM1菌株。

然后，使用谷氨酸棒状杆菌R菌株tkt-tal基因染色体导入用质粒pSKM10，通过电脉冲法[Agric.Biol.Chem.，Vol.54，443-447(1990)及Res.Microbiol.，Vol.144，181-185(1993)]转化谷氨酸棒状杆菌SKM1菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的A琼脂培养基[A液体培养基、及1.5％琼脂]上。将上述培养基上得到的单交换菌株涂布在含有10％(W/V)蔗糖及芳香族氨基酸的BT琼脂培养基上。

从培养基上的增殖菌株中选择显示卡那霉素敏感性及含蔗糖培养基增殖性的菌株。将该谷氨酸棒状杆菌R菌株tkt-tal基因无标记染色体导入菌株命名为谷氨酸棒状杆菌SKM2菌株。

然后，使用谷氨酸棒状杆菌R菌株iolT1基因染色体导入用质粒pSKM14，通过电脉冲法[Agric.Biol.Chem.，Vol.54，443-447(1990)及Res.Microbiol.，Vol.144，181-185(1993)]转化谷氨酸棒状杆菌SKM2菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml及芳香族氨基酸的A琼脂培养基[A液体培养基、及1.5％琼脂]上。将上述培养基上得到的单交换菌株涂布在含有10％(W/V)蔗糖及芳香族氨基酸的BT琼脂培养基上。

从培养基上的增殖菌株中选择显示卡那霉素敏感性及含蔗糖培养基增殖性的菌株。将该谷氨酸棒状杆菌R菌株iolT1基因无标记染色体导入菌株命名为谷氨酸棒状杆菌LHglc553菌株。

然后，使用谷氨酸棒状杆菌R菌株ptsH基因破坏用质粒pCRC809[Microbiology，155(Pt11)：3652-3660(2009)]，通过电脉冲法[Agric.Biol.Chem.Vol.54，443-447(1990)及Res.Microbiol.Vol.144，181-185(1993)]转化谷氨酸棒状杆菌LHglc553菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml及芳香族氨基酸的A琼脂培养基[A液体培养基、及1.5％琼脂]上。将上述培养基上得到的单交换菌株涂布在含有10％(W/V)蔗糖及芳香族氨基酸的BT琼脂培养基上。

从培养基上的增殖菌株中选择显示卡那霉素敏感性及含蔗糖培养基增殖性的菌株。将该谷氨酸棒状杆菌R菌株ptsH基因无标记破坏菌株命名为谷氨酸棒状杆菌LHglc567菌株。

然后，使用谷氨酸棒状杆菌R菌株ppgK基因染色体导入用质粒pSKM25，通过电脉冲法[Agric.Biol.Chem.Vol.54、443-447(1990)及Res.Microbiol.Vol.144，181-185(1993)]转化谷氨酸棒状杆菌LHglc567菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml及芳香族氨基酸的A琼脂培养基[A液体培养基、及1.5％琼脂]上。将上述培养基上得到的单交换菌株涂布在含有10％(W/V)蔗糖及芳香族氨基酸的BT琼脂培养基上。

从培养基上的增殖菌株中选择显示卡那霉素敏感性及含蔗糖培养基增殖性的菌株。将该谷氨酸棒状杆菌R菌株ppgK基因无标记染色体导入菌株命名为谷氨酸棒状杆菌LHglc594菌株。

然后，使用谷氨酸棒状杆菌R菌株glk1基因染色体导入用质粒pSKM23，通过电脉冲法[Agric.Biol.Chem.，Vol.54，443-447(1990)及Res.Microbiol.，Vol.144，181-185(1993)]转化谷氨酸棒状杆菌LHglc594菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml及芳香族氨基酸的A琼脂培养基[A液体培养基、及1.5％琼脂]上。将上述培养基上得到的单交换菌株涂布在含有10％(W/V)蔗糖及芳香族氨基酸的BT琼脂培养基上。

从培养基上的增殖菌株中选择显示卡那霉素敏感性及含蔗糖培养基增殖性的菌株。将该谷氨酸棒状杆菌R菌株glk1基因无标记染色体导入菌株命名为谷氨酸棒状杆菌LHglc611菌株。

然后，使用谷氨酸棒状杆菌R菌株glk2基因染色体导入用质粒pSKM24，通过电脉冲法[Agric.Biol.Chem.Vol.54、443-447(1990)及Res.Microbiol.Vol.144，181-185(1993)]转化谷氨酸棒状杆菌LHglc611菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml及芳香族氨基酸的A琼脂培养基[A液体培养基、及1.5％琼脂]上。将上述培养基上得到的单交换菌株涂布在含有10％(W/V)蔗糖及芳香族氨基酸的BT琼脂培养基上。

从培养基上的增殖菌株中选择显示卡那霉素敏感性及含蔗糖培养基增殖性的菌株。将该谷氨酸棒状杆菌R菌株glk2基因无标记染色体导入菌株命名为谷氨酸棒状杆菌LHglc618菌株。

然后，使用谷氨酸棒状杆菌R菌株gapA基因染色体导入用质粒pCRD906[ApplEnviron Microbiol.78(12)：4447-4457(2012)]，通过电脉冲法[Agric.Biol.Chem.Vol.54，443-447(1990)及Res.Microbiol.Vol.144，181-185(1993)]转化谷氨酸棒状杆菌LHglc618菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml及芳香族氨基酸的A琼脂培养基[A液体培养基、及1.5％琼脂]上。将上述培养基上得到的单交换菌株涂布在含有10％(W/V)蔗糖及芳香族氨基酸的BT琼脂培养基上。

从培养基上的增殖菌株中选择显示卡那霉素敏感性及含蔗糖培养基增殖性的菌株。将该谷氨酸棒状杆菌R菌株gapA基因无标记染色体导入菌株命名为谷氨酸棒状杆菌LHglc741菌株。

然后，使用谷氨酸棒状杆菌R菌株hdpA基因破坏用质粒pSKM28，通过电脉冲法[Agric.Biol.Chem.Vol.54，443-447(1990)及Res.Microbiol.Vol.144，181-185(1993)]转化谷氨酸棒状杆菌LHglc741菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml及芳香族氨基酸的A琼脂培养基[A液体培养基、及1.5％琼脂]上。将上述培养基上得到的单交换菌株涂布在含有10％(W/V)蔗糖及芳香族氨基酸的BT琼脂培养基上。

从培养基上的增殖菌株中选择显示卡那霉素敏感性及含蔗糖培养基增殖性的菌株。将该谷氨酸棒状杆菌R菌株hdpA基因无标记破坏菌株命名为谷氨酸棒状杆菌LHglc753菌株。

另外，使用谷氨酸棒状杆菌R菌株gapA基因染色体导入用质粒pCRD907[ApplEnviron Microbiol.78(12)：4447-4457(2012)]，通过电脉冲法[Agric.Biol.Chem.Vol.54，443-447(1990)及Res.Microbiol.Vol.144，181-185(1993)]转化谷氨酸棒状杆菌SKM2菌株，涂布含有卡那霉素50μg/ml及芳香族氨基酸的A琼脂培养基[A液体培养基、及1.5％琼脂]上。将上述培养基上得到的单交换菌株涂布在含有10％(W/V)蔗糖及芳香族氨基酸的BT琼脂培养基上。

从培养基上的增殖菌株中选择显示卡那霉素敏感性及含蔗糖培养基增殖性的菌株。将该谷氨酸棒状杆菌R菌株gapA基因无标记染色体导入菌株命名为谷氨酸棒状杆菌LHglc573菌株。

[表2]

通过染色体基因重组构建莽草酸生产菌株

缩略符号一览^＊

tkt-tal：转酮醇酶(tkt)和转醛醇酶(tal)

iolT1：肌醇转运体

glk1：葡萄糖激酶1

glk2：葡萄糖激酶2

ppgK：多聚磷酸盐/ATP依赖性葡萄糖激酶

gapA：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

xylAB：木糖异构酶和木酮糖激酶(大肠杆菌)

bglF(V317A)A：突变型β-葡糖苷酶(bglF(V317A))和6-磷酸-β-葡糖苷酶(bglA)

araBAD：阿拉伯糖异构酶、核酮糖激酶和核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶)(大肠杆菌)

araE：阿拉伯糖转运体(谷氨酸棒状杆菌31831)

ldhA：乳酸脱氢酶A

aroK：莽草酸激酶

qsuB：3-脱氢莽草酸脱水酶

qsuD：奎宁酸/莽草酸脱氢酶

ptsH：组氨酸-可磷酸化蛋白

hdpA：HAD(haloacid dehalogenase，卤酸脱卤酶)超家族磷酸酶

aroG(S180F)：抗反馈突变型DAHP(3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸)合成酶(S180F)(大肠杆菌)

aroG(P150L)：抗反馈突变型DAHP合成酶(P150L)(大肠杆菌)

aroB：3-脱氢奎宁酸合成酶

aroD：3-脱氢奎宁酸脱水酶

aroE：莽草酸脱氢酶

^＊无来源菌株名的为来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的基因

(9)莽草酸生产基因表达质粒导入菌株的构建

使用上述质粒pCRB237，通过电脉冲法[Agric.Biol.Chem.Vol.54，443-447(1990)及Res.Microbiol.Vol.144，181-185(1993)]转化谷氨酸棒状杆菌SKM2菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的A琼脂培养基上。

通过常规方法对该培养基上的增殖菌株进行液体培养，由培养液提取质粒DNA，将该质粒用限制酶切断，确认插入质粒。其结果是，确认导入了上述制作的质粒pCRB237。

将得到的菌株命名为谷氨酸棒状杆菌SKM3。需要说明的是，将本质粒的基因重组的概要综合示于表3。

使用上述质粒pCRB237及pCRB238，通过电脉冲法[Agric.Biol.Chem.Vol.54，443-447(1990)及Res.Microbiol.Vol.144，181-185(1993)]分别转化谷氨酸棒状杆菌SKM2菌株、LHglc618菌株、LHglc741菌株、LHglc753菌株及SKM1菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml及氯霉素5μg/ml的A琼脂培养基上。

通过常规方法对该培养基上的增殖菌株进行液体培养，由培养液提取质粒DNA，将该质粒用限制酶切断，确认插入质粒。其结果是，确认导入了上述制作的质粒pCRB237及pCRB238。

将在谷氨酸棒状杆菌SKM2菌株、LHglc618菌株、LHglc741菌株、LHglc753菌株、及SKM1菌株中分别导入pCRB237及pCRB238而得到的转化体分别命名为谷氨酸棒状杆菌SKM4菌株、SKM5菌株、SKM6菌株、SKM7菌株、及SKM10菌株。需要说明的是，将本质粒的基因重组的概要综合示于表3。

使用上述质粒pCRB239及pCRB238，通过电脉冲法[Agric.Biol.Chem.Vol.54，443-447(1990)及Res.Microbiol.Vol.144，181-185(1993)]转化谷氨酸棒状杆菌SKM2菌株及LHglc573菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml及氯霉素5μg/ml的A琼脂培养基上。

通过常规方法对该培养基上的增殖菌株进行液体培养，由培养液提取质粒DNA，将该质粒用限制酶切断，确认插入质粒。其结果是，确认导入了上述制作的质粒pCRB239及pCRB238。

将得到的菌株命名为谷氨酸棒状杆菌SKM11菌株及SKM12菌株。

将本质粒的基因重组的概要综合示于表3。

谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)SKM 7保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8(邮编292-0818))(保藏日：2014年7月29日、保藏编号：NITE BP-01903)。

[表3]

莽草酸生产试验使用菌株

*)在全部菌株中，导入了作为混合糖同化基因的来自大肠杆菌K-12菌株的xylA基因(木糖异构酶)、xylB基因(木酮糖激酶)、araA基因(阿拉伯糖异构酶)、araB基因(核酮糖激酶)、araD基因(核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶)、来自谷氨酸棒状杆菌R菌株的bglF(V317A)基因(β-糖苷酶)、bglA基因(6-磷酸-β-糖苷酶)及来自谷氨酸棒状杆菌ATCC 31831菌株的araE基因(阿拉伯糖转运体)。

基因名缩略符号参照表2。

[实施例2]通过谷氨酸棒状杆菌转化体生产莽草酸

使用作为谷氨酸棒状杆菌R菌株的混合糖同化菌株的、以A1X5C1araEΔldhA菌株为基础构建的莽草酸生产菌株SKM6菌株(参照实施例1(表3))，按照以下所述的方法使用发酵罐(エイブル株式会社制、型号：BMJ1L)进行有氧分批反应下的莽草酸生产实验。

将SKM6菌株接种在含有苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸各20μg/ml、对氨基苯甲酸10μg/ml、卡那霉素50μg/ml、及氯霉素5μg/ml的试管内的10ml A液体培养基[在蒸馏水1L中溶解有(NH₂)₂CO 2g、(NH₄)₂SO₄ 7g、KH₂PO₄ 0.5g、K₂HPO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、0.06％(w/v)Fe₂SO₄·7H₂O+0.042％(w/v)MnSO₄·2H₂O 1ml、0.02％(w/v)生物素溶液1ml、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g]中后，在33℃、有氧条件下进行16小时振荡培养。

将在上述条件下增殖的谷氨酸棒状杆菌SKM6菌株接种在含有苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸各20μg/ml、对氨基苯甲酸10μg/ml、卡那霉素50μg/ml及氯霉素5μg/ml的容量500ml烧瓶内的100ml A液体培养基[在蒸馏水1L中溶解有(NH₂)₂CO 2g、(NH₄)₂SO₄ 7g、KH₂PO₄0.5g、K₂HPO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、0.06％(w/v)Fe₂SO₄·7H₂O+0.042％(w/v)MnSO₄·2H₂O 1ml、0.02％(w/v)生物素溶液1ml、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g]中，在33℃、有氧条件下进行16小时振荡培养。

通过离心分离(4℃、3000×g、10分钟)收集在上述条件下增殖的谷氨酸棒状杆菌SKM6菌株的菌体，将得到的菌体悬浮在1000ml容积的发酵罐培养槽内的含有葡萄糖60g/l、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸各100mg/l、对氨基苯甲酸50mg/l、卡那霉素50μg/ml、氯霉素5μg/ml、及消泡剂(Disfoam CB-442)5g/l的600ml A(-尿素、3×硫安、5μg/l生物素、2×酵母提取物、2×维生素分析酪蛋白水解物)液体培养基[在蒸馏水1L中溶解有(NH₄)₂SO₄ 21g、KH₂PO₄ 0.5g、K₂HPO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、0.06％(w/v)Fe₂SO₄.·7H₂O+0.042％(w/v)MnSO₄·2H₂O 1ml、0.02％(w/v)生物素溶液25μl、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物4g、维生素分析酪蛋白水解物14g]中且使OD₆₁₀达到0.5，通过1000ml容量发酵罐(エイブル株式会社制、型号：BMJ1L)在33℃、pH 7.0(通过添加5.0N氨水来控制)、通气量0.6L/min(air、1vvm)、溶解氧浓度(DO)10％(将大气压下饱和溶解氧浓度设为100％)的条件下进行18小时通气搅拌培养。

通过离心分离(4℃、5000×g、10分钟)收集在上述条件下增殖的谷氨酸棒状杆菌SKM6菌株的菌体，将菌体用0.9％氯化钠水溶液洗涤1次后，按照成为100g湿菌体/L(每体积的培养基中以湿菌体重量计为10％)的方式悬浮在含有10％葡萄糖的250ml BT(-尿素、-生物素)液体培养基[在蒸馏水1L中溶解有(NH₄)₂SO₄ 7g、KH₂PO₄ 0.5g、K₂HPO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、0.06％(w/v)Fe₂SO₄·7H₂O+0.042％(w/v)MnSO₄·2H₂O 1ml、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml]中，使用1000ml容量发酵罐(エイブル株式会社制、型号：BMJ1L)在33℃、pH 7.0(通过添加5.0N氨水来控制)、通气量0.25L/min(air、1vvm)、溶解氧浓度(DO)5％(将大气压下饱和溶解氧浓度设为100％)的条件下进行莽草酸生成反应。需要说明的是，反应液中的葡萄糖浓度用葡萄糖传感器(王子计测机器、BF-5i)来监测，在葡萄糖耗尽前进行补加葡萄糖。培养上清液中的芳香族化合物的代谢物质浓度通过高效液相色谱(Prominence HPLC装置(岛津制作所制)，COSMOSIL填充柱5C18-AR-II，使用20％甲醇、0.07％高氯酸的流动相来分离)来分析。将其结果示于表4。SKM6菌株在莽草酸生成反应24小时后生成480mM(83.6g/l)的莽草酸(莽草酸生成速度20.0mM/h＝3.5g/l/h)、90.3mM(15.5g/l)的3-DHS、及6.9mM(1.3g/l)的3-DHQ。另外，作为大肠杆菌(Escherichia coli)的莽草酸生产菌株中主要的副产物列举的奎宁酸(quinate)，其生成极微量(1mM以下)。另外，葡萄糖消耗量为1119mM，就相对于糖的收率(mol/(mol葡萄糖)，％)而言，莽草酸为42.9％，莽草酸、3-DHS、3-DHQ合计为51.6％。另外，通过SKM6菌株进行的莽草酸生成反应中，未确认到菌体的增殖。这些结果表明，SKM6菌株在使用无机盐基本培养基的不伴有菌体增殖的反应工艺中具有非常高的莽草酸生产率及相对于糖的收率。就SKM6菌株的莽草酸生产率而言，使用基本培养基从糖开始的通过发酵法的生产率大幅超过迄今所报道的生产率最高的大肠杆菌(Escherichiacoli)重组菌株的生产率(E.coli SP1.1 pts^-/pSC6.090B，莽草酸生产速度1.8g/l/h，莽草酸收率27％、(专利文献4(US 6472169))。另外，上述大肠杆菌的莽草酸生产菌株存在如下严重问题：在后续莽草酸的纯化工序中由于难以与莽草酸分离而带来阻碍的奎宁酸的副产量多(专利文献3(US 6613552)、专利文献4(US 6472169))、本发明的SKM6菌株具有几乎确认不到奎宁酸的生成的特征，认为具有不妨碍莽草酸的纯化工序的优点。另一方面，通过HPLC分析(Prominence HPLC装置(岛津制作所制)、使用TSK-gel Oapak-A柱(东曹株式会社制)，用水作为流动相进行分离)对于反应上清液进行有机酸的定量分析的结果是，如表4所示，SKM6菌株显著累积通过作为糖酵解中间代谢产物的二羟丙酮磷酸(DHAP)的去磷酸化而生成的二羟基丙酮(DHA)。关于除DHA以外的有机酸，未确认到显著的累积。

[实施例3]

二羟丙酮磷酸(DHAP)磷酸酶基因(hdpA)破坏对莽草酸生产的效果

按照实施例2所述那样，在SKM6菌株的莽草酸生成反应中确认到通过作为糖酵解代谢中间体的二羟丙酮磷酸(DHAP)的去磷酸化而生成的二羟基丙酮(DHA)的显著累积。由此推测，通过阻断DHA生成途径来抑制DHA生成，从而莽草酸生产效率进一步增大。为了考察该效果，构建了除改变SKM6菌株中的基因以外进一步破坏编码DHAP磷酸酶(HAD(haloaciddehalogenase，卤酸脱卤酶)超家族磷酸酶)的hdpA基因的SKM7菌株(参照实施例1(表3))，对该菌株通过与实施例2相同的条件、方法进行莽草酸生产实验。如表4所示，SKM7菌株在反应24小时后生成536mM(93.3g/l)的莽草酸(莽草酸生成速度22.3mM/h＝3.9g/l/h)、97.3mM(16.7g/l)的3-DHS、及6.9mM的3-DHQ(1.3g/l)。另外，葡萄糖消耗量为1136mM，就相对于糖的收率(mol/mol，％)而言，莽草酸为47.2％，莽草酸、3-DHS、3-DHQ合计为56.3％。该结果表明，SKM6菌株中，除了实施基因改变(ptsH基因破坏、非PTS葡萄糖通透酶、葡萄糖激酶、GAPDH的各基因高表达等)以外，通过破坏hdpA基因，DHA生成受到抑制，莽草酸生成量及莽草酸相对于糖的收率增加，同时与SKM6菌株的这些指标相比进一步增大(莽草酸生成量增加12％、莽草酸收率增加9％)。与此相对地，与SMK6菌株同样地，几乎确认不到奎宁酸的生成。另一方面，如表4所示，根据有机酸分析的结果，SKM7菌株中DHA的生成完全被抑制。除DHA以外的有机酸也未确认到显著的累积。另外，利用SKM7菌株进行反应时，未确认到菌体浓度的变化。根据以上结果，SKM7菌株在不伴有菌体增殖的反应工艺中显示出比SKM6菌株更高的莽草酸生产率及相对于糖的收率。

[比较例1]

GAPDH活性强化对莽草酸生产的效果

为了考察甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因(gapA)高表达对实施例2所示的SKM6菌株的莽草酸生产能力的贡献程度，除了不进行来自谷氨酸棒状杆菌的编码GAPDH的gapA基因的染色体导入以外，对于具有与SKM6菌株相同的基因型的SKM5菌株(实施例1、参照表3)在与实施例2中记载的莽草酸生产试验相同的方法、条件下进行莽草酸生产实验。其结果是，如表4所示，在反应24小时后，SKM5菌株生成394mM(68.6g/l)的莽草酸(莽草酸生成速度16.4mM/h＝2.9g/l/h)、64.5mM(11.1g/l)的3-DHS、及5.9mM的3-DHQ(1.1g/l)。另外，消耗881mM的葡萄糖，就相对于糖的收率(mol/mol，％)而言，莽草酸为44.7％，莽草酸、3-DHS、3-DHQ合计为52.7％。该结果表明，实施例2中所述的导入有gapA基因的SKM6菌株的莽草酸生成量(表4)与未导入gapA基因的SKM5菌株的生成量相比增加22％，因此该转化体中的GAPDH基因高表达使莽草酸的生成显著增加。需要说明的是，SKM6菌株与SKM5菌株相比，葡萄糖的消耗量也大幅增加(27％)，另一方面，莽草酸以及莽草酸、3-DHS、3-DHQ合计的相对于糖的收率与SKM5菌株相比降低若干，因此认为，SKM6菌株中的莽草酸生产率增加的主要原因为与葡萄糖消耗的增加相伴随的莽草酸生成速度增加。即表明，GAPDH活性强化通过活化该转化体中的葡萄糖消耗来提高莽草酸生产率。

需要说明的是，测定SKM5菌株及SKM6菌株的反应6小时后的各菌体的粗酶提取液中的GAPDH活性，结果如表4所示，SKM6菌株中的GAPDH活性(5.4U/mg protein)与SKM5菌株的该活性(1.3U/mg protein)相比，上升约4.3倍，确认将gapA导入染色体的SKM6菌株中GAPDH活性得到强化。

[比较例2]

GAPDH活性强化带来的莽草酸生产率提高是非PTS葡萄糖通透酶系强化菌株所特有的效果的验证

如比较例1所述，表明除了ptsH基因破坏、iolT1基因高表达、及葡萄糖激酶基因群(glk1、glk2、ppgK)的高表达(以下将这些基因改变的组合称为非PTS葡萄糖通透酶系的强化)以外进一步组合糖酵解的GAPDH基因(gapA)的导入·高表达时，葡萄糖消耗得到促进，莽草酸生产量大幅增加。为了验证该gapA基因高表达带来的莽草酸生产率提高效果是否是非PTS葡萄糖通透酶系的强化菌株所特有的，对以未破坏ptsH基因、依赖于PTS将葡萄糖摄取细胞内的莽草酸生产菌株为基础的情况下的gapA基因高表达的效果进行确认。

如实施例1(表3)中记载那样，使用ptsH基因未被破坏的莽草酸生产菌株SKM11菌株、以及除了在高表达用启动子的控制下进行gapA基因的染色体导入·高表达以外具有与SKM11菌株相同的基因型的SKM12菌株(两菌株中，aroK、qsuB及qsuD基因被破坏，导入了tkt-tal基因及莽草酸生成途径基因(aroG、aroB、aroD、aroE))，将反应使用的菌体浓度设为50g湿菌体/l(相对于培养基体积，以湿菌体重量计为5％)，除此以外，通过与实施例2相同的条件、方法进行莽草酸生产实验。需要说明的是，这2个菌株中导入与其它莽草酸生产菌株的突变点不同的aroG(P150L)基因作为DAHP合成酶基因，其基因产物显示与aroG(S180F)基因所编码的DAHP合成酶基本相同的酶特性(对芳香族氨基酸的反馈抑制耐性)，另外确认，导入谷氨酸棒状杆菌时，对莽草酸生成赋予同等效果。

其结果如表5所示，在反应24小时后，SKM11菌株生成139mM的莽草酸及24.5mM的3-DHS，与此相对地，SKM12菌株生成115mM的莽草酸及17.2mM的3-DHS。需要说明的是，对各菌株回收反应6小时后的菌体，测定这些粗酶提取液中的GAPDH活性，结果如表5所示，进行了gapA基因的染色体导入的SKM12菌株与未导入的SKM11菌株相比，检测到高约10倍的GAPDH活性，由此确认SKM12菌株中GAPDH活性得到强化。其结果是，以具有PTS的莽草酸生产菌株为基础时，未确认到GAPDH活性强化带来的糖消耗、及对莽草酸生成的提升效果。这表明，GAPDH活性强化带来的莽草酸生产率的上升是依赖非PTS葡萄糖通透酶进行葡萄糖输送的棒状细菌转化体所特有的效果。

[比较例3]

非PTS葡萄糖通透酶系强化和GAPDH活性强化对莽草酸生产的效果

为了考察非PTS葡萄糖通透酶系强化(ptsH基因破坏、iolT1基因高表达、葡萄糖激酶基因(glk1，glk2，ppgK)高表达)及GAPDH活性强化对实施例2所示的SKM6菌株的莽草酸生成能力的贡献程度，不进行非PTS葡萄糖通透酶系的强化和GAPDH活性的强化，除此以外，对于具有与SKM6菌株相同的基因型的SKM4菌株(实施例1、参照表3)通过与实施例2相同的条件、方法进行莽草酸生产实验，与SKM6菌株进行生产率比较。其结果如表4所示，SKM4菌株在反应24小时后生成291mM(50.7g/l)的莽草酸(莽草酸生成速度12.1mM/h＝2.1g/l/h)、48.1mM(8.3g/l)的3-DHS、4.7mM(0.9g/l)的3-DHQ。另外，消耗676mM的葡萄糖，就相对于糖的收率(mol/mol，％)而言，莽草酸为43.0％，莽草酸、3-DHS、3-DHQ合计为50.8％。即表明，SKM6菌株的莽草酸生产量、及葡萄糖消耗量与SKM4菌株的这些指标相比，均增加约65％。该结果表明，通过将非PTS葡萄糖通透酶系的强化和GAPDH活性强化组合，伴随着葡萄糖消耗速度的增大，莽草酸生产率大幅增加。

[比较例4]

非PTS葡萄糖通透酶系强化对莽草酸生产的效果

若对上述比较例3中所述的SKM4菌株以及除了SKM4菌株中的基因改变以外还实施了非PTS葡萄糖通透酶系强化(通过破坏ptsH基因来阻断PTS糖的输送、iolT1基因高表达、及葡萄糖激酶(glk1、glk2、ppgK)基因高表达)的SKM5菌株(比较例1)的莽草酸生产率进行比较(表4)，SKM5菌株的莽草酸生产量与SKM4菌株的生产量相比，伴随着葡萄糖消耗量的增加而增加35％，即使单独强化非PTS葡萄糖通透酶系，也显示出莽草酸生成量显著增加。

[表4]

通过发酵罐反应进行的莽草酸生产实验(反应24小时)

[表5]

具有PTS的莽草酸生产菌株中GAPDH活性强化的效果(反应24小时)

[实施例4]

以混合糖为碳源生成莽草酸

本发明中构建的莽草酸生产菌株由于导入有混合糖同化基因群，从而除了葡萄糖以外，还能够与葡萄糖一起同化木糖、阿拉伯糖、纤维二糖(Sasaki，M.，et al，Engineeringof pentose transport in Corynebacterium glutamicum to improve simultaneousutilization of mixed sugars.Appl.Microbiol.Biotechnol.85：105-115(2009))。因此，使用SKM7菌株，使用由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖构成的混合糖作为碳源，进行莽草酸生产实验。莽草酸生产实验中，除了使用含有初始浓度为葡萄糖60g/l、木糖35g/l、阿拉伯糖5g/l的反应用培养基作为碳源以外，按照与实施例2相同的条件下、方法来进行(碳源浓度下降时，在耗尽前以相同的比率补加上述3种碳源)。

其结果如表6所示，SKM7菌株在反应24小时后生成518mM(90.2g/l)的莽草酸(莽草酸生成速度21.6mM/h＝3.8g/l/h)、122mM(21.0g/l)的3-DHS、及6.7mM(1.3g/l)的3-DHQ。另外，消耗656mM的葡萄糖、497mM的木糖、及75mM的阿拉伯糖，就相对于糖的收率(mol/mol，％)而言，莽草酸为45.8％，莽草酸、3-DHS、3-DHQ合计为57.2％。

从而表明，SKM7菌株在以由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖组成的混合糖为碳源的反应中，也与以葡萄糖为单一碳源时具有几乎同等的莽草酸的生产率、及相对于糖的收率。另外还确认，该转化体可以同时利用这些混合糖。

[表6]

通过发酵罐反应进行的、以混合糖为碳源的莽草酸生产实验(反应24小时)

^a将各生成量相对于以葡萄糖换算(6mol的木糖或阿拉伯糖换算为5mol的葡萄糖)的糖消耗量的比率以％表示

[比较例5]

3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合成酶活性强化对莽草酸生产的效果

为了考察通过谷氨酸棒状杆菌转化体进行的莽草酸生成中的、DAHP合成酶活性强化的效果，进行了SKM2菌株和SKM3菌株(实施例1，参照表2、表3)的莽草酸生产率比较。SKM3菌株是除了SKM2菌株中的基因改变(aroK、qsuB qsuD基因破坏、及tkt，tal基因高表达)以外、还通过质粒导入有来自大肠杆菌的反馈抑制耐性型DAHP合成酶基因(aroG(S180F))的菌株。将SKM2菌株及SKM3菌株接种到含有各20μg/ml的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、及10μg/ml的对氨基苯甲酸的试管内的10ml A液体培养基[在蒸馏水1L溶解有(NH₂)₂CO 2g、(NH₄)₂SO₄ 7g、KH₂PO₄ 0.5g、K₂HPO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、0.06％(w/v)Fe₂SO₄·7H₂O+0.042％(w/v)MnSO₄·2H₂O 1ml、0.02％(w/v)生物素溶液1ml、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g](需要说明的是，SKM3菌株的培养中，添加有卡那霉素50μg/ml(终浓度))中后，在33℃、有氧条件下进行16小时振荡培养。

将在上述条件下增殖的前培养菌体接种到含有各20μg/ml的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、及10μg/ml的对氨基苯甲酸的试管内的10ml A液体培养基(需要说明的是，在SKM3菌株的培养中，添加有卡那霉素50μg/ml(终浓度))中且使OD₆₁₀达到0.5，在33℃下、有氧条件下进行24小时振荡培养。将24小时后的培养液离心分离(4℃，15,000×g，5分钟)，对于得到的上清液，通过高效液相色谱(HPLC)进行包括莽草酸在内的芳香族相关化合物的定量分析。将结果示于表7。在有氧培养24小时后，SKM2菌株生成10.2mM的莽草酸、及2.5mM的3-DHS(莽草酸以及莽草酸和3-DHS的合计值相对于糖的收率分别为8.6％和10.6％)，SKM3菌株生成18.9mM的莽草酸、及6.6mM的3-DHS(莽草酸以及莽草酸和3-DHS的合计值相对于糖的收率分别为16.0％和21.9％)。需要说明的是，两菌株的3-DHQ的生成量均极少(1mM以下)。该结果表明，通过来自大肠杆菌的反馈抑制耐性DAHP合成酶基因(aroG(S180F))的高表达，莽草酸及3-DHS的生成量大幅增加。

[比较例6]

莽草酸生成途径活性强化对莽草酸生产的效果

为了考察利用谷氨酸棒状杆菌转化体进行的莽草酸生产中，依次催化由DAHP向莽草酸的转变的编码3-脱氢奎宁酸(3-DHQ)合成酶、3-DHQ脱水酶及莽草酸脱氢酶的莽草酸生成途径基因群(分别记作aroB、aroD及aroE)的活性强化效果，对于通过质粒导入该基因群从而使该基因群高表达的SKM4菌株(参照实施例1(表3))，按照与上述比较例5相同的条件、方法进行莽草酸生产实验。(需要说明的是，在SKM4菌株的培养中，培养基中添加有卡那霉素50μg/ml(终浓度)及氯霉素5μg/ml(终浓度)。)

其结果如表7所示，SKM4菌株生成了28.8mM的莽草酸和4.9mM的3-DHS(莽草酸以及莽草酸和3-DHS的合计值相对于糖的收率分别为28.7％和33.0％)。将该结果与比较例5中所述的未进行aroB、aroD、aroE基因导入的SKM3菌株比较，表明SKM4菌株的莽草酸生成量大幅(52％)增加。另一方面，SKM4菌株的3-DHS生成量与SKM3菌株的该量相比减少26％。这些结果表明，通过莽草酸生成途径基因(aroB，aroD，aroE)的高表达，由3-DHS向莽草酸的转变得到促进，并且莽草酸生产率大幅上升。

[比较例7]

转酮醇酶以及转醛醇酶活性强化对莽草酸生产的效果

为了考察通过谷氨酸棒状杆菌转化体进行的莽草酸生产中、与作为莽草酸的前体物质的赤藓糖-4-磷酸(E4P)的供给有关的转酮醇酶基因(tkt)、及转醛醇酶基因(tal)的活性强化的效果，对于SKM1菌株和SKM2菌株、以及SKM10菌株和SKM4菌株(参照实施例1(表2、表3))的各组合，进行莽草酸生产率的比较。

对于SKM1菌株、及SKM10菌株，按照与比较例5相同的条件、方法进行莽草酸生产实验，结果如表7所示，在培养24小时后，未导入tkt-tal基因的SKM1菌株生成了10.0mM的莽草酸和1.6mM的3-DHS。该结果表明，SKM1菌株和比较例5中所述的导入有tkt-tal基因的SKM2菌株的莽草酸生成量(表7)几乎相同。这表明，在这2个菌株共同的基因型中，并未确认到通过tkt-tal基因导入而使莽草酸生成量显著增加。

另一方面，导入莽草酸生成途径基因并使其高表达、但未导入tkt-tal基因的SKM10菌株在培养24小时后生成了20.2mM的莽草酸和2.0mM的3-DHS，莽草酸相对于糖的收率为21.7％。将该结果与比较例6中所述的导入有莽草酸生成途径基因和tkt-tal基因并使其高表达的SKM4菌株的生产率(表7)进行比较，后者的莽草酸生产量、收率均大幅(分别为43％和32％)增加。这表明，通过使该莽草酸生成途径基因(aroG、aroB、aroD、aroE)高表达而强化了向莽草酸生成途径的碳流的转化体中，确认到tkt-tal基因高表达带来的显著的莽草酸生产率增加效果。

[比较例8]

莽草酸激酶基因、3-脱氢莽草酸(3-DHS)脱水酶基因及奎宁酸/莽草酸脱氢酶基因的破坏对莽草酸生产的效果

为了考察在谷氨酸棒状杆菌转化体中、通过破坏分别编码莽草酸激酶、3-DHS脱水酶及奎宁酸/莽草酸脱氢酶的染色体基因来阻遏这些酶参与的莽草酸(和3-DHS)消耗相关代谢时对莽草酸生产的效果，对于A1X5C1araEΔldhA菌株(莽草酸生产菌株的原菌株、混合糖同化菌株)、SKM1菌株、SKM8菌株和SKM9菌株(实施例1、表3参照)，进行莽草酸生产率比较。

对于A1X5C1-araEΔldhA菌株、SKM8菌株和SKM9菌株，除了培养基中未添加抗生物质以外，按照与比较例5相同的条件、方法通过试管培养进行莽草酸生产实验。其结果如表7所示，A1X5C1-araEΔldhA菌株、SKM8菌株和SKM9菌株任一者均几乎未生成莽草酸和3-DHS(分别生成0.3mM和0.1mM)，与此相对地，SKM1菌株生成了10.0mM的莽草酸和1.6mM的3-DHS。该结果表明，莽草酸生产菌株的原菌株、qsuB基因破坏菌株和qsuB/qsuD双基因破坏菌株几乎不累积莽草酸，与此相对地，通过破坏编码存在于莽草酸的主代谢途径上的莽草酸激酶的基因(aroK)，莽草酸生成量显著增加。

[表7]

通过试管培养进行的莽草酸生产实验(反应24小时)

产业上的可利用性

根据本发明方法，可以使用微生物以实用的效率由葡萄糖等制造莽草酸等有机化合物。

序列表

<110> 公益财团法人地球环境产业技术研究机构（Research Institute of InnovativeTechnology for the Earth）

<120> 棒状细菌转化体及使用该转化体的有机化合物的制造方法（Coryneformtransformant and method of producing organic compounds using thereof）

<130> C01F5333

<150> JP2014-168646

<151> 2014-08-21

<160> 95

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1053

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 1

atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60

gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120

aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca 180

tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt 240

gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300

acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac 360

gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420

gcaggtgagt ttctcgatat gatcacccca caatatctcg ctgacctgat gagctggggc 480

gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag gtgcaccgcg aactggcatc agggcttttt 540

tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt 600

aatgccgccg gtgcgccgca ctgcttcctg tccgtaacga aatgggggca ttcggcgatt 660

gtgaatacca gcggtaacgg cgattgccat atcattctgc gcggcggtaa agagcctaac 720

tacagcgcga agcacgttgc tgaagtgaaa gaagggctga acaaagcagg cctgccagca 780

caggtgatga tcgatttcag ccatgctaac tcgtccaaac aattcaaaaa gcagatggat 840

gtttgtgctg acgtttgcca gcagattgcc ggtggcgaaa aggccattat tggcgtgatg 900

gtggaaagcc atctggtgga aggcaatcag agcctcgaga gcggggagcc gctggcctac 960

ggtaagagca tcaccgatgc ctgcatcggc tgggaagata ccgatgctct gttacgtcaa 1020

ctggcgaatg cagtaaaagc gcgtcgcggg taa 1053

<210> 2

<211> 1476

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 2

atggctagta ccttcattca ggccgacagc cctgaaaaaa gtaagaagct acccccactc 60

acagaaggtc cgtatagaaa gcggctgttc tacgttgcac tagttgcgac gtttggtggg 120

ctgctcttcg gatatgacac cggagtaatc aacggtgcac tcaacccaat gacacgtgag 180

ctcggactaa ccgcgttcac cgagggtgtt gtaacttctt ccctgctgtt tggtgcagca 240

gctggtgcga tgtttttcgg tcgcatttcc gacaactggg gtcgccggaa aacaatcatc 300

tcacttgcag tagctttctt tgtcggcacc atgatctgcg tgtttgctcc atcttttgca 360

gtaatggttg tcggacgtgt gcttcttgga ctcgcagttg gtggcgcttc cactgttgtc 420

cctgtctacc tggctgaact tgctcctttt gaaatccgtg gctcactggc tggccgtaat 480

gagttgatga ttgttgttgg tcagctcgca gctttcgtca tcaatgcgat tattggaaat 540

gtttttggac accacgatgg tgtgtggcgc tacatgctgg caattgccgc aatcccagca 600

attgccctct tctttggaat gctccgagtt ccagaatccc cacgctggct tgttgagcga 660

ggacgcattg atgaggctcg cgcagttctt gaaaccattc gccctctaga acgtgcccat 720

gcagaagttg ctgatgttga gcacctagca aaagaagagc acgccatttc cgagaagtcc 780

atgggcttaa gggaaatttt gtccagcaag tggcttgtgc gcatcctcct ggtaggtatc 840

ggattgggtg tcgcacagca gctgactggc atcaactcca tcatgtacta cggccaggtt 900

gttctcattg aggctggttt ctccgaaaat gcagctctga tcgccaacgt ggcgccagga 960

gtgatcgcag ttgtcggtgc atttatcgca ctgtggatga tggatcgcat caaccgccgt 1020

accaccctca ttaccggcta ctctctcact accattagcc acgtgttgat cggcatcgca 1080

tccgtagcat tctcagtcgg cgatccactt cgcccatacg ttattttgac cctagttgtg 1140

atcttcgtag gatccatgca gaccttcctc aacgtagcca cctgggtcat gctctccgag 1200

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gcaaacgcgt tcctcggatt gttcttcccc accatcatgg aagcagtagg actaaccgga 1320

accttcttca tgttcgccgg aatcggtgtg gttgccttga tcttcatcta cacccaggtt 1380

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ttcaacaagg acatccgaaa aggaaaggtg cactaa 1476

<210> 3

<211> 972

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 3

atgccacaaa aaccggccag tttcgcggtg ggctttgaca tcggcggcac caacatgcga 60

gctgggcttg tcgacgaatc cgggcgcatc gtgaccagtt tgtcggcgcc gtcgccgcgc 120

acgacgcagg caatggaaca ggggattttt gatctagtcg aacagctcaa ggccgaatac 180

ccggttggtg ctgtgggact tgccgtcgcg ggatttttgg atcctgagtg cgaggttgtt 240

cgatttgccc cgcaccttcc ttggcgcgat gagccagtgc gtgaaaagtt ggaaaacctt 300

ttgggcctgc ctgttcgttt ggaacatgat gccaactcag cagcgtgggg tgagcatcgt 360

tttggtgcag ctcaaggcgc tgacaactgg gttttgttgg cactcggcac tggaattggt 420

gcagcgctga ttgaaaaagg cgaaatttac cgtggtgcat atggcacggc accagaattt 480

ggtcatttgc gtgttgttcg tggcggacgc gcatgtgcgt gtggcaaaga aggctgcctg 540

gagcgttact gttccggtac tgccttggtt tacactgcgc gtgaattggc ttcgcatggc 600

tcattccgca acagcgggct gtttgacaag atcaaagccg atccgaattc catcaatgga 660

aaaacgatca ctgcggcagc gcgccaagaa gacccacttg ctctcgccgt tctggaagat 720

ttcagcgagt ggctgggcga aactttggcg atcattgctg atgtccttga cccaggtatg 780

atcatcattg gtggcggact gtccaatgct gccgaccttt atttggatcg ctcggttaac 840

cactattcca cccgcatcgt cggcgcagga tatcgccctt tggcacgcgt tgccacagct 900

cagttgggtg cggatgctgg catgatcggt gtcgctgatc tggctcgacg ttccgtgttg 960

gaagccaact ag 972

<210> 4

<211> 912

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 4

atgactgatc ccacttgcac ccttgccctt gatattggtg ccacaaagat tgcctacgca 60

ctagtccccg ataacgcccc gacgacaaca ttgtccacgg gacgcttggg aacaaaagaa 120

ggcgacagcc ctatcgagca gatccggctg gttcttctgg caggcttaaa agctgccgag 180

gaacacggtc tcagtgtcgc ccgcatcggc atgggcgctc ctggtgtaat tctgggacca 240

gagggaacca tcgtgtacaa cggtgaaacc ctcacagagt gggcaggcac tgacctgcga 300

ggattatccc gagaagtcct caacgttcca ttcgcggcac acaatgatgt ccgcgtatgg 360

gcctacggtg agcaccactt aggcaccggc aaagacctca ccggcagggt tctctacgtg 420

tccctcggca ctggagtcgg cggagcaatc atcgaagacg gaatcatgat gagtagcccc 480

actggaactg cgggagaatt cgcagaagtt gtgtgctctg accatgcagg attagccgtt 540

cggtgcgaaa atgtagcaag tggcaccggc ctaaccaggt actacaacga ggccgccgca 600

actcaacttg accttcccgc catcatggag cgcttccacc aaggtgacgg cctggcacag 660

caaatcatta ctggaaatct ccgaggcttt ggccaagcgc taggcgcatt agtcacagtg 720

ctggaccttt ccgcagtagt agttggaggc ggagtcgcag gcatcggcgc acccgtcatg 780

gatcccatca ccgcagggat tttcgatcga atgttagccc ccaacaaatc cgtacaagtt 840

ttaagcacgt cccttggtgc ccaagcagcc gtcatcgcag cagcaaaata tgcccgcgat 900

aacgcctttt aa 912

<210> 5

<211> 1233

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 5

gtggcgcgcg gcggtgtaca gcaccccggt gaccacattg atcacagcac ctgctacgac 60

ctcgccgtcg atcgccgcag cgatcgagac ggcgtattgg ggcaggccat aaaggaagtt 120

gacggtgccg tcaatggggt cgacgatcca ggtaactccg cttatcgacg ccgtccccgt 180

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atcttcagcc aaagtatcta ctatcgtcac cggatcgact gtcgaacttt tggtgttggt 300

gtagtcccac aaattggtga gttcagcacg tttatccctg atacgtgtag cggtaagcgt 360

ggcagtttcc gcggcgatgg cacgcaactc attaaacgat tgttgttcca taagaccatc 420

atcgttgttt ttttagaaaa ttgcctgcca aaagccgaag taatttgtac acttgggcgc 480

atgactgaga ctggatttgg aattgatatc ggtggctccg gcatcaaagg cgcccgcgtt 540

aaccttaaga ccggtgagtt tattgatgaa cgcataaaaa tcgccacccc taagccagca 600

accccagagg ctgtcgccga agtagtcgca gagattattt ctcaagccga atgggagggt 660

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cgagagatca ccgttctcaa tgacgcagac gccgccggca tcgccgaagc aacctttggc 840

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tccgtcttca tcatcggtgg cggaatttcc agaaagcacg aaaagtggct tccattgctg 1140

gagctagaca ctgacattgt cccagctgag ctgcgcaatc gagccggaat cgtaggagct 1200

gccatggcag taaaccaaca cctcacccca taa 1233

<210> 6

<211> 1005

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 6

atgaccattc gtgttggtat taacggattt ggccgtatcg gacgtaactt cttccgcgca 60

gttctggagc gcagcgacga tctcgaggta gttgcagtca acgacctcac cgacaacaag 120

accctttcca cccttctcaa gttcgactcc atcatgggcc gccttggcca ggaagttgaa 180

tacgacgatg actccatcac cgttggtggc aagcgcatcg ctgtttacgc agagcgcgat 240

ccaaagaacc tggactgggc tgcacacaac gttgacatcg tgatcgagtc caccggcttc 300

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ctggtttcca ccgacatcgt ccacgattcc cacggctcca tcttcgacgc tggcctgacc 900

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tgccagctcc tgcgtctgac cgagctcgta gcttccaagc tctaa 1005

<210> 7

<211> 1098

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 7

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cacattggtt ccggcctcaa cgagctcatt gttcagcgcg cagcggaatc aggcgcggag 120

caggtagcga ttttgcacca gcccagcatg gatgacattg catccgagtt ggatgcagca 180

ctagtcgctg ctggtttgaa ggtcctgcac cttaatgttc ccgatgcgga aaacggcaag 240

tccttggaag tagcggggca gtgctgggat gaattgggtg gcgcagcatt cggccgccgc 300

gatatcgtca tcggacttgg tggcggtgct gccacagatc tcgcgggatt cgtcgctgct 360

gcgtggatgc gtggcgtgcg cgtcattcag gttccaacca ccttgttggc catggtggac 420

gctgcggtgg gcggcaagac tggcatcaat accgccgcag gcaagaacct tgtgggcgcg 480

ttccacgagc ctgacgcagt attcattgac accgaacgcc tagccaccct gcctgacgcg 540

gaaatcatcg cgggatccgc cgaaatcatc aaaactggtt tcatcgccga cccagaaatc 600

ctgcgccttt acgaaactga tcccgcagcc tgcctgaaga aagaagtcga aggctcccac 660

ctacctgaac tgatttggcg ctccgtcacc gtcaagggct ccgtggtcgg ccaagacctc 720

aaagaatcta gcctgcgcga aatcctcaac tacggacaca cctttgccca cgccgtcgaa 780

ctccgcgaaa acttccgctg gcgccacggc aatgccgttg cagtgggcat gatgttcatc 840

gctaacctct cccacaagct cgggcttatc gacgcgcccc tcctcgagcg ccaccgctca 900

atcctggcgg ccatcggtct gcccacttcc tacgaaggcg gagccttcga cgagctttac 960

gacggcatga cccgcgacaa gaaaaaccgc gacggcaaca tccgcttcgt cgcactgacc 1020

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gaggcaatca gccactaa 1098

<210> 8

<211> 438

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 8

atgcttggaa aaattctcct cctcaacggc ccaaacctga acatgctggg caaacgcgag 60

cctgacattt acggacacga caccttggaa gacgtcgtcg cgctggcaac cgctgaggct 120

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cacacttcgg tggcgctttt ggatgcggtg aaggcgtctg agcttcctac cgttgaggtg 300

cacatttcca atccgcatgc ccgtgaagag ttccgccacc attcttacat ttccctcgcc 360

gcggtctccg ttatcgctgg cgctggcatc cagggttacc gtttcgcggt cgatatcctg 420

gcaaatctca aaaagtag 438

<210> 9

<211> 831

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 9

ttgggttctc acatcactca ccgggcggcc gtactcggct cacccatcga gcattccaaa 60

tccccagtcc tccacaacac cggctataaa gccctcggac tggaccaatg ggaatacgac 120

cgctttgagt gcaccggcga catgctcccc ggaatcgtct ccggcgctga tgaaacctac 180

cgcggattct ccgtcactat gccgtccaaa ttcgcagccc tcgaattcgc cgacgaagta 240

accgaacgcg cccgcgccat cggctccgca aacacacttc tgcgcaccga aaccggatgg 300

cgcgcagaca acaccgacgt cgacggcatc aggggagccc tcggtgaact cctcggcagc 360

gcatcactgg ccggcaaaca cgccatcgtc atcggctccg gcggcaccgc acgccccgcc 420

atctgggcac tcatcgaagc cggggtcgcg cggatcacgg tgctcaaccg ctccgatcga 480

accgccgaac tgcaaacgct tttcgacgaa acccccacca ccttggccta cgccccgctc 540

gaacatctcg acatcgaagc cgacgtcgta gtctctacag tgccctccgc agcaatcgca 600

ggcctcgaag acacactcgc aatcgcccca gtcctcgacg tcatctacga tccttggcca 660

acaccactcg tagaagtcgc acgagccaaa ggtctcaaag ctgtcggagg ccacgtcatg 720

ctggcacacc agtcctacgg acagtttgaa caattcaccg gaatggatgc accccgcgat 780

gctatgcgtg aggctttgga agaatcccta ggcatctcgg aagaacacta g 831

<210> 10

<211> 2094

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 10

ttgacgctgt cacctgaact tcaggcgctc actgtacgca attacccctc tgattggtcc 60

gatgtggaca ccaaggctgt agacactgtt cgtgtcctcg ctgcagacgc tgtagaaaac 120

tgtggctccg gccacccagg caccgcaatg agcctggctc cccttgcata caccttgtac 180

cagcgggtta tgaacgtaga tccacaggac accaactggg caggccgtga ccgcttcgtt 240

ctttcttgtg gccactcctc tttgacccag tacatccagc tttacttggg tggattcggc 300

cttgagatgg atgacctgaa ggctctgcgc acctgggatt ccttgacccc aggacaccct 360

gagtaccgcc acaccaaggg cgttgagatc accactggcc ctcttggcca gggtcttgca 420

tctgcagttg gtatggccat ggctgctcgt cgtgagcgtg gcctattcga cccaaccgct 480

gctgagggcg aatccccatt cgaccaccac atctacgtca ttgcttctga tggtgacctg 540

caggaaggtg tcacctctga ggcatcctcc atcgctggca cccagcagct gggcaacatc 600

atcgtgttct gggatgacaa ccgcatctcc atcgaagaca acactgagat cgctttcaac 660

gaggacgttg ttgctcgtta caaggcttac ggctggcaga ccattgaggt tgaggctggc 720

gaggacgttg cagcaatcga agctgcagtg gctgaggcta agaaggacac caagcgacct 780

accttcatcc gcgttcgcac catcatcggc ttcccagctc caaccatgat gaacaccggt 840

gctgtgcacg gtgctgctct tggcgcagct gaggttgcag caaccaagac tgagcttgga 900

ttcgatcctg aggctcactt cgcgatcgac gacgaggtca tcgctcacac ccgctccctc 960

gcagagcgcg ctgcagagaa gaaggctgca tggcaggtca agttcgatga gtgggcagct 1020

gccaaccctg agaacaaggc tctgttcgat cgcctgaact cccgtgagct tccagcgggc 1080

tacgctgacg agctcccaac atgggatgca gatgagaagg gcgtcgcaac tcgtaaggcg 1140

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gacctcgcag gttccaacaa caccgtgatc aagggctccc cttccttcgg ccctgagtcc 1260

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gagcacgcta tgggatccat cctcaacggc atttccctcc acggtggcac ccgcccatac 1380

ggcggaacct tcctcatctt ctccgactac atgcgtcctg cagttcgtct tgcagctctc 1440

atggagaccg acgcttacta cgtctggacc cacgactcca tcggtctggg cgaagatggc 1500

ccaacccacc agcctgttga aaccttggct gcactgcgcg ccatcccagg tctgtccgtc 1560

ctgcgtcctg cagatgcgaa tgagaccgcc caggcttggg ctgcagcact tgagtacaat 1620

gaaggcccta agggtcttgc actgacccgc cagaacgttc ctgttctgga aggcaccaag 1680

gagaaggctg ctgaaggcgt tcgccgcggt ggctacgtcc tggttgaggg ttccaaggaa 1740

accccagatg tgatcctcat gggctccggc tccgaggttc agcttgcagt taacgctgcg 1800

aaggctctgg aagctgaggg cgttgcagct cgcgttgttt ccgttccttg catggattgg 1860

ttccaggagc aggacgcaga gtacatcgag tccgttctgc ctgcagctgt gaccgctcgt 1920

gtgtctgttg aagctggcat cgcaatgcct tggtaccgct tcttgggcac ccagggccgt 1980

gctgtctccc ttgagcactt cggtgcttct gcggattacc agaccctgtt tgagaagttc 2040

ggcatcacca ccgatgcagt cgtggcagcg gccaaggact ccattaacgg ttaa 2094

<210> 11

<211> 1083

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 11

atgtctcaca ttgatgatct ggcacagctc ggcacttcca cttggctcga cgacctctcc 60

cgcgagcgca ttacttccgg caatctcagc caggttattg aggaaaagtc tgtagtcggt 120

gtcaccacca acccagctat tttcgcagca gcaatgtcca agggcgattc ctacgacgct 180

cagatcgcag agctcaaggc cgctggcgca tctgttgacc aggctgttta cgccatgagc 240

atcgacgacg ttcgcaatgc ttgtgatctg tttaccggca tcttcgagtc ctccaacggc 300

tacgacggcc gcgtgtccat cgaggttgac ccacgtatct ctgcggaccg cgacgcaacc 360

ctggctcagg ccaaggagct gtgggcaaag gttgatcgtc caaacgtcat gatcaagatc 420

cctgctaccc caggttcttt gccagcaatc accgacgctt tggctgaggg catcagtgtt 480

aacgtcacct tgatcttctc cgttgctcgc taccgcgaag tcatcgctgc gttcatcgag 540

ggcatcaagc aggcagctgc aaacggccac gacgtatcca agatccactc tgtggcttcc 600

ttcttcgtct cccgcgtcga cgttgagatc gacaagcgcc tcgaggcaat cggatccgat 660

gaggctttgg ctctgcgtgg caaggcaggc gttgccaacg ctcagcgcgc ttacgctgtg 720

tacaaggagc ttttcgacgc cgccgagctg cctgaaggcg ccaacactca gcgcccactg 780

tgggcatcca ccggcgtgaa gaaccctgcg tacgctgcaa ctctttacgt ttccgagctg 840

gctggtccaa acaccgtcaa caccatgcca gaaggcacca tcgacgctgt tctggaactg 900

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cagcttgagg ctctgggcgt tgacttggca gatgtcttcc aggtcctgga gaccgagggc 1020

gtggacaagt tcgttgcttc ttggagcgaa ctgcttgagt ccatggaagc tcgcctgaag 1080

tag 1083

<210> 12

<211> 486

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 12

tcgctcgtct cataaaaacg accgagccta ttgggattac cattgaagcc agtgtgagtt 60

gcatcacact ggcttcaaat ctgagacttt actttgtgga ttcacggggg tgtagtgcaa 120

ttcataatta gccccattcg ggggagcaga tcgcggcgcg aacgatttca ggttcgttcc 180

ctgcaaaaac tatttagcgc aagtgttgga aatgcccccg tctggggtca atgtctattt 240

ttgaatgtgt ttgtatgatt ttgaatccgc tgcaaaatct ttgtttcccc gctaaagttg 300

gggacaggtt gacacggagt tgactcgacg aattatccaa tgtgagtagg tttggtgcgt 360

gagttggaaa atttcgccat actcgccctt gggttctgtc agctcaagaa ttcttgagtg 420

accgatgctc tgattgacct aactgcttga cacattgcat ttcctacaat ctttagagga 480

gacaca 486

<210> 13

<211> 4586

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> plasmid pKK223-3

<400> 13

ttctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacattata cgagccgatg 60

attaattgtc aacagctcat ttcagaatat ttgccagaac cgttatgatg tcggcgcaaa 120

aaacattatc cagaacggga gtgcgccttg agcgacacga attatgcagt gatttacgac 180

ctgcacagcc ataccacagc ttccgatggc tgcctgacgc cagaagcatt ggtgcaccgt 240

gcagtcgata agctccggat cctctacgcc ggacgcatcg tggccggcat caccggcgcc 300

acaggtgcgg ttgctggcgc ctatatcgcc gacatcaccg atggggaaga tcgggctcgc 360

cacttcgggc tcatgagcgc ttgtttcggc gtgggtatgg tggcaggccc cgtggccggg 420

ggactgttgg gcgccatctc cttgcatgca ccattccttg cggcggcggt gctcaacggc 480

ctcaacctac tactgggctg cttcctaatg caggagtcgc ataagggaga gcgtcgaccg 540

atgcccttga gagccttcaa cccagtcagc tccttccggt gggcgcgggg catgactatc 600

gtcgccgcac ttatgactgt cttctttatc atgcaactcg taggacaggt gccggcagcg 660

ctctgggtca ttttcggcga ggaccgcttt cgctggagcg cgacgatgat cggcctgtcg 720

cttgcggtat tcggaatctt gcacgccctc gctcaagcct tcgtcactgg tcccgccacc 780

aaacgtttcg gcgagaagca ggccattatc gccggcatgg cggccgacgc gctgggctac 840

gtcttgctgg cgttcgcgac gcgaggctgg atggccttcc ccattatgat tcttctcgct 900

tccggcggca tcgggatgcc cgcgttgcag gccatgctgt ccaggcaggt agatgacgac 960

catcagggac agcttcaagg atcgctcgcg gctcttacca gcctaacttc gatcactgga 1020

ccgctgatcg tcacggcgat ttatgccgcc tcggcgagca catggaacgg gttggcatgg 1080

attgtaggcg ccgccctata ccttgtctgc ctccccgcgt tgcgtcgcgg tgcatggagc 1140

cgggccacct cgacctgaat ggaagccggc ggcacctcgc taacggattc accactccaa 1200

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acatatccat cgcgtccgcc atctccagca gccgcacgcg gcgcatctcg ggcagcgttg 1320

ggtcctggcc acgggtgcgc atgatcgtgc tcctgtcgtt gaggacccgg ctaggctggc 1380

ggggttgcct tactggttag cagaatgaat caccgatacg cgagcgaacg tgaagcgact 1440

gctgctgcaa aacgtctgcg acctgagcaa caacatgaat ggtcttcggt ttccgtgttt 1500

cgtaaagtct ggaaacgcgg aagtcagcgc cctgcaccat tatgttccgg atctgcatcg 1560

caggatgctg ctggctaccc tgtggaacac ctacatctgt attaacgaag cgctggcatt 1620

gaccctgagt gatttttctc tggtcccgcc gcatccatac cgccagttgt ttaccctcac 1680

aacgttccag taaccgggca tgttcatcat cagtaacccg tatcgtgagc atcctctctc 1740

gtttcatcgg tatcattacc cccatgaaca gaaattcccc cttacacgga ggcatcaagt 1800

gaccaaacag gaaaaaaccg cccttaacat ggcccgcttt atcagaagcc agacattaac 1860

gcttctggag aaactcaacg agctggacgc ggatgaacag gcagacatct gtgaatcgct 1920

tcacgaccac gctgatgagc tttaccgcag ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga 1980

aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg 2040

gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat 2100

gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta tactggctta actatgcggc atcagagcag 2160

attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 2220

taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 2280

ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 2340

gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 2400

gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 2460

cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 2520

ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 2580

tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg 2640

gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 2700

tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 2760

ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 2820

ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct 2880

ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 2940

accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 3000

tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 3060

cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat 3120

taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac 3180

caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt 3240

gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt 3300

gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag 3360

ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct 3420

attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt 3480

gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc 3540

tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt 3600

agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg 3660

gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg 3720

actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct 3780

tgcccggcgt caacacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc 3840

attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt 3900

tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt 3960

tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg 4020

aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat 4080

tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaaa gagtttgtag 4140

aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta atttgatgcc tggcagttta 4200

tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc gcaacgttca aatccgctcc 4260

cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa caacagataa aacgaaaggc 4320

ccagtctttc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg gcagttccct actctcgcat 4380

ggggagaccc cacactacca tcggcgctac ggcgtttcac ttctgagttc ggcatggggt 4440

caggtgggac caccgcgcta ctgccgccag gcaaattctg ttttatcaga ccgcttctgc 4500

gttctgattt aatctgtatc aggctgaaaa tcttctctca tccgccaaaa cagaagcttg 4560

gctgcaggtc gacggatccc cgggaa 4586

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 14

ctctctgcag tcgctcgtct cataaaaacg ac 32

<210> 15

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial sequuence

<220>

<223> PCR primer

<400> 15

ctctaagctt gtcgacggat ccgcatgctg tgtctcctct aaagattgta gg 52

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 16

ctctgcatgc ctgttttggc ggatgagaga 30

<210> 17

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 17

ctctaagctt gtcgacggat ccaagagttt gtagaaacgc aaaaagg 47

<210> 18

<211> 1118

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 18

atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60

gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120

aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca 180

tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt 240

gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300

acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac 360

gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420

gcaggtgagt ttctcgatat gatcacccca caatatctcg ctgacctgat gagctggggc 480

gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag gtgcaccgcg aactggcatc agggctttct 540

tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt 600

aatgccgccg gtgcgccgca ctgcttcctg tccgtaacga aatgggggca ttcggcgatt 660

gtgaatacca gcggtaacgg cgattgccat atcattctgc gcggcggtaa agagcctaac 720

tacagcgcga agcacgttgc tgaagtgaaa gaagggctga acaaagcagg cctgccagca 780

caggtgatga tcgatttcag ccatgctaac tcgtccaaac aattcaaaaa gcagatggat 840

gtttgtgctg acgtttgcca gcagattgcc ggtggcgaaa aggccattat tggcgtgatg 900

gtggaaagcc atctggtgga aggcaatcag agcctcgaga gcggggagcc gctggcctac 960

ggtaagagca tcaccgatgc ctgcatcggc tgggaagata ccgatgctct gttacgtcaa 1020

ctggcgaatg cagtaaaagc gcgtcgcggg taaggtttaa ttgtcggatg cgccgtcaga 1080

gtggcgtatc cgatgaatca ccacaggcct gataagtc 1118

<210> 19

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 19

ctctgatatc atgaattatc agaacgacga tttacgc 37

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 20

ctctgatatc gacttatcag gcctgtggtg 30

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 21

tttgtccggt cggcttcaaa aatg 24

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 22

aaagccctga tgccagttc 19

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 23

tacaatatct cgctgacctg atg 23

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 24

gggtgatcat atcgagaaac tc 22

<210> 25

<211> 1140

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 25

atgagcgcag cgcagatttt caacaccgtc cacgtcaatg gatcttcccc ctatgatgtc 60

cacattggtt ccggcctcaa cgagctcatt gttcagcgcg cagcggaatc aggcgcggag 120

caggtagcga ttttgcacca gcccagcatg gatgacattg catccgagtt ggatgcagca 180

ctagtcgctg ctggtttgaa ggtcctgcac cttaatgttc ccgatgcgga aaacggcaag 240

tccttggaag tagcggggca gtgctgggat gaattgggtg gcgcagcatt cggccgccgc 300

gatatcgtca tcggacttgg tggcggtgct gccacagatc tcgcgggatt cgtcgctgct 360

gcgtggatgc gtggcgtgcg cgtcattcag gttccaacca ccttgttggc catggtggac 420

gctgcggtgg gcggcaagac tggcatcaat accgccgcag gcaagaacct tgtgggcgcg 480

ttccacgagc ctgacgcagt attcattgac accgaacgcc tagccaccct gcctgacgcg 540

gaaatcatcg cgggatccgc cgaaatcatc aaaactggtt tcatcgccga cccagaaatc 600

ctgcgccttt acgaaactga tcccgcagcc tgcctgaaga aagaagtcga aggctcccac 660

ctacctgaac tgatttggcg ctccgtcacc gtcaagggct ccgtggtcgg ccaagacctc 720

aaagaatcta gcctgcgcga aatcctcaac tacggacaca cctttgccca cgccgtcgaa 780

ctccgcgaaa acttccgctg gcgccacggc aatgccgttg cagtgggcat gatgttcatc 840

gctaacctct cccacaagct cgggcttatc gacgcgcccc tcctcgagcg ccaccgctca 900

atcctggcgg ccatcggtct gcccacttcc tacgaaggcg gagccttcga cgagctttac 960

gacggcatga cccgcgacaa gaaaaaccgc gacggcaaca tccgcttcgt cgcactgacc 1020

gccgtgggcg aggttacccg cattgagggg ccctcaaaac aagatttaca gagtgcttat 1080

gaggcaatca gccactaagt gttgagtaat ctactagttt ggactagaag ttatccactt 1140

<210> 26

<211> 438

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 26

atgcttggaa aaattctcct cctcaacggc ccaaacctga acatgctggg caaacgcgag 60

cctgacattt acggacacga caccttggaa gacgtcgtcg cgctggcaac cgctgaggct 120

gcgaagcacg gccttgaggt tgaggcgctg cagagcaatc acgaaggtga gctaatcgat 180

gcgctgcaca acgctcgcgg cacccacatc ggttgcgtga ttaaccccgg cggcctgact 240

cacacttcgg tggcgctttt ggatgcggtg aaggcgtctg agcttcctac cgttgaggtg 300

cacatttcca atccgcatgc ccgtgaagag ttccgccacc attcttacat ttccctcgcc 360

gcggtctccg ttatcgctgg cgctggcatc cagggttacc gtttcgcggt cgatatcctg 420

gcaaatctca aaaagtag 438

<210> 27

<211> 851

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 27

ataaggatca acgaataaaa ttgggttctc acatcactca ccgggcggcc gtactcggct 60

cacccatcga gcattccaaa tccccagtcc tccacaacac cggctataaa gccctcggac 120

tggaccaatg ggaatacgac cgctttgagt gcaccggcga catgctcccc ggaatcgtct 180

ccggcgctga tgaaacctac cgcggattct ccgtcactat gccgtccaaa ttcgcagccc 240

tcgaattcgc cgacgaagta accgaacgcg cccgcgccat cggctccgca aacacacttc 300

tgcgcaccga aaccggatgg cgcgcagaca acaccgacgt cgacggcatc aggggagccc 360

tcggtgaact cctcggcagc gcatcactgg ccggcaaaca cgccatcgtc atcggctccg 420

gcggcaccgc acgccccgcc atctgggcac tcatcgaagc cggggtcgcg cggatcacgg 480

tgctcaaccg ctccgatcga accgccgaac tgcaaacgct tttcgacgaa acccccacca 540

ccttggccta cgccccgctc gaacatctcg acatcgaagc cgacgtcgta gtctctacag 600

tgccctccgc agcaatcgca ggcctcgaag acacactcgc aatcgcccca gtcctcgacg 660

tcatctacga tccttggcca acaccactcg tagaagtcgc acgagccaaa ggtctcaaag 720

ctgtcggagg ccacgtcatg ctggcacacc agtcctacgg acagtttgaa caattcaccg 780

gaatggatgc accccgcgat gctatgcgtg aggctttgga agaatcccta ggcatctcgg 840

aagaacacta g 851

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 28

ctctgaattc atgagcgcag cgcagatttt 30

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 29

ctctcccggg aagtggataa cttctagtcc 30

<210> 30

<211> 32

<212> DNA

<213> PCR primer

<400> 30

ctctgaattc atgcttggaa aaattctcct cc 32

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 31

ctctcccggg ctactttttg agatttgcca 30

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 32

ctctcccggg ataaggatca acgaataaaa 30

<210> 33

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 33

ctctctgcag ctagtgttct tccgagatgc 30

<210> 34

<211> 5426

<212> DNA

<213> Artificial sequnece

<220>

<223> plasmid pSKM4

<400> 34

caagaattga ttggctccaa ttcttggagt ggtgaatccg ttagcgaggt gccgccggct 60

tccattcagg tcgaggtggc ccggctccat gcaccgcgac gcaacgcggg gaggcagaca 120

aggtataggg cggcgcctac aatccatgcc aacccgttcc atgtgctcgc cgaggcggca 180

taaatcgccg tgacgatcag cggtccagtg atcgaagtta ggctggtaag agccgcgagc 240

gatccttgaa gctgtccctg atggtcgtca tctacctgcc tggacagcat ggcctgcaac 300

gcgggcatcc cgatgccgcc ggaagcgaga agaatcataa tggggaaggc catccagcct 360

cgcgtcgcga acgccagcaa gacgtagccc agcgcgtcgg ccgccatgcc ggcgataatg 420

gcctgcttct cgccgaaacg tttggtggcg ggaccagtga cgaaggcttg agcgagggcg 480

tgcaagattc cgaataccgc aagcgacagg ccgatcatcg tcgcgctcca gcgaaagcgg 540

tcctcgccga aaatgaccca gagcgctgcc ggcacctgtc ctacgagttg catgataaag 600

aagacagtca taagtgcggc gacgatagtc atgccccgcg cccaccggaa ggagctgact 660

gggttgaagg ctctcaaggg catcggtcga cgctctccct tatgcgactc ctgcattagg 720

aagcagccca gtagtaggtt gaggccgttg agcaccgccg ccgcaaggaa tggtgcatgc 780

aaggagatgg cgcccaacag tcccccggcc acggggcctg ccaccatacc cacgccgaaa 840

caagcgctca tgagcccgaa gtggcgagcc cgatcttccc catcggtgat gtcggcgata 900

taggcgccag caaccgcacc tgtggcgccg gtgatgccgg ccacgatgcg tccggcgtag 960

aggatccgga gcttatcgac tgcacggtgc accaatgctt ctggcgtcag gcagccatcg 1020

gaagctgtgg tatggctgtg caggtcgtaa atcactgcat aattcgtgtc gctcaaggcg 1080

cactcccgtt ctggataatg ttttttgcgc cgacatcata acggttctgg caaatattct 1140

gaaatgagct gttgacaatt aatcatcggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata 1200

acaatttcac acaggaaaca gaattcccgg gataaggatc aacgaataaa attgggttct 1260

cacatcactc accgggcggc cgtactcggc tcacccatcg agcattccaa atccccagtc 1320

ctccacaaca ccggctataa agccctcgga ctggaccaat gggaatacga ccgctttgag 1380

tgcaccggcg acatgctccc cggaatcgtc tccggcgctg atgaaaccta ccgcggattc 1440

tccgtcacta tgccgtccaa attcgcagcc ctcgaattcg ccgacgaagt aaccgaacgc 1500

gcccgcgcca tcggctccgc aaacacactt ctgcgcaccg aaaccggatg gcgcgcagac 1560

aacaccgacg tcgacggcat caggggagcc ctcggtgaac tcctcggcag cgcatcactg 1620

gccggcaaac acgccatcgt catcggctcc ggcggcaccg cacgccccgc catctgggca 1680

ctcatcgaag ccggggtcgc gcggatcacg gtgctcaacc gctccgatcg aaccgccgaa 1740

ctgcaaacgc ttttcgacga aacccccacc accttggcct acgccccgct cgaacatctc 1800

gacatcgaag ccgacgtcgt agtctctaca gtgccctccg cagcaatcgc aggcctcgaa 1860

gacacactcg caatcgcccc agtcctcgac gtcatctacg atccttggcc aacaccactc 1920

gtagaagtcg cacgagccaa aggtctcaaa gctgtcggag gccacgtcat gctggcacac 1980

cagtcctacg gacagtttga acaattcacc ggaatggatg caccccgcga tgctatgcgt 2040

gaggctttgg aagaatccct aggcatctcg gaagaacact agctgcagcc aagcttctgt 2100

tttggcggat gagagaagat tttcagcctg atacagatta aatcagaacg cagaagcggt 2160

ctgataaaac agaatttgcc tggcggcagt agcgcggtgg tcccacctga ccccatgccg 2220

aactcagaag tgaaacgccg tagcgccgat ggtagtgtgg ggtctcccca tgcgagagta 2280

gggaactgcc aggcatcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt 2340

tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca aatccgccgg gagcggattt 2400

gaacgttgcg aagcaacggc ccggagggtg gcgggcagga cgcccgccat aaactgccag 2460

gcatcaaatt aagcagaagg ccatcctgac ggatggcctt tttgcgtttc tacaaactct 2520

tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 2580

aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 2640

ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 2700

aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 2760

acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt 2820

ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtgttga cgccgggcaa gagcaactcg 2880

gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc 2940

atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 3000

acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt 3060

tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 3120

ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca 3180

aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg 3240

aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg 3300

ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag 3360

atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg 3420

aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag 3480

accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga 3540

tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 3600

tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc 3660

tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 3720

cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac 3780

caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 3840

cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 3900

cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 3960

gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 4020

acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 4080

atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 4140

cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 4200

gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt 4260

tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg 4320

tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg 4380

agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgcct gatgcggtat tttctcctta 4440

cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 4500

ccgcatagtt aagccagtat acactccgct atcgctacgt gactgggtca tggctgcgcc 4560

ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc 4620

ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc 4680

accgaaacgc gcgaggcagc tgcggtaaag ctcatcagcg tggtcgtgaa gcgattcaca 4740

gatgtctgcc tgttcatccg cgtccagctc gttgagtttc tccagaagcg ttaatgtctg 4800

gcttctgata aagcgggcca tgttaagggc ggttttttcc tgtttggtca cttgatgcct 4860

ccgtgtaagg gggaatttct gttcatgggg gtaatgatac cgatgaaacg agagaggatg 4920

ctcacgatac gggttactga tgatgaacat gcccggttac tggaacgttg tgagggtaaa 4980

caactggcgg tatggatgcg gcgggaccag agaaaaatca ctcagggtca atgccagcgc 5040

ttcgttaata cagatgtagg tgttccacag ggtagccagc agcatcctgc gatgcagatc 5100

cggaacataa tggtgcaggg cgctgacttc cgcgtttcca gactttacga aacacggaaa 5160

ccgaagacca ttcatgttgt tgctcaggtc gcagacgttt tgcagcagca gtcgcttcac 5220

gttcgctcgc gtatcggtga ttcattctgc taaccagtaa ggcaaccccg ccagcctagc 5280

cgggtcctca acgacaggag cacgatcatg cgcacccgtg gccaggaccc aacgctgccc 5340

gagatgcgcc gcgtgcggct gctggagatg gcggacgcga tggatatgtt ctgccaaggg 5400

ttggtttgcg cattcacagt tctccg 5426

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 35

ctctggtacc ggctgtgcag gtcgtaaatc 30

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 36

ctctggtacc ctagtgttct tccgagatgc 30

<210> 37

<211> 7501

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> plasmid pSKM7

<400> 37

agatctaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag 60

ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga 120

attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta cgaattcgag 180

ctcggtaccg gctgtgcagg tcgtaaatca ctgcataatt cgtgtcgctc aaggcgcact 240

cccgttctgg ataatgtttt ttgcgccgac atcataacgg ttctggcaaa tattctgaaa 300

tgagctgttg acaattaatc atcggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa 360

tttcacacag gaaacagaat tcccgggata aggatcaacg aataaaattg ggttctcaca 420

tcactcaccg ggcggccgta ctcggctcac ccatcgagca ttccaaatcc ccagtcctcc 480

acaacaccgg ctataaagcc ctcggactgg accaatggga atacgaccgc tttgagtgca 540

ccggcgacat gctccccgga atcgtctccg gcgctgatga aacctaccgc ggattctccg 600

tcactatgcc gtccaaattc gcagccctcg aattcgccga cgaagtaacc gaacgcgccc 660

gcgccatcgg ctccgcaaac acacttctgc gcaccgaaac cggatggcgc gcagacaaca 720

ccgacgtcga cggcatcagg ggagccctcg gtgaactcct cggcagcgca tcactggccg 780

gcaaacacgc catcgtcatc ggctccggcg gcaccgcacg ccccgccatc tgggcactca 840

tcgaagccgg ggtcgcgcgg atcacggtgc tcaaccgctc cgatcgaacc gccgaactgc 900

aaacgctttt cgacgaaacc cccaccacct tggcctacgc cccgctcgaa catctcgaca 960

tcgaagccga cgtcgtagtc tctacagtgc cctccgcagc aatcgcaggc ctcgaagaca 1020

cactcgcaat cgccccagtc ctcgacgtca tctacgatcc ttggccaaca ccactcgtag 1080

aagtcgcacg agccaaaggt ctcaaagctg tcggaggcca cgtcatgctg gcacaccagt 1140

cctacggaca gtttgaacaa ttcaccggaa tggatgcacc ccgcgatgct atgcgtgagg 1200

ctttggaaga atccctaggc atctcggaag aacactaggg tacccggggg ctgtgcaggt 1260

cgtaaatcac tgcataattc gtgtcgctca aggcgcactc ccgttctgga taatgttttt 1320

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tcggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagaatt 1440

catgcttgga aaaattctcc tcctcaacgg cccaaacctg aacatgctgg gcaaacgcga 1500

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tgcgaagcac ggccttgagg ttgaggcgct gcagagcaat cacgaaggtg agctaatcga 1620

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tcacacttcg gtggcgcttt tggatgcggt gaaggcgtct gagcttccta ccgttgaggt 1740

gcacatttcc aatccgcatg cccgtgaaga gttccgccac cattcttaca tttccctcgc 1800

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caaatattct gaaatgagct gttgacaatt aatcatcggc tcgtataatg tgtggaattg 2400

tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gaattcatga gcgcagcgca gattttcaac 2460

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cacggcaatg ccgttgcagt gggcatgatg ttcatcgcta acctctccca caagctcggg 3300

cttatcgacg cgcccctcct cgagcgccac cgctcaatcc tggcggccat cggtctgccc 3360

acttcctacg aaggcggagc cttcgacgag ctttacgacg gcatgacccg cgacaagaaa 3420

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gaggggccct caaaacaaga tttacagagt gcttatgagg caatcagcca ctaagtgttg 3540

agtaatctac tagtttggac tagaagttat ccacttcccg gggatccgtc gacctgcagg 3600

catgcaagct tggcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt 3660

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caattctgat tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg 3900

attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag 3960

gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc 4020

aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg 4080

agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagcttatgc atttctttcc agacttgttc 4140

aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat 4200

tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac 4260

aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga 4320

atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag tggtgagtaa 4380

ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt 4440

cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg 4500

tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg tcgcacctga 4560

ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt 4620

taatcgcggc ttcgagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac cccttgtatt 4680

actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgatgat atatttttat cttgtgcaat 4740

gtaacatcag agattttgag acacaacgtg gctttgttga ataaatcgaa cttttgctga 4800

gttgaaggat cagatcacgc atcttcccga caacgcagac cgttccgtgg caaagcaaaa 4860

gttcaaaatc accaactggt ccacctacaa caaagctctc atcaaccgtg gctccctcac 4920

tttctggctg gatgatgggg cgattcaggc ctggtatgag tcagcaacac cttcttcacg 4980

aggcagacct ctcgacggag ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 5040

cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 5100

taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 5160

gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc 5220

acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 5280

ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 5340

ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 5400

cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg 5460

aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 5520

gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 5580

gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 5640

gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc 5700

ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg 5760

ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagaagctc 5820

gcacattcag cagcgttttt cagcgcgttt tcgatcaacg tttcaatgtt ggtatcaaca 5880

ccaggtttaa ctttgaactt atcggcactg acggttactg attttgaact tttgctttgc 5940

cacggaacgg tctgcgttgt cgggaagatg cgtgatctga tccttcaact cagcaaaagt 6000

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gagatctgac ttggttacga tggactttga acacgccgag ggtgactaaa ccgctggatt 6120

tacgcggttt tcttctcttc aacttctttg acgtagcggt gaaccgtgcc caccgagcaa 6180

ccaatctctg ccgcgatagc gcgcatggac agacctttgg cgcgcagctc ctggacgcga 6240

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gctgttctca ccgacatacc ggcacgttct gccagctcgc gggctgtttt tccgttgcgt 6360

ggataacgtg cataaacctt agccaatgtt cctccaaaga gtatgtccag cctcacgacg 6420

cacctcagcg cttcgttgcc agcctttctt cccgcgtgcg gattgcattg cggtgaatgt 6480

ggcgtcgtag acggcggcgc cgtctgtcca catgcgtgac ttggtgatga tccatttatg 6540

gattgacctg gcaatacagt caacttcggc cacaggtagt ggttcatcaa acagctcttg 6600

gttaagtgct tgcgcggtgg tttggattgc gcggcctagg ccgtcagcgt ctccaaaatg 6660

ctttctgacc tcccgatatg cccacgtacg tgcgctttca aagagtgcgc aattacgacc 6720

tagaccaact ggcgagaacc gccgcgtttt cctccaggac gcaggcggca taaagccggt 6780

ttcttcgagc caaaagcgca gctcatcgag cgtatacagc ttatcggtga tccagtgact 6840

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gtattcggtg cgggtaaatg gctccgcgag cgcccagaca gcgtgtgcgt gcccgtttaa 7020

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cgcgtcctcc tggtcgatgt caacgaccag gaggttagag agcgcgtcgg gattggcttc 7140

gacgtagcgc ttatccagcg cgttcttccg tgaggtgcgg taaatgccct cacggaggtc 7200

atcgcttgcc aatggccaca gcggcagcca cagctgctca aagcgtccct cagggcgggt 7260

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tacgacattt aaccaagtca gatgtttccc cggtttccgg gggttcccct gaagaaccct 7380

tccagtgcga gcgaagcgag ctcctttggc cggcgcccct caggtagccc tctaaggctc 7440

ccagggctcc gcccctccct gaggttggct caagcctcct ggtggctcct acggacgttc 7500

t 7501

<210> 38

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 38

caggaaacag ctatgac 17

<210> 39

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 39

gttttcccag tcacgac 17

<210> 40

<211> 3341

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 40

ttgacgctgt cacctgaact tcaggcgctc actgtacgca attacccctc tgattggtcc 60

gatgtggaca ccaaggctgt agacactgtt cgtgtcctcg ctgcagacgc tgtagaaaac 120

tgtggctccg gccacccagg caccgcaatg agcctggctc cccttgcata caccttgtac 180

cagcgggtta tgaacgtaga tccacaggac accaactggg caggccgtga ccgcttcgtt 240

ctttcttgtg gccactcctc tttgacccag tacatccagc tttacttggg tggattcggc 300

cttgagatgg atgacctgaa ggctctgcgc acctgggatt ccttgacccc aggacaccct 360

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tctgcagttg gtatggccat ggctgctcgt cgtgagcgtg gcctattcga cccaaccgct 480

gctgagggcg aatccccatt cgaccaccac atctacgtca ttgcttctga tggtgacctg 540

caggaaggtg tcacctctga ggcatcctcc atcgctggca cccagcagct gggcaacatc 600

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tacgctgacg agctcccaac atgggatgca gatgagaagg gcgtcgcaac tcgtaaggcg 1140

tccgaggctg cacttcaggc actgggcaag acccttcctg agctgtgggg cggttccgct 1200

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ccaacccacc agcctgttga aaccttggct gcactgcgcg ccatcccagg tctgtccgtc 1560

ctgcgtcctg cagatgcgaa tgagaccgcc caggcttggg ctgcagcact tgagtacaat 1620

gaaggcccta agggtcttgc actgacccgc cagaacgttc ctgttctgga aggcaccaag 1680

gagaaggctg ctgaaggcgt tcgccgcggt ggctacgtcc tggttgaggg ttccaaggaa 1740

accccagatg tgatcctcat gggctccggc tccgaggttc agcttgcagt taacgctgcg 1800

aaggctctgg aagctgaggg cgttgcagct cgcgttgttt ccgttccttg catggattgg 1860

ttccaggagc aggacgcaga gtacatcgag tccgttctgc ctgcagctgt gaccgctcgt 1920

gtgtctgttg aagctggcat cgcaatgcct tggtaccgct tcttgggcac ccagggccgt 1980

gctgtctccc ttgagcactt cggtgcttct gcggattacc agaccctgtt tgagaagttc 2040

ggcatcacca ccgatgcagt cgtggcagcg gccaaggact ccattaacgg ttaattgccc 2100

tgctgttttt agcttcaacc cggggcaata tgatcctccg gaattttatt gccccgggtt 2160

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atctcagcca ggttattgag gaaaagtctg tagtcggtgt caccaccaac ccagctattt 2400

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ctggcgcatc tgttgaccag gctgtttacg ccatgagcat cgacgacgtt cgcaatgctt 2520

gtgatctgtt taccggcatc ttcgagtcct ccaacggcta cgacggccgc gtgtccatcg 2580

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gggcaaaggt tgatcgtcca aacgtcatga tcaagatccc tgctacccca ggttctttgc 2700

cagcaatcac cgacgctttg gctgagggca tcagtgttaa cgtcaccttg atcttctccg 2760

ttgctcgcta ccgcgaagtc atcgctgcgt tcatcgaggg catcaagcag gcagctgcaa 2820

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ttgagatcga caagcgcctc gaggcaatcg gatccgatga ggctttggct ctgcgtggca 2940

aggcaggcgt tgccaacgct cagcgcgctt acgctgtgta caaggagctt ttcgacgccg 3000

ccgagctgcc tgaaggcgcc aacactcagc gcccactgtg ggcatccacc ggcgtgaaga 3060

accctgcgta cgctgcaact ctttacgttt ccgagctggc tggtccaaac accgtcaaca 3120

ccatgccaga aggcaccatc gacgctgttc tggaactggg caacctgcac ggtgacaccc 3180

tgtccaactc cgcggcagaa gctgacgctg tgttctccca gcttgaggct ctgggcgttg 3240

acttggcaga tgtcttccag gtcctggaga ccgagggcgt ggacaagttc gttgcttctt 3300

ggagcgaact gcttgagtcc atggaagctc gcctgaagta g 3341

<210> 41

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 41

ctctcatatg acgctgtcac ctgaac 26

<210> 42

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 42

ctctcatatg ctacttcagg cgagcttc 28

<210> 43

<211> 3000

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 43

taatggtgtc gaccgacatc cgaatatcac catgggcaga tacaaagatc actacaacat 60

gtggagaaag ctcatttagt ttttcctgga gacgaatccc gctcatagat ggcatacgaa 120

catcaaggat caaacaagct ggcttagtgt catcaaacga gtccaagagt tcctgagcgc 180

tatgacaaat tgtgctttcg atgctcgcgc tttctaatag ccaagcaacc gattcgcaca 240

cttccacgtc atcatccaca atgtagacga cgggatcaat cttatccatg ggttgaaaat 300

ctttccccac ctgctgtttc atcgcgatat tcacttaaat ctcaatccca agaagcttcg 360

gcgacccagt agttcatgcc aaaatcactg actcgatgtt cccagggcgt ggttcgacga 420

agttctggtt cctctaaacg aacggattca tctgcaaatt caggtccatc ggcttcaaca 480

gtccagtgga cccagttcac ttctcgaccg tgctcatcgt gaacaaacaa atcaacatga 540

tgccagccgt aattgaaagt gtcctcgtag caagttaaga acatatggtg gtggttgatg 600

ggacgtggtg gaattggttt ttctacagtt accatttcat ttccttaagt gttgatggtg 660

tctgggtgtt tgaaaatgac gggagctcgc gcagcagcgg ttccagtact tttcctagac 720

gcaacaaggt caattcatta tgtttgttgc cgataagttg tattcccaat ggcattccag 780

ttgaggttga ggctcctgga acagtcacaa ctggaagtcc cagtaactgc catggtcgac 840

ttaattcggg ggacccagtc ccctcttcta accttagtgc ttgcccgtgt gcggcaggcc 900

cgataattac tgaatcccta ctcataattt tcaaaaacac ttggtaggaa gcgtctctac 960

ggaatactgc ttctgagtac atctgatcag ttgctgcatc gccttcagta agtagtcgct 1020

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ctgacattgc tggatcaagg ttgagcaacc cggaaccatc ccaaataaag atacttagat 1260

tttcaggatc aactgattgt tctccagctc ttccagagaa gtgtcggtac acataatcta 1320

gatcttcaac gtttcgagtc atgattccca aggaatctaa ggagccactc ataccgtgta 1380

ctcccttcag agaagtacta ccttgtgtca tgaccaagcc tgcggctcca gaaaacgatg 1440

ctggtcgagt gagtgaaccc gcagtttgag tacctagcgc acattgaatc gtgccggccc 1500

caaccgccgc tgcggaaccg ctggaggagc ctccaggagt atgttccaca ctgaatgggt 1560

ttgtgcttga tccaggagca aagtatccat attcagttgt gactgtcttt ccttgtacga 1620

ccgcaccgag atctcgtaat cgcttgacac aatcggcatc attttctcga attgacgggt 1680

ctgcagtctc agaaccacac ctggtcggta gtcctcggac atcgattatg tctttgacgc 1740

caagagaaac tcctcggaga ggttgatccg caccattcgt cgcgcgagca gacgaagacg 1800

ctagttccgt cgataaatct gttagttcaa cccatgcttt caagcgggct tcataacggt 1860

caatttcacg ccgggatttt tgaactaact catcaaccga aacttctcct gcaccaattt 1920

cctttgctgc gtcggagatt gaatttgatc gaaaagttgt aatcatacat tctccctaaa 1980

ttcacaactg aattgaatgt gacaataaat aatgtggaat atgccactct ttttgcctta 2040

tgtgtttcat attaaaacaa cggggcagga gatgacagtt atgagggggt aaaggtttcc 2100

ccagtatcaa tgtaagcaat atcacctcta cgttgaaaac acggacatta gctggctgtc 2160

cagaccatcc gataatcttt gaaatggagt cactgtgaca ataaaaactc agatcggcgc 2220

agaggggcgt gaactgacta gctcttccgc gcattcgaaa ggcaacgagc gtaagcgcct 2280

ccgtcgggca tgggtcgtgg tattcctgct cgttattttt cagatcatcg catttgccga 2340

taaggccgtt ctggggcttg tctccaccga cgcaatggct gagcttggac taacacccac 2400

ccagttcggt atgatcggca gctcattctt cctgctatat tccattgtct caatcgtcac 2460

tggcgtaatc gcctctcggg tttcggtcca ttggattgtt cttacactcg gagtcatttg 2520

ggctgtcatg cagttcccga tgcttctcgg aggcggagct gctgttcttt tagcaacgcg 2580

aattatcctc ggcggtgctg aaggtccagc tacagcgatg tctctgactt ctgcacacac 2640

atggtttaag ccaaaagagc gcgcattgcc ttccagcctc attgccgctg ggtccacttt 2700

ggggccaatc atcgctgcac cggttttgac tctagttatt actgcttggg gctggcgttg 2760

ggcttttgga gtcctgggta tcgtcggcct cgtatggtgc gtatcttggc tgtttttcgg 2820

aggaagtggc cccttcttag ccaataagaa gcagcaggta gttacagaca atgcgaaaaa 2880

tattgaacaa gctccagttg ccaaagagtc ctcagtagat gatcagccta gttttccaat 2940

ctggcgcgtt cttcttagcg tctctttcct agccgctctt gtcggagcca catctaactt 3000

<210> 44

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 44

ctctcctgca ggtaatggtg tcgaccgaca tc 32

<210> 45

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 45

ctctcctgca ggaagttaga tgtggctccg ac 32

<210> 46

<211> 1617

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 46

atggctagta ccttcattca ggccgacagc cctgaaaaaa gtaagaagct acccccactc 60

acagaaggtc cgtatagaaa gcggctgttc tacgttgcac tagttgcgac gtttggtggg 120

ctgctcttcg gatatgacac cggagtaatc aacggtgcac tcaacccaat gacacgtgag 180

ctcggactaa ccgcgttcac cgagggtgtt gtaacttctt ccctgctgtt tggtgcagca 240

gctggtgcga tgtttttcgg tcgcatttcc gacaactggg gtcgccggaa aacaatcatc 300

tcacttgcag tagctttctt tgtcggcacc atgatctgcg tgtttgctcc atcttttgca 360

gtaatggttg tcggacgtgt gcttcttgga ctcgcagttg gtggcgcttc cactgttgtc 420

cctgtctacc tggctgaact tgctcctttt gaaatccgtg gctcactggc tggccgtaat 480

gagttgatga ttgttgttgg tcagctcgca gctttcgtca tcaatgcgat tattggaaat 540

gtttttggac accacgatgg tgtgtggcgc tacatgctgg caattgccgc aatcccagca 600

attgccctct tctttggaat gctccgagtt ccagaatccc cacgctggct tgttgagcga 660

ggacgcattg atgaggctcg cgcagttctt gaaaccattc gccctctaga acgtgcccat 720

gcagaagttg ctgatgttga gcacctagca aaagaagagc acgccatttc cgagaagtcc 780

atgggcttaa gggaaatttt gtccagcaag tggcttgtgc gcatcctcct ggtaggtatc 840

ggattgggtg tcgcacagca gctgactggc atcaactcca tcatgtacta cggccaggtt 900

gttctcattg aggctggttt ctccgaaaat gcagctctga tcgccaacgt ggcgccagga 960

gtgatcgcag ttgtcggtgc atttatcgca ctgtggatga tggatcgcat caaccgccgt 1020

accaccctca ttaccggcta ctctctcact accattagcc acgtgttgat cggcatcgca 1080

tccgtagcat tctcagtcgg cgatccactt cgcccatacg ttattttgac cctagttgtg 1140

atcttcgtag gatccatgca gaccttcctc aacgtagcca cctgggtcat gctctccgag 1200

ctcttcccgc tggcaatgcg aggtttcgca atcggtatct cagtgttctt cctctggatc 1260

gcaaacgcgt tcctcggatt gttcttcccc accatcatgg aagcagtagg actaaccgga 1320

accttcttca tgttcgccgg aatcggtgtg gttgccttga tcttcatcta cacccaggtt 1380

cctgaaactc gtggacgtac cttggaggag attgatgagg atgttacttc cggtgtcatt 1440

ttcaacaagg acatccgaaa aggaaaggtg cactaaaaac ccagacactg catagataat 1500

acgctccaga tttttctcag ccgctgcccc tcccctgctt cgcgcaggtg gaggggcagc 1560

ggtgtttttc tttaaagttt ggattccaaa tcaccgaatt cgggagtgaa gcacact 1617

<210> 47

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 47

ggagaccata tggctagtac cttcattcag 30

<210> 48

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 48

cctattgcat atgagtgtgc ttcactcccg 30

<210> 49

<211> 3013

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 49

gagatcgtac ttcgtaggca tcgctgctcc tgttaactct tggctttctg ctctgtctca 60

gccatactgg accttccagt acaggggaag gtcaagcgcg gccacggagg gagacagcaa 120

tgcggatcgg agaactcgcc gagagggcgg gcactaccgc gaagaccctt cgcttctacg 180

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ccgagacggt cgctcggatc gacttcgtcc accgcggcca ggccgcgggc ctcaccctcg 300

cccagatccg ccagatcctc gacatccgcg acggcggcca tgcgccctgc gagcacgtgc 360

gcgacctgct tgacgtgcgc ctcgctgaga tcgagcagca gatcgcgcag ctctccgtgc 420

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gcaccgatca agtgtgtagg tacttgtaat ccaattgggc acacctcctt agcaaccacg 540

ctatgcgaga gttgcagctc gacgagagca aagatggcag gattgatcac caggatcgat 600

ctttaaataa ggactatttc ttacctggaa gtaacatttt ggccgttgag gataatacct 660

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tcgcaaccaa aactgagcct ataataaatg cttctttatt tatctgcagt gattgcagat 780

taaatctttt gttgttgacg tcatgctcca taagcttgtc gtcaaggcgt tctagccgat 840

cgaaagcatc tcggcgactt tcttctgatg aattagggtc gctaataact tgcgtaagta 900

tgcttttcgt cttatcaaaa ctgtcataaa gcctatctga gctgtattta ttgctagata 960

gggcctgttg gaaagaatcg gccattgctt gagacacttt caccatagtg ttatgagaca 1020

cgccctaagc caccgtggcc tccgctgcaa tcatcagggg atcatcaggg gatgacggtg 1080

agtattccac ctaccaacaa ccgcagtgag ggcctccagt gtccaggacg cgagatgttt 1140

tcctgaccgc gtgtgggaag gctggtttta tgaagtcgtc ggcatttttc gcttggatga 1200

cctgggggtg gcacttctta ccggtactgg caggccctcc tttccgggtg ggcgctgatc 1260

tagcatggag acatgaatct gcacagcgat gcccgggagt ttctcaagtc ccgccgggac 1320

cgcgtcaccc cgcaggccgc cggcctcccg tcctacggta ggaaccgtcg cgtacccggt 1380

ctgcggcgtg aggaagtcgc cctgctggcc ggtgtcagcg tggactatta cacccgcctg 1440

gagcggggaa acctctccgg ggtctccgag gaggtactcg cggcggtggc gggcgccctc 1500

cagctcgacg aagcggaacg ctcccacctg ttcgacctgg ccaaggccac caactcccag 1560

agcctgcggc gcaggaacac ccgcggggct acccgcgccc aggagaaggt ccgcccagag 1620

gtccagcgga tcctcgacgc gatggccgat acgccggcgt tcatcctgac cgaccgcgcg 1680

gacatgctga ccaccaacca gctgggcaga gccctgtttg cacccctgta cgacagcccc 1740

gtctccccgg gcacgagcgg gcaggcggag acggtaaaca tcgcccgctt cactttcctc 1800

gatccggtgg cccgcgagtt ttttccccac tgggagcaca acgccgccga cctggccgcc 1860

agcctgcgca gcacggccgg gcgccaccct cacgacacgg tcttcagcaa tctcatcggg 1920

gaactggcca cccgcagcca ggacttcgcc caattgtggg ccgaccataa tgtgcggctg 1980

caccgggtgg ggcggaaaac cctgcaccac ccgatcgtcg gggacctgga gctcgacttt 2040

gagactctca tcctgccggc ggacccagac caatccctga tcgtctactc cgccgctccc 2100

ggatccgatg ccgcacagaa cctgcgcctg ctcgccagct ggacggtcac cggtactgat 2160

aaaacaggca ctgacagggc cttccacccg gcggacgatg tccctagtct ggaggaatga 2220

cacctcaatc agcaccctcc caccctgtcc ccaccatcga actcaacaac aacgtgtcca 2280

tgccggcctt aggtttcggg gtgttccaaa cccctcccgc ggacacgatg acggccgtga 2340

ccacggccct gggcaccggc taccggcata tcgacaccgc cgcggcctat ggcaacgaac 2400

gcgaggtcgg ccaagccatc gccacttccg ggttgtcccg tcaggaggta ttcatcgaga 2460

ccaaggtctg gatcaccgac tacggctacg ataagaccct gcacgccttc gataagtccg 2520

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actttgaagc cacgatcgag gcctaccggg cgttggagag actgcaggcc gacgggcggg 2640

tccgagcgat tggggttagc aatttcatgg tcccccacct cgaccgtctc atggaccggg 2700

ccacggttgc cccggcggtc aatcagctgg agatccaccc ctacttccag cagcgcgagg 2760

tgctcgcccg caacgctgag ctgggaatta tcagccaggc gtggtcaccg atcgggggca 2820

tcaccttcta ccgggacagc ggacatggca gcaccctgga ggatcccacc attggtgaga 2880

tcgcggccga tcatgccaag accccggcgc aggtgatgct gcgctggcac ctgcagcagg 2940

gtcgtcaggt catcccgaag tcggttacgc cctcgcgtat cagggagaac ttcgcggtct 3000

tcgatttcga gct 3013

<210> 50

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 50

ctctgtcgac gagatcgtac ttcgtaggc 29

<210> 51

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 51

ctctgtcgac agctcgaaat cgaagaccg 29

<210> 52

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 52

ctctagatct accaactccc agagcc 26

<210> 53

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 53

ctctagatct ttggccaggt cgaacag 27

<210> 54

<211> 972

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 54

atgccacaaa aaccggccag tttcgcggtg ggctttgaca tcggcggcac caacatgcga 60

gctgggcttg tcgacgaatc cgggcgcatc gtgaccagtt tgtcggcgcc gtcgccgcgc 120

acgacgcagg caatggaaca ggggattttt gatctagtcg aacagctcaa ggccgaatac 180

ccggttggtg ctgtgggact tgccgtcgcg ggatttttgg atcctgagtg cgaggttgtt 240

cgatttgccc cgcaccttcc ttggcgcgat gagccagtgc gtgaaaagtt ggaaaacctt 300

ttgggcctgc ctgttcgttt ggaacatgat gccaactcag cagcgtgggg tgagcatcgt 360

tttggtgcag ctcaaggcgc tgacaactgg gttttgttgg cactcggcac tggaattggt 420

gcagcgctga ttgaaaaagg cgaaatttac cgtggtgcat atggcacggc accagaattt 480

ggtcatttgc gtgttgttcg tggcggacgc gcatgtgcgt gtggcaaaga aggctgcctg 540

gagcgttact gttccggtac tgccttggtt tacactgcgc gtgaattggc ttcgcatggc 600

tcattccgca acagcgggct gtttgacaag atcaaagccg atccgaattc catcaatgga 660

aaaacgatca ctgcggcagc gcgccaagaa gacccacttg ctctcgccgt tctggaagat 720

ttcagcgagt ggctgggcga aactttggcg atcattgctg atgtccttga cccaggtatg 780

atcatcattg gtggcggact gtccaatgct gccgaccttt atttggatcg ctcggttaac 840

cactattcca cccgcatcgt cggcgcagga tatcgccctt tggcacgcgt tgccacagct 900

cagttgggtg cggatgctgg catgatcggt gtcgctgatc tggctcgacg ttccgtgttg 960

gaagccaact ag 972

<210> 55

<211> 932

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 55

atgactgatc ccacttgcac ccttgccctt gatattggtg ccacaaagat tgcctacgca 60

ctagtccccg ataacgcccc gacgacaaca ttgtccacgg gacgcttggg aacaaaagaa 120

ggcgacagcc ctatcgagca gatccggctg gttcttctgg caggcttaaa agctgccgag 180

gaacacggtc tcagtgtcgc ccgcatcggc atgggcgctc ctggtgtaat tctgggacca 240

gagggaacca tcgtgtacaa cggtgaaacc ctcacagagt gggcaggcac tgacctgcga 300

ggattatccc gagaagtcct caacgttcca ttcgcggcac acaatgatgt ccgcgtatgg 360

gcctacggtg agcaccactt aggcaccggc aaagacctca ccggcagggt tctctacgtg 420

tccctcggca ctggagtcgg cggagcaatc atcgaagacg gaatcatgat gagtagcccc 480

actggaactg cgggagaatt cgcagaagtt gtgtgctctg accatgcagg attagccgtt 540

cggtgcgaaa atgtagcaag tggcaccggc ctaaccaggt actacaacga ggccgccgca 600

actcaacttg accttcccgc catcatggag cgcttccacc aaggtgacgg cctggcacag 660

caaatcatta ctggaaatct ccgaggcttt ggccaagcgc taggcgcatt agtcacagtg 720

ctggaccttt ccgcagtagt agttggaggc ggagtcgcag gcatcggcgc acccgtcatg 780

gatcccatca ccgcagggat tttcgatcga atgttagccc ccaacaaatc cgtacaagtt 840

ttaagcacgt cccttggtgc ccaagcagcc gtcatcgcag cagcaaaata tgcccgcgat 900

aacgcctttt aagcacctaa aacgctgttc tc 932

<210> 56

<211> 1233

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 56

gtggcgcgcg gcggtgtaca gcaccccggt gaccacattg atcacagcac ctgctacgac 60

ctcgccgtcg atcgccgcag cgatcgagac ggcgtattgg ggcaggccat aaaggaagtt 120

gacggtgccg tcaatggggt cgacgatcca ggtaactccg cttatcgacg ccgtccccgt 180

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atcttcagcc aaagtatcta ctatcgtcac cggatcgact gtcgaacttt tggtgttggt 300

gtagtcccac aaattggtga gttcagcacg tttatccctg atacgtgtag cggtaagcgt 360

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atcgttgttt ttttagaaaa ttgcctgcca aaagccgaag taatttgtac acttgggcgc 480

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aaccttaaga ccggtgagtt tattgatgaa cgcataaaaa tcgccacccc taagccagca 600

accccagagg ctgtcgccga agtagtcgca gagattattt ctcaagccga atgggagggt 660

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cgagagatca ccgttctcaa tgacgcagac gccgccggca tcgccgaagc aacctttggc 840

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ggcgaggaag cagaacacct tgcagcagca gccgtcaaag aaaacgaaga tctgtcatgg 1020

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tccgtcttca tcatcggtgg cggaatttcc agaaagcacg aaaagtggct tccattgctg 1140

gagctagaca ctgacattgt cccagctgag ctgcgcaatc gagccggaat cgtaggagct 1200

gccatggcag taaaccaaca cctcacccca taa 1233

<210> 57

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 57

ctctgcatgc cacaaaaacc ggcc 24

<210> 58

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 58

ctctgcatgc ctagttggct tccaacacg 29

<210> 59

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 59

ctctcatatg actgatccca cttgcac 27

<210> 60

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 60

ctctcatatg gagaacagcg ttttaggtgc 30

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 61

ctctcatatg gcgcgcggcg 20

<210> 62

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 62

ctctcatatg ttatggggtg aggtgttgg 29

<210> 63

<211> 3241

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 63

tccagtgtgg atcgcaactc aaaccttcct cacccaactt cgtgatttag acggagtggc 60

cattatcgga acctttgatg atgattcaca caccgttgga ccttccgatg gctggccctg 120

gacgttctat gtgctcgccg atgtcaaaga ccaacccacg gtcaaagaag cctgcaacct 180

cctccgcaca atcatggttg gagaacacgc tctatggcgc tacttcaaga tcgaagctcg 240

catgggcaga gaactgacca tccgtgacga cgttgtcgtc tgatcaaaaa actgaaagga 300

ctcaccatga ccaccacaac tagtaaccag acccgattct ctgacctggt cgaagacgac 360

cgtgtcgctg gccagctgta caccgatcct gaaatcttca aagaagaaat ggagaagatt 420

ttctataaga cctgggtatg ggtcgctcac gaaagtgaaa tcccagaggc cggatcattt 480

aagaccacat gggtaggcga tcagcctgtc attgtaaacc gagatcgcaa gggcaacttc 540

aacactctgc tcaaccgctg ccgccaccgt ggagcaacag tctgtgacca gcgaaaaggc 600

aaagcaaacg gatttacttg cccttaccac aactggtcct acacccacga tggtcgtcta 660

cgcggagttc cttaccctga cggatacgaa ggtgtgttga aaaaggaaga gcttggcctt 720

caaactctcc gaaccgagag ctacctcggt atgatttttg ccaccttcaa tgaagacatc 780

gagcctctag aagatcacct aggtgacgcc aagatttgga tggaacgatt cctcaagcag 840

accaatggat acccttgcaa ggtcattggc gcacacaagt tccgcttcaa cggcaactgg 900

aagatccagc tggaaaatac aaccgacggc taccacttcc ctatggttca caaatcatgg 960

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gttactcacg cacttggaaa tggtcacagt gttggaatta tggccactgc tcatatcgat 1080

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tgtggcttca acctcaacat gttccccaac atcgcaatgt cttcttcatt cttccgcgtt 1260

ctaattccaa tctctgtgaa cgagaccgaa atttggcaca tggctatcgg catggacggc 1320

ggtccagaaa gcatcaacca ggaaaggctc cgcattcacg agcacttcca aggaccattc 1380

ggattcggaa gccccgacga tgctgaaggt tgggaccgag ttcagatcgg tgccggcggc 1440

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aactggccaa cctcccatgt caccgatgaa accggcatgc gcgaggctta ctacaagtgg 1560

aagaagctga tgagcaatga ctaacaccac cctccagact gaactgacca acaccagctt 1620

cctaaacgat gagcgagttt tacgcgccat ccagctgatc tggcacgaag ctgccctgct 1680

ggatcgtaaa gactacacaa attgggaaga gctgtttacc gaagatggcc tctacatcgt 1740

ccccatcgat cgtgaaaccg aggacttcca cggctccttg aacatgatct acgacgacaa 1800

gcgcatgcga agcctccgag tccagcgaat gatgcagggc tatgcgcctt ctgctgtcgc 1860

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tggagctgac ctcatccaca aaatccgatt ttctgaagat ggaacttcca gaatcgtgca 2040

gaaggtcgca cgcatgatca acagcgaaga tgccatcaat gccgctggtt tctttatcta 2100

aatcccttca atagttagga aactcatgac tgaaaaaacc cagaagattg cacttgttac 2160

cggtgcagct ggtggcctag gcagcttcat tactaagaaa ctccacgctg acgggcacaa 2220

ggtggtcgtc acaggacgtt cctttgaacc acttcaggag cttgcaaatg agctatcagc 2280

agatggaagc acggcactgc cgttgcagct tgatgtgtcg cacaaagaca acttcctgaa 2340

cgcacttgac caggttaaag atgtttgggg aacgccatcc attctggtga acaacgcggc 2400

agttacccgt gcagccaacg tcctcgagct caataccgag gaattcgatg aagttcttac 2460

caccaatgtg aacagtatct tcttcggatg ccaagtattc ggaattgcaa tggcggagca 2520

aggatacggt cgcatcgtta accaagcatc ccttgccggc caaaacggtg gaactgctac 2580

tggagctcac tacgctgctt caaaaggcgc gatcttaaca accaccaagg tattcgcgcg 2640

cgaatttgct ggctcgggag taaccgttaa cgctatctca cctgggccac acgatgtgga 2700

catcgtccac acaacagttg cagaccacct ggaacaaatt gtggaaggaa tccctgtcaa 2760

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aagctttgtt accggcgcat gctgggacat caatggcggc ctctacctgc gttaaccccc 2880

cgtacaccat ctggaaagtg aggaaacagc aatgtctatg aaagaagtta ttgtcacaga 2940

tctcgtctat gaaacgccga cgatcatctc aatccatcta gcaaaactag acggcacgcc 3000

cattgggcac tacgttcccg gcgcacacat cgatgtcgaa ggtccaactg cagtaacgag 3060

gcaatactcc ttatgtggac gcccagatgg tgacgacgcc tatgtcgttg cagtaaagcg 3120

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gaagatttca gaacctcgaa acctcatcgg tatcgcagat caagctagtc accatatcct 3240

c 3241

<210> 64

<211> 2520

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 64

caccgttgtc agcttcactg tcagggaggc tggcgatacc tttattgatc tccgcgcagc 60

aagcgttgag gaggttcgcc tggacaatgt gtccatcaaa gatgaggctc taacccttgg 120

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gcgtatgttc gcgtgtttcg atcagccaga cctcaaggct acctatgatc tgaacatcaa 360

aactcctaag ggttggaaga ttatttccaa ctctgagcag caggtttcca ctcagcacac 420

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ccctgaattt aacgccggtg caatggaaaa cgcaggtgcg gtgactattc gtgatgaata 780

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<210> 65

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<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 65

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<212> DNA

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<220>

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 68

ctctcctgca ggcaccgttg tcagcttcac t 31

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 69

ctctcctgca ggctgactgt ggcatacctc ta 32

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<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

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ctctcctgca ggttgggaac ttagctaggt cg 32

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<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 71

ctctcctgca ggtggaatca ggatcagatg cg 32

<210> 72

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 72

ctctgatatc cttcctaaac gatgagcgag 30

<210> 73

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequnece

<220>

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<212> DNA

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<220>

<223> PCR primer

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ctctagtact gcagatccat ttcattgcgc 30

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<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 75

ctctagtact tggtggaatt acacgcacc 29

<210> 76

<211> 2494

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

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<210> 77

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<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 77

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cgcttttgga tgcggtgaag gcgtctgagc ttcctaccgt tgaggtgcac atttccaatc 480

cgcatgcccg tgaagagttc cgccaccatt cttacatttc cctcgccgcg gtctccgtta 540

tcgctggcgc tggcatccag ggttaccgtt tcgcggtcga tatcctggca aatctcaaaa 600

agtagaaagc ccaaaaaata tgaacgacag tattctcctc ggcctaatcg gccagggcct 660

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cgtgtacagg cgcatcgaca cgcttgggtc gcgtgcttcc gggcaagatt taaagacgct 780

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ccgcatgcgg gaaactttcc tatccctcta aaagagtcag taaaacctcg acgcttcgac 1500

cgtttccttc gcttccttca accctgcccc ggtaagttca cggtgacgtt tgatcgccgc 1560

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ttgcaacgac agcggagtcg aagaatcacc ccctagctga gcaatgatct gatcttgctc 1680

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tctaccaaac atggccccca caataggtga gcgtttagtt ccgggggtgc cggtttcgcg 1800

ggctcaattt ctcatgacga acttaagcag ggtctgcacc catacacggt agaataagtg 1860

ctacggttcg acttcacgtg cgctgacttc tcatgctcaa cttcttgtca tacgacttca 1920

gtaggaaatc cggtgatcgc ctaatgaagt ctgcacatga gaagtcgccc tttaaggtga 1980

tca 1983

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<211> 2664

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 78

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aacatcgttc gctgttcctt cgatggtgca gagctctggg cggacctggc cggtggcgcc 240

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gacctgcatg taatacactt cggcggcgag ggtgaagccg tggatgaaca cgaccgttgc 360

cgtggcattt tcagcatggc caaccgtgta cgtgtggatg ctgaggccgt cggagtccac 420

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acgctccagg aggagttgcc tgcgaccatt tggcgtcatc tttagccttg ctttatgagc 540

ttttccccgc aatgagccgc gttgtgtatc cataagtctt agcctacaag cgctttgagg 600

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gattagcggg aaaatttcgc ccaaaacagg gacaatggtg ttatgacagt gaacatttca 960

tatctgaccg acatggacgg cgtcctcatc aaagagggcg agatgattcc gggtgcagat 1020

cgttttcttc agtctctcac cgataacaat gtggagttta tggttttgac caacaactcc 1080

attttcaccc cgagggatct ttctgcacgt cttaagactt ccggtttgga tatcccgccg 1140

gagcgtattt ggacttctgc aaccgccact gctcacttcc tgaaatccca ggtcaaggag 1200

ggcacagcct atgttgttgg cgagtctggt ctgaccactg cgttgcatac cgcgggttgg 1260

attttgacgg atgcaaatcc tgagtttgtt gtcctgggcg aaacccgcac gtattccttc 1320

gaggcaatca ccactgctat aaatctgatt ttgggcggcg ctcgctttat ttgcaccaac 1380

ccggatgtaa caggaccttc accaagtggc attttgcctg ctactggctc tgtcgcagcg 1440

cttattaccg cagctacagg cgctgagcct tattacatcg gtaagccaaa ccctgtgatg 1500

atgcgcagtg cgctgaacac catcggggcg cattccgagc acactgtcat gatcggcgac 1560

cgcatggaca ccgacgtgaa atctggtttg gaagccggcc tgagcaccgt gctggttcga 1620

agcggaattt ccgacgacgc cgagatccgc cgctacccct tccgcccaac tcacgtgatc 1680

aattccatcg ccgatcttgc cgattgctgg gacgatcctt tcggtgacgg tgcatttcac 1740

gtaccagatg agcagcagtt cactgactag tattctgtag gtcatggcat ttgcagacat 1800

tgtgcgcagc gtcgaaaacc gcaccaacgc agcgaccctc aactggtcca tcaaaaaggg 1860

ctggaagccc gaagtcaccg gattttccgg gtacggctcc gggcgtcgag tgcgcgtcct 1920

tgcgcgcgtg ctcatgtcca accccgaaaa tttgcttgtc gacgccccct cccaatcaat 1980

tacccaacaa gcacagcgcg gttggcgcca gttcttcacc atccaagtgc ccaacctgcc 2040

agtaactgtc accgttggtg ggaaaacagt tacctcatcc accaacgaca acggctacgt 2100

tgacctcctg gtggaagacc acaaccttga ccccggctgg cacaccatcc agatccaagc 2160

cgaaggttcc acccccgccg aagcccgcgt cctcatcgtg gaaaacaccg cccgaatcgg 2220

actcatctcc gacatcgacg acaccatcat ggtcacctgg cttccccgag cactcctcgc 2280

cgcatggaac tcgtgggttt tgcacaccaa cacccgcaaa ccagtccccg gaatgaaccg 2340

cttctacgaa gaactcctca aagaccaccc cgacgcaccc gtgttctacc tctccaccgg 2400

cgcatggaac acctttgaaa ccctccaaga gttcatcaac aaacacgcat tccccgacgg 2460

ccccatgctg ctcaccgact ggggaccaac ccccacagga ctattccgct caggtcaaga 2520

gcacaagaaa gtccaactgc gcaacctgtt tatcgaatac cccgacatga aatggatcct 2580

cgtcggcgac gatggccaac acgatcccct catctacggc gaagcagtcg aagaacaccc 2640

caaccgcatc gcaggtgttg caat 2664

<210> 79

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 79

ctctgtcgac ctcagattgg tttcgcagtc 30

<210> 80

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 80

ctgattgcgc accaaaccaa gaacgtatcc aagcaggttc 40

<210> 81

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 81

ttggtttggt gcgcaatcag 20

<210> 82

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 82

ctctgtcgac tcaacggtag gaagctcag 29

<210> 83

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 83

ctctgtcgac gttcttcgaa gtggtggaac 30

<210> 84

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 84

gtgaggcagc tgacatcaaa cgttgaagcc aaggtagag 39

<210> 85

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 85

tttgatgtca gctgcctcac 20

<210> 86

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 86

ctctgtcgac tgatcacctt aaagggcgac 30

<210> 87

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 87

ctctctgcag ttgtggtaga ccttgggtg 29

<210> 88

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 88

aacaccattg tccctgtttt gg 22

<210> 89

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 89

tcgcccaaaa cagggacaat ggtgtttatt ctgtaggtca tggcatttgc 50

<210> 90

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 90

ctcttctaga attgcaacac ctgcgatgc 29

<210> 91

<211> 2185

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 91

ggaggtgctc tctcacgtaa tttccattgg tgcgtccgag ccttacgtcg gcgcggagcc 60

aacctttgca gatattcaag caatcgatga ttccccagtt cgtgcattcg gtaaagacgc 120

tgaaaaatcc atgatcgcgg aaatcgaggc cgcaaagaaa gccggcgata ccctcggtgg 180

catcgtggaa gtgattgttg aaggcctacc catcggtttg ggctcacaca tttctggcga 240

agatcgcctc gatgcgcaga tcgcagctgc actcatgggc attcaggcca tcaagggcgt 300

ggaaatcggt gacggtttcg aagaagctcg tcgacgtggc tccgaagccc acgatgaagt 360

gttcctggat gacaacggcg tataccgcaa caccaaccgt gcaggtggcc tcgaaggcgg 420

catgaccaac ggtgaaaccc tgcgcgttcg tgctggcatg aagccaattt ctactgtgcc 480

tcgcgccctg aaaaccattg atatggaaaa cggcaaggca gcaaccggaa tccaccagcg 540

ttccgacgtg tgcgctgttc cagccgccgg tgtcgttgca gaagcaatgg tcaccctggt 600

tctcgcccgc gcagtcctgc agaaattcgg cggtgactcc ctgagtgaaa ccaagagcaa 660

cattgacacc tacctcaaaa acattgagga acgaatgaaa ttcgaaggtt tagaggatgg 720

agcgtaatga agtgaatgat caaattcact tagatcatca atcagatgac acctctgaat 780

gctcctgccc gatcgtggtt cttgtgggtt tgccaggagc tggaaaatcc accattggac 840

gtcgattagc gcgcgcctta aacactgaac tcgtcgactc cgacgaactc attgagcgcg 900

ccaccggaaa agcctgcggc gccgtgttca gcgagctcgg cgagccagcc ttccgcgagc 960

tcgaggccat ccacgtggcc gaagcactga aatcctccgg agtggtgagc ttgggaggcg 1020

gatctgtgct gacagaatcc acccgtgaac tgctcaaagg ccacgacgtg gtctggatcg 1080

acgtgccagt agaagaaggc atcaggcgca ccgcaaacga gcgttcccgc cccgtgctgc 1140

aagccgccga ccccgccgag cactaccgca acctggtgaa agtgcgcacc ccgttgtacg 1200

aagaggtggc aacctaccga cttcgcacca acaaccgcag cccccagcaa gtggtggcag 1260

cagtgttgca tcatctagaa atcgattaat taaaccgggc acctgattaa cattgggctg 1320

cccggtttct tcctattaca agcgaaaggc aacgtgcccc atgagcgcag cgcagatttt 1380

caacaccgtc cacgtcaatg gatcttcccc ctatgatgtc cacattggtt ccggcctcaa 1440

cgagctcatt gttcagcgcg cagcggaatc aggcgcggag caggtagcga ttttgcacca 1500

gcccagcatg gatgacattg catccgagtt ggatgcagca ctagtcgctg ctggtttgaa 1560

ggtcctgcac cttaatgttc ccgatgcgga aaacggcaag tccttggaag tagcggggca 1620

gtgctgggat gaattgggtg gcgcagcatt cggccgccgc gatatcgtca tcggacttgg 1680

tggcggtgct gccacagatc tcgcgggatt cgtcgctgct gcgtggatgc gtggcgtgcg 1740

cgtcattcag gttccaacca ccttgttggc catggtggac gctgcggtgg gcggcaagac 1800

tggcatcaat accgccgcag gcaagaacct tgtgggcgcg ttccacgagc ctgacgcagt 1860

attcattgac accgaacgcc tagccaccct gcctgacgcg gaaatcatcg cgggatccgc 1920

cgaaatcatc aaaactggtt tcatcgccga cccagaaatc ctgcgccttt acgaaactga 1980

tcccgcagcc tgcctgaaga aagaagtcga aggctcccac ctacctgaac tgatttggcg 2040

ctccgtcacc gtcaagggct ccgtggtcgg ccaagacctc aaagaatcta gcctgcgcga 2100

aatcctcaac tacggacaca cctttgccca cgccgtcgaa ctccgcgaaa acttccgctg 2160

gcgccacggc aatgccgttg cagtg 2185

<210> 92

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 92

aggcatgcgg aggtgctctc tcacgtaa 28

<210> 93

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 93

tcccccgggc gagcactacc gcaacct 27

<210> 94

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 94

tcccccgggc cggaggattt cagtgctt 28

<210> 95

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 95

aggcatgcca ctgcaacggc attgccgt 28

Claims

1.一种谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)转化体，实施了下述(A)、(B)、(C)及(D)的操作而得：

(A)3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合成酶活性的强化，

(C)与磷酸烯醇丙酮酸-糖磷酸转移酶系统不同的糖转运体介导的糖向细胞内的摄取活性及葡萄糖激酶活性的强化，

(D)甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性的强化。

2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌转化体，其中，二羟丙酮磷酸的磷酸酶活性消失、阻遏或减少。

3.根据权利要求1或2所述的谷氨酸棒状杆菌转化体，其中，3-脱氢奎宁酸合成酶活性、3-脱氢奎宁酸脱水酶活性及莽草酸脱氢酶活性中的任意一种以上得到强化。

4.根据权利要求1或2所述的谷氨酸棒状杆菌转化体，其中，转酮醇酶活性及转醛醇酶活性中的任意一种以上得到强化。

5.根据权利要求1或2所述的谷氨酸棒状杆菌转化体，其中，莽草酸激酶活性、奎宁酸/莽草酸脱氢酶活性及3-脱氢莽草酸脱水酶活性中的任意一种以上消失、阻遏或减少。

6.根据权利要求1或2所述的谷氨酸棒状杆菌转化体，其具有葡萄糖和选自由木糖、阿拉伯糖及纤维二糖组成的组中的至少1种糖的利用能力。

7.根据权利要求1或2所述的谷氨酸棒状杆菌转化体，其中，通过导入由序列号1中记载的碱基序列组成的DNA，3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶活性得到强化。

8.根据权利要求1或2所述的谷氨酸棒状杆菌转化体，其中，通过使编码磷酸烯醇丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)的构成因子的基因中、编码组氨酸-可磷酸化蛋白(Histidine-phosphorylatable protein：HPr)的ptsH、编码酶I(EnzymeI)的ptsI及编码葡萄糖特异性酶II(Enzyme II)的ptsG基因中的一种以上破坏、缺失或突变，从而PTS介导的糖向细胞内的摄取消失、阻遏或减少。

9.根据权利要求1或2所述的谷氨酸棒状杆菌转化体，其中，与磷酸烯醇丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)不同的糖转运体为肌醇转运体。

10.根据权利要求9所述的谷氨酸棒状杆菌转化体，其中，通过导入由序列号2中记载的碱基序列组成的DNA，肌醇转运体介导的糖向细胞内的摄取活性得到强化。

11.根据权利要求1或2所述的谷氨酸棒状杆菌转化体，其中，通过导入由序列号3、4或5中记载的碱基序列组成的DNA，葡萄糖激酶活性得到强化。

12.根据权利要求1或2所述的谷氨酸棒状杆菌转化体，其中，通过导入由序列号6中记载的碱基序列组成的DNA，甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性得到强化。

13.根据权利要求3所述的谷氨酸棒状杆菌转化体，其中，3-脱氢奎宁酸合成酶活性的强化是通过由序列号7中记载的碱基序列组成的DNA的导入而实现的，3-脱氢奎宁酸脱水酶活性的强化是通过由序列号8中记载的碱基序列组成的DNA的导入而实现的，莽草酸脱氢酶活性的强化是通过由序列号9中记载的碱基序列组成的DNA的导入而实现的。

14.根据权利要求4所述的谷氨酸棒状杆菌转化体，其中，转酮醇酶活性的强化是通过由序列号10中记载的碱基序列组成的DNA的导入而实现的，转醛醇酶活性的强化通过由序列号11中记载的碱基序列组成的DNA的导入而实现的。

15.根据权利要求1或2所述的谷氨酸棒状杆菌转化体，其中，对谷氨酸棒状杆菌R、ATCC13032或ATCC13869实施了上述操作，所述谷氨酸棒状杆菌R的保藏编号为FERM BP-18976。

16.一种谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)SKM7，其保藏编号为NITEBP-01903。

17.一种有机化合物的制造方法，其包含下述工序：

在含有糖类的反应液中、在有氧且谷氨酸棒状杆菌转化体不增殖的条件下培养权利要求1、2或16所述的谷氨酸棒状杆菌转化体的工序，以及

回收反应液中的选自由莽草酸、3-脱氢莽草酸、3-脱氢奎宁酸、原儿茶酸、分支酸、没食子酸(gallic acid)、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、邻氨基苯甲酸、对羟基苯甲酸、对氨基苯甲酸、苯酚及邻苯二酚组成的组中的至少1种有机化合物的工序。