KR20130080944A - 퀴놀린산을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 퀴놀린산의 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 L-아스파르트산 산화효소 및 퀴놀린산 신타아제가 링커를 통하여 연결된 융합단백질을 발현하는 퀴놀린산을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용하여 퀴놀린산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

퀴놀린산을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 퀴놀린산의 생산 방법{Recombinant microorganism producing quinolinic acid and method of producing quinolinic acid using the same}
본 발명은 퀴놀린산을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용하여 퀴놀린산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
퀴놀린산 (quinolinic acid)은 2,3-피리딘-디카복실산 (2,3-Pyridine- dicarboxilic acid)으로 불리우며 의학용, 농업용 화학 물질, 염색 물질 등 매우 다양한 분야에서 사용되는 화학합성물의 전구체로 이용된다.
상기 퀴놀린산은 화학적 또는 생물학적 합성 방법을 통하여 제조될 수 있다. 화학적 합성 방법은 석유 유래의 재생불가능한 (non-renewable) 재료를 원료로 사용하기 때문에 환경적인 문제나 유가 또는 석유 추출 단가에 많은 영향을 받는 문제점을 가지고 있다.
생물학적 합성 방법의 대표적인 예로는, 퀴놀린산 포스포리보실트란스퍼라제의 활성이 제거된 대장균에 L-아스파르트산 산화효소 (NadB), 퀴놀린산 신타아제 (NadA)를 암호화하는 유전자를 각각 다른 카피 수를 가지는 플라스미드에 클로닝하여 상기 두 가지 효소의 발현이 강화된 대장균 균주에서 퀴놀린산을 생산하는 방법이 개시된 바 있다(Eur. J. Biochem. 175,221 -228 (1988), DE3826041). 이때, 퀴놀린산의 농도는 500 mg/L 이하로 매우 낮은 수준이었다. 이렇게 낮은 농도로 퀴놀린산이 생성되는 첫 번째 원인은 L-아스파르트산 산화효소를 코딩하는 nadB와 퀴놀린산 신타아제를 코딩하는 nadA 유전자의 NAD 관련 전사단계 저해인자인 NadR에 의한 전사단계 발현 조절 저해이며, 두 번째 원인은 L-아스파르트산 산화효소인 NadB 단백질의 NAD에 의한 피드백 저해이며, 세 번째 원인은 사용된 대장균 자체가 탄소원으로부터 L-아스파르트산까지의 생합성 경로가 약한 것에 기인한다.
첫 번째 원인을 해결하고자, 대한민국 출원특허 제2011-004093호에서 전사단계에서의 저해를 받는 퀴놀린산 생합성 유전자인 L-아스파르트산 산화효소 (NadB)와 퀴놀린산 신타아제 (NadA)의 프로모터 부분을 항시발현 프로모터 (constitutive promoter)로 변경하고, L-아스파르트산 생합성 경로가 강화된 미생물 균주를 이용하여 퀴놀린산의 생산을 5.5 g/L까지 증가시키는 시도를 하였다.
생물학적 합성 방법에 의한 L-아스파르트산으로부터 퀴놀린산으로 생합성하는 경로는 아래와 같다.
1) L-아스파르트산 산화효소 (NadB)
L-아스파르트산 + 산소 <=> 과산화수소 + α-이미노숙시네이트 + H+
2) 퀴놀린산 신타아제 (NadA)
α-이미노숙시네이트 + 디히드록시아세톤 포스페이트 <=> 퀴놀린산 + 포스페이트 + 2H2O
상기의 퀴놀린산 생합성 경로 중 중간대사 산물인 α-이미노숙시네이트는 불안정한 물질로 세포 내에서 자연적인 탈아미노 반응에 의하여 옥살로아세트산으로 변형되는 특성을 지닌다(THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 257, No. 2, Issue of January 25. pp. 626-632, 1982). 일반적으로 불안정한 중간대사산물이 기질로 이용될 경우, 상기 기질과 효소의 접촉 확률이 높지 않으면 많은 양의 부산물이 생성되는 양상을 나타낸다. 그러나, 퀴놀린산의 생산과 관련하여 상기 문제점을 해결하고자 하는 노력은 현재까지 없었다.
한편, 이종의 효소나 단백질이 아미노산 링커로 연결되어 하나의 단백질로 발현되도록 하는 융합단백질 기술은 발현량이 적은 단백질을 발현량이 많은 단백질과 연결시켜 상기 단백질의 발현량을 증가시키거나, 태그 (Tag)와 연결된 융합단백질로 제작하여 단백질 정제 수율을 높이는 등 여러 가지 목적에 사용되고 있다.
이러한 융합단백질의 제작에 있어서는 링커의 디자인이 중요한 것으로 알려져 있다. 일반적으로, 링커는 알파-헬릭스 (alpha-helix) 구조를 가지는 나선형 (Helical) 링커나 구조적으로 유동성 (flexibility)을 가지는 유동형 (flexible) 링커가 많이 사용되며, 구현하고자하는 융합단백질의 특성에 따라 상기의 두 링커를 복합하여 사용하는 등 매우 다양하게 디자인되어 사용된다(Cancer Res 2005; 65: (16). August 15, 2005).
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 NadB와 NadA가 다양한 형태의 아미노산 링커에 의해 연결된 융합단백질을 발현하도록 함으로써 불안정한 대사산물에 의한 반응 저하를 해결하고자 시도하였고, 상기 융합단백질의 발현에 의하여 퀴놀린산을기존의 생물학적 생산 방법에 비하여 고수율로 생산할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 L-아스파르트산 산화효소 (L-aspartate oxidase) 및 퀴놀린산 신타아제 (Quinolinate synthase)가 링커를 통하여 연결된 융합단백질을 발현하는 퀴놀린산을 생산하는 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계 및 상기 배양과정에서 생산된 퀴놀린산을 수득하는 단계를 포함하는 퀴놀린산의 생산방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 L-아스파르트산 산화효소 (L-aspartate oxidase) 및 퀴놀린산 신타아제 (Quinolinate synthase)가 링커를 통하여 연결된 융합단백질을 발현하는 퀴놀린산을 생산하는 재조합 미생물을 제공한다.
상기 L-아스파르트산 산화효소 (이하, 'NadB')는 L-아스파르트산을 이미노숙신산으로 산화시키는 활성을 가지는 효소로서, 서열번호 42로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 높은 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
[L-아스파르트산 산화효소의 활성]
L-아스파르트산 + 푸마레이트 <=> α-이미노숙시네이트 + 숙시네이트 + H+, 또는
L-아스파르트산 + 산소 <=> 과산화수소 + α-이미노숙시네이트 + H+
상기 효소를 코딩하는 유전자 nadB의 서열은 문헌 (Mol Syst Biol. 2006;2:2006.0007. Epub 2006 Feb 21)에 공개된 대장균 (Escherichia coli)의 게놈 서열 (gi: GI:89109380)이나 미국생물공학정보센터 (NCBI) 및 일본 DNA 데이터 뱅크 (DDBJ)와 같은 데이터베이스로부터 얻을 수 있다.
상기 퀴놀린산 신타아제 (이하, 'NadA')는 이미노숙신산으로부터 퀴놀린산을 합성하는 활성을 가지는 효소로서, 서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 높은 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
[퀴놀린산 신타아제의 활성]
α-이미노숙시네이트 + 디히드록시아세톤 포스페이트 <=> 퀴놀린산 + 포스페이트 + 2H2O
상기 효소를 코딩하는 유전자 nadA의 서열은 문헌 (Mol Syst Biol. 2006;2:2006.0007. Epub 2006 Feb 21)에 공개된 대장균의 게놈 서열(gi: GI:89109380)이나 NCBI 및 DDBJ와 같은 데이터베이스로부터 얻을 수 있다.
상기 NadB 및 NadA의 활성을 강화할 경우, 세포 내에 퀴놀린산의 전구 물질인 α-이미노숙시네이트의 축적과 α-이미노숙시네이트에서 퀴놀린산으로의 생합성이 증가되어 퀴놀린산의 생산이 증가 될 수 있다. 그러나, 상기 α-이미노숙시네이트는 불안정한 대사산물이기 때문에 상기 두 효소 (NadB 및 NadA)의 활성과 발현량이 증가하더라도 α-이미노숙시네이트와 NadA의 접촉 확률이 높지 않으면 많은 양의 부산물이 생성되는 양상을 나타내며, 이에 따라 결국 기대한 바와 같이 퀴놀린산을 효율적으로 생산할 수 없게 된다. 이러한 문제점의 해결을 위하여, 본 발명에서는 링커를 통하여 서로 연결된 융합단백질의 형태로 NadB 및 NadA를 균주에서 발현하도록 함으로써 높은 수율로 퀴놀린산을 생산할 수 있다.
상기 NadB 및 NadA는 서열번호 42 및 43으로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 미생물의 종 또는 균주에 따라 상기 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열에 차이가 존재하는 경우가 있기 때문에, 이에 한정되지 않는다. 즉,상기 NadB 및 NadA는 링커에 의해 연결된 융합단백질의 형태로 제공되어 퀴놀린산 생산성 증가에 도움이 될 수 있는 단백질인 한, 서열번호 42 및 43의 아미노산 서열의 하나 이상의 위치에서 1개 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 첨가 등에 의하여 변이된 아미노산 서열을 갖는 돌연변이체, 또는 인위적인 변형체일 수 있다. 여기에서, '수개'란, 단백질의 아미노산 잔기의 입체 구조에 있어서의 위치나 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 2 내지 20개, 바람직하게는 2 내지 10개, 보다 바람직하게는 2 내지 5개일 수 있다. 또한, 이러한 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위 등에는 상기 폴리펩티드를 발현하는 미생물의 개체 또는 종의 차이에 근거하는 경우 등의 천연적으로 생기는 돌연변이 또는 인위적인 변이 (variant)에 의해서 발생하는 것도 포함될 수 있다.
상기 NadB 및 NadA 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 상기 반응식에 나타난 NadB 및 NadA 효소의 활성을 갖는 한, 각각 서열번호 42 및 43의 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 가장 바람직하게는 각각 서열번호 27 및 서열번호 28로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
본 발명에서, 용어 "상동성"이란 두 아미노산 서열 간의 동일성을 나타내는 것으로, 점수 (score), 동일성 (identity), 유사도 (similarity) 등의 매개 변수 (parameter)들을 계산하는 BLAST 2.0을 이용하는 등 당업자에게 널러 알려진 방법으로 결정될 수 있다.
상기 NadB 및 NadA 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 27 및 서열번호 28의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 상기 폴리뉴클레오티드 서열로부터 제조된 프로브와 '엄격한 조건'에서 혼성화될 수 있으며, 정상적으로 기능하는 단백질을 암호화하는 변이형일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "엄격한 조건 (stringent conditions)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. Molecular Cloning (A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989) 또는 Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York)에 구체적으로 기재되어 있으며, 예컨대, 65℃의 혼성화 완충액 (3.5 × SSC, 0.02% Ficoll, 0.02% 폴리비닐피롤리돈, 0.02% 소 혈청 알부민, 2.5　mM NaH2PO4 (pH 7), 0.5% SDS, 2　mM EDTA)에서의 혼성화를 기재하고 있다. SSC는 pH 7의 0.15　M 염화나트륨/0.15　M 시트르산나트륨이다. 혼성화 후, DNA가 전달되어 있는 멤브레인을 실온에서 2 × SSC로 세척하고 나서, 68℃의 온도에서 0.1 내지 0.5 × SSC/0.1 × SDS로 세척한다.
본 발명의 융합단백질은 서로 다른 활성을 나타내는 L-아스파르트산 산화효소와 퀴놀린산 신타아제가 아미노산 링커를 통하여 서로 연결된 폴리펩티드로서, 하기 반응식에 나타낸 바와 같이 L-아스파르트산으로부터 퀴놀린산을 생합성하는 활성을 갖는다.
[융합단백질의 활성]
L-아스파르트산 + 산소 + 디히드록시아세톤 포스페이트 <=> 퀴놀린산 + 포스페이트 + 2H2O + 과산화수소
상기 융합단백질의 활성을 강화할 경우, 반응 중간 대사산물인 α-이미노숙시네이트로부터 퀴놀린산으로의 전환 속도가 향상됨으로써, NadB 및 NadA의 활성을 독립적으로 강화한 경우보다 더욱 높은 생산성으로 퀴놀린산을 생산할 수 있다.
상기 융합단백질은 L-아스파르트산 산화효소의 N 말단과 퀴놀린산 신타아제의 C 말단이 링커를 통하여 연결된 폴리펩티드, 또는 L-아스파르트산 산화효소의 C 말단과 퀴놀린산 신타아제의 N 말단이 링커를 통하여 연결된 폴리펩티드일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 47, 48, 49, 50, 51, 52 및 53으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 링커는 NadB 및 NadA 폴리펩티드의 사이, 또는 이를 암호화하는 유전자 사이에 위치하며, 나선형 링커 또는 유동형 링커일 수 있다. 또한, 상기 링커로서 나선형 링커 또는 유동형 링커가 단독 또는 복합적으로 이용될 수 있으며, 상기 나선형 링커로서 "EAAAK" 또는 "EAAAR"이 사용될 수 있으며, 유동형 링커로서 "GGSGGS", "GGGS", "GGSG" 또는 "GS"가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 링커는 5 내지 30개의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 나선형 링커 또는 유동형 링커를 단독으로 또는 반복적으로 연결하여 사용할 수 있다.
바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 나선형 링커를 포함하는 링커는 LA(EAAAK)nAAA 일 수 있으며, 상기 유동형 링커를 포함하는 링커는 L(GGGS)nAAA 일 수 있다. 바람직하게, 상기 n은 1 내지 5의 정수일 수 있다.
바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 링커는 서열번호 54, 55, 56, 57, 58, 59 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이와 높은 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 "퀴놀린산을 생산하는 재조합 미생물"은 배지 중의 탄소원으로부터 퀴놀린산을 생산하여 축적시킬 수 있는 미생물로서, L-아스파르트산 산화효소 및 퀴놀린산 신타아제가 링커를 통하여 연결된 융합단백질을 발현함으로써 높은 생산성으로 퀴놀린산을 생산할 수 있다.
본 발명의 재조합 미생물은 상기 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 도입시킴으로써 융합단백질을 발현하도록 제작할 수 있다.
바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 미생물은 상기 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환하여 제작할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "형질전환"이란 유전자를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미하며, 형질전환된 유전자는 숙주세포 내에서 발현될 수 있으면 숙주세포의 염색체 내 삽입 또는 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 제한하지 않고 포함된다. 또한, 상기 유전자는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 유전자는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터, 전사종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
상기 재조합 벡터는 본 발명의 융합단백질을 발현하는 미생물을 만들기 위하여 숙주세포에 DNA를 도입하여 융합단백질을 발현시키기 위한 수단으로서, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 등 공지의 발현벡터를 사용할 수 있으며, 벡터는 DNA 재조합 기술을 이용한 임의의 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다.
바람직하게, 상기 재조합 벡터는 도 2에 도시된 개열지도를 갖는 pNBHL1A, pNBHL2A, pNBHL3A, pNBHL4A, pNBHL5A, pNBFL3A 또는 pNBFL4A 플라스미드 벡터일 수 있으며, 보다 바람직하게 상기 플라스미드 벡터는 각각 서열번호 34, 35, 36, 37, 38, 39 및 40의 염기서열을 포함할 수 있다.
바람직한 일 구현예에 따르면, 퀴놀린산을 생산하는 미생물은 엔테로박터 (Enterbacter) 속, 에스케리시아 (Escherichia) 속, 어위니아 (Erwinia) 속, 세라티아 (Serratia) 속, 프로비덴시아 (Providencia) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움 (Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 일 수 있으며, 바람직하게는 에스케리시아 (Escherichia) 속에 속하는 미생물, 보다 바람직하게는 대장균일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 미생물은 추가적으로 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제 (NadC)의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화될 수 있다. 여기서, "내재적 활성"이란 미생물이 천연의 상태로 가지고 있는 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제의 활성 상태를 의미한다.
상기 NadC는 퀴놀린산을 니코틴산 모노뉴클레오티드로 전환시키는 활성을 가지며, 서열번호 44 또는 이와 높은 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 효소를 코딩하는 유전자 nadC의 서열은 문헌 (Mol Syst Biol. 2006;2:2006.0007. Epub 2006 Feb 21.)에 공개된 대장균의 게놈 서열 (GI:89106990) 또는 NCBI, DDBJ와 같은 데이터베이스로부터 얻을 수 있다.
[퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제의 활성]
5-포스포-α-D-리보오스 1-디포스페이트 + 퀴놀린산 + 2H+ <=> CO2 + 다이포스페이트 + 니코틴네이트 모노뉴클레오티드
상기 NadC의 활성을 약화시킴으로써 세포 내에 퀴놀린산의 축적을 증가시킬 수 있다. 상기 효소의 활성 약화는 상기 효소를 암호화하는 유전자의 일부 또는 전체의 결실, 2) 상기 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절 서열의 변형 (예컨대, 상기 유전자의 프로모터를 내재적 프로모터보다 약한 프로모터로 교체하는 방법), 3) 상기 효소의 활성이 약화되도록 염색체 상의 상기 유전자 서열의 변형 및 4) 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의하여 수행될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 상동성 재조합 (Homologous recombination)에 의해 nadC를 미생물의 유전체로부터 제거하였다.
또한, 본 발명의 미생물은 추가적으로 포스포에놀파이루베이트에서 L-아스파르트산으로의 생합성 경로를 강화하기 위하여, 포스포에놀파이루베이트 카복실라제, L-아스파르트산 아미노트랜스퍼라제 및 본 발명의 융합단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 활성이 강화될 수 있다.
상기 포스포에놀파이루베이트 카복실라제 (PPC) 및 L-아스파르트산 아미노트랜스퍼라제 (AspC)는 포스포에놀파이루베이트로부터 L-아스파르트산을 합성하는 활성을 가지며, 각각 서열번호 45 및 46으로 표시되는 아미노산 서열, 또는 이와 높은 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 효소를 코딩하는 유전자 ppc, aspC의 서열은 문헌 (Mol Syst Biol. 2006;2:2006.0007. Epub 2006 Feb 21.)에 공개된 대장균의 게놈 서열 (gi: GI:89110074, GI:89107778)이나 NCBI, DDBJ와 같은 데이터베이스로부터 얻을 수 있다.
[포스포에놀파이루베이트 카복실라제 활성]
포스포에놀파이루베이트 + CO2 → 옥살로아세트산 + 포스페이트
[L-아스파르트산 아미노트랜스퍼라제 활성]
옥살로아세트산 + 글루타민산 <=> L-아스파르트산 + 2-케토글루타민산
따라서, PPC 및 AspC의 활성을 강화할 경우, 세포 내에 퀴놀린산의 전구체인 L-아스파르트산의 생산을 증가시킬 수 있으며, 이에 의하여 퀴놀린산의 생산을 증가시킬 수 있다.
상기 효소의 활성 강화는 1) 상기 효소를 암호화하는 유전자의 카피 수 증가, 2) 상기 유전자의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형, 3) 상기 효소의 활성이 강화되도록 염색체 상의 상기 유전자 서열의 변형 및 4) 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의하여 수행될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 제작하고, 이를 퀴놀린산을 생산하는 미생물에 도입하여 상기 유전자의 카피 수를 증가시킴으로써 활성 강화를 유도하였다.
상기 융합단백질의 활성을 강화하기 위하여, 상기 융합단백질을 암호화하는 유전자의 내재적 프로모터를 활성이 증가된 프로모터로 치환하거나, 프로모터의 활성이 증가하도록 프로모터에 변이를 유발하거나, 또는 상기 유전자 카피 수를 증가시키는 등의 방법이 사용될 수 있다. 상기 활성이 증가된 프로모터로는 일반적으로 pTac, pTrc, pPro, pR, pL, pCJ1, pCysK 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, nadB 및 nadA의 프로모터 부분을 항시 발현 프로모터인 pPro (서열번호 32)로 치환하여 세포 내 NAD 농도에 의해 nadB 및 nadA의 발현을 저해시키는 전사단계 저해인자인 NadR에 의한 저해를 받지 않는 항시 발현 형태의 nadB 및 nadA 유전자를 플라스미드 형태로 제작하고, 균주에 도입하여 아스파르트산 산화효소 및 퀴놀린산 신타아제의 과발현을 유도하였다. 또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서는, NadB-L-NadA를 코딩하는 유전자의 프로모터 부분을 pPro 프로모터로 치환하여 NadB-L-NadA의 과발현을 유도하였다. 이때, pPro 프로모터는 세포 내의 조절을 해제하고, 발현을 강화하기 위한 일례로서, 본 발명에 사용하는 프로모터는 위에 한정하지 아니한다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) L-아스파르트산 산화효소 (L-aspartate oxidase) 및 퀴놀린산 신타아제 (Quinolinate synthase)가 링커를 통하여 연결된 융합단백질을 발현하는 재조합 미생물을 탄소원을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양과정에서 생산된 퀴놀린산을 수득하는 단계를 포함하는 퀴놀린산의 생산방법을 제공한다.
상기 재조합 미생물의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다.　 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 미생물에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.　 배양 방법은 회분식, 연속식 및 유가식 배양을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 미생물의 다양한 배양 방법이 예를 들어 "Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176에 개시되어 있다.
배양에 사용되는 배지는 특정한 미생물의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다.　다양한 미생물의 배지는 예를 들어 문헌 ("Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., 미국, 1981)에 개시되어 있다.　 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다.　
미생물 배양용 배지에 이용가능한 탄소원은 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리셀롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 탄소원은 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있다.　
미생물 배양용 배지에 이용가능한 질소원은 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액 (CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 질소원은 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있다.
미생물 배양용 배지는 인의 공급원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염을 포함할 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다.　 이 외에, 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다.　 미생물 배양용 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다.　 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.　 배양액의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양액 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있다.　 배양액의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃일 수 있다.　배양기간은 원하는 퀴놀린산의 생성량이 얻어질 때까지 지속될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 160 시간일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 다양한 링커로 연결된 NadB-L-NadA 융합단백질을 코딩하는 유전자의 발현 플라스미드로 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제의 활성이 제거된 W3110△nadC 균주를 형질전환시킨 후, 이들 균주의 아스파르트산으로부터 퀴놀린산으로의 생합성능을 확인하였다. 그 결과, L-아스파르트산 산화효소와 퀴놀린산 신타아제가 하나의 융합단백질로 발현된 경우에 이들 효소를 각각 단독으로 발현된 경우보다 더 높은 수율로 퀴놀린산을 생산할 수 있음을 확인하였다(표 2).
또한, 포스포에놀파이루베이트 카복실라제와 L-아스파르트산 아미노트랜스퍼라제의 활성이 강화되고, 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제의 활성이 제거된 대장균을 상기 융합단백질을 코딩하는 유전자의 발현 플라스미드로 형질전환시킨 후, 이들 균주 CV01-0600, CV01-0601, CV01-0602, CV01-0603, CV01-0604, CV01-0605, CV01-0606 및 CV01-0607의 퀴놀린산 생산능을 확인하였다. 그 결과, L-아스파르트산 산화효소와 퀴놀린산 신타아제 융합단백질의 발현에 의하여 높은 수율로 퀴놀린산을 생산할 수 있었으며, 융합단백질 형태로의 발현과 함께 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제의 활성 제거 및 포스포에놀파이루베이트 카복실라제, L-아스파르트산 아미노트랜스퍼라제의 발현 강화의 조합을 통하여 기존의 균주보다 더 높은 효율로 퀴놀린산을 생산할 수 있음을 확인하였다(표 5).
상기 퀴놀린산 생산 균주인 대장균 CV01-0604 및 CV01-0605를 부다페스트 조약 하에 서울 서대문구 홍제1동 소재의 한국미생물보존센터 (Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2011년 12월 21일자로 기탁하여, 수탁번호 KCCM11235P 및 KCCM11236P를 부여받았다.
본 발명에 의하면 L-아스파르트산 산화효소와 퀴놀린산 신타아제가 링커를 통하여 연결된 융합단백질을 발현하는 미생물을 제공함으로써, 기존의 생물학적 생산공정에서의 문제점인 α-이미노숙시네이트의 자연적인 분해 반응을 최소화할 수 있으며, 이를 통하여 높은 생산성으로 퀴놀린산을 생산할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 L-아스파르트산 산화효소와 퀴놀린산 신타아제 융합단백질의 구조를 보여준다.
도 2는 pPro-NBA, pNBHL1A, pNBHL2A, pNBHL3A, pNBHL4A, pNBHL5A, pNBFL3A, pNBFL4A 플라스미드의 구조를 보여준다.
도 3은 포스포에놀파이루베이트 카복실라제, L-아스파르트산 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자의 발현 플라스미드인 pCPA의 구조를 보여준다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 퀴놀린산 생산용 균주 제작
<1-1> L-아스파르트산 산화효소 발현용 플라스미드 제작
대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, L-아스파르트산 산화효소를 코딩하는 유전자 nadB를 수득하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행 (NIH GenBank)으로부터 서열번호 27의 nadB 유전자의 염기서열 (NCBI 등록번호 "GI:89109380")을 수득하고, 이에 근거하여 nadB 유전자의 ATG 부분과 TAA를 함유하는 ORF 부분을 증폭할 수 있고 제한효소 인식부위 NdeI과 BamHI를 갖는 서열번호 1 및 2의 프라이머를 합성하였다.
대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 1과 2의 올리고뉴클레오티드를 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였고, PCR은 96℃에서 30초 변성, 50℃에서 30초 어닐링 및 72℃에서 2분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다. 이에 의하여, nadB 유전자와 제한효소 NdeI 및 BamHI의 인식부위를 함유한 약 1.9 kb의 증폭된 유전자를 수득하였다.
상기 PCR을 통하여 수득된 nadB 유전자를 제한효소 NdeI 및 BamHI으로 처리하고, 제한효소 NdeI 및 BamHI로 처리한 pProLar (CloneTech) 벡터에 접합 (ligation)을 통하여 클로닝하고, 최종적으로 항시 발현 프로모터인 pPro 프로모터에 의해 발현 조절을 받는 nadB 유전자가 클로닝된 pPro-nadB 재조합 벡터를 제작하였다.
<1-2> L-아스파르트산 산화효소 및 퀴놀린산 신타아제 발현용 플라스미드 제작
대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, 퀴놀린산 신타아제를 코딩하는 유전자 nadA를 수득하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행 (NIH GenBank)으로부터 서열번호 28의 nadA 유전자의 염기서열 정보 (NCBI 등록번호 "GI:89107601")를 수득하고, 이에 근거하여 nadA 유전자의 ATG 부분과 TAA를 함유하는 ORF 부분을 증폭할 수 있고, 제한효소 ApaI 및 NotI의 인식부위를 갖는 서열번호 3 및 4의 프라이머를 합성하였다.
대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 상기 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드를 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하고, PCR은 96℃에서 30초 변성, 50℃에서 30초 어닐링 및 72℃에서 2분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다. 이에 의하여, nadA 유전자와 제한효소 ApaI과 NotI의 인식부위를 함유한 약 1.0 kb의 증폭된 유전자를 획득하였다.
또한, pProLar (CloneTech) 벡터의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, Pro 프로모터를 수득하였다. CloneTech사로부터 Pro 프로모터의 염기서열 정보 (서열번호 32)를 수득하고, 이에 근거하여 pPro 프로모터와 상기에 증폭된 nadA유전자를 접합시키기 위해 제한효소 BamHI과 ApaI의 인식부위를 갖는 서열번호 5 및 6의 프라이머를 합성하였다.
대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 상기 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드를 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 96℃에서 30초 변성, 50℃에서 30초 어닐링 및 72℃에서 1분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하였다. 이에 의하여, pPro 프로모터와 제한효소 BamHI과 ApaI를 함유한 약 0.135 kb의 증폭된 유전자를 획득하였다.
상기 PCR을 통하여 획득한 nadA 유전자를 제한효소 ApaI 및 NotI으로 처리하고, 증폭된 pPro 프로모터 절편을 ApaI 및 BamHI으로 처리하였다. 제한효소로 처리한 nadA 및 pPro 프로모터 절편을 제한효소 NotI 및 BamHI으로 처리한 상기 <실시예 1-1>에서 수득된 pPro-nadB 벡터에 접합을 통하여 클로닝하고, 최종적으로 항시 발현 프로모터인 pPro 프로모터에 의해 발현 조절을 받는 nadB 유전자와 pPro 프로모터에 의해 발현 조절을 받는 nadA 유전자가 클로닝된 5.7 Kb의 pPro-NBA 재조합 벡터를 제작하였다. 제작된 pPro-NBA는 서열번호 33의 서열을 갖는다. 도 2는 L-아스파르트산 산화효소 및 퀴놀린산 신타아제를 코딩하는 유전자의 발현 플라스미드인 pPro-NBA의 구조를 보여준다.
<1-3> NadB -L- NadA 발현용 플라스미드 제작
링커를 포함한 NadB-L-NadA 발현 플라스미드의 제작을 위하여, 상기의 <실시예 1-2>에서 제작된 pPro-NBA (서열번호 33)을 주형으로 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드를 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 96℃에서 30초 변성, 50℃에서 30초 어닐링 및 72℃에서 2분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하였다. 이에 의하여, pPro 프로모터와 제한효소 XhoI 및 nadB 유전자 말단에 링커를 함유한 약 1.8 kb의 증폭된 유전자를 획득하였다.
또한, 상기의 제한효소 XhoI을 가지며 pPro 프로모터와 nadB 유전자 말단에 링커를 함유한 약 1.8 kb의 증폭된 유전자 말단과 상동성 부분을 가지며 nadA 유전자 말단에 제한효소 NotI을 함유한 nadA 유전자 절편의 증폭을 위하여, pPro-NBA을 주형으로 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드를 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 96℃에서 30초 변성, 50℃에서 30초 어닐링 및 72℃에서 2분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하였다. 이에 의하여, 링커와 상동성에 의한 접합이 가능하며 nadA 유전자 말단에 제한효소 NotI을 함유한 약 1.1 kb의 증폭된 유전자를 획득하였다.
상기에서 제작된「pPro 프로모터, 제한효소 XhoI 및 nadB 유전자 말단에 링커를 함유한 약 1.8 kb의 증폭된 유전자」와 「상기 약 1.8 kb의 증폭된 유전자의 말단과 상동한 부분을 가지며, nadA 유전자 말단에 제한효소 NotI을 함유한 nadA 유전자 절편」을 혼합하여 접합 (Sewing) PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 96℃에서 60초 변성, 50℃에서 60초 어닐링 및 72℃에서 1분의 신장으로 구성된 사이클을 10회 반복한 후, PCR 반응액에 서열번호 7 및 16의 올리고뉴클레오티드를 첨가하여 PCR을 추가 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 96℃에서 30초 변성, 50℃에서 30초 어닐링 및 72℃에서 3분의 신장으로 구성된 사이클을 20회 반복하였다. 이에 의하여, "제한효소 XhoI_pPro 프로모터_nadB_링커_nadA_제한효소 NotI"을 함유한 약 2.9 kb의 증폭된 융합단백질 유전자를 획득하였다.
상기 PCR을 통하여 획득한 "제한효소 XhoI_pPro 프로모터_nadB_링커_nadA_제한효소 NotI" 유전자 절편을 제한효소 XhoI 및 NotI으로 처리하였다. 제한효소로 처리한 "pPro 프로모터_nadB_링커_nadA 유전자 절편"을 제한효소 XhoI 및 NotI으로 처리한 pProLar (CloneTech) 벡터에 접합을 통하여 클로닝하고, 최종적으로 항시 발현 프로모터인 pPro 프로모터에 의해 발현 조절을 받고 nadB 유전자와 nadA 유전자가 링커를 통하여 단일 융합단백질로 클로닝된 pNBHL1A 재조합 벡터를 제작하였다. 본 실시예에서 사용한 링커는 5 내지 30개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 각각 서열번호 54, 55, 56, 57, 58, 59 및 60으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
링커를 함유한 서열번호 8번 올리고뉴클레오티드를 서열번호 9, 10, 11, 12, 13, 14번 올리고뉴클레오티드로 변경하여 nadB 유전자 절편을 증폭하는 방법으로 다양한 링커를 함유한 pPro 프로모터와 nadB 유전자 말단에 링커를 함유한 유전자를 증폭하고, 상기와 동일한 방법을 사용하여 pNBHL2A, pNBHL3A, pNBHL4A, pNBHL5A, pNBFL3A 및 pNBFL4A 재조합 벡터를 제작하였다. 제작된 pNBHL1A, pNBHL2A, pNBHL3A, pNBHL4A, pNBHL5A, pNBFL3A 및 pNBFL4A는 각각 서열번호 34, 35, 36, 37, 38, 39 및 40의 염기서열을 갖는다. 또한, 이렇게 제작된 L-아스파르트산 산화효소와 퀴놀린산 신타아제 융합단백질은 각각 서열번호 47, 48, 49, 50, 51, 52 및 53의 아미노산 서열을 갖는다. 도 2는 다양한 링커를 통하여 연결된 L-아스파르트산 산화효소와 퀴놀린산 신타아제 융합단백질을 코딩하는 유전자의 발현 플라스미드인 pNBHL1A, pNBHL2A, pNBHL3A, pNBHL4A, pNBHL5A, pNBFL3A 및 pNBFL4A의 구조를 보여준다.
<1-4> 포스포에놀파이루베이트 카복실라제 및 L-아스파르트산 트랜스아미나 제 발현용 플라스미드 제작
대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, 포스포에놀파이루베이트 카복실라제를 코딩하는 유전자 ppc를 수득하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행 (NIH GenBank)으로부터 서열번호 29의 ppc 유전자의 염기서열 (NCBI 등록번호 "GI:89110074")을 수득하고, 이에 근거하여 ppc 유전자의 프로모터로부터 터미네이터까지 함유하는 부분을 증폭할 수 있고, 제한효소 인식부위 HindIII와 BamHI를 갖는 서열번호 17 및 18의 프라이머를 합성하였다.
대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 17과 18의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였고, PCR은 96℃에서 30초 변성, 50℃에서 30초 어닐링 및 72℃에서 4분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다. 이에 의하여, ppc 유전자와 제한효소 HindIII 및 BamHI의 인식부위를 함유한 약 3.1 kb의 증폭된 유전자를 수득하였다.
상기 PCR을 통하여 수득된 ppc 유전자를 제한효소 HindIII 및 BamHI으로 처리하고, 제한효소 HindIII 및 BamHI로 처리한 pCL1920(AB236930) 벡터에 접합을 통하여 클로닝하고, 최종적으로 ppc 유전자가 클로닝된 pCP 재조합 벡터를 제작하였다.
ppc 유전자가 클로닝되어 있는 pCP 재조합 벡터상에 aspC 유전자를 클로닝하기 위하여, 대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여 L-아스파르트산 트랜스아미나제를 코딩하는 유전자 aspC를 수득하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행 (NIH GenBank)으로부터 서열번호 30의 aspC 유전자의 염기서열 (NCBI 등록번호 "GI:89107778")을 수득하고, 이에 근거하여 aspC 유전자의 프로모터로부터 터미네이터까지 함유하는 부분을 증폭할 수 있고, 제한효소 인식부위 BamHI와 KpnI를 갖는 서열번호 19 및 20의 프라이머를 합성하였다.
대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로, 서열번호 19과 20의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였고, PCR은 96℃에서 30초 변성, 50℃에서 30초 어닐링 및 72℃에서 2분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다. 이에 의하여, aspC 유전자와 제한효소 BamHI 및 KpnI의 인식부위를 함유한 약 1.5 kb의 증폭된 유전자를 수득하였다.
상기 PCR을 통하여 수득된 aspC 유전자를 제한효소 BamHI 및 KpnI으로 처리하고, 제한효소 BamHI 및 KpnI로 처리한 pCP 벡터에 접합을 통하여 클로닝하고, 최종적으로 aspC 유전자와 ppc 유전자가 동시에 클로닝된 pCPA 재조합 벡터를 제작하였다. 제작된 pCPA 벡터는 서열번호 41의 서열을 갖는다. 도 3은 포스포에놀파이루베이트 카복실라제 및 L-아스파르트산 트랜스아미나제를 코딩하는 유전자의 발현 플라스미드인 pCPA의 구조를 보여준다.
<1-5> 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제 결손 균주 제작
본 실시예에서는 대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, 퀴놀린산 분해경로의 nadC 유전자를 수득하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행 (NIH GenBank)으로부터 nadC 유전자의 염기서열 정보 (NCBI 등록번호 "GI:89106990")를 수득하고, 이에 근거하여 nadC 유전자의 하류 (downstream) 부분을 증폭하는 서열번호 21 및 22의 프라이머, nadC의 상류 및 하류 부분과 loxpCm을 증폭하는 서열번호 23 및 24의 프라이머, 상류 부분을 증폭하는 서열번호 25 및 26의 프라이머를 합성하였다.
대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 21과 22, 및 25와 26의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 이용한 PCR을 수행하여, 각각 0.5 kb 및 0.3 kb의 nadC 유전자의 상류 부분 및 하류 부분을 증폭하였다. 또한, loxpCm을 함유하고 있는 플라스미드 벡터 pLoxpCat2 벡터를 주형으로 하여 서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 이용한 PCR을 수행하여, 1.0 kb의 양 말단에 nadC 유전자와 상동 서열을 갖는 loxpCm 유전자를 증폭하였다. 중합효소는 PfuUltraTM DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하고, PCR은 96℃에서 30초 변성, 53℃에서 30초 어닐링 및 72℃에서 1분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다. 이후, 상기의 PCR 반응을 통하여 얻어진 nadC-상류 절편, nadC-하류 절편, loxpCm 절편을 주형으로 PCR을 수행하였으며, PCR 조건은 96℃에서 60초 변성, 50℃에서 60초 변성 및 72℃에서 1분의 신장으로 구성된 사이클의 10회 반복, 및 서열번호 21 및 26의 프라이머 첨가 후 사이클의 20회 반복이었다. 이에 의하여, 1.8 kb의 nadC 유전자 상류-loxpCm-하류를 함유한 nadC 결손 카세트를 획득하였다.
제작된 nadC 결손 카세트를 람다 레드 재조합효소 (lambda red recombinase) 발현 벡터인 pKD46을 함유한 대장균 W3110 상에 전기천공을 통하여 형질전환시키고, 선별마커인 클로람페니콜이 함유된 LB(Luria-Bertani) 평판배지 (트립톤 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 10g, 및 아가 1.5%/L) 상에 도말하고, 37℃에서 밤새 배양한 후 클로람페니콜에 대한 내성을 보이는 균주를 선별하였다.
선별된 균주를 직접 주형으로 하여 서열번호 21 및 26의 프라이머를 이용하여 같은 조건으로 PCR을 수행한 후, 1.0% 아가로오스 겔 상에서 유전자의 크기가 야생주의 경우 1.0 kb, nadC 결손 균주의 경우 1.8 kb인 것을 확인함으로써 nadC 유전자의 결실을 확인하였다. 또한, 상기의 방법과 동일한 방법을 통하여 야생형 대장균인 E.coli W3110의 nadC 유전자를 결손하였다.
실시예 2. 융합단백질 발현 균주 제작 및 평가
<2-1> 융합단백질 발현 균주 제작
상기 <실시예 1-3>에서 제작된 다양한 링커로 연결된 L-아스파르트산 산화효소와 퀴놀린산 신타아제를 단일 융합단백질로 코딩하는 유전자의 발현 플라스미드인 pNBHL1A, pNBHL2A, pNBHL3A, pNBHL4A, pNBHL5A, pNBFL3A 및 pNBFL4A와 pPro-NBA를 <실시예 1-5>에서 제작된 W3110△nadC 균주에 CaCl2 방법을 통하여 형질전환시킨 후, LB-Km (효모 추출물 10g/L, NaCl 5g/L, 트립톤 10g/L, 카나마이신 25㎍/L) 평판 배지에 도말하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 이후, 카나마이신 내성을 갖는 콜로니를 선발하였다. 이를 통하여, L-아스파르트산 산화효소와 퀴놀린산 신타아제를 단일 융합단백질로 발현하는 균주를 확보하였다.
<2-2> 다양한 링커를 함유한 융합단백질의 아스파르트산으로부터 퀴놀린산으로의 생산능 비교
다양한 링커를 함유한 융합단백질의 아스파르트산으로부터 퀴놀린산으로의 생합성능을 비교하고자 <실시예 2-1>에서 확보한 융합단백질 발현 균주를 37℃의 배양기에서 LB-Km-IPTG (효모 추출물 10g/L, NaCl 5g/L, 트립톤 10g/L, 카나마이신 25㎍/L, IPTG 10mM) 액상배지 5 ㎖에 접종하여 37℃에서 250 rpm으로 밤샘 배양한 후 세포 배양액을 확보하였다. 이렇게 확보한 배양액을 4000 rpm에서 10분간 원심분리하여 융합단백질 발현 균주만을 획득한 후 500 ㎕의 pH 7.0 Tris 버퍼상에서 재현탁한 후, 초음파세포 파쇄법을 이용하여 세포를 파쇄하였다.
상기의 방법을 통하여 획득한 융합단백질이 발현된 전체 세포 파쇄액를 이용하여, L-아스파르트산으로부터 퀴놀린산으로의 생합성능을 효소반응을 통하여 비교하였다. 표 1은 L-아스파르트산으로부터 퀴놀린산으로의 생합성능을 비교하기 위한 효소반응액의 조성이다.
Figure pat00001
상기와 같은 반응 조성물을 37℃에서 30분 동안 반응하였다. 배양액 중의 L-아스파르트산과 퀴놀린산을 HPLC에 의하여 분석하였다. 반응 분석 결과를 표 2에 나타내었으며, 이는 L-아스파르트산으로부터 퀴놀린산을 생산하는 각각의 융합단백질의 생산능을 나타낸다.
Figure pat00002
L-아스파르트산 산화효소 및 퀴놀린산 신타아제를 각각 발현시킨 pPro-NBA는 L-아스파르트산을 이용하여 1.5 g/L의 퀴놀린산을 생산하여, L-아스파르트산으로부터 퀴놀린산으로의 효소전환 수율이 44.9%인 반면, L-아스파르트산 산화효소 및 퀴놀린산 신타아제를 다양항 링커를 이용하여 융합단백질로 발현한 pNBHL1A, pNBHL2A, pNBHL3A, pNBHL4A, pNBHL5A, pNBFL3A 및 pNBFL4A는 2.2 ~ 3.2 g/L의 퀴놀린산을 생산하여, L-아스파르트산으로부터 퀴놀린산으로의 효소전환 수율이 65.9 ~ 95.8%를 나타내었다.
이러한 결과는 L-아스파르트산 산화효소와 퀴놀린산 신타아제가 하나의 융합단백질로 발현된 경우에 이들 효소를 각각 단독으로 발현된 경우보다 더 높은 수율로 퀴놀린산으로 전환됨을 의미한다. 또한, 다양한 형태의 링커를 도입한 모든 균주에서 높은 효소 전환율을 나타내었으며, 이는 L-아스파르트산 산화효소 및 퀴놀린산 신타아제를 링커를 사용하여 단일 융합단백질로 발현시에 L-아스파르트산으로부터 퀴놀린산을 생합성하는 것에 보다 효율적임을 의미한다. 또한, LA(EAAAK)4 ~ 5AAA의 형태로 링커를 도입한 pNBHL4A 및 pNBHL5A의 경우 가장 높은 퀴놀린산으로의 전환율을 나타내었으며, 이는 제작된 융합단백질 링커 중 LA(EAAAK)4 ~ 5AAA가 퀴놀린산 생산에 가장 효율적인 형태임을 의미한다.
실시예 3. 퀴놀린산 생산용 균주 제작 및 평가
<3-1> 퀴놀린산 생산 균주 제작
다양한 링커를 함유한 융합단백질의 포도당으로부터 퀴놀린산으로의 생합성능을 비교하고자 <실시예 1-4>에서 제작된 pCPA 플라스미드를 <실시예 1-5>에서 제작된 W3110△nadC 균주에 CaCl2 방법을 통하여 형질전환시킨 후 LB-SP (효모 추출물 10g/L, NaCl 5g/L, 트립톤 10g/L, 스펙티노마이신 50㎍/L) 평판 배지에 도말하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 이후, 스펙티노마이신 내성을 갖는 콜로니를 선발하였다.
상기에서 제작된 pCPA를 함유한 W3110△nadC 균주에 <실시예 1-2> 및 <실시예 1-3>에서 제작된 pPro-NBA, pNBHL1A, pNBHL2A, pNBHL3A, pNBHL4A, pNBHL5A, pNBFL3A 및 pNBFL4A 플라스미드를 CaCl2 방법을 통하여 형질전환시킨 후 LB-Km-Sp (효모 추출물 10g/L, NaCl 5g/L, 트립톤 10g/L, 스펙티노마이신 50㎍/L, 카나마이신 25㎍/L) 평판 배지에 도말하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 이후, 카나마이신과 스펙티노마이신 내성을 갖는 콜로니를 각각 10주씩 선발하였다. 이렇게 제작된 퀴놀린산 생산 균주를 각각 CV01-0600, CV01-0601, CV01-0602, CV01-0603, CV01-0604, CV01-0605, CV01-0606 및 CV01-0607으로 명명하였다. 표 3은 숙주 균주의 유전형, 함유한 플라스미드 및 L-아스파르트산 산화효소와 퀴놀린산 신타아제 융합단백질의 링커 아미노산 서열을 나타낸다.
Figure pat00003
<3-2> 퀴놀린산 생산 균주 평가
포도당으로부터 퀴놀린산을 생산하는 능력을 확인하기 위하여 하기의 퀴놀린산 역가 확인 실험을 진행하였다. 상기 <실시예 3-1>에서 제작된 퀴놀린산 생산 균주를 37℃의 배양기에서 LB-SP-Km 평판배지 중에 밤새 배양하여 수득한 단일 콜로니를 25 ㎖의 퀴놀린산 역가 배지에 1 백금이씩 접종하여 37℃에서 250 rpm으로 24 내지 72 시간 동안 배양하였다. 표 4는 퀴놀린산 생산용 배지의 조성을 나타낸다.
Figure pat00004
배양액 중의 퀴놀린산을 HPLC에 의하여 분석하여 결과를 표 5에 나타내었으며, 이는 균주의 포도당으로부터 퀴놀린산을 생산하는 생산능을 나타낸다.
Figure pat00005
퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제에 의한 세포 내에서 생산된 퀴놀린산의 분해를 억제하기 위하여, 대장균 W3110에서 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제를 제거한 후, 포스포에놀파이루베이트 카복실라제, L-아스파르트산 아미노트랜스퍼라제와 각각의 L-아스파르트산 산화효소, 퀴놀린산 신타아제의 발현을 강화시킨 CV01-0600 균주는 5.5 g/L의 퀴놀린산을 생산한 반면, L-아스파르트산 산화효소와 퀴놀린산 신타아제를 다양한 링커를 이용하여 융합단백질로 발현한 CV01-0601, CV01-0602, CV01-0603, CV01-0604, CV01-0605, CV01-0606 및 CV01-0607 균주는 각각 6.0 ~ 10.3 g/L의 퀴놀린산을 생산하였다.
이러한 결과는 상기 <실시예 2>의 L-아스파르트산으로부터 퀴놀린산을 효소전환하는 결과와 동일한 결과이고, L-아스파르트산 산화효소와 퀴놀린산 신타아제를 하나의 융합단백질로 발현시킨 경우, 불안정한 중간 대사산물인 α-이미노숙시네이트와 퀴놀린산 신타아제의 반응을 증대하여 α-이미노숙시네이트가 옥살로아세트산으로 전환되는 부반응을 최소화하여 퀴놀린산의 생산이 증대된다는 것을 의미한다. 또한, 다양한 형태의 링커를 도입한 모든 균주에서 상대적으로 높은 퀴놀린산 생산성을 나타내었으며, 이는 L-아스파르트산 산화효소와 퀴놀린산 신타아제를 링커를 사용하여 단일 융합단백질로 발현시에 퀴놀린산의 생합성에 보다 효율적임을 의미한다.
또한, 상기 <실시예 2>의 결과와 동일하게 LA(EAAAK)4 ~ 5AAA의 형태로 링커를 도입한 pNBHL4A 및 pNBHL5A의 경우, 가장 높은 퀴놀린산 생산능을 나타내었으며, 이는 제작된 융합단백질 링커 중 LA(EAAAK)4 ~ 5AAA가 퀴놀린산 생산에 가장 효율적인 형태임을 의미한다.
또한, L-아스파르트산 산화효소와 퀴놀린산 신타아제의 융합단백질 형태로의 발현에 의한 반응속도 강화와 함께 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제의 활성 제거 및 포스포에놀파이루베이트 카복실라제, L-아스파르트산 아미노트랜스퍼라제의 발현 강화의 조합을 통한 L-아스파르트산 생합성 경로의 강화를 통하여 기존의 균주보다 더 높은 효율로 퀴놀린산을 생산할 수 있음을 확인하였다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11235P 20111221 한국미생물보존센터(국외) KCCM11236P 20111221
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Recombinant microorganism producing quinolinic acid and method of producing quinolinic acid using the same <130> PA110984/KR <160> 63 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of nadB <400> 1 catatgaata ctctccctga acatt 25 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of nadB <400> 2 ggatccctat accactacgc ttgatcac 28 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of nadA <400> 3 gggcccatga gcgtaatgtt tgatcca 27 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of nadA <400> 4 gcggccgctc gtgcctaccg cttcg 25 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of Pro promoter <400> 5 ggatccctcg agcatagcat ttttatcc 28 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of Pro promoter 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gggctgcttc cttcgcggct gcttccttcg cggctgcttc 60 cttcgcggct gcttctgcca ggattctgtt tatgtaatg 99 <210> 12 <211> 114 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of nadB gene with Helical linker (HL5) <400> 12 aaacattacg ctcatctgca gggctgcttc cttcgcggct gcttccttcg cggctgcttc 60 cttcgcggct gcttccttcg cggctgcttc tgccaggatt ctgtttatgt aatg 114 <210> 13 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of nadB gene with Flexible linker (FL3) <400> 13 aaacattacg ctcatctgca gctgggtggt ggtagcggtg gtggtagcgg tggtggtagc 60 gcagcagccg attctgttta tgtaatg 87 <210> 14 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of nadB gene with Flexible linker (FL4) <400> 14 aaacattacg ctcatctgca gctgggtggt ggtagcggtg gtggtagcgg tggtggtagc 60 ggtggtggta gcgcagcagc cgattctgtt tatgtaatg 99 <210> 15 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of nadA gene <400> 15 ctgcagatga gcgtaatgtt tgatccagac acggcgattt atc 43 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of nadA gene <400> 16 attaattaat taagcggccg ctc 23 <210> 17 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of ppc gene <400> 17 aagcttctgt aggccggata aggcgctcgc gccgcat 37 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of ppc gene <400> 18 cggatccttt gaataaaatg cagacag 27 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of aspC gene <400> 19 ggatccgtcc acctatgttg actaca 26 <210> 20 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of aspC gene <400> 20 ggtaccgagc tcataagcgt agcgcatcag g 31 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of downstream region of nadC <400> 21 gaaacgggaa agcagattcc 20 <210> 22 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of downstream region of nadC <400> 22 cggtaggtac cgagctcgaa aagtagagaa tctggaagaa c 41 <210> 23 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplificaiton of loxCm <400> 23 gttcttccag attctctact tttcgagctc ggtacctacc g 41 <210> 24 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of loxpCm <400> 24 tgaagaggtg tttattcaac tgggggtacc gttcgtataa tg 42 <210> 25 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of upstream region of nadC <400> 25 cattatacga acggtacccc cagttgaata aacacctctt ca 42 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of upstream region of nadC <400> 26 gtggtgctaa tacccggtt 19 <210> 27 <211> 1623 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(1623) <223> nadB ORF <400> 27 atgaatactc tccctgaaca ttcatgtgac gtgttgatta tcggtagcgg cgcagccgga 60 ctttcactgg cgctacgcct ggctgaccag catcaggtca tcgttctaag taaaggcccg 120 gtaacggaag gttcaacatt ttatgcccag ggcggtattg ccgccgtgtt tgatgaaact 180 gacagcattg actcgcatgt ggaagacaca ttgattgccg gggctggtat ttgcgatcgc 240 catgcagttg aatttgtcgc cagcaatgca cgatcctgtg tgcaatggct aatcgaccag 300 ggggtgttgt ttgataccca cattcaaccg aatggcgaag aaagttacca tctgacccgt 360 gaaggtggac atagtcaccg tcgtattctt catgccgccg acgccaccgg tagagaagta 420 gaaaccacgc tggtgagcaa ggcgctgaac catccgaata ttcgcgtgct ggagcgcagc 480 aacgcggttg atctgattgt ttctgacaaa attggcctgc cgggcacgcg acgggttgtt 540 ggcgcgtggg tatggaaccg taataaagaa acggtggaaa cctgccacgc aaaagcggtg 600 gtgctggcaa ccggcggtgc gtcgaaggtt tatcagtaca ccaccaatcc ggatatttct 660 tctggcgatg gcattgctat ggcgtggcgc gcaggctgcc gggttgccaa tctcgaattt 720 aatcagttcc accctaccgc gctatatcac ccacaggcac gcaatttcct gttaacagaa 780 gcactgcgcg gcgaaggcgc ttatctcaag cgcccggatg gtacgcgttt tatgcccgat 840 tttgatgagc gcggcgaact ggccccgcgc gatattgtcg cccgcgccat tgaccatgaa 900 atgaaacgcc tcggcgcaga ttgtatgttc cttgatatca gccataagcc cgccgatttt 960 attcgccagc atttcccgat gatttatgaa aagctgctcg ggctggggat tgatctcaca 1020 caagaaccgg taccgattgt gcctgctgca cattatacct gcggtggtgt aatggttgat 1080 gatcatgggc gtacggacgt cgagggcttg tatgccattg gcgaggtgag ttataccggc 1140 ttacacggcg ctaaccgcat ggcctcgaat tcattgctgg agtgtctggt ctatggctgg 1200 tcggcggcgg aagatatcac cagacgtatg ccttatgccc acgacatcag tacgttaccg 1260 ccgtgggatg aaagccgcgt tgagaaccct gacgaacggg tagtaattca gcataactgg 1320 cacgagctac gtctgtttat gtgggattac gttggcattg tgcgcacaac gaagcgcctg 1380 gaacgcgccc tgcggcggat aaccatgctc caacaagaaa tagacgaata ttacgcccat 1440 ttccgcgtct caaataattt gctggagctg cgtaatctgg tacaggttgc cgagttgatt 1500 gttcgctgtg caatgatgcg taaagagagt cgggggttgc atttcacgct ggattatccg 1560 gaactgctca cccattccgg tccgtcgatc ctttcccccg gcaatcatta cataaacaga 1620 taa 1623 <210> 28 <211> 1044 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(1044) <223> nadA ORF <400> 28 atgagcgtaa tgtttgatcc agacacggcg atttatcctt tccccccgaa gccgacgccg 60 ttaagcattg atgaaaaagc gtattaccgc gagaagataa aacgtctgct aaaagaacgt 120 aatgcggtga tggttgccca ctactatacc gatcccgaaa ttcaacaact ggcagaagaa 180 accggtggct gtatttctga ttctctggaa atggcgcgct tcggtgcaaa gcatcccgct 240 tctactttgt tagtcgctgg ggtgagattt atgggagaaa ccgccaaaat tctcagtccg 300 gaaaaaacaa ttctgatgcc gacacttcag gctgaatgtt cactggatct cggctgccct 360 gttgaagaat ttaacgcatt ttgcgatgcc catcccgatc gtactgtcgt cgtctacgcc 420 aacacttctg ctgcggtaaa agcgcgcgca gattgggtgg taacttcaag cattgccgtc 480 gaacttattg atcatcttga tagtttgggt gaaaaaatca tctgggcacc cgacaaacat 540 ctggggcgtt acgtgcaaaa acagacgggt ggagacattc tatgctggca gggtgcctgt 600 attgtgcatg atgaatttaa gactcaggcg ttaacccgct tgcaagaaga atacccggat 660 gctgccatac tggtgcatcc agaatcacca caagctattg tcgatatggc ggatgcggtc 720 ggttccacca gtcaactgat cgctgctgcg aaaacattgc cacatcagag gcttattgtg 780 gcaaccgatc ggggtatttt ctacaaaatg cagcaggcgg tgccagataa agagttactg 840 gaagcaccaa ccgcaggtga gggtgcaacc tgccgcagct gcgcgcattg tccgtggatg 900 gccatgaatg gccttcaggc catcgcagag gcattagaac aggaaggaag caatcacgag 960 gttcatgttg atgaaaggct gcgagagagg gcgctggtgc cgctcaatcg tatgctggat 1020 tttgcggcta cactacgtgg ataa 1044 <210> 29 <211> 3096 <212> DNA <213> Escherichia coli W3110 <220> <221> gene <222> (1)..(3096) <223> ppc <400> 29 ataaggcgct cgcgccgcat ccggcactgt tgccaaactc cagtgccgca ataatgtcgg 60 atgcgatact tgcgcatctt atccgaccta cacctttggt gttacttggg gcgatttttt 120 aacatttcca taagttacgc ttatttaaag cgtcgtgaat ttaatgacgt aaattcctgc 180 tatttattcg tttgctgaag cgatttcgca gcatttgacg tcaccgcttt tacgtggctt 240 tataaaagac gacgaaaagc aaagcccgag catattcgcg ccaatgcgac gtgaaggata 300 cagggctatc aaacgataag atggggtgtc tggggtaata tgaacgaaca atattccgca 360 ttgcgtagta atgtcagtat gctcggcaaa gtgctgggag aaaccatcaa ggatgcgttg 420 ggagaacaca ttcttgaacg cgtagaaact atccgtaagt tgtcgaaatc ttcacgcgct 480 ggcaatgatg ctaaccgcca ggagttgctc accaccttac aaaatttgtc gaacgacgag 540 ctgctgcccg ttgcgcgtgc gtttagtcag ttcctgaacc tggccaacac cgccgagcaa 600 taccacagca tttcgccgaa aggcgaagct gccagcaacc cggaagtgat cgcccgcacc 660 ctgcgtaaac tgaaaaacca gccggaactg agcgaagaca ccatcaaaaa agcagtggaa 720 tcgctgtcgc tggaactggt cctcacggct cacccaaccg aaattacccg tcgtacactg 780 atccacaaaa tggtggaagt gaacgcctgt ttaaaacagc tcgataacaa agatatcgct 840 gactacgaac acaaccagct gatgcgtcgc ctgcgccagt tgatcgccca gtcatggcat 900 accgatgaaa tccgtaagct gcgtccaagc ccggtagatg aagccaaatg gggctttgcc 960 gtagtggaaa acagcctgtg gcaaggcgta ccaaattacc tgcgcgaact gaacgaacaa 1020 ctggaagaga acctcggcta caaactgccc gtcgaatttg ttccggtccg ttttacttcg 1080 tggatgggcg gcgaccgcga cggcaacccg aacgtcactg ccgatatcac ccgccacgtc 1140 ctgctactca gccgctggaa agccaccgat ttgttcctga aagatattca ggtgctggtt 1200 tctgaactgt cgatggttga agcgacccct gaactgctgg cgctggttgg cgaagaaggt 1260 gccgcagaac cgtatcgcta tctgatgaaa aacctgcgtt ctcgcctgat ggcgacacag 1320 gcatggctgg aagcgcgcct gaaaggcgaa gaactgccaa aaccagaagg cctgctgaca 1380 caaaacgaag aactgtggga accgctctac gcttgctacc agtcacttca ggcgtgtggc 1440 atgggtatta tcgccaacgg cgatctgctc gacaccctgc gccgcgtgaa atgtttcggc 1500 gtaccgctgg tccgtattga tatccgtcag gagagcacgc gtcataccga agcgctgggc 1560 gagctgaccc gctacctcgg tatcggcgac tacgaaagct ggtcagaggc cgacaaacag 1620 gcgttcctga tccgcgaact gaactccaaa cgtccgcttc tgccgcgcaa ctggcaacca 1680 agcgccgaaa cgcgcgaagt gctcgatacc tgccaggtga ttgccgaagc accgcaaggc 1740 tccattgccg cctacgtgat ctcgatggcg aaaacgccgt ccgacgtact ggctgtccac 1800 ctgctgctga aagaagcggg tatcgggttt gcgatgccgg ttgctccgct gtttgaaacc 1860 ctcgatgatc tgaacaacgc caacgatgtc atgacccagc tgctcaatat tgactggtat 1920 cgtggcctga ttcagggcaa acagatggtg atgattggct attccgactc agcaaaagat 1980 gcgggagtga tggcagcttc ctgggcgcaa tatcaggcac aggatgcatt aatcaaaacc 2040 tgcgaaaaag cgggtattga gctgacgttg ttccacggtc gcggcggttc cattggtcgc 2100 ggcggcgcac ctgctcatgc ggcgctgctg tcacaaccgc caggaagcct gaaaggcggc 2160 ctgcgcgtaa ccgaacaggg cgagatgatc cgctttaaat atggtctgcc agaaatcacc 2220 gtcagcagcc tgtcgcttta taccggggcg attctggaag ccaacctgct gccaccgccg 2280 gagccgaaag agagctggcg tcgcattatg gatgaactgt cagtcatctc ctgcgatgtc 2340 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ctaa 894 <210> 32 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pro promoter <400> 32 ctcgagcata gcatttttat ccataagatt agcggatcta acctttacaa ttgtgagcgc 60 tcacaattat gatagattca attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag 120 aggagaaagg tacat 135 <210> 33 <211> 5741 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid vector (pPro-NBA) <400> 33 ctcgagcata gcatttttat ccataagatt agcggatcta acctttacaa ttgtgagcgc 60 tcacaattat gatagattca attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag 120 aggagaaagg tacatatgaa tactctccct gaacattcat gtgacgtgtt gattatcggt 180 agcggcgcag ccggactttc actggcgcta cgcctggctg accagcatca ggtcatcgtt 240 ctaagtaaag gcccggtaac ggaaggttca acattttatg cccagggcgg tattgccgcc 300 gtgtttgatg aaactgacag cattgactcg catgtggaag acacattgat tgccggggct 360 ggtatttgcg atcgccatgc agttgaattt gtcgccagca atgcacgatc ctgtgtgcaa 420 tggctaatcg accagggggt gttgtttgat acccacattc aaccgaatgg cgaagaaagt 480 taccatctga cccgtgaagg tggacatagt caccgtcgta ttcttcatgc cgccgacgcc 540 accggtagag aagtagaaac cacgctggtg agcaaggcgc tgaaccatcc gaatattcgc 600 gtgctggagc gcagcaacgc ggttgatctg attgtttctg acaaaattgg cctgccgggc 660 acgcgacggg ttgttggcgc gtgggtatgg aaccgtaata aagaaacggt ggaaacctgc 720 cacgcaaaag cggtggtgct ggcaaccggc ggtgcgtcga aggtttatca gtacaccacc 780 aatccggata tttcttctgg cgatggcatt gctatggcgt ggcgcgcagg ctgccgggtt 840 gccaatctcg aatttaatca gttccaccct accgcgctat atcacccaca ggcacgcaat 900 ttcctgttaa cagaagcact gcgcggcgaa ggcgcttatc tcaagcgccc ggatggtacg 960 cgttttatgc ccgattttga tgagcgcggc gaactggccc cgcgcgatat tgtcgcccgc 1020 gccattgacc atgaaatgaa acgcctcggc gcagattgta tgttccttga tatcagccat 1080 aagcccgccg attttattcg ccagcatttc ccgatgattt atgaaaagct gctcgggctg 1140 gggattgatc tcacacaaga accggtaccg attgtgcctg ctgcacatta tacctgcggt 1200 ggtgtaatgg ttgatgatca tgggcgtacg gacgtcgagg gcttgtatgc cattggcgag 1260 gtgagttata ccggcttaca cggcgctaac cgcatggcct cgaattcatt gctggagtgt 1320 ctggtctatg gctggtcggc ggcggaagat atcaccagac gtatgcctta tgcccacgac 1380 atcagtacgt taccgccgtg 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Val Leu Glu Arg Ser 145 150 155 160 Asn Ala Val Asp Leu Ile Val Ser Asp Lys Ile Gly Leu Pro Gly Thr 165 170 175 Arg Arg Val Val Gly Ala Trp Val Trp Asn Arg Asn Lys Glu Thr Val 180 185 190 Glu Thr Cys His Ala Lys Ala Val Val Leu Ala Thr Gly Gly Ala Ser 195 200 205 Lys Val Tyr Gln Tyr Thr Thr Asn Pro Asp Ile Ser Ser Gly Asp Gly 210 215 220 Ile Ala Met Ala Trp Arg Ala Gly Cys Arg Val Ala Asn Leu Glu Phe 225 230 235 240 Asn Gln Phe His Pro Thr Ala Leu Tyr His Pro Gln Ala Arg Asn Phe 245 250 255 Leu Leu Thr Glu Ala Leu Arg Gly Glu Gly Ala Tyr Leu Lys Arg Pro 260 265 270 Asp Gly Thr Arg Phe Met Pro Asp Phe Asp Glu Arg Gly Glu Leu Ala 275 280 285 Pro Arg Asp Ile Val Ala Arg Ala Ile Asp His Glu Met Lys Arg Leu 290 295 300 Gly Ala Asp Cys Met Phe Leu Asp Ile Ser His Lys Pro Ala Asp Phe 305 310 315 320 Ile Arg Gln His Phe Pro Met Ile Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Leu Gly 325 330 335 Ile Asp Leu Thr Gln Glu Pro Val Pro Ile Val Pro Ala Ala His Tyr 340 345 350 Thr Cys Gly Gly Val Met Val Asp Asp His Gly Arg Thr Asp Val Glu 355 360 365 Gly Leu Tyr Ala Ile Gly Glu Val Ser Tyr Thr Gly Leu His Gly Ala 370 375 380 Asn Arg Met Ala Ser Asn Ser Leu Leu Glu Cys Leu Val Tyr Gly Trp 385 390 395 400 Ser Ala Ala Glu Asp Ile Thr Arg Arg Met Pro Tyr Ala His Asp Ile 405 410 415 Ser Thr Leu Pro Pro Trp Asp Glu Ser Arg Val Glu Asn Pro Asp Glu 420 425 430 Arg Val Val Ile Gln His Asn Trp His Glu Leu Arg Leu Phe Met Trp 435 440 445 Asp Tyr Val Gly Ile Val Arg Thr Thr Lys Arg Leu Glu Arg Ala Leu 450 455 460 Arg Arg Ile Thr Met Leu Gln Gln Glu Ile Asp Glu Tyr Tyr Ala His 465 470 475 480 Phe Arg Val Ser Asn Asn Leu Leu Glu Leu Arg Asn Leu Val Gln Val 485 490 495 Ala Glu Leu Ile Val Arg Cys Ala Met Met Arg Lys Glu Ser Arg Gly 500 505 510 Leu His Phe Thr Leu Asp Tyr Pro Glu Leu Leu Thr His Ser Gly Pro 515 520 525 Ser Ile Leu Ser Pro Gly Asn His Tyr Ile Asn Arg Ile Leu Gly Gly 530 535 540 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Ala 545 550 555 560 Ala Leu Gln Met Ser Val Met Phe Asp Pro Asp Thr Ala Ile Tyr Pro 565 570 575 Phe Pro Pro Lys Pro Thr Pro Leu Ser Ile Asp Glu Lys Ala Tyr Tyr 580 585 590 Arg Glu Lys Ile Lys Arg Leu Leu Lys Glu Arg Asn Ala Val Met Val 595 600 605 Ala His Tyr Tyr Thr Asp Pro Glu Ile Gln Gln Leu Ala Glu Glu Thr 610 615 620 Gly Gly Cys Ile Ser Asp Ser Leu Glu Met Ala Arg Phe Gly Ala Lys 625 630 635 640 His Pro Ala Ser Thr Leu Leu Val Ala Gly Val Arg Phe Met Gly Glu 645 650 655 Thr Ala Lys Ile Leu Ser Pro Glu Lys Thr Ile Leu Met Pro Thr Leu 660 665 670 Gln Ala Glu Cys Ser Leu Asp Leu Gly Cys Pro Val Glu Glu Phe Asn 675 680 685 Ala Phe Cys Asp Ala His Pro Asp Arg Thr Val Val Val Tyr Ala Asn 690 695 700 Thr Ser Ala Ala Val Lys Ala Arg Ala Asp Trp Val Val Thr Ser Ser 705 710 715 720 Ile Ala Val Glu Leu Ile Asp His Leu Asp Ser Leu Gly Glu Lys Ile 725 730 735 Ile Trp Ala Pro Asp Lys His Leu Gly Arg Tyr Val Gln Lys Gln Thr 740 745 750 Gly Gly Asp Ile Leu Cys Trp Gln Gly Ala Cys Ile Val His Asp Glu 755 760 765 Phe Lys Thr Gln Ala Leu Thr Arg Leu Gln Glu Glu Tyr Pro Asp Ala 770 775 780 Ala Ile Leu Val His Pro Glu Ser Pro Gln Ala Ile Val Asp Met Ala 785 790 795 800 Asp Ala Val Gly Ser Thr Ser Gln Leu Ile Ala Ala Ala Lys Thr Leu 805 810 815 Pro His Gln Arg Leu Ile Val Ala Thr Asp Arg Gly Ile Phe Tyr Lys 820 825 830 Met Gln Gln Ala Val Pro Asp Lys Glu Leu Leu Glu Ala Pro Thr Ala 835 840 845 Gly Glu Gly Ala Thr Cys Arg Ser Cys Ala His Cys Pro Trp Met Ala 850 855 860 Met Asn Gly Leu Gln Ala Ile Ala Glu Ala Leu Glu Gln Glu Gly Ser 865 870 875 880 Asn His Glu Val His Val Asp Glu Arg Leu Arg Glu Arg Ala Leu Val 885 890 895 Pro Leu Asn Arg Met Leu Asp Phe Ala Ala Thr Leu Arg Gly 900 905 910 <210> 54 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HL1 Linker peptide <400> 54 Leu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 55 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HL2 Linker peptide <400> 55 Leu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala 1 5 10 15 <210> 56 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HL3 Linker peptide <400> 56 Leu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala 1 5 10 15 Lys Ala Ala Ala 20 <210> 57 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HL4 Linker peptide <400> 57 Leu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala 1 5 10 15 Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala 20 25 <210> 58 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HL5 Linker peptide <400> 58 Leu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala 1 5 10 15 Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala 20 25 30 <210> 59 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FL3 Linker peptide <400> 59 Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala 1 5 10 15 <210> 60 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FL4 Linker peptide <400> 60 Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Ala Ala Ala 20 <210> 61 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FL1 Linker peptide <400> 61 Leu Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala 1 5 <210> 62 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FL2 Linker peptide <400> 62 Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 63 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FL5 Linker peptide <400> 63 Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala 20

Claims (14)

  1. L-아스파르트산 산화효소 (L-aspartate oxidase) 및 퀴놀린산 신타아제 (Quinolinate synthase)가 링커를 통하여 연결된 융합단백질을 발현하는 퀴놀린산을 생산하는 재조합 미생물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 L-아스파르트산 산화효소 및 퀴놀린산 신타아제는 각각 서열번호 42 및 서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것인 재조합 미생물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 링커는 5 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 것인 재조합 미생물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 링커는 LA(EAAAK)nAAA (n은 1 내지 5의 정수) 또는 L(GGGS)nAAA (n은 1 내지 5의 정수)의 아미노산 서열을 갖는 것인 재조합 미생물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 54, 55, 56, 57, 58, 59 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 재조합 미생물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 융합단백질은 서열번호 47, 48, 49, 50, 51, 52 및 53으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 재조합 미생물.
  7. 제 1항에 있어서, 추가적으로 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제 (quinolinate phosphoribosyltransferase)의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 것인 재조합 미생물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제의 활성 약화는 1) 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 일부 또는 전체의 결실, 2) 상기 유전자의발현이 감소하도록 발현조절 서열의 변형, 3) 상기 단백질의 활성이 약화되도록 염색체 상의 상기 유전자 서열의 변형 및 4) 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의하여 수행되는 것인 재조합 미생물.
  9. 제 1항에 있어서, 추가적으로 포스포에놀파이루베이트 카복실라제 (phosphoenolpyruvate carboxylase), L-아스파르트산 아미노트랜스퍼라제 (aspartate aminotransferase) 및 상기 융합단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 활성이 강화된 것인 재조합 미생물.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 단백질의 활성 강화는 1) 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 카피 수 증가, 2) 상기 유전자의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형, 3) 상기 효소의 활성이 강화되도록 염색체 상의 상기 유전자 서열의 변형 및 4) 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의하여 수행되는 것인 재조합 미생물.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 엔테로박터 (Enterbacter) 속, 에스케리시아 (Escherichia) 속, 어위니아 (Erwinia) 속, 세라티아 (Serratia) 속, 프로비덴시아 (Providencia) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움 (Brevibacterium) 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 미생물.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 것인 재조합 미생물.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 수탁번호 KCCM11235P 또는 KCCM11236P인 것인 재조합 미생물.
  14. (a) L-아스파르트산 산화효소 (L-aspartate oxidase) 및 퀴놀린산 신타아제 (Quinolinate synthase)가 링커를 통하여 연결된 융합단백질을 발현하는 재조합 미생물을 탄소원을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양과정에서 생산된 퀴놀린산을 수득하는 단계를 포함하는 퀴놀린산의 생산방법.
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