KR101223904B1 - 니코틴산의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

퀴놀린산 생산능을 갖는 미생물을 배양하여 퀴놀린산이 포함된 배양액을 수득하는 단계, 및 상기 배양액에 산을 첨가하고 탈탄산 반응을 수행하는 단계를 포함하는 니코틴산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

니코틴산의 제조 방법{Method for the preparation of nicotinic acid}

본 발명은 퀴놀린산 생산능을 갖는 미생물의 배양 및 그로부터 수득된 퀴놀린산의 탈탄산 반응을 통해 니코틴산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

니코틴산은 니코틴의 산화물이며, 비타민 B 복합체이다. 니아신(niacin) 또는 비타민 B₃로도 불리는 수용성 비타민으로 동·식물체에 널리 존재한다. 니코틴산이 결핍되면 펠라그라병에 걸리거나 신경 장애를 일으킬 수 있다. 니코틴산은 생체내에서 주로 니코틴산아미드 보조효소(NAD, NADP)의 형태로 존재하며 산화환원반응에 관여한다.

식품 및 의약품에서 유용하게 이용되는 니코틴산은 화학적 합성 방법 및 생물학적 생산 방법을 통하여 제조될 수 있다.

니코틴산의 화학적 합성은 주로 3-피콜린(3-picoline)을 산화 촉매로 이용한 산화 반응을 통하여 이루어진다. 2-메틸펜탄디아민(2-methylpentanediamine, MPDA)으로부터 촉매를 이용한 고온반응(280 내지 360℃)을 통하여 3-피콜린이 합성되고 3-피콜린의 암모산화반응(Ammoxidation)을 통하여 생성된 3-시아노피리딘의 가수분해를 통해 니아신아미드 또는 니코틴산이 합성된다. 또한, 3-피콜린으로부터 선택적 산화반응(selective oxidation)을 통해 직접적으로 니코틴산이 합성될 수 있다 (Applied Catalysis A: General 280 (2005) 75-82). 그러나, 화학적 합성에서는 촉매를 포함한 다량의 유독한 폐기물이 발생하기 때문에 이에 대한 철저한 관리가 필요하며, 폐기물 처리에 많은 비용이 소요된다. 이를 해결하기 위하여 3-시아노피리딘으로부터 효소를 사용하여 니아신을 합성하는 방법이 개발되었으나, 이 공정도 다량의 폐기물의 발생을 야기하는 3-시아노피리딘을 사용하기 때문에 유사한 문제점을 갖는다. 또한 전구물질로 사용되는 피리미딘은 다양한 유도체를 가지고 있어, 공급량 및 가격의 변동이 크기 때문에 니아신 가격의 불안정을 초래한다.

이외에 퀴놀린산으로부터 니코틴산을 생산하는 방법이 알려져 있다. 중국특허 CN101353322C는 퀴놀린산을 기질로 사용한 열수탈탄산반응(Hydrothermal Decarboxylation)을 통하여 니코틴산을 합성하는 방법을 개시한다. 퀴놀린산을 이온을 제거한 고온수와 2:1 내지 5:1의 비율로 혼합한 후 150 내지 250℃의 고온 및 1 내지 2MPa의 고압에서 5 내지 60분 동안 반응시켜 니코틴산을 생산하는 방법이 보고되었다(Ind. Eng. Chem. Res. 2009, 48, 10467-10471.) 이 방법은 촉매 부산물의 생성이 없다는 장점이 있는 반면에 반응 조건이 150 내지 250℃ 및 2MPa로 고에너지를 사용하는 고온, 고압이라는 문제점이 있다. 기존의 화학적 합성 방법은 모두 석유 유래의 재생불가능한(non-renewable) 재료를 원료로 사용하기 때문에 환경적인 문제나 유가 또는 석유 추출 단가에 많은 영향을 받는다.

이와 같은 화학적 합성 방법의 문제를 해소하기 위해, 재생가능한 탄수화물 유래의 재료를 이용하여 생물학적으로 니코틴산을 생산하는 방법이 연구되었다.

니코틴산의 생물학적 생산은 크게 두가지 경로를 통하여 이루어진다. 먼저 트립토판을 출발물질로 하여 퀴놀린산을 생성하고, 이로부터 니코틴산을 생합성하는 경로와 아스파라긴산을 출발물질로 하여 퀴놀린산을 생성하고, 이로부터 니코틴산을 생합성하는 경로이다. 일반적으로 진핵생물(eukaryote)의 경우 트립토판을 출발물질로 하여 니코틴산을 합성하는 경로를 통해 니코틴산을 생합성하며, 원핵생물(prokaryote)의 경우 아스파라긴산을 출발물질로 하여 니코틴산을 합성하는 경로가 주경로로 사용된다. 두 경로 모두 퀴놀린산을 중간체로 포함하며, 퀴놀린산으로부터 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제 (quinolinate phosphoribosyltransferase - nadC), 니코틴산-모노뉴클레오티드 아데닐트랜스퍼라아제 (nicotinate-mononucleotide adenylyltransferase - nadD), NAD 신타아제 (NAD synthetase - nadE), NMN 아데닐트랜스퍼라아제 (NMN adenylyltransferase nadR), 및 니코틴 아미다아제 (nicotinamidase - pncA)의 작용에 의하여 니코틴산을 합성한다.

니코틴산의 생물학적 생산방법은 아스파라긴산 경로를 통하여 니코틴산을 생산하는 재조합 대장균이나 코리네박테리아 글루타미쿰을 이용한 방법이 보고된 바 있다.

미국특허 제6,692,946호 및 제6,689,587호는 각각 코리네박테리움 글루타미쿰(ATCC 13032) 균주 상의 퀴놀린산 신타아제와 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자 nadA 및 nadC를 분리하고, 이를 과발현하는 숙주 세포의 배양을 통해 니코틴산을 생산하는 방법을 개시한다. 이들 특허에 개시된 니코틴산의 생물학적 생산 방법에서 생산되는 니코틴산의 양은 100mg/L이하로 매우 낮다. 그 원인은 아스파라긴산 산화효소를 코딩하는 유전자 nadB와 퀴놀린산 신타아제를 코딩하는 유전자 nadA의 NAD 관련 전사단계저해인자(transcriptional repressor)인 NadR에 의한 전사 저해 (Gerasimova AV (2005). J Bioinform Comput Biol 3(4);1007-19.), 아스파라긴산 산화효소와 NAD 신타아제의 NAD에 의한 피드백 억제(feedback inhibition)(Biol Chem Hoppe Seyler. 1990 Mar; 371(3):239-48), 및 NadB, NadA, NadC 외에 NadD, NadE, NadR, 및 PncA에 의한 단계들을 포함하는 반응의 복잡성 등으로 사료된다.

니코틴산의 생물학적 생산 방법에서는 전술된 바와 같은 생합성 경로에 관여하는 효소들의 발현 저해, 피드백 억제, 및 반응의 복잡성 등으로 인해 니코틴산의 생산 수율이 낮다.

본 발명자들은 니코틴산의 화학적 합성 방법 및 생물학적 생산 방법이 갖는 문제점을 해소하고 니코틴산의 생산 수율을 향상시키기 위한 연구를 수행하여, 생물학적 생산 방법과 화학적 합성 방법의 조합을 통해 니코틴산을 고수율로 생산하는 방법을 완성하였다.

본 발명의 목적은 퀴놀린산 생산능이 향상된 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 퀴놀린산 생산능이 향상된 미생물의 배양과 퀴놀린산의 탈탄산 반응을 통해 니코틴산을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태는 퀴놀린산 생산능을 갖는 미생물을 배양하여 퀴놀린산이 포함된 배양액을 수득하는 단계, 및

상기 배양액에 산을 첨가하고 탈탄산 반응을 수행하는 단계를 포함하는 니코틴산을 제조하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 "퀴놀린산 생산능을 갖는 미생물"은 배지 중의 탄소원으로부터 퀴놀린산을 생산하여 축적시킬 수 있는 미생물을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 "탈탄산 반응"은 반응물, 즉, 퀴놀린의 탈탄산에 의해 니코틴산을 생성하는 반응을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서, 퀴놀린산 생산능을 갖는 미생물은 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제의 활성이 약화되거나 결실되고, 아스파라긴산 산화 효소 및 퀴놀린산 신타아제의 활성이 강화되어 퀴놀린산 생산능이 향상된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제는 서열번호 21 또는 그와 높은 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, 아스파라긴산 산화 효소는 서열번호 19 또는 그와 높은 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖고, 퀴놀린산 신타아제는 서열번호 20 또는 그와 높은 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

퀴놀린산의 생산능을 향상시키기 위해서 미생물이 다량의 퀴놀린산을 생성하게 하고, 생성한 퀴놀린산이 다른 경로에서 이용되지 않고 축적될 수 있도록 해야 한다. 따라서, 퀴놀린산의 생산능이 향상된 미생물은 퀴놀린산의 분해 경로에서 작용하는 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제의 활성을 제거 또는 약화시키는 방법, 퀴놀리산의 합성 경로에 작용하는 아스파라긴산 산화효소 및 퀴놀린산 신타아제의 발현을 강화시키는 방법 또는 이들의 조합에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제의 활성의 약화 또는 결실은 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제를 코딩하는 내재적 유전자를 효소 활성이 약화 또는 결실되도록 변형된 유전자로 대체하는 방법, 상기 유전자의 프로모터를 내재적 프로모터보다 약한 프로모터로 교체하는 방법 또는 상기 유전자를 염색체로부터 결실시키는 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 아스파라긴산 산화 효소 및 퀴놀린산 신타아제의 활성은 아스파라긴산 산화 효소 및 퀴놀린산 신타아제를 코딩하는 유전자의 세포내 카피수를 증가시키는 방법, 상기 유전자의 발현 조절 서열을 변형시키는 방법, 및 상기 유전자를 효소의 활성이 강화되도록 변형된 유전자로 교체하는 방법으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 미생물의 배양액 중에 퀴놀린산을 축적할 수 있게 하기 위해, 균주로부터 아스파라긴산 산화효소 단백질을 코딩하는 유전자인 nadB의 프로모터 부분을 서열번호 16의 구성적(constitutive) 프로모터인 pPro로 치환하여 세포내 NAD 농도에 의해 nadB 유전자의 발현을 저해시키는 전사단계 저해인자인 NadR에 의한 저해를 받지 않는 구성적 발현 형태의 nadB 유전자를 플라스미드 형태로 제작하고 균주에 도입하여 아스파라긴간 산화효소의 과발현을 유도하였다.

본 발명의 일 구체예에서, 아스파라긴산 산화효소는 서열번호 19의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 효소를 코딩하는 유전자 nadB의 서열은 문헌(Mol Syst Biol. 2006;2:2006.0007. Epub 2006 Feb 21.)에 공개된 대장균(Escherichia coli)의 게놈 서열(gi: GI:89109380)이나 미국생물공학정보센터(NCBI) 및 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)와 같은 데이터베이스로부터 얻을 수 있다.　

아스파라긴산 산화효소는 하기 반응식에 나타난 바와 같이 아스파라긴산을 이미노숙신산으로 산화시키는 활성을 갖는다.

L-아스파르테이트 + 푸마레이트 <=> α-이미노숙시네이트 + 숙시네이트 + H⁺

L-아스파르테이트 + 산소 <=> 과산화수소 + α-이미노숙시네이트 + H⁺

따라서, 아스파라긴산 산화 효소의 활성이 강화되면, 세포 내에 퀴놀린산의 전구 물질인 이미노숙신산의 축적이 증가되고, 이에 의해 퀴놀린산의 생산이 증가될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 퀴놀린산의 축적을 증가시키기 위해 퀴놀린산 생산능을 갖는 미생물에서 퀴놀린산 신타아제 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터를 보다 강력한 프로모터인 서열번호 17의 pCysK로 치환하여 세포내 NAD 농도에 의해 nadA 유전자의 발현을 저해시키는 전사단계 저해인자인 NadR에 의한 저해를 받지 않는 구성적 발현 형태의 nadA 유전자를 플라스미드 형태로 제작하고 균주에 도입하여 퀴놀린산 신타아제의 과발현을 유도하였다.

본 발명의 일 구체예에서, 퀴놀린산 신타아제는 서열번호 20의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 효소를 코딩하는 유전자 nadA의 서열은 문헌(Mol Syst Biol. 2006;2:2006.0007. Epub 2006 Feb 21.)에 공개된 대장균의 게놈 서열(gi: GI:89109380)이나 미국생물공학정보센터(NCBI) 및 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)와 같은 데이터베이스로부터 얻을 수 있다.　

퀴놀린산 신타아제는 하기 반응식에 나타난 바와 같이 이미노숙신산으로부터 퀴놀린산을 합성하는 활성을 갖는다.

α-이미노숙시네이트 + 디히드록시아세톤 포스페이트 <=> 퀴놀리네이트 + 포스페이트 + 2H₂O

따라서, 퀴놀린산 신타아제를 코딩하는 유전자의 발현이나 이 효소의 활성을 강화할 경우, 세포 내에 퀴놀린산의 생산을 증가시킬 수 있다.

퀴놀린산 생산능을 갖는 미생물에서 아스파라긴산 산화효소 및 퀴놀린산 신타아제 활성을 강화하기 위하여, 아스파라긴산 산화효소 및 퀴놀린산 신타아제를 코딩하는 유전자의 내재적 프로모터의 강력한 프로모터로의 치환, 프로모터의 변이 유발 또는 유전자 카피수 증가를 수행할 수 있다. 상기 강력한 프로모터로 치환하기 위하여, 일반적으로 강력한 프로모터로 알려진 pTac, pTrc, pPro, pR, pL, pCJ1, pCysK 등의 프로모터가 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 퀴놀린산 생합성에 관여하는 nadB 및 nadA 유전자의 프로모터를 강력한 프로모터인 pPro 또는 pCysK로 치환하여 상기 유전자를 과발현하는 퀴놀린산 생산능이 향상된 균주를 제조할 수 있다. 유전자의 발현을 증가시키기 위해 내재적 프로모터를 치환하기 위한 프로모터로서, 각각 서열번호 17 및 18의 pPro 및 pCysK 프로모터 또는 그의 일부가 사용될 수 있다.

또한, 추가적으로 퀴놀린산을 축적할 수 있도록 하기 위하여, 퀴놀린산 생산능을 갖는 미생물의 게놈 상에 위치한 퀴놀린산을 니코틴산 모노뉴클레오티드로 전환시키는 효소인 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제의 활성을 제거할 수 있다. 이를 위해, 상동성 재조합(Homologous recombination)에 의해 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자 nadC를 미생물의 유전체로부터 제거하였다. nadC의 서열은 문헌(Mol Syst Biol. 2006;2:2006.0007. Epub 2006 Feb 21.)에 공개된 대장균의 게놈 서열(GI:89106990) 또는 미국생물공학정보센터(NCBI) 및 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)와 같은 데이터베이스로부터 얻을 수 있다.　

본 발명의 일 구체예에서, 포스포리보실트랜스퍼라아제는 서열번호 21의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제는 하기 반응식에 나타난 바와 같이 퀴놀린산을 니코틴산 모노뉴클레오티드로 합성하는 활성을 갖는다. 따라서 이 활성을 갖는 유전자를 제거하거나 또는 그의 발현을 약화시킬 경우 세포 내에 퀴놀린산의 생산을 증가시킬 수 있다.

5-포스포-α-D-리보오스 1-디포스페이트 + 퀴놀리네이트 + 2H⁺ <=> CO₂ + ㅍ + 니코틴네이트 모노뉴클레오티드

본 발명의 일 구체예에서 퀴놀린산 생산능을 갖는 미생물은 체내에서 퀴놀린산을 생산할 수 있는 원핵 및 진핵 미생물 균주일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 퀴놀린산 생산능을 갖는 미생물은 엔테로박터(Enterbacter) 속, 에스케리시아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아 (Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서, 퀴놀린산 생산능을 갖는 미생물은 에스케리시아(Escherichia) 속에 속하는 미생물일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 퀴놀린산 생산능을 갖는 미생물은 대장균(Escherichia coli)일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, L-쓰레오닌을 생산하는 대장균 변이 균주 TF4076(KFCC 10718, 한국특허공고 제92-8365호)가 퀴놀린산 생산능을 향상시키기 위한 모균주로 사용될 수 있다. 대장균 TF4076은 메티오닌 요구성, 메티오닌 유사체 (예를 들면, α-아미노-β-히드록시 발레릭산, AHV)에 대한 내성, 라이신 유사체 (예를 들면, S-(2-아미노에틸)-L-시스테인, AEC)에 대한 내성, 이소루이신 유사체 (예를 들면, α-아미노부티르산) 대한 내성, 메티오닌의 유사체 (예를 들면, 에티오닌)에 대한 내성 등의 특성을 갖는다. 상기 대장균 TF4076에서 아스파라긴산 산화효소 및 퀴놀린산 신타아제의 활성이 강화되도록 변형하고, 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제의 활성을 제거하여 퀴놀린산 생산능이 향상된 미생물을 제조할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 퀴놀린산 생산능을 갖는 미생물은 아스파라긴산의 생합성 경로가 강화된 쓰레오닌 생산균주 TF4076(KFCC 10718, 한국특허공고 제92-8365호)에 아스파라긴산 산화효소 및 퀴놀린산 신타아제를 코딩하는 유전자의 발현 강화와 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제의 활성 제거 및 저하를 통하여 퀴놀린산 생합성 경로가 강화된 대장균일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 퀴놀린산 생산능을 갖는 미생물은 아스파라긴산의 생합성 경로가 강화된 라이신, 쓰레오닌, 이소루이신, 또는 메티오닌 생산균주 유래의 균주일 수 있다.

대장균 TF4076 균주로부터 아스파라긴산 산화효소 및 퀴놀린산 신타아제를 코딩하는 유전자의 발현을 강화하고, 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제의 활성을 약화 또는 제거하여 퀴놀린산 생산균주인 대장균 CV01 -0009를 부다페스트 조약 하에 서울 서대문구 홍제1동 소재의 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2011년 1월 10일자로 수탁번호 KCCM11165P로 기탁하였다.

본 발명의 니코틴산을 제조하는 방법은 퀴놀린산 생산능을 갖는 미생물을 배양하여 퀴놀린산이 포함된 배양액을 수득하는 단계를 포함한다.

퀴놀린산 생산능을 갖는 미생물의의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다.　이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 미생물에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.　배양 방법은 회분식, 연속식 및 유가식 배양을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 미생물의 다양한 배양 방법이 예를 들어 "Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176에 개시되어 있다.

배양에 사용되는 배지는 특정한 미생물의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다.　다양한 미생물의 배지는 예를 들어 문헌("Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., 미국, 1981)에 개시되어 있다.　상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다.　

미생물 배양용 배지에 이용가능한 탄소원은, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리셀롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 탄소원은 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있다.　

미생물 배양용 배지에 이용가능한 질소원은 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 질소원은 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있다.　

미생물 배양용 배지는 인의 공급원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염을 포함할 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다.　이 외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다.　미생물 배양용 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다.　또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.　배양액의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양액 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다.　배양액의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다.　배양기간은 원하는 퀴놀린산의 생성량이 얻어질 때까지 지속될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 160 시간이다.

본 발명의 니코틴산 제조 방법은 퀴놀린산이 포함된 배양액에 산을 첨가하고 탈탄산 반응을 수행하는 단계를 포함한다.

보다 구체적으로 퀴놀린산 생산능을 갖는 미생물의 배양 후 수득된 퀴놀린산 함유 배양액에서 원심분리 또는 막 여과 방법을 통하여 미생물을 제거한다. 그 후, 탈탄산반응을 촉진하기 위해 퀴놀린산을 포함하는 배양액에 수소기를 제공하는 산을 첨가한다. 배양액에 수소기를 제공할 수 있으면 첨가되는 산의 종류는 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서, 퀴놀린산이 포함된 배양액은 정제 없이 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 배양액에 첨가되는 산은 염산 또는 황산일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 산의 첨가 후 배양액의 pH는 5 이하일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 산의 첨가 후 배양액의 pH는 2 내지 3일 수 있다.

본발명의 일 구체예에서, 배양액의 탈탄산 반응시 온도는 100℃ 내지 150℃일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 배양액의 탈탄산 반응시 온도는 135℃일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 배양액의 탈탄산 반응시 압력은 0.1 MPa 내지 0.5 MPa일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 배양액의 탈탄산 반응시 압력은 0.3 MPa일 수 있다.

퀴놀린산을 포함하는 발효액에 산을 첨가한 후 1시간 내지 3시간 동안 고온 및 고압 조건 하에 탈탄산 반응을 수행하면, 하기식에 표시된 바와 같이 배양액 내의 퀴놀린산이 니코틴산으로 변환된다.

퀴놀리네이트 + 2H⁺ <=> CO₂ + 니코티네이트

본 발명의 니코틴산을 제조하는 방법은 니코틴을 회수하고 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서, 니코틴산의 회수는 배양액의 여과 및 결정화 과정을 포함하는 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다.　 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 기존의 화학적 합성법에 의해 제조되는 니코틴산의 제조 공정을 발효에 의한 퀴놀린산 생산 단계 및 퀴놀린산을 포함하는 배양액의 산 리 및 탈탄산 반응에 의해 퀴놀린산을 니코틴산으로 전환시키는 단계로 구성되는 방법을 통해 제조하여, 기존에 문제가 되었던 화학적 합성법의 촉매 부산물, 고에너지, 재사용 불가능한 자원 이용에 따른 환경적인 문제와 생물학적 생산에서의 낮은 수율을 해소하고, 보다 친환경적이고 효율적으로 니코틴산을 생산할 수 있게 한다.

도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 니코틴산의 제조 방법에서 니코틴산의 제조 경로를 보여준다.
도 2는 아스파라긴산 산화효소 및 퀴놀린산 신타아제를 코딩하는 유전자의 발현 플라스미드인 pPro - nadBA의 구조를 보여준다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따라, 배양액 중의 퀴놀린산 및 배양액의 탈탄산 반응 후 수득된 니코틴산을 확인하는 HPLC 결과를 보여준다.

실시예 1. 퀴놀린산 생산용 균주 제작

1-1. 아스파라긴산 산화효소 발현용 플라스미드 제작

대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, 아스파라긴산 산화효소를 코딩하는 유전자 nadB를 수득하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행 (NIH GenBank)으로부터 서열번호 13의 nadB 유전자의 염기서열(NCBI 등록번호 "GI:89109380")을 수득하고, 이에 근거하여 nadB 유전자의 ATG 부분과 TAA를 함유하는 ORF 부분을 증폭할 수 있고 제한효소 인식부위 NdeI과 BamHI를 갖는 서열번호 1 및 2의 프라이머를 합성하였다.

대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1과 2의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra^TM DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하고, PCR은 96℃에서의 30초의 변성, 50℃에서의 30초의 어닐링, 및 72℃에서의 2분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다. 그 결과, nadB 유전자와 제한효소 NdeI 및 BamHI의 인식부위를 함유한 약 1.9kb의 증폭된 유전자를 수득하였다.

상기 PCR을 통하여 수득된 nadB 유전자를 제한효소 NdeI 및 BamHI으로 처리하고, 제한효소 NdeI 및 BamHI로 처리한 pProLar (CloneTech) 벡터에 접합(ligation)을 통하여 클로닝하고 최종적으로 구성적 프로모터인 pPro 프로모터에 의해 발현 조절을 받는 nadB 유전자가 클로닝된 pPro-nadB 재조합 벡터를 제작하였다.

1-2 아스파라긴산 산화효소 및 퀴놀린산 신타아제 발현용 플라스미드 제작

대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, 퀴놀린산 신타아제를 코딩하는 유전자 nadA를 수득하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행 (NIH GenBank)으로부터 서열번호 14의 nadA 유전자의 염기서열 정보 (NCBI 등록번호 "GI:89107601")를 수득하고 이에 근거하여 nadA 유전자의 ATG 부분과 TAA를 함유하는 ORF부분을 증폭할 수 있고 제한효소 ApaI 및 NotI의 인식부위를 갖는 서열번호 3 및 4의 프라이머를 합성하였다.

대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra^TM DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하고, PCR은 96℃에서의 30초의 변성, 50℃에서의 30초의 어닐링, 및 72℃에서의 2분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다. 그 결과, nadA 유전자와 제한효소 ApaI과 NotI의 인식부위를 함유한 약 1.0kb의 증폭된 유전자를 획득하였다.

또한 대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, cysK 프로모터를 수득하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행 (NIH GenBank)으로부터 cysK 유전자의 상류(upstream) 0.3 kb 내에 위치한 프로모터의 염기서열 정보(서열번호 17)를 수득하고, 이에 근거하여 cysK 프로모터와 상기에 증폭된 nadA유전자를 접합시키기 위해 제한효소 BamHI과 ApaI의 인식부위를 갖는 서열번호 5 및 6의 프라이머를 합성하였다.

대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra^TM DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 96℃에서의 30초의 변성, 50℃에서의 30초의 어닐링, 및 72℃에서의 1분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하였다. 그 결과, cysK 프로모터와 제한효소 BamHI과 ApaI를 함유한 약 0.3kb의 증폭된 유전자를 획득하였다.

상기 PCR을 통하여 획득한 nadA 유전자를 제한효소 ApaI 및 NotI으로 처리하고, 증폭된 cysK 프로모터 절편을 ApaI 및 BamHI으로 처리하였다. 제한효소로 처리한 nadA 및 cysK 프로모터 절편을 제한효소 NotI 및 BamHI으로 처리한 상기 1-1에서 수득된 pPro-nadB 벡터에 접합을 통하여 클로닝하고 최종적으로 구성적 프로모터인 pPro 프로모터에 의해 발현 조절을 받는 nadB 유전자와 cysk 유전자 프로모터에 의해 발현 조절을 받는 nadA 유전자가 클로닝된 5.9Kb의 pPro-nadBA 재조합 벡터를 제작하였다. 제작된 pPro-nadBA는 서열번호 18의 서열을 갖는다. 도 2는 아스파라긴산 산화효소 및 퀴놀린산 신타아제를 코딩하는 유전자의 발현 플라스미드인 pPro-nadBA의 구조를 보여준다.

1-3. 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제 제거 균주 제작.

본 실시예에서는 대장균 TF4076의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, 퀴놀린산 분해경로의 nadC 유전자를 수득하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행 (NIH GenBank)으로부터 nadC 유전자의 염기서열 정보 (NCBI 등록번호 "GI:89106990")를 수득하고, 이에 근거하여 nadC 유전자의 하류(downstream) 부분을 증폭하는 서열번호 7 및 8의 프라이머, nadC의 상류 및 하류 부분과 loxpCm을 증폭하는 서열번호 9 및 10의 프라이머, 상류 부분을 증폭하는 서열번호 11 및 12의 프라이머를 합성하였다.

대장균 TF4076의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 7과 8 및 11과 12의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하여 각각 0.5 kb 및 0.3 kb의 nadC 유전자의 상류 부분 및 하류 부분을 증폭하였다. 또한, loxpCm을 함유하고 있는 플라스미드 벡터 pLoxpCat2 벡터를 주형으로 하여 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하여 1.0kb의 양말단에 nadC 유전자와 상동 서열을 갖는 loxpCm 유전자를 증폭하였다. 중합효소는 PfuUltra^TM DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하고, PCR은 96℃에서 30초의 변성, 53℃에서 30초의 어닐링, 및 72℃에서 1분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다. 이후 상기의 PCR 반응을 통하여 얻어진 nadC-상류 절편, nadC-하류 절편, loxpCm 절편을 주형으로 하여 PCR을 수행하였으며, PCR 조건은 96℃에서의 60초의 변성, 50℃에서의 60초의 변성, 및 72℃에서의 1분의 신장으로 구성된 사이클의 10회 반복 및 서열번호 7 및 12의 프라이머 첨가 후 사이클의 20회 반복이었다. 그 결과 1.8kb의 nadC 유전자 상류-loxpCm-하류를 함유한 nadC 제거 카세트를 획득하였다.

제작된 nadC 제거 카세트를 람다 레드 재조합효소(lambda red recombinase) 발현 벡터인 pKD46을 함유한 대장균 TF4076 상에 전기천공을 통하여 형질전환시키고 선별마커인 클로람페니콜이 함유된 LB(Luria-Bertani) 평판배지(트립톤 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 10g, 및 아가 1.5%/L) 상에 도말하여 37℃에서 밤새 배양한 후, 클로람페니콜에 대한 내성을 보이는 균주를 선별하였다.

선별된 균주를 직접 주형으로 하여 서열번호 7 및 12의 프라이머를 이용하여 같은 조건으로 PCR을 수행한 후, 1.0% 아가로오스 겔 상에서 유전자의 크기가 야생주의 경우 1.0kb, nadC 제거 균주의 경우 1.8kb인 것을 확인함으로써 nadC 유전자의 결실을 확인하였다. 또한 상기의 방법과 동일한 방법을 통하여 야생형 대장균인 E.coli W3110의 nadC 유전자를 제거하였다.

1-4. 퀴놀린산 생산용 균주 제작

실시예 1-2에서 제작된 pPro-nadBA 플라스미드를 실시예 1-3에서 제작된 TF4076△ nadC 균주와 W3110 △ nadC에 CaCl₂ 방법을 통하여 형질전환시킨 후 LB-Km (효모 추출물 10g/L, NaCl 5g/L, 트립톤 10g/L, 카나마이신 25㎍/L) 평판 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 그 후, 카나마이신 내성을 갖는 콜로니를 10주씩 선발하였다. 이렇게 제작된 퀴놀린산 생산균주를 CV01 -0009로 명명하였다.

실시예 2. 니코틴산의 제조

2-1. 퀴놀린산 생산

실시예 1에서 제조된 퀴놀린산 생산 균주를 37℃의 배양기에서 LB-Km 평판배지 중에 밤새 배양하여 수득한 단일 콜로니를 25 ml의 퀴놀린산 역가 배지에 1 백금이씩 접종하여 37℃에서 250 rpm으로 24 내지 72 시간 동안 배양하였다. 하기의 표 1은 퀴놀린산 생산용 배지의 조성을 표시한다.

조성	농도(리터당)
포도당	70 g
황산암모늄	17 g
KH2PO4	1.0 g
MgSO4ㆍ7H2O	0.5 g
FeSO4ㆍ7H2O	5 mg
MnSO4ㆍ8H2O	5 mg
ZnSO4	5 mg
탄산칼슘	30 g
효모 추출물	2 g
메티오닌	0.15g

배양액 중의 퀴놀린산을 HPLC에 의하여 분석하였다. 분석 결과가 하기 표 2에 표시되며, 이는 균주의 퀴놀린산 생산능을 나타낸다. 하기의 표 2에 표시된 바와 같이 쓰레오닌 생산 균주 유래의 TF4076 및 야생형 대장균인 W3110 균주에 프로모터 치환을 통해 아스파라긴산 산화효소 및 퀴놀린산 신타아제를 코딩하는 유전자의 발현을 강화할 경우 두 균주 모두에서 퀴놀린산은 생산되지 않았다. 이는 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제의 활성으로 인하여 생성된 퀴놀린산이 모두 NAD 합성 경로에서 소모되기 때문이다.

균주	플라스미드	퀴놀린산 (g/L)
W3110	-	미검출(ND)
	pWN - nadBA	미검출
W3110 △ nadC	-	미검출
	pWN - nadBA	0.4
TF4076	-	미검출
	pWN - nadBA	미검출
TF4076 △ nadC	-	0.1
	pWN - nadBA	5.5

세포 내에서 생산된 퀴놀린산의 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제에 의한 분해를 억제하기 위하여 대장균 TF4076 및 W3110 에서 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제를 제거한 후 아스파라긴산 산화효소 및 퀴놀린산 신타아제의 발현을 강화시킨 균주, W3110△nadC는 0.4g/L의 퀴놀린산을 생산하며 쓰레오닌 균주 유래의 TF4076△nadC는 균주 자체가 가지고 있는 아스파라긴산으로의 강화된 생합성 경로로 인하여 야생주인 W3110△nadC 균주 대비 13배 이상 높은 5.5g/L의 퀴놀린산을 생산하였다. 즉 아스파라긴산 산화효소 및 퀴놀린산 신타아제의 발현 강화, 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제의 활성 제거, 및 아스파라긴산 생합성 경로의 강화의 조합을 통하여 기존의 균주보다 더 높은 효율로 퀴놀린산을 생산한다는 것을 확인하였다.

2-2. 탈탄산 반응을 통한 니코틴산 생산

퀴놀린산 생산균주인 CV01-0009 균주의 배양액인 퀴놀린산을 5.5g/L 함유한 배양액 중 퀴놀린산을 니코틴산으로 전환하기 위하여 고온, 고압 조건에서 탈탄산 반응을 수행하였다. 먼저 퀴놀린산 배양액 중의 세포를 제거하기 위해 3000 내지 4000 rpm으로 10 내지 30분 동안 원심분리를 수행하였다. 원심분리 후 수득된 퀴놀린산 함유 상등액을 분리하여 탈탄산 반응의 시료로 사용하였다. 탈탄산 반응은 135℃ 및 0.2MPa의 조건 하에 3시간 동안 수행하였고, 사용된 시료의 조건은 하기의 표 3과 같았다. 대조군 실험으로 수행된 탈이온수에 사용된 퀴놀린산은 Sigma-Aldrich사의 표준품을 사용하였으며 퀴놀린산 수용액의 pH는 수산화나트륨, 암모니아수, 염산, 또는 황산 등을 이용하여 적정하였다. 하기의 표 3은 고온고압 반응에 의한 퀴놀린산의 니코틴산으로의 전환율을 표시한다. 도 3은 배양액 중의 퀴놀린산 및 배양액의 탈탄산 반응 후 수득된 니코틴산을 확인하는 HPLC 결과를 보여준다.

퀴놀린산	용액	pH (산)	니코틴산	수율
				g/g	몰 기준
5.5 g/L	탈이온수	-	3.8 g/L	70%	95%
	배양액	6 - 7	ND	-	-
		2 (HCl)	4.0 g/L	73%	99%
		3 (HCl)	3.4 g/L	63%	85%
		2 (H2SO4)	3.6 g/L	66%	90%
		3 (H2SO4)	3.0 g/L	55%	75%

선행문헌인 중국특허 CN101353322C에서 개시된 탈이온수를 수용액으로 하여 150 내지 250℃ 및 2MPa보다 낮은 온도 및 압력 조건인 135℃ 및 0.2MPa에서 퀴놀린산을 니코틴산으로 전환하는 실험을 3시간 동안 수행하여 상기 표 3의 결과를 수득하였다. 이는 선행 문헌에 개시된 조건보다 낮은 온도 및 압력 조건에서도 퀴놀린산이 니코틴산으로 95% 전환되었다는 것을 보여준다.

선행문헌과 동일한 방법이나 퀴놀린산의 수용액이 발효 배양액인 상태로 니코틴산 전환 실험을 수행하였다. 그 결과, 탈이온수의 사용시에는 니코틴산으로 전환되었던 퀴놀린산이 배양액 중에서는 니코틴산으로 전환되지 않았다. 이는 배양액 내에 존재하는 다양한 이온들이 퀴놀린산의 탈탄산 반응이 일어나기 위한 필요조건인 카르복실기에 대한 수소 이온의 접근 및 수소 이온의 이동을 방해하기 때문이다. 이를 해결 하기 위하여 발효액 중의 퀴놀린산과 수소 이온이 접촉할 수 있는 기회를 높여주고자 수소 이온의 농도를 높여주는 방법을 통해 퀴놀린산을 포함하는 발효액의 탈탄산 반응 여부를 확인하고자 하였다. 이를 위해 퀴놀린산을 포함하는 배양액의 pH를 6 내지 7에서 염산 또는 황산을 사용하여 수소 이온이 높은 농도로 유지될 수 있는 pH 2 내지 3의 범위로 적정하였다.

그 결과, 염산을 첨가하여 배양액의 pH를 2 내지 3으로 적정한 경우, 퀴놀린산의 니코틴산으로의 전환율이 85% 내지 99%였고, 황산의 경우 75% 내지 90%였다. 이에 의해, 미생물의 배양 후 수득된 퀴놀린산을 함유하는 배양액의 추가적인 정제 없이 산의 첨가 및 선행문헌 대비 온건한 온도 및 압력 조건 하에서의 탈탄산 반응에 의해 니코틴산을 효율적으로 생산할 수 있었다.

한국미생물보존센터(국외) KCCM11165 20110110

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Method for the preparation of nicotinic acid <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of nadB <400> 1 catatgaata ctctccctga acatt 25 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of nadB <400> 2 ggatccctat accactacgc ttgatcac 28 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of nadA <400> 3 gggcccatga gcgtaatgtt tgatcca 27 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of nadA <400> 4 gcggccgctc gtgcctaccg cttcg 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of cysK promoter <400> 5 ggatccccag cctgtttacg atgat 25 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of cysK promoter <400> 6 gggccctcct taactgtatg aaattggg 28 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> 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<213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(1044) <223> nadA ORF <400> 14 atgagcgtaa tgtttgatcc agacacggcg atttatcctt tccccccgaa gccgacgccg 60 ttaagcattg atgaaaaagc gtattaccgc gagaagataa aacgtctgct aaaagaacgt 120 aatgcggtga tggttgccca ctactatacc gatcccgaaa ttcaacaact ggcagaagaa 180 accggtggct gtatttctga ttctctggaa atggcgcgct tcggtgcaaa gcatcccgct 240 tctactttgt tagtcgctgg ggtgagattt atgggagaaa ccgccaaaat tctcagtccg 300 gaaaaaacaa ttctgatgcc gacacttcag gctgaatgtt cactggatct cggctgccct 360 gttgaagaat ttaacgcatt ttgcgatgcc catcccgatc gtactgtcgt cgtctacgcc 420 aacacttctg ctgcggtaaa agcgcgcgca gattgggtgg taacttcaag cattgccgtc 480 gaacttattg atcatcttga tagtttgggt gaaaaaatca tctgggcacc cgacaaacat 540 ctggggcgtt acgtgcaaaa acagacgggt ggagacattc tatgctggca gggtgcctgt 600 attgtgcatg atgaatttaa gactcaggcg ttaacccgct tgcaagaaga atacccggat 660 gctgccatac tggtgcatcc agaatcacca caagctattg tcgatatggc ggatgcggtc 720 ggttccacca gtcaactgat cgctgctgcg aaaacattgc cacatcagag gcttattgtg 780 gcaaccgatc ggggtatttt ctacaaaatg cagcaggcgg tgccagataa agagttactg 840 gaagcaccaa ccgcaggtga gggtgcaacc tgccgcagct gcgcgcattg tccgtggatg 900 gccatgaatg gccttcaggc catcgcagag gcattagaac aggaaggaag caatcacgag 960 gttcatgttg atgaaaggct gcgagagagg gcgctggtgc cgctcaatcg tatgctggat 1020 tttgcggcta cactacgtgg ataa 1044 <210> 15 <211> 894 <212> DNA <213> Escherichia coli W3110 <220> <221> gene <222> (1)..(894) <223> nadC ORF <400> 15 atgccgcctc gccgctataa ccctgacacc cgacgtgacg agctgctgga acgcattaat 60 ctcgatatcc ccggcgcggt ggcccaggcg ctgcgggaag atttaggcgg aacagtcgat 120 gccaacaatg atattacggc aaaactttta ccggaaaatt ctcgctctca tgccacggtg 180 atcacccgcg agaatggcgt cttttgcggc aaacgctggg ttgaagaggt gtttattcaa 240 ctggcaggcg acgatgtcac cataatctgg catgtggatg acggcgatgt catcaatgcc 300 aatcaatcct tgttcgaact tgaaggccca tcccgcgtgc tgttaacggg cgaacgcact 360 gcgcttaatt ttgtgcaaac cctttcagga gttgccagta aggtacgcca ctatgtcgaa 420 ttgctggaag gcaccaacac gcagttgttg gatacgcgca aaaccttacc cggcctgcgt 480 tcagctctga aatacgcggt actttgcggc ggcggagcga atcaccgtct ggggctttct 540 gatgccttcc tgatcaaaga aaaccatatt attgcctccg gctcagtgcg ccaggcggtc 600 gaaaaagcgt cctggctgca cccggatgcg ccagtagaag tcgaagtaga gaatctggaa 660 gaacttgatg aagccctgaa agcaggagcc gatatcatca tgctggataa cttcgaaaca 720 gaacagatgc gcgaagccgt caaacgcacc aacggcaagg cgctactgga agtgtctggc 780 aacgtcactg acaaaacact gcgtgaattt gccgaaacgg gcgtggactt tatctccgtc 840 ggtgcgctaa ctaaacacgt acaagcactc gacctttcaa tgcgttttcg ctaa 894 <210> 16 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pro promoter <400> 16 ctcgagcata gcatttttat ccataagatt agcggatcta acctttacaa ttgtgagcgc 60 tcacaattat gatagattca attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag 120 aggagaaagg tacat 135 <210> 17 <211> 294 <212> DNA <213> Escherichia coli W3110 <220> <221> promoter <222> (1)..(294) <223> cysK promoter <400> 17 ccagcctgtt tacgatgatc ccgctgctta atctgttcat catgcccgtt gccgtttgtg 60 gcgcgacggc gatgtgggtc gattgctatc gcgataaaca cgcgatgtgg cggtaacaat 120 ctaccggtta ttttgtaaac cgtttgtgtg aaacaggggt ggcttatgcc gccccttatt 180 ccatcttgca tgtcattatt tcccttctgt atatagatat gctaaatcct tacttccgca 240 tattctctga gcgggtatgc tacctgttgt atcccaattt catacagtta agga 294 <210> 18 <211> 5900 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid vector (pPro-nadBA) <400> 18 ctcgagcata gcatttttat ccataagatt agcggatcta acctttacaa ttgtgagcgc 60 tcacaattat gatagattca attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag 120 aggagaaagg tacatatgaa tactctccct gaacattcat gtgacgtgtt gattatcggt 180 agcggcgcag ccggactttc actggcgcta cgcctggctg accagcatca ggtcatcgtt 240 ctaagtaaag gcccggtaac ggaaggttca acattttatg cccagggcgg tattgccgcc 300 gtgtttgatg aaactgacag cattgactcg catgtggaag acacattgat tgccggggct 360 ggtatttgcg atcgccatgc agttgaattt gtcgccagca atgcacgatc ctgtgtgcaa 420 tggctaatcg accagggggt gttgtttgat acccacattc aaccgaatgg cgaagaaagt 480 taccatctga cccgtgaagg tggacatagt caccgtcgta ttcttcatgc cgccgacgcc 540 accggtagag aagtagaaac cacgctggtg agcaaggcgc tgaaccatcc gaatattcgc 600 gtgctggagc gcagcaacgc ggttgatctg attgtttctg acaaaattgg cctgccgggc 660 acgcgacggg ttgttggcgc gtgggtatgg aaccgtaata aagaaacggt ggaaacctgc 720 cacgcaaaag cggtggtgct ggcaaccggc ggtgcgtcga aggtttatca gtacaccacc 780 aatccggata tttcttctgg cgatggcatt gctatggcgt ggcgcgcagg ctgccgggtt 840 gccaatctcg aatttaatca gttccaccct accgcgctat atcacccaca ggcacgcaat 900 ttcctgttaa cagaagcact gcgcggcgaa ggcgcttatc tcaagcgccc ggatggtacg 960 cgttttatgc ccgattttga tgagcgcggc gaactggccc cgcgcgatat tgtcgcccgc 1020 gccattgacc atgaaatgaa acgcctcggc gcagattgta tgttccttga tatcagccat 1080 aagcccgccg attttattcg ccagcatttc ccgatgattt atgaaaagct gctcgggctg 1140 gggattgatc tcacacaaga accggtaccg attgtgcctg ctgcacatta tacctgcggt 1200 ggtgtaatgg ttgatgatca tgggcgtacg gacgtcgagg gcttgtatgc cattggcgag 1260 gtgagttata ccggcttaca cggcgctaac cgcatggcct cgaattcatt gctggagtgt 1320 ctggtctatg gctggtcggc ggcggaagat atcaccagac gtatgcctta tgcccacgac 1380 atcagtacgt taccgccgtg ggatgaaagc cgcgttgaga accctgacga acgggtagta 1440 attcagcata actggcacga gctacgtctg tttatgtggg attacgttgg cattgtgcgc 1500 acaacgaagc gcctggaacg cgccctgcgg cggataacca tgctccaaca agaaatagac 1560 gaatattacg cccatttccg cgtctcaaat aatttgctgg agctgcgtaa tctggtacag 1620 gttgccgagt tgattgttcg ctgtgcaatg atgcgtaaag agagtcgggg gttgcatttc 1680 acgctggatt atccggaact gctcacccat tccggtccgt cgatcctttc ccccggcaat 1740 cattacataa acagataaaa agcctgggtc agcgccgtat acgcttcgga atagttctgg 1800 tctggcccac gaatgactaa gcgatcgcta aagcattctc ccgcctgcgg ggagaatgcc 1860 agcagcaccc gatgcggcag tcgcgcttcg ttttccgcca catccgtccg caaacgtaaa 1920 tgccagccca tgcttaatgc cagctccgta aaaccattac caatctgctc tggcagcact 1980 acgcagaaaa atccctcttc ggtaatgcac tccgccgcac aggtcagcaa cgatgggtga 2040 tcaagcgtag tggtataggg atccccagcc tgtttacgat gatcccgctg cttaatctgt 2100 tcatcatgcc cgttgccgtt tgtggcgcga cggcgatgtg ggtcgattgc tatcgcgata 2160 aacacgcgat gtggcggtaa caatctaccg gttattttgt aaaccgtttg tgtgaaacag 2220 gggtggctta tgccgcccct tattccatct tgcatgtcat tatttccctt ctgtatatag 2280 atatgctaaa tccttacttc cgcatattct ctgagcgggt atgctacctg ttgtatccca 2340 atttcataca gttaaggagg gcccatgagc gtaatgtttg atccagacac ggcgatttat 2400 cctttccccc cgaagccgac gccgttaagc attgatgaaa aagcgtatta ccgcgagaag 2460 ataaaacgtc tgctaaaaga acgtaatgcg gtgatggttg cccactacta taccgatccc 2520 gaaattcaac aactggcaga agaaaccggt ggctgtattt ctgattctct ggaaatggcg 2580 cgcttcggtg caaagcatcc cgcttctact ttgttagtcg ctggggtgag atttatggga 2640 gaaaccgcca aaattctcag tccggaaaaa acaattctga tgccgacact tcaggctgaa 2700 tgttcactgg atctcggctg ccctgttgaa gaatttaacg cattttgcga tgcccatccc 2760 gatcgtactg tcgtcgtcta cgccaacact tctgctgcgg taaaagcgcg cgcagattgg 2820 gtggtaactt caagcattgc cgtcgaactt attgatcatc ttgatagttt gggtgaaaaa 2880 atcatctggg cacccgacaa acatctgggg cgttacgtgc aaaaacagac gggtggagac 2940 attctatgct ggcagggtgc ctgtattgtg catgatgaat ttaagactca ggcgttaacc 3000 cgcttgcaag aagaataccc ggatgctgcc atactggtgc atccagaatc accacaagct 3060 attgtcgata tggcggatgc ggtcggttcc accagtcaac tgatcgctgc tgcgaaaaca 3120 ttgccacatc agaggcttat tgtggcaacc gatcggggta ttttctacaa aatgcagcag 3180 gcggtgccag ataaagagtt actggaagca ccaaccgcag gtgagggtgc aacctgccgc 3240 agctgcgcgc attgtccgtg gatggccatg aatggccttc aggccatcgc agaggcatta 3300 gaacaggaag gaagcaatca cgaggttcat gttgatgaaa ggctgcgaga gagggcgctg 3360 gtgccgctca atcgtatgct ggattttgcg gctacactac gtggataacg aataataagg 3420 cgtaacgtta cgctttgggg gaaagatgga tttttttagt gtgcagaata tcctggtaca 3480 tataccaata ggggcaggcg gttatgatct ctcatggatc gaagcggtag gcacgagcgg 3540 ccgcttaatt aattaatcta gaggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg 3600 gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg 3660 ccctagacct aggggatata ttccgcttcc tcgctcactg actcgctacg ctcggtcgtt 3720 cgactgcggc gagcggaaat ggcttacgaa cggggcggag atttcctgga agatgccagg 3780 aagatactta acagggaagt gagagggccg cggcaaagcc gtttttccat aggctccgcc 3840 cccctgacaa gcatcacgaa atctgacgct caaatcagtg gtggcgaaac ccgacaggac 3900 tataaagata ccaggcgttt ccccctggcg gctccctcgt gcgctctcct gttcctgcct 3960 ttcggtttac cggtgtcatt ccgctgttat ggccgcgttt gtctcattcc acgcctgaca 4020 ctcagttccg ggtaggcagt tcgctccaag ctggactgta tgcacgaacc ccccgttcag 4080 tccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccgga aagacatgca 4140 aaagcaccac tggcagcagc cactggtaat tgatttagag gagttagtct tgaagtcatg 4200 cgccggttaa ggctaaactg aaaggacaag ttttggtgac tgcgctcctc caagccagtt 4260 acctcggttc aaagagttgg tagctcagag aaccttcgaa aaaccgccct gcaaggcggt 4320 tttttcgttt tcagagcaag agattacgcg cagaccaaaa cgatctcaag aagatcatct 4380 tattaatcag ataaaatatt actagatttc agtgcaattt atctcttcaa atgtagcacc 4440 tgaagtcagc cccatacgat ataagttgtt actagtgctt ggattctcac caataaaaaa 4500 cgcccggcgg caaccgagcg ttctgaacaa atccagatgg agttctgagg tcattactgg 4560 atctatcaac aggagtccaa gcgagctctc gaaccccaga gtcccgctca gaagaactcg 4620 tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg 4680 aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct 4740 atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg 4800 ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag gcatcgccat gggtcacgac gagatcctcg 4860 ccgtcgggca tgcgcgcctt gagcctggcg aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc 4920 tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg 4980 atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc 5040 cgcattgcat cagccatgat ggatactttc tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga 5100 tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg 5160 agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtcc 5220 tgcagttcat tcagggcacc ggacaggtcg gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc 5280 gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag 5340 ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc 5400 atgcgaaacg atcctcatcc tgtctcttga tcagatcttg atcccctgcg ccatcagatc 5460 cttggcggca agaaagccat ccagtttact ttgcagggct tcccaacctt accagagggc 5520 gccccagctg gcaattccga cgtctgtgtg gaattctcgg acaccgagga gaatgtcaag 5580 aggcgaacac acaacgtctt ggagcgccag aggaggaacg agctaaaacg gagctttttt 5640 gccctgcgtg accagatccc ggagttggaa aacaatgaaa aggcccccaa ggtagttatc 5700 cttaaaaaag ccacagcata catcctgtcc gtccaagcag aggagcaaaa gctcatttct 5760 gaagaggact tgttgcggaa acgacgagaa cagttgaaac acaaacttga acagctacgg 5820 aactcttgtg cgtaaggaaa agtaaggaaa acgattcctt ctaacagaaa tgtcctgagc 5880 aatcacctat gaactgtcga 5900 <210> 19 <211> 540 <212> PRT <213> Escherichia coli W3110 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(540) <223> NadB - aspartate oxidase <400> 19 Met Asn Thr Leu Pro Glu His Ser Cys Asp Val Leu Ile Ile Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ala Ala Gly Leu Ser Leu Ala Leu Arg Leu Ala Asp Gln His Gln 20 25 30 Val Ile Val Leu Ser Lys Gly Pro Val Thr Glu Gly Ser Thr Phe Tyr 35 40 45 Ala Gln Gly Gly Ile Ala Ala Val Phe Asp Glu Thr Asp Ser Ile Asp 50 55 60 Ser His Val Glu Asp Thr Leu Ile Ala Gly Ala Gly Ile Cys Asp Arg 65 70 75 80 His Ala Val Glu Phe Val Ala Ser Asn Ala Arg Ser Cys Val Gln Trp 85 90 95 Leu Ile Asp Gln Gly Val Leu Phe Asp Thr His Ile Gln Pro Asn Gly 100 105 110 Glu Glu Ser Tyr His Leu Thr Arg Glu Gly Gly His Ser His Arg Arg 115 120 125 Ile Leu His Ala Ala Asp Ala Thr Gly Arg Glu Val Glu Thr Thr Leu 130 135 140 Val Ser Lys Ala Leu Asn His Pro Asn Ile Arg Val Leu Glu Arg Ser 145 150 155 160 Asn Ala Val Asp Leu Ile Val Ser Asp Lys Ile Gly Leu Pro Gly Thr 165 170 175 Arg Arg Val Val Gly Ala Trp Val Trp Asn Arg Asn Lys Glu Thr Val 180 185 190 Glu Thr Cys His Ala Lys Ala Val Val Leu Ala Thr Gly Gly Ala Ser 195 200 205 Lys Val Tyr Gln Tyr Thr Thr Asn Pro Asp Ile Ser Ser Gly Asp Gly 210 215 220 Ile Ala Met Ala Trp Arg Ala Gly Cys Arg Val Ala Asn Leu Glu Phe 225 230 235 240 Asn Gln Phe His Pro Thr Ala Leu Tyr His Pro Gln Ala Arg Asn Phe 245 250 255 Leu Leu Thr Glu Ala Leu Arg Gly Glu Gly Ala Tyr Leu Lys Arg Pro 260 265 270 Asp Gly Thr Arg Phe Met Pro Asp Phe Asp Glu Arg Gly Glu Leu Ala 275 280 285 Pro Arg Asp Ile Val Ala Arg Ala Ile Asp His Glu Met Lys Arg Leu 290 295 300 Gly Ala Asp Cys Met Phe Leu Asp Ile Ser His Lys Pro Ala Asp Phe 305 310 315 320 Ile Arg Gln His Phe Pro Met Ile Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Leu Gly 325 330 335 Ile Asp Leu Thr Gln Glu Pro Val Pro Ile Val Pro Ala Ala His Tyr 340 345 350 Thr Cys Gly Gly Val Met Val Asp Asp His Gly Arg Thr Asp Val Glu 355 360 365 Gly Leu Tyr Ala Ile Gly Glu Val Ser Tyr Thr Gly Leu His Gly Ala 370 375 380 Asn Arg Met Ala Ser Asn Ser Leu Leu Glu Cys Leu Val Tyr Gly Trp 385 390 395 400 Ser Ala Ala Glu Asp Ile Thr Arg Arg Met Pro Tyr Ala His Asp Ile 405 410 415 Ser Thr Leu Pro Pro Trp Asp Glu Ser Arg Val Glu Asn Pro Asp Glu 420 425 430 Arg Val Val Ile Gln His Asn Trp His Glu Leu Arg Leu Phe Met Trp 435 440 445 Asp Tyr Val Gly Ile Val Arg Thr Thr Lys Arg Leu Glu Arg Ala Leu 450 455 460 Arg Arg Ile Thr Met Leu Gln Gln Glu Ile Asp Glu Tyr Tyr Ala His 465 470 475 480 Phe Arg Val Ser Asn Asn Leu Leu Glu Leu Arg Asn Leu Val Gln Val 485 490 495 Ala Glu Leu Ile Val Arg Cys Ala Met Met Arg Lys Glu Ser Arg Gly 500 505 510 Leu His Phe Thr Leu Asp Tyr Pro Glu Leu Leu Thr His Ser Gly Pro 515 520 525 Ser Ile Leu Ser Pro Gly Asn His Tyr Ile Asn Arg 530 535 540 <210> 20 <211> 347 <212> PRT <213> Escherichia coli W3110 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(347) <223> NadA - quinolinate sythase <400> 20 Met Ser Val Met Phe Asp Pro Asp Thr Ala Ile Tyr Pro Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Thr Pro Leu Ser Ile Asp Glu Lys Ala Tyr Tyr Arg Glu Lys 20 25 30 Ile Lys Arg Leu Leu Lys Glu Arg Asn Ala Val Met Val Ala His Tyr 35 40 45 Tyr Thr Asp Pro Glu Ile Gln Gln Leu Ala Glu Glu Thr Gly Gly Cys 50 55 60 Ile Ser Asp Ser Leu Glu Met Ala Arg Phe Gly Ala Lys His Pro Ala 65 70 75 80 Ser Thr Leu Leu Val Ala Gly Val Arg Phe Met Gly Glu Thr Ala Lys 85 90 95 Ile Leu Ser Pro Glu Lys Thr Ile Leu Met Pro Thr Leu Gln Ala Glu 100 105 110 Cys Ser Leu Asp Leu Gly Cys Pro Val Glu Glu Phe Asn Ala Phe Cys 115 120 125 Asp Ala His Pro Asp Arg Thr Val Val Val Tyr Ala Asn Thr Ser Ala 130 135 140 Ala Val Lys Ala Arg Ala Asp Trp Val Val Thr Ser Ser Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Leu Ile Asp His Leu Asp Ser Leu Gly Glu Lys Ile Ile Trp Ala 165 170 175 Pro Asp Lys His Leu Gly Arg Tyr Val Gln Lys Gln Thr Gly Gly Asp 180 185 190 Ile Leu Cys Trp Gln Gly Ala Cys Ile Val His Asp Glu Phe Lys Thr 195 200 205 Gln Ala Leu Thr Arg Leu Gln Glu Glu Tyr Pro Asp Ala Ala Ile Leu 210 215 220 Val His Pro Glu Ser Pro Gln Ala Ile Val Asp Met Ala Asp Ala Val 225 230 235 240 Gly Ser Thr Ser Gln Leu Ile Ala Ala Ala Lys Thr Leu Pro His Gln 245 250 255 Arg Leu Ile Val Ala Thr Asp Arg Gly Ile Phe Tyr Lys Met Gln Gln 260 265 270 Ala Val Pro Asp Lys Glu Leu Leu Glu Ala Pro Thr Ala Gly Glu Gly 275 280 285 Ala Thr Cys Arg Ser Cys Ala His Cys Pro Trp Met Ala Met Asn Gly 290 295 300 Leu Gln Ala Ile Ala Glu Ala Leu Glu Gln Glu Gly Ser Asn His Glu 305 310 315 320 Val His Val Asp Glu Arg Leu Arg Glu Arg Ala Leu Val Pro Leu Asn 325 330 335 Arg Met Leu Asp Phe Ala Ala Thr Leu Arg Gly 340 345 <210> 21 <211> 297 <212> PRT <213> Escherichia coli W3110 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(297) <223> NadC - quinolinate phosphoribosyltransferase <400> 21 Met Pro Pro Arg Arg Tyr Asn Pro Asp Thr Arg Arg Asp Glu Leu Leu 1 5 10 15 Glu Arg Ile Asn Leu Asp Ile Pro Gly Ala Val Ala Gln Ala Leu Arg 20 25 30 Glu Asp Leu Gly Gly Thr Val Asp Ala Asn Asn Asp Ile Thr Ala Lys 35 40 45 Leu Leu Pro Glu Asn Ser Arg Ser His Ala Thr Val Ile Thr Arg Glu 50 55 60 Asn Gly Val Phe Cys Gly Lys Arg Trp Val Glu Glu Val Phe Ile Gln 65 70 75 80 Leu Ala Gly Asp Asp Val Thr Ile Ile Trp His Val Asp Asp Gly Asp 85 90 95 Val Ile Asn Ala Asn Gln Ser Leu Phe Glu Leu Glu Gly Pro Ser Arg 100 105 110 Val Leu Leu Thr Gly Glu Arg Thr Ala Leu Asn Phe Val Gln Thr Leu 115 120 125 Ser Gly Val Ala Ser Lys Val Arg His Tyr Val Glu Leu Leu Glu Gly 130 135 140 Thr Asn Thr Gln Leu Leu Asp Thr Arg Lys Thr Leu Pro Gly Leu Arg 145 150 155 160 Ser Ala Leu Lys Tyr Ala Val Leu Cys Gly Gly Gly Ala Asn His Arg 165 170 175 Leu Gly Leu Ser Asp Ala Phe Leu Ile Lys Glu Asn His Ile Ile Ala 180 185 190 Ser Gly Ser Val Arg Gln Ala Val Glu Lys Ala Ser Trp Leu His Pro 195 200 205 Asp Ala Pro Val Glu Val Glu Val Glu Asn Leu Glu Glu Leu Asp Glu 210 215 220 Ala Leu Lys Ala Gly Ala Asp Ile Ile Met Leu Asp Asn Phe Glu Thr 225 230 235 240 Glu Gln Met Arg Glu Ala Val Lys Arg Thr Asn Gly Lys Ala Leu Leu 245 250 255 Glu Val Ser Gly Asn Val Thr Asp Lys Thr Leu Arg Glu Phe Ala Glu 260 265 270 Thr Gly Val Asp Phe Ile Ser Val Gly Ala Leu Thr Lys His Val Gln 275 280 285 Ala Leu Asp Leu Ser Met Arg Phe Arg 290 295

Claims (14)

1. 퀴놀린산 생산능을 갖는 미생물을 배양하여 퀴놀린산이 포함된 배양액을 수득하는 단계, 및
   상기 배양액에 산을 첨가하고 탈탄산 반응을 수행하는 단계를 포함하는, 니코틴산을 제조하는 방법으로서,
   상기 미생물은 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제의 활성이 약화되거나 결실되고, 아스파라긴산 산화 효소 및 퀴놀린산 신타아제의 활성이 강화된 미생물이고,
   상기 탈탄산 반응에서 압력은 0.1 MPa 내지 0.5 MPa인 것인 니코틴산을 제조하는 방법.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제의 활성의 약화 또는 결실은 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자를 효소의 활성이 약화 또는 결실되도록 변형된 유전자로 대체하는 방법, 상기 유전자의 프로모터를 내재적 프로모터보다 약한 프로모터로 교체하는 방법 또는 상기 유전자를 염색체로부터 결실시키는 방법에 의해 수행되는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 아스파라긴산 산화 효소 및 퀴놀린산 신타아제의 활성은 아스파라긴산 산화 효소 및 퀴놀린산 신타아제를 코딩하는 유전자의 세포내 카피수를 증가시키는 방법, 상기 유전자의 발현 조절 서열을 변형시키는 방법, 및 상기 유전자를 효소의 활성이 강화되도록 변형된 유전자로 교체하는 방법으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의해 수행되는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 에스케리시아 속 미생물인 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 대장균 KMCC11165P인 것인 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 배양액에 첨가되는 산은 염산 또는 황산인 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 산의 첨가 후 배양액의 pH는 5 이하인 것인 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 탈탄산 반응에서 온도는 100℃ 내지 150℃인 것인 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 탈탄산 반응에서 온도는 135℃인 것인 방법.
12. 삭제
13. 제1항에 있어서, 상기 탈탄산 반응에서 압력은 0.3 MPa인 것인 방법.
14. 제1항에 있어서, 니코틴을 회수하고 정제하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.

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