JP2014504872A - ニコチン酸を製造する方法 - Google Patents

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Abstract


本発明は、キノリン酸生産能を有する微生物を培養することによってキノリン酸の含まれた培養液を得る段階と、前記培養液に酸を添加し、脱炭酸反応を行う段階とを含んでなるニコチン酸を製造する方法に関する。
【選択図】図１

Description

本発明は、キノリン酸生産能を有する微生物の培養およびそれから得られたキノリン酸の脱炭酸反応によってニコチン酸を製造する方法に関する。
ニコチンの酸化物であるニコチン酸(nicotinic acid)は、ビタミンＢ複合体であって、ニアシン(niacin)またはビタミンＢ３とも呼ばれる水溶性ビタミンとして動・植物体に広く存在する。ニコチン酸が欠乏すると、ペラグラ病にかかったり神経障害を起こしたりする。ニコチン酸は、生体内で主にニコチン酸アミド補助酵素（ＮＡＤ、ＮＡＤＰ）として存在し、酸化還元反応に関与する。
食品および医薬品に有用に用いられるニコチン酸は、化学的合成方法および生物学的生産方法によって製造できる。ニコチン酸の化学的合成は主に３−ピコリン(3-picoline)を酸化触媒として用いた酸化反応を介して行われる。具体的には、２−メチルペンタンジアミン（2-methylpentanediamine、ＭＰＤＡ）から、触媒を用いた高温反応（２８０〜３６０℃）を介して３−ピコリンが合成され、３−ピコリンのアンモ酸化反応(Ammoxidation)によって生成された３−シアノピリジンの加水分解を介してニアシンアミドまたはニコチン酸が合成される。また、３−ピコリンから選択的酸化反応(selective oxidation)を介して直接ニコチン酸が合成できる(非特許文献１)。ところが、化学的合成では、触媒を含む大量の有毒な廃棄物が発生するため、これに対する徹底的な管理が必要であり、廃棄物の処理に多くの費用がかかる。これを解決するために、３−シアノピリジンから酵素を用いてニアシンを合成する方法が開発された。ところが、この方法も、大量の廃棄物の発生を引き起こす３−シアノピリジンを使用するため、類似の問題点を有する。さらに、前駆物質として用いられるピリミジンは多様な誘導体を持っており供給量および価格の変動が大きいため、この方法はニアシン価格の不安定をもたらすおそれがある。
さらに、キノリン酸からニコチン酸を生産する他の方法が開示されている。例えば、特許文献１では、キノリン酸を基質として熱水脱炭酸反応(Hydrothermal Decarboxylation)によってニコチン酸を合成する方法を開示している。キノリン酸を、イオンを除去した高温水と２：１〜５：１の比で混合した後、前記混合物を１５０〜２５０℃の高温および１〜２ＭＰａの高圧で５〜６０分間反応させてニコチン酸を生産する方法が報告された(非特許文献２)。この方法は、触媒副産物の生成がないという利点はあるものの、反応条件が１５０〜２５０℃および２ＭＰａの高エネルギーを使用する高温・高圧であるという問題点もある。既存の化学的合成方法はいずれも石油由来の再生不可能な(non-renewable)材料を原料として用いるため、環境的な問題または石油抽出単価に多くの影響を受ける。
このような化学的合成方法の問題を解決するために、再生可能な炭水化物由来の材料を用いて生物学的にニコチン酸を生産する方法が研究された。ニコチン酸の生物学的生産は大きく２つの合成経路を介して行われる。一つの経路は、トリプトファンを出発物質としてキノリン酸を生成し、前記キノリン酸からニコチン酸を生物学的に合成する経路であり、もう一つの経路はアスパラギン酸を出発物質としてキノリン酸を生成し、前記キノリン酸からニコチン酸を生物学的に合成する経路である。一般に、真核生物はトリプトファンを出発物質としてニコチン酸を合成する経路を介してニコチン酸を生物学的に合成し、これに対し、原核生物ではアスパラギン酸を出発物質としたニコチン酸を合成する経路が主経路として用いられる。２つの経路はいずれもキノリン酸を中間体として含み、キノリン酸からキノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（quinolinate phosphoribosyltransferase；ｎａｄＣ）、ニコチン酸−モノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（nicotinate-mononucleotide adenylyltransferase；ｎａｄＤ）、ＮＡＤシンターゼ（NAD synthetase；ｎａｄＥ）、ＮＭＮアデニリルトランスフェラーゼ（NMN adenylyltransferase；ｎａｄＲ）およびニコチンアミダーゼ（nicotinamidase；ｐｎｃＡ）の作用によってニコチン酸を合成する。
ニコチン酸の生物学的生産方法は、アスパラギン酸経路を介してニコチン酸を生産する組み換え大腸菌またはコリネバクテリウムグルタミカムを用いた方法が報告されたことがある。特許文献２及び特許文献３は、それぞれコリネバクテリウムグルタミカム（ＡＴＣＣ１３０３２）菌株のキノリン酸シンターゼとキノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをそれぞれコードする遺伝子ｎａｄＡおよびｎａｄＣを分離し、これらの遺伝子を過剰発現する宿主細胞の培養によってニコチン酸を生産する方法を開示する。これらの特許に開示されたニコチン酸の生物学的生産方法によって生産されるニコチン酸の量は１００ｍｇ／Ｌ以下と非常に少ない。このような低い生産の原因はアスパラギン酸酸化酵素をコードする遺伝子ｎａｄＢとキノリン酸シンターゼをコードする遺伝子ｎａｄＡのＮＡＤ関連転写抑制因子(transcriptional repressor)であるＮａｄＲによる転写阻害(非特許文献３)、アスパラギン酸酸化酵素とＮＡＤシンターゼのＮＡＤによるフィードバック抑制(feedback inhibition)(非特許文献４)、並びにＮａｄＢ、ＮａｄＡ、ＮａｄＣの他にＮａｄＤ、ＮａｄＥ、ＮａｄＲおよびＰｎｃＡによる段階を含む反応の複雑性などであると思われる。
ニコチン酸の生物学的生産方法は、前記生合成経路に関与する酵素の発現阻害、フィードバック抑制および反応の複雑性などによりニコチン酸の生産収率が非常に低いという問題を持つ。
中国特許ＣＮ１０１３５３３２２Ｃ 米国特許第６，６９２，９４６号 米国特許第６，６８９，５８７号
Applied Catalysis A: General 280(2005)75-82 Ind. Eng.Chem. Res. 2009, 48, 10467-10471 Generasimova AV(2005), J Bioinform Comput Biol 3(4)、1007-19. Biol Chem Hoppe Seyler. 1990 Mar; 371(3);239-48 Mol Syst Biol. 2006；2：2006.0007. Epub 2006 Feb 21. "Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176 "Manual of Methods for General Bacteriology"by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981
前述した技術的背景の下で、本発明者は、ニコチン酸の化学的合成方法および生物学的生産方法が有する問題点を解消し、ニコチン酸の生産収率を向上させるための研究を行い、生物学的生産方法と化学的合成方法の組み合わせによってニコチン酸を高収率で生産する方法を完成した。
本発明の目的は、キノリン酸生産能を有する微生物を培養してキノリン酸の含まれた培養液を得る段階と、前記培養液に酸を添加し、脱炭酸反応を行う段階とを含んでなる、ニコチン酸を製造する方法を提供することにある。
本発明は、既存の化学的合成法によるニコチン酸の製造工程を発酵によるキノリン酸生産工程で代替し、キノリン酸を含む培養液への酸添加および脱炭酸反応によってキノリン酸をニコチン酸に転換させる工程を提供することにより、既存の問題であった化学的合成法の触媒副産物、高エネルギーの要求、再生不可能な資源の利用による環境的な問題、および生物学的生産における低い収率を解消し、より環境親和的かつ効率的にニコチン酸を生産することができる。
本発明の一具体例によるニコチン酸の製造方法におけるニコチン酸の製造経路を示す。 アスパラギン酸酸化酵素およびキノリン酸シンターゼをコードする遺伝子の発現プラスミドｐＰｒｏ−ｎａｄＢＡの構造を示す。 本発明の一具体例による、培養液中のキノリン酸、および培養液の脱炭酸反応の後に得られたニコチン酸を確認するＨＰＬＣの結果を示す。
一つの様態として、本発明は、キノリン酸生産能を有する微生物を培養することによってキノリン酸の含まれた培養液を得る段階と、前記培養液に酸を添加し、脱炭酸反応を行う段階とを含んでなる、ニコチン酸を製造する方法を提供する。
本明細書で使用される用語「キノリン酸生産能を有する微生物」とは、培地中の炭素源からキノリン酸を生産して蓄積させることが可能な微生物を意味する。
本明細書で使用される用語「脱炭酸反応」とは、反応物、すなわちキノリン酸の脱炭酸によってニコチン酸を生成する反応を意味する。
本発明の一具体例において、キノリン酸生産能を有する微生物は、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの活性が弱化または除去され、アスパラギン酸酸化酵素およびキノリン酸シンターゼの活性が強化されてキノリン酸生産能が向上した微生物であってもよい。
本発明の一具体例において、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼは、配列番号２１またはそれと高い相同性を有するアミノ酸配列を有することができ、アスパラギン酸酸化酵素は配列番号１９またはそれと高い相同性を有するアミノ酸配列を有することができ、キノリン酸シンターゼは配列番号２０またはそれと高い相同性を有するアミノ酸配列を持つことができる。
キノリン酸の生産能を向上させるために微生物が多量のキノリン酸を生成するようにし、生成したキノリン酸が他の経路で利用されず蓄積されるようにしなければならない。よって、本発明でキノリン酸の生産能が向上した微生物は、キノリン酸の分解経路で作用するキノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの活性を除去または弱化させる方法、キノリン酸の合成経路に作用するアスパラギン酸酸化酵素およびキノリン酸シンターゼの発現を強化させる方法、またはこれらの組み合わせによって製造できる。
本発明の一具体例において、前記キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの活性の弱化または除去は、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする内在的遺伝子を、酵素活性が弱化または除去されるように修飾した遺伝子で代替する方法、前記遺伝子のプロモーターを、内在的プロモーターより活性が弱いプロモーターで交換する方法、または前記遺伝子を染色体から欠失させる方法によって行われ得る。
本発明の一具体例において、前記アスパラギン酸酸化酵素およびキノリン酸シンターゼの活性の強化は、アスパラギン酸酸化酵素およびキノリン酸シンターゼをコードする遺伝子の細胞内コピー数を増加させる方法、前記遺伝子の発現調節配列を修飾する方法、および前記遺伝子を酵素の活性が強化されるように修飾した遺伝子で交換する方法の中から選ばれた一つ以上の方法によって行われ得る。
本発明の一具体例において、微生物の培養液中にキノリン酸が蓄積できるようにするために、菌株からアスパラギン酸酸化酵素タンパク質をコードする遺伝子ｎａｄＢのプロモーター部分を配列番号１６の構成的プロモーターｐＰｒｏで置換して、細胞内ＮＡＤ濃度によってｎａｄＢ遺伝子の発現を阻害させる転写抑制因子ＮａｄＲによる阻害を受けない構成的発現形態のｎａｄＢ遺伝子をプラスミドの形で製作し、菌株に導入してアスパラギン酸酸化酵素の過剰発現を誘導した。
本発明の一具体例において、アスパラギン酸酸化酵素は、配列番号１９のアミノ酸配列を持つことができる。前記酵素をコードする遺伝子ｎａｄＢの配列は、文献(非特許文献５)に公開された大腸菌(Escherichia coli)のゲノム配列（ｇｉ：ＧＩ：８９１０９３８０）、または全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）や日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）などのデータベースから得ることができる。
アスパラギン酸酸化酵素は、下記反応式に示すように、アスパラギン酸をイミノコハク酸に酸化させる活性を有する。
Ｌ−アスパラギン酸塩＋フマル酸塩⇔α−イミノコハク酸塩＋コハク酸塩＋Ｈ＋
Ｌ−アスパラギン酸塩＋酸素⇔過酸化水素＋α−イミノコハク酸塩＋Ｈ＋
したがって、アスパラギン酸酸化酵素の活性が強化されると、細胞内にキノリン酸の前駆物質であるイミノコハク酸の蓄積が増加し、これによりキノリン酸の生産を増やすことができる。
本発明の一具体例において、キノリン酸の蓄積を増加させるために、キノリン酸生産能を有する微生物においてキノリン酸シンターゼタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターを、より強力なプロモーターである配列番号１７のｐＣｙｓＫで置換して、細胞内ＮＡＤ濃度によってｎａｄＡ遺伝子の発現を阻害させる転写抑制因子ＮａｄＲによる阻害を受けない構成的発現形態のｎａｄＡ遺伝子をプラスミドの形で製作し、菌株に導入してキノリン酸シンターゼの過剰発現を誘導した。
本発明の一具体例において、キノリン酸シンターゼは、配列番号２０のアミノ酸配列を有することができる。前記酵素をコードする遺伝子ｎａｄＡの配列は、文献(非特許文献５)に公開された大腸菌(Escherichia coli)のゲノム配列（ｇｉ：ＧＩ：８９１０７６０１）、または全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）や日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）などのデータベースから得ることができる。
キノリン酸シンターゼは、下記反応式に示すように、イミノコハク酸からキノリン酸を合成する活性を有する。
α−イミノコハク酸塩＋ジヒドロキシアセトンリン酸⇔キノリン酸塩＋リン酸塩＋２Ｈ２Ｏ
したがって、キノリン酸シンターゼをコードする遺伝子の発現またはこの酵素の活性を強化すれば、細胞内にキノリン酸の生産を増加させることができる。
キノリン酸生産能を有する微生物におけるアスパラギン酸酸化酵素およびキノリン酸シンターゼの活性を強化するために、アスパラギン酸酸化酵素およびキノリン酸シンターゼをコードする遺伝子の内在的プロモーターを強力なプロモーターで置換し、或いはプロモーターの活性が増加するようにプロモーターに変異を誘発し、或いは遺伝子コピー数を増加させることができる。前記強力なプロモーターで置換するために、一般に強力なプロモーターとして知られるｐＴａｃ、ｐＴｒｃ、ｐＰｒｏ、ｐＲ、ｐＬ、ｐＣＪ１、ｐＣｙｓＫなどのプロモーターが使用できる。
本発明の一具体例において、キノリン酸生合成に関与するｎａｄＢおよびｎａｄＡ遺伝子のプロモーターを、強力なプロモーターであるｐＰｒｏまたはｐＣｙｓＫで置換して、前記遺伝子を過剰発現するキノリン酸生産能の向上した菌株を製造することができる。遺伝子の発現を増加させるための内在的プロモーターの置換のためのプロモーターとして、それぞれ配列番号１７および１８のｐＰｒｏおよびｐＣｙｓＫプロモーターまたはその一部が使用できる。
また、さらにキノリン酸が蓄積できるようにするために、キノリン酸生産能を有する微生物のゲノム上に位置した、キノリン酸をニコチン酸モノヌクレオチドに転換させる酵素であるキノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの活性を除去することができる。このために、相同組み換え(Homologous recombination)によってキノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｎａｄＣを微生物のゲノムから除去することができる。ｎａｄＣの配列は、文献(非特許文献５)に公開された大腸菌(Escherichia coli)のゲノム配列（ＧＩ：８９１０６９９０）、または全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）や日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）などのデータベースから得ることができる。
本発明の一具体例において、ホスホリボシルトランスフェラーゼは、配列番号２１のアミノ酸配列を有することができる。
キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼは、下記反応式に示すように、キノリン酸からニコチン酸モノヌクレオチドを合成する活性を有する。よって、この活性を有する遺伝子を除去し、或いはその発現を弱化させる場合、細胞内にキノリン酸の生産を増加させることができる。
５−ホスホ−α−Ｄ−リボース１−二リン酸塩＋キノリン酸塩＋２Ｈ＋⇔ＣＯ２＋二リン酸塩＋ニコチン酸モノヌクレオチド
本発明の一具体例において、キノリン酸生産能を有する微生物は、キノリン酸を生産することが可能な原核および真核微生物菌株であってもよい。前記キノリン酸生産能を有する微生物は、エンテロバクター(Enterobacter)属、エシェリキア(Escherichia)属、エルビニア(Erwinia)属、セラチア(Serratia)属、プロビデンシア(Providencia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、またはブレビバクテリウム(Brevibacterium)属に属する微生物であってもよいが、これに限定されない。
好ましくは、キノリン酸生産能を有する微生物は、エシェリキア(Escherichia)属に属する微生物であり、より好ましくは大腸菌(Escherichia coli)である。
本発明の一具体例において、Ｌ−トレオニンを生産する大腸菌変異菌株ＴＦ４０７６（ＫＦＣＣ１０７１８、韓国特許公告第９２−８３６５号）を、キノリン酸生産能を向上させるための親菌株として使用できる。大腸菌ＴＦ４０７６は、メチオニン要求性またはトレオニン類似体（ＡＨＶ：α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸）、リシン類似体（ＡＥＣＬ Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン）、イソロイシン類似体（α−アミノ酪酸）、メチオニン類似体（エチオニン）などに対する耐性を有する。
前記大腸菌ＴＦ４０７６におけるアスパラギン酸酸化酵素およびキノリン酸シンターゼの活性が強化されるように修飾し、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの活性を除去することにより、キノリン酸生産能の向上した微生物を製造することができる。
本発明の一具体例において、キノリン酸生産能を有する微生物は、アスパラギン酸の生合成経路が強化されたトレオニン生産菌株ＴＦ４０７６（ＫＦＣＣ１０７１８、韓国特許公告第９２−８３６５号）にアスパラギン酸酸化酵素及びキノリン酸シンターゼをコードする遺伝子の発現強化とキノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの活性除去および低下によってキノリン酸生合成経路が強化された大腸菌であってもよい。
本発明の一具体例において、キノリン酸生産能を有する微生物は、アスパラギン酸の生合成経路が強化されたリシン、トレオニン、イソロイシン、またはメチオニン生産菌株由来の菌株であってもよい。
大腸菌ＴＦ４０７６のアスパラギン酸酸化酵素及びキノリン酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を強化し、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの活性を弱化または除去して製造されたキノリン酸生産菌株である大腸菌ＣＶ０１−０００９をブタペスト条約に基づいてソウル市西大門区弘済１洞所在の韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms、ＫＣＣＭ）に２０１１年１月１０日付で受託番号ＫＣＣＭ１１１６５Ｐで寄託した。
本発明のニコチン酸を製造する方法は、キノリン酸生産能を有する微生物を培養することにより、キノリン酸の含まれた培養液を得る段階を含む。
キノリン酸生産能を有する微生物の培養は、当業界に知られている適当な培地と培養条件によって行われ得る。このような培養過程は、当業者であれば選択される微生物に応じて容易に調整して使用することができる。培養方法は、回分式、連続式および流加式培養を含むが、これに限定されない。微生物の多様な培養方法が例えば文献(非特許文献６)に開示されている。
培養培地は、特定の微生物の要求条件を適切に満足させなければならない。多様な微生物の培養培地は、例えば、文献(非特許文献７)に開示されている。前記培養培地は多様な炭素源、窒素源および微量元素成分を含む。
利用可能な炭素源は、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、果糖、マルトース、澱粉、セルロースなどの炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ヤシ油などの脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸などの脂肪酸、グリセロールおよびエタノールなどのアルコール、並びに酢酸などの有機酸を含むが、これに限定されない。前記炭素源は単独で或いは組み合わせて使用できる。
利用可能な窒素源は、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）および大豆かすなどの有機窒素源、並びに尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムなどの無機窒素源を含むが、これに限定されない。前記窒素源は単独で或いは組み合わせて使用できる。
利用可能なリンの供給源は、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、または相応するナトリウム含有塩を含むことができる。培養培地は硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄などの金属塩を含むことができる。さらに、アミノ酸およびビタミンなどの成長に必須な成分を使用できる。適切な前駆体も培養培地に添加できる。上記に掲げた物質は培養中に適切に連続式または回分式で培養液に添加できる。
また、培養液のｐＨ値を調節するために、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、およびアンモニアなどの塩基性化合物、またはリン酸、硫酸などの酸性化合物を必要に応じて使用することができる。気泡生成を調節するために、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を使用することができる。好気条件を維持するために、培養液内に酸素、または空気などの酸素含有気体を注入する。培養液の温度は通常２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃である。培養は所望のキノリン酸の生産量が得られるまで持続できる。これは通常１０〜１６０時間の時間内に達成される。
本発明のニコチン酸の製造方法は、キノリン酸の含まれた培養液に酸を添加し、脱炭酸反応を行う段階を含む。
より具体的に、キノリン酸生産能を有する微生物の培養により得られたキノリン酸含有培養液から遠心分離または膜濾過法を介して微生物を除去する。その後、脱炭酸反応を促進するために、キノリン酸を含む培養液に水素基を提供する酸を添加する。培養液に水素基を提供することができれば、添加される酸の種類は制限されない。
本発明の一具体例において、キノリン酸の含まれた培養液は精製することなく利用できる。
本発明の一具体例において、前記培養液に添加される酸は塩酸または硫酸であってもよい
本発明の一具体例において、前記酸添加後の培養液のｐＨは５以下であってもよい。
本発明の一具体例において、前記酸添加後の培養液のｐＨは２〜３であってもよい。
本発明の一具体例において、培養液の脱炭酸反応時の温度は１００℃〜１５０℃であってもよい。
本発明の一具体例において、培養液の脱炭酸反応時の温度は１３５℃であってもよい。
本発明の一具体例において、培養液の脱炭酸反応時の圧力は０．１ＭＰａ〜０．５ＭＰａであってもよい。
本発明の一具体例において、培養液の脱炭酸反応時の圧力は０．２ＭＰａであってもよい。
キノリン酸を含む発酵液に酸を添加した後、１時間〜３時間高温および高圧条件の下に脱炭酸反応を行うと、下記式に示すように、培養液内のキノリン酸がニコチン酸に変換される：
キノリン酸塩＋２Ｈ＋⇔ＣＯ２＋ニコチン酸塩
本発明のニコチン酸を製造する方法は、ニコチン酸を回収し精製する段階をさらに含むことができる。
本発明において、ニコチン酸の回収は培養液の濾過および結晶化過程を含む、本発明の属する技術分野における公知の通常の方法によって行われてもよく、培養液を濾過及び結晶化する過程を含んでもよい。
以下、本発明を実施例及び実験例によってさらに詳細に説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
キノリン酸生産用菌株の製作
１−１．アスパラギン酸酸化酵素発現用プラスミドの製作
大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、アスパラギン酸酸化酵素をコードする遺伝子ｎａｄＢを得た。米国国立保健院のジーンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）から配列番号１３のｎａｄＢ遺伝子の塩基配列（ＮＣＢＩ登録番号「ＧＩ：８９１０９３８０」）を得、これに基づいてｎａｄＢ遺伝子のＡＴＧ部分とＴＡＡを含有するＯＲＦ部分を増幅することができ、制限酵素認識部位ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを有する配列番号１および２のプライマーを合成した。
大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１と２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。ポリメラーゼとしてＰｆｕＵｌｔｒａＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した。ＰＣＲは、９６℃で３０秒の変性、５０℃で３０秒のアニーリングおよび７２℃で２分の伸長からなるサイクルを３０サイクル繰り返し行った。これに基づいて、ｎａｄＢ遺伝子と制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩの認識部位を含有した約１．９ｋｂの増幅された遺伝子を得た。
前記ＰＣＲによって得られたｎａｄＢ遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで処理し、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで処理したｐＰｒｏＬａｒ（ＣｌｏｎｅＴｅｃｈ）ベクターにライゲーション(ligation)によってクローニングし、最終的に常時発現プロモーターとしてのｐＰｒｏプロモーターによって発現調節を受けるｎａｄＢ遺伝子がクローニングされたｐＰｒｏ−ｎａｄＢ組み換えベクターを製作した。
１−２．アスパラギン酸酸化酵素およびキノリン酸シンターゼ発現用プラスミドの製作
大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、キノリン酸シンターゼをコードする遺伝子ｎａｄＡを得た。米国国立保健院のジーンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）から配列番号１４のｎａｄＡ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号「ＧＩ：８９１０７６０１」）を得、これに基づいてｎａｄＡ遺伝子のＡＴＧ部分とＴＡＡを含有するＯＲＦ部分を増幅することができ、制限酵素ＡｐａＩおよびＮｏｔＩの認識部位を有する配列番号３および４のプライマーを合成した。
大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型として、前記配列番号３および４のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。ポリメラーゼとしてＰｆｕＵｌｔｒａＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した。ＰＣＲは、９６℃で３０秒の変性、５０℃で３０秒のアニーリングおよび７２℃で２分の伸長からなるサイクルを３０サイクル繰り返し行った。これにより、ｎａｄＡ遺伝子と制限酵素ＡｐａＩとＮｏｔＩの認識部位を含有した約１．０ｋｂの増幅された遺伝子を得た。
大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、ｃｙｓＫプロモーターを得た。米国国立保健院のジーンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）からｃｙｓＫ遺伝子の上流(upstream)０．３ｋｂ内に位置したプロモーターの塩基配列情報（配列番号１７）を得、これに基づいてｃｙｓＫプロモーターと前記の増幅されたｎａｄＡ遺伝子とをライゲーションさせるために、制限酵素ＢａｍＨＩとＡｐａＩの認識部位を有する配列番号５および６のプライマーを合成した。
大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型として、前記配列番号５および６のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。ポリメラーゼとしてＰｆｕＵｌｔｒａＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した。ＰＣＲ条件は９６℃で３０秒の変性、５０℃で３０秒のアニーリングおよび７２℃で１分の伸長からなるサイクルを３０サイクル繰り返し行った。これにより、ｃｙｓＫプロモーターと制限酵素ＢａｍＨＩとＡｐａＩを含有した約０．３ｋｂの増幅された遺伝子を得た。
前記ＰＣＲによって獲得したｎａｄＡ遺伝子を制限酵素ＡｐａＩおよびＮｏｔＩで処理し、増幅されたｃｙｓｋプロモーター切片をＡｐａＩおよびＢａｍＨＩで処理した。制限酵素で処理したｎａｄＡおよびｃｙｓＫプロモーター切片を制限酵素ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで処理した、前記１−１で得られたｐＰｒｏ−ｎａｄＢベクターにライゲーションによりクローニングし、最終的に常時発現プロモーターとしてのｐＰｒｏプロモーターによって発現調節を受けるｎａｄＢ遺伝子およびｃｙｓＫ遺伝子プロモーターによって発現調節を受けるｎａｄＡ遺伝子がクローニングされた５．９ｋｂのｐＰｒｏ−ｎａｄＢＡ組み換えベクターを製作した。製作されたｐＰｒｏ−ｎａｄＢＡは配列番号１８の配列を有する。図２はアスパラギン酸酸化酵素およびキノリン酸シンターゼをコードする遺伝子の発現プラスミドｐＰｒｏ−ｎａｄＢＡの構造を示す。
１−３．キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損菌株の製作
本実施例では、大腸菌ＴＦ４０７６の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、キノリン酸分解経路のｎａｄＣ遺伝子を得た。米国国立保健院のジーンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）からｎａｄＣ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号「ＧＩ：８９１０６９９０」）を得、これに基づいてｎａｄＣ遺伝子の下流(downstream)部分を増幅する配列番号７および８のプライマー、ｎａｄＣの上流および下流部分とｌｏｘｐＣｍを増幅する配列番号９および１０のプライマー、並びに上流部分を増幅する配列番号１１および１２のプライマーを合成した。
大腸菌ＴＦ４０７６の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号７と８および１１と１２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲを行い、それぞれ０．５ｋｂおよび０．３ｋｂのｎａｄＣ遺伝子の上流部分および下流部分を増幅した。また、ｌｏｘｐＣｍを含有しているプラスミドベクターｐＬｏｘｐＣａｔ２ベクターを鋳型として、配列番号９および１０のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲを行い、１．０ｋｂの両末端にｎａｄＣ遺伝子と相同配列を有するｌｏｘｐＣｍ遺伝子を増幅した。重合酵素はＰｆｕＵｌｔｒａＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した。ＰＣＲは、９６℃で３０秒の変性、５３℃で３０秒のアニーリングおよび７２℃で１分の伸長からなるサイクルを３０サイクル繰り返し行った。その後、前記ＰＣＲ反応によって得られたｎａｄＣ上流切片、ｎａｄＣ下流切片、ｌｏｘｐＣｍ切片を鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９６℃で６０秒の変性、５０℃で６０秒の変性および７２℃で１分の伸長からなるサイクルを１０サイクル繰り返し行い、配列番号７および１２のプライマーを添加した後、２０サイクルを繰り返し行った。これにより、１．８ｋｂのｎａｄＣ遺伝子上流−ｌｏｘｐＣｍ−下流を含有したｎａｄＣ除去カセットを得た。
製作されたｎａｄＣ欠損カセットを用いて、ラムダレッドリコンビナーゼ(lambda red recombinase)発現ベクターｐＫＤ４６を含有する大腸菌ＴＦ４０７６を、エレクトロポレーションにより形質転換し、選別マーカーであるクロラムフェニコールを含有したＬＢ(Luria-Bertani)平板培地（トリプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ、および寒天１．５％／Ｌ）上に塗抹して３７℃で一晩培養した後、クロラムフェニコールに対する耐性を示す菌株を選別した。
選別された菌株を直接鋳型として配列番号７および１２のプライマーを用いて同一の条件でＰＣＲを行った後、１．０％アガロースゲル上で遺伝子のサイズが野生株の場合には１．０ｋｂ、ｎａｄＣ除去菌株の場合には１．８ｋｂであることを確認することにより、ｎａｄＣ遺伝子の欠失を確認した。また、前記方法と同一の方法によって野生型大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０のｎａｄＣ遺伝子を除去した。
１−４．キノリン酸生産用菌株の製作
実施例１−２で製作されたｐＰｒｏ−ｎａｄＢＡプラスミドを、実施例１−３で製作されたＴＦ４０７６ΔｎａｄＣ菌株とＷ３１１０ΔｎａｄＣにＣａＣｌ２法によって形質転換した後、ＬＢ−Ｋｍ（酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／Ｌ）平板培地に塗抹して３７℃で一晩培養した。その後、カナマイシン耐性を有するコロニーを１０コロニーずつ選抜した。こうして製作されたキノリン酸生産菌株をＣＶ０１−０００９と命名した。
ニコチン酸の製造
２−１．キノリン酸の生産
実施例１で製造されたキノリン酸生産菌株を３７℃の培養器でＬＢ−Ｋｍ平板培地中に一晩培養して得た単一コロニーを２５ｍＬのキノリン酸力価培地に１白金耳ずつ接種して３７℃で２５０ｒｐｍにて２４〜７２時間培養した。下記表１はキノリン酸生産用培地の組成を示す。
培養液中のキノリン酸はＨＰＬＣによって分析した。分析結果を下記表２に示した。これは菌株のキノリン酸生産能を示す。
表２に示すように、トレオニン生産菌株由来のＴＦ４０７６および野生型大腸菌のＷ３１１０菌株において、プロモーター置換によってアスパラギン酸酸化酵素およびキノリン酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を強化した場合、２つの菌株ともからキノリン酸が生産されなかった。これはキノリン酸ホスホリボリシルトランスフェラーゼの活性により生成されたキノリン酸がすべてＮＡＤ合成経路で消耗されるためである。
これに対し、細胞内で生産されたキノリン酸のキノリン酸ホスホリボリシルトランスフェラーゼによる分解を抑制するために、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼを除去し、アスパラギン酸酸化酵素およびキノリン酸シンターゼの発現を強化させた菌株Ｗ３１１０ΔｎａｄＣは０．４ｇ／Ｌのキノリン酸を生産した。そして、キノリン酸のキノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼによる分解を抑制するためにキノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼを除去し、アスパラギン酸酸化酵素およびキノリン酸シンターゼの発現を強化させた菌株であるトレオニン菌株由来のＴＦ４０７６ΔｎａｄＣは、菌株自体が持っているアスパラギン酸への強化された生合成経路により野生株Ｗ３１１０ΔｎａｄＣ菌株に比べて１３倍以上高い５．５ｇ／Ｌのキノリン酸を生産した。すなわち、アスパラギン酸酸化酵素およびキノリン酸シンターゼの発現強化、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの活性除去、およびアスパラギン酸生合成経路の強化の組み合わせによって既存の菌株よりさらに高い効率でキノリン酸を生産することができることを確認した。
２−２．脱炭酸反応によるニコチン酸の生産
キノリン酸生産菌株であるＣＶ０２−０００９菌株の培養液であって、キノリン酸を５．５ｇ／Ｌ含有する培養液中のキノリン酸をニコチン酸に転換するために、高温、高圧条件で脱炭酸反応を行った。まず、キノリン酸培養液中の細胞を除去するために３０００〜４０００ｒｐｍで１０〜３０分間遠心分離を行った。遠心分離の後に得られたキノリン酸含有上澄み液を分離して脱炭酸反応の試料として用いた。脱炭酸反応は１３５℃で０．２ＭＰａの条件下で３時間行った。使用された試料の条件は下記表３のとおりである。対照群実験で行われた脱イオン水に使用されたキノリン酸はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社の標準品を使用した。キノリン酸水溶液のｐＨは水酸化ナトリウム、アンモニア水、塩酸、または硫酸などを用いて滴定した。下記表３は高温高圧反応によるキノリン酸のニコチン酸への転換率を示す。図３は培養液中のキノリン酸、および培養液の脱炭酸反応後に得られたニコチン酸を確認したＨＰＬＣの結果を示す。
先行文献である特許文献１で開示された脱イオン水を水溶液とした１５０〜２５０℃と２ＭＰａの条件より低い温度および圧力条件である１３５℃および０．２ＭＰａでキノリン酸をニコチン酸に転換する実験を３時間行い、前記表３の結果を得た。これは先行文献に開示された条件より低い温度および圧力条件でもキノリン酸がニコチン酸に９５％転換されたことを示す。
先行文献と同一の方法であるが、キノリン酸の水溶液が発酵培養液の状態である、ニコチン酸転換実験を行った。その結果、脱イオン水の使用の際にはニコチン酸に転換されたキノリン酸が培養液中ではニコチン酸に転換されなかった。これは、培養液内に存在する多様なイオンが、キノリン酸の脱炭酸反応が起こるための必要条件であるカルボキシ基に対する水素イオンの接近および水素イオンの移動を妨害するためである。これを解決するために、発酵液中のキノリン酸と水素イオンが接触しうる機会を高めようと水素イオンの濃度を高める方法によって、キノリン酸を含む発酵液の脱炭酸反応有無を確認することを試みた。そのために、キノリン酸を含む培養液（ｐＨ６〜７）を水素イオンが高濃度に維持できるｐＨ２〜３の範囲に滴定した。前記滴定には塩酸または硫酸を使用した。
その結果、塩酸を添加して培養液をｐＨ２〜３に滴定した場合、キノリン酸のニコチン酸への転換率が８５％〜９９％であり、硫酸の場合には７５％〜９０％であった。これにより、微生物の培養後に得られた培養液の追加精製することなく酸の添加、および先行文献に比べて穏やかな温度および圧力の条件下における脱炭酸反応によってニコチン酸を効率よく生産することができた。

Claims (14)

  1. キノリン酸生産能を有する微生物を培養することによってキノリン酸の含まれた培養液を得る段階と、
    前記培養液に酸を添加し、脱炭酸反応を行う段階とを含んでなる、ニコチン酸を製造する方法。
  2. 前記微生物が、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの活性が弱められまたは除去され、アスパラギン酸酸化酵素およびキノリン酸シンターゼの活性が強化されたものである、請求項１に記載のニコチン酸を製造する方法。
  3. 前記キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの活性の弱化または除去が、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を酵素の活性が弱化または除去されるように修飾した遺伝子で代替する方法、前記遺伝子のプロモーターを内在的プロモーターより活性が弱いプロモーターで交換する方法、および前記遺伝子を染色体から欠失させる方法の中から選ばれた一つ以上の方法によって行われる、請求項２に記載の方法。
  4. 前記アスパラギン酸酸化酵素およびキノリン酸シンターゼの活性強化が、アスパラギン酸酸化酵素およびキノリン酸シンターゼをコードする遺伝子の細胞内のコピー数を増加させる方法、前記遺伝子の発現調節配列を修飾する方法、および前記遺伝子を酵素の活性が強化されるように修飾した遺伝子で交換する方法の中から選ばれた一つ以上の方法によって行われる、請求項２に記載の方法。
  5. 前記微生物がエシェリキア属微生物である、請求項１に記載の方法。
  6. 前記微生物が大腸菌である、請求項１に記載の方法。
  7. 前記微生物が受託番号ＫＭＣＣ１１１６５Ｐで寄託された大腸菌である、請求項１に記載の方法。
  8. 前記培養液に添加される酸が塩酸または硫酸である、請求項１に記載の方法。
  9. 前記酸添加後の培養液のｐＨが５以下である、請求項１に記載の方法。
  10. 前記脱炭酸反応における温度が１００℃〜１５０℃である、請求項１に記載の方法。
  11. 前記脱炭酸反応における温度が１３５℃である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記脱炭酸反応における圧力が０．１ＭＰａ〜０．５ＭＰａである、請求項１に記載の方法。
  13. 前記脱炭酸反応における圧力が０．３ＭＰａである、請求項１２に記載の方法。
  14. ニコチン酸を回収し精製する段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。
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