RU2691581C2 - О-сукцинилгомосерин - продуцирующий микроорганизм и способ получения о-сукцинилгомосерина с его использованием - Google Patents
О-сукцинилгомосерин - продуцирующий микроорганизм и способ получения о-сукцинилгомосерина с его использованием Download PDFInfo
- Publication number
- RU2691581C2 RU2691581C2 RU2016144104A RU2016144104A RU2691581C2 RU 2691581 C2 RU2691581 C2 RU 2691581C2 RU 2016144104 A RU2016144104 A RU 2016144104A RU 2016144104 A RU2016144104 A RU 2016144104A RU 2691581 C2 RU2691581 C2 RU 2691581C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- microorganism
- gene
- activity
- succinylhomoserine
- strain
- Prior art date
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 54
- GNISQJGXJIDKDJ-YFKPBYRVSA-N O-succinyl-L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCOC(=O)CCC(O)=O GNISQJGXJIDKDJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 title claims abstract description 48
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 51
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 24
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 108010061618 O-succinylhomoserine (thiol)-lyase Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102100035172 Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 101710155861 Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 102100033451 Thyroid hormone receptor beta Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108010071598 homoserine kinase Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 108010016979 Homoserine O-succinyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 41
- 101150078419 zwf gene Proteins 0.000 claims description 28
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 19
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 18
- 101150060102 metA gene Proteins 0.000 claims description 15
- 101150003180 metB gene Proteins 0.000 claims description 13
- 101150072448 thrB gene Proteins 0.000 claims description 12
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 27
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 27
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 23
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 23
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 15
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 15
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 11
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 11
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 9
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 8
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 8
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 8
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 8
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 7
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 7
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 7
- 230000009123 feedback regulation Effects 0.000 description 7
- VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N succinyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 6
- 101150086633 metAA gene Proteins 0.000 description 6
- 101150091110 metAS gene Proteins 0.000 description 6
- 101150043924 metXA gene Proteins 0.000 description 6
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 6
- 101100290837 Bacillus subtilis (strain 168) metAA gene Proteins 0.000 description 5
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 5
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 5
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 230000004108 pentose phosphate pathway Effects 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 5
- WIIZWVCIJKGZOK-IUCAKERBSA-N 2,2-dichloro-n-[(1s,2s)-1,3-dihydroxy-1-(4-nitrophenyl)propan-2-yl]acetamide Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@@H](CO)[C@@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 4
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 4
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YPWSLBHSMIKTPR-UHFFFAOYSA-N Cystathionine Natural products OC(=O)C(N)CCSSCC(N)C(O)=O YPWSLBHSMIKTPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ILRYLPWNYFXEMH-UHFFFAOYSA-N D-cystathionine Natural products OC(=O)C(N)CCSCC(N)C(O)=O ILRYLPWNYFXEMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 3
- ILRYLPWNYFXEMH-WHFBIAKZSA-N L-cystathionine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O ILRYLPWNYFXEMH-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 description 3
- MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N N-[1-oxo-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propan-2-yl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(C(C)NC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108700015396 E coli cscB Proteins 0.000 description 2
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 2
- 108090000156 Fructokinases Proteins 0.000 description 2
- 102000003793 Fructokinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000007376 cm-medium Substances 0.000 description 2
- 238000012786 cultivation procedure Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010093591 phosphoenolpyruvate-sucrose phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- IJOJIVNDFQSGAB-SQOUGZDYSA-N 6-O-phosphono-D-glucono-1,5-lactone Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)[C@@H]1O IJOJIVNDFQSGAB-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N D-Glucose 6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N Glc6P Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102000012011 Isocitrate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010075869 Isocitrate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FXDNYOANAXWZHG-VKHMYHEASA-N O-phospho-L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCOP(O)(O)=O FXDNYOANAXWZHG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588768 Providencia Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- -1 malt extract Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к микроорганизмам рода Escherichia для продуцирования О-сукцинилгомосерина и способу получения O-сукцинилгомосерина с использованием указанного микроорганизма. В предложенном микроорганизме рода Escherichia активность глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназы ослаблена или элиминирована по сравнению с ее эндогенной активностью, активности одной или более из цистатионин-гамма-синтазы и гомосеринкиназы элиминированы по сравнению с их эндогенными активностями у микроорганизма дикого типа, активность гомосерин-O-сукцинилтрансферазы усилена по сравнению с ее эндогенной активностью у микроорганизма дикого типа, и продукция О-сукцинилгомосерина увеличена по сравнению с продукцией у микроорганизма дикого типа. Предложен также способ получения О-сукцинилгомосерина, включающий культивирование вышеуказанного микроорганизма в среде и извлечение О-сукцинилгомосерина из культуральной среды или культивируемого микроорганизма. Изобретение обеспечивает получение О-сукцинилгомосерина с высоким выходом. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 3 табл., 2 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к O-сукцинилгомосерин-продуцирующему микроорганизму и к способу получения O-сукцинилгомосерина с его использованием.
Уровень техники
O-сукцинилгомосерин получают с помощью связывания гомосерина и сукцинила-КоА биосинтетическим путем. Таким образом, при разработке штамма, продуцирующего O-сукцинилгомосерин с высоким выходом, образование гомосерина и сукцинила-КоА имеет важное значение. Из них сукцинил-КоА продуцируется в цикле TCA, и, таким образом, требуется усиление цикла TCA для получения высокой концентрации сукцинила-КоА.
Пентозофосфатный путь (PPP) хорошо известен в качестве основного источника NADPH, и кофактор NADPH требуется в путях биосинтеза аминокислот. Таким образом, для усиления пентозофосфатного пути при разработке штаммов, продуцирующих аминокислоты, ген zwf, кодирующий глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназу, участвующий на первой стадии пути, обычно усиливают, и эти штаммы описаны в корейских патентных публикациях №№2008-0036608 и 2006-0129352.
Когда экспрессия гена zwf или активность фермента, кодируемого указанным геном, ослаблена, пентозофосфатный путь ослабевает, что приводит к недостаточному поступлению NADPH. В этом случае NADPH может быть частично восполнен сверхэкспрессией изоцитратдегидрогеназы (icd) и малатдегидрогеназы (mae) цикла TCA (Appl Microbiol Biotechnol. 2004 64(1); 91-8, Metab Eng. 2004 6(2); 164-74, FEBS Letters 581 2007 3771-6).
Авторы настоящего изобретения провели исследование для разработки штамма, способного продуцировать O-сукцинилгомосерин с высоким выходом и высокой эффективностью, и разработали штамм, в котором ген zwf ослаблен и делегирован для получения высокой концентрации сукцинила-КоА как предшественника O-сукцинилгомосерина в Е. coli, способном продуцировать O-сукцинилгомосерин. В результате культивирования авторы настоящего изобретения обнаружили, что концентрация O-сукцинилгомосерина была увеличена, в чем и заключается настоящее изобретение.
Подробное описание изобретения
Техническая проблема
Задачей настоящего изобретения является предложить O-сукцинилгомосерин-продуцирующий микроорганизм.
Другой задачей настоящего изобретения является предложить способ получения O-сукцинилгомосерина, включающий стадию культивирования O-сукцинилгомосерин-продуцирующего микроорганизма.
Техническое решение
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает O-сукцинилгомосерин-продуцирующий микроорганизм.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения O-сукцинилгомосерин-продуцирующий микроорганизм может быть микроорганизмом рода Escherichia для продуцирования O-сукцинилгомосерина, в котором активность глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназы ослаблена или элиминирована по сравнению с ее эндогенной активностью.
Термин «O-сукцинилгомосерин-продуцирующий микроорганизм», употребляемый в настоящем документе, относится к прокариотическому или эукариотическому микроорганизму, способному продуцировать O-сукцинилгомосерин в организме и аккумулирующему O-сукцинилгомосерин. Например, O-сукцинилгомосерин-продуцирующий микроорганизм может быть микроорганизмом, относящимся к роду Escherichia, роду Erwinia, роду Serratia, роду Providencia, роду Corynebacteria, роду Pseudomonas, роду Leptospira, роду Salmonella, роду Brevibacteria, роду Hyphomonas, роду Chromobacterium, роду Norcardia, или к грибам или дрожжам. O-сукцинилгомосерин-продуцирующий микроорганизм может быть, в частности, микроорганизмом, относящимся к роду Escherichia и, более конкретно, Escherichia coli (E. coli).
Глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназа участвует в пентозофосфатном пути, который представляет собой метаболический путь, обеспечивающий восстановительную способность клеток за счет поддержания концентраций NADPH. Этот фермент катализирует окисление глюкозо-6-фосфата в 6-фосфоглюконолактон путем восстановления NADP в NADPH на первой стадии пентозофосфатного пути. Ген, кодирующий этот фермент, обычно называют zwf. Ослабление или элиминирование этого фермента приводит к потоку через цикл TCA, вызывая усиление цикла TCA.
Глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназа может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23. Кроме того, глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназа может иметь аминокислотную последовательность, имеющую 80% или более высокую, 90% или более высокую, 95% или более высокую гомологию с SEQ ID NO: 23.
Термин «гомология», используемый в настоящем описании применительно к последовательности, относится к степени совпадения с определенной аминокислотной последовательностью или последовательностью оснований, и гомология может быть выражена в процентах. В настоящем описании гомологичная последовательность, имеющая активность, которая одинакова или аналогична определенной аминокислотной последовательности или последовательности оснований, выражается в виде «% гомологии». Например, аминокислотная последовательность, имеющая 80% или более высокую, 90% или более высокую, 95% или более высокую гомологию с SEQ ID NO: 23, представляет последовательность, имеющую активность глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназы.
Термин «эндогенный» фермент и активность, употребляемый в настоящем документе, относится к нативному ферменту, естественным образом присутствующему в микроорганизме или клетке, и к его активности, - другими словами, относится к ферменту и к его активности до модификации соответствующего фермента и его активности.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения микроорганизм может быть микроорганизмом рода Escherichia для продуцирования O-сукцинилгомосерина, в котором активность одной или более из цистатионин-гамма-синтазы и гомосеринкиназы дополнительно ослаблена или элиминирована по сравнению с их эндогенными активностями. В частности, микроорганизм может быть микроорганизмом для продуцирования O-сукцинилгомосерина, в котором активности и цистатионин-гамма-синтазы и гомосеринкиназы ослаблены или элиминированы по сравнению с их эндогенными активностями.
Цистатионин-гамма-синтаза обладает активностью для превращения O-сукцинилгомосерина в цистатионин. Цистатионин-гамма-синтаза кодируется геном metB. Когда активность данного фермента ослаблена или элиминирована, O-сукцинилгомосерин может аккумулироваться без превращения в цистатионин.
Гомосеринкиназа катализирует синтез O-фосфогомосерина из гомосерина, и кодируется геном thrB. Когда активность данного фермента ослаблена или элиминирована, гомосерин может не превращаться в O-фосфогомосерин, и может использоваться для продуцирования O-сукцинилгомосерина.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения цистатионин-гамма-синтаза может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, и гомосеринкиназа может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25. Кроме того, цистатионин-гамма-синтаза и гомосеринкиназа могут иметь аминокислотные последовательности, имеющие 80% или более высокую, 90% или более высокую, 95% или более высокую гомологию с SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 25, соответственно.
Термин «ослабление» или «элиминирование» ферментативной активности, используемый в настоящем документе, означает, что экспрессия гена, кодирующего соответствующий фермент или активность фермента снижена по сравнению с эндогенной активностью или совсем отсутствует, что может быть обусловлено модификацией всей или части последовательности оснований гена, кодирующего соответствующий фермент, или всей или части последовательности, регулирующей экспрессию гена, путем делеции, замены или инсерции, или путем их сочетания.
Термин «последовательность, регулирующая экспрессию», используемый в настоящем документе, представляет собой последовательность оснований, регулирующую экспрессию гена, и относится к сегменту, способному к увеличению или уменьшению экспрессии конкретного гена у субъекта, и может включать промотор, сайт связывания факторов транскрипции и т.д., но не ограничивается ими.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения микроорганизм может быть микроорганизмом для продуцирования O-сукцинилгомосерина, в котором активность гомосерин-O-сукцинилтрансферазы дополнительно усилена по сравнению с ее эндогенной активностью.
Гомосерин O-сукцинилтрансфераза представляет собой фермент, который катализирует продуцирование O-сукцинилгомосерина из сукцинила-КоА и гомосерина и участвует в первой стадии пути биосинтеза метионина. Ген, кодирующий данный фермент, обычно называют metA, и его экспрессия подавляется метионином по типу регуляции с обратной связью. Таким образом, может использоваться мутант для экспрессирования гена на высоком уровне за счет устранения регуляции метионином по типу обратной связи.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения гомосерин-O-сукцинилтрансфераза может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26. Кроме того, гомосерин-O-сукцинилтрансфераза может иметь аминокислотную последовательность, имеющую 80% или более высокую, 90% или более высокую, 95% или более высокую гомологию с SEQ ID NO: 26. В то же время, гомосерин-O-сукцинилтрансфераза, для которой устранена регуляция метионином по типу обратной связи, может иметь аминокислотную последовательность, имеющую 80% или более высокую, 90% или более высокую, 95% или более высокую гомологию с SEQ ID NO: 27 (metA11: корейская патентная публикация №2009-0106365).
Термин «усиление» ферментативной активности, используемый в настоящем документе, означает, что активность соответствующего фермента повышается по сравнению с его активностью до модификации. В частности, ферментативная активность возрастает за счет сверхэкспрессии гена, кодирующего соответствующий фермент, по сравнению с ее эндогенной активностью, или активность фермента, кодируемого геном, увеличивается за счет мутации гена, по сравнению с ее эндогенной активностью, и усиление может быть вызвано увеличением числа копий кодирующего гена, заменой промотора гена более сильным промотором, чем эндогенный промотор, или модификацией всей или части последовательности оснований гена на хромосоме или всей или части последовательности, регулирующей его экспрессию, путем делеции, замены или инсерции, или путем их сочетания.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения гомосерин-O-сукцинилтрансфераза может кодироваться геном, в котором промотор гена, кодирующего данный фермент, заменен на более сильный промотор, чем эндогенный промотор. Например, промотор включает известные сильные промоторы Ptac, Ptrc, Ppro, PR, PL, Prmf, PcysK, и т.д., но не ограничивается ими.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения микроорганизмом может быть Е. coli. Микроорганизмом может быть E. coli, в котором активность глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназы ослаблена или элиминирована по сравнению с ее эндогенной активностью, и активности одной или более из цистатионин-гамма-синтазы и гомосеринкиназы ослаблены или элиминированы по сравнению с их эндогенными активностями, соответственно, и активность гомосерин-O-сукцинилтрансферазы усилена по сравнению с ее эндогенной активностью.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения микроорганизмом может быть Е. coli, в котором metA на хромосоме E. coli заменен на metA11 (SEQ ID NO: 27), который является мутантом, полученным с помощью устранения регуляции метионином по типу обратной связи, thrB и metB на хромосоме делегированы, и zwf ослаблен или элиминирован.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения микроорганизмом может быть штамм Е. coli CC03-0156, который депонировали в Корейском центре культур микроорганизмов (KCCM) 22 ноября 2013 года под номером доступа KCCM11487P.
Кроме того, в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения микроорганизмом может быть микроорганизм, наделенный способностью ассимилировать сахарозу. Ассимиляция сахарозы означает способность метаболизировать сахарозу в качестве источника углерода или метаболического источника. Способность ассимилировать сахарозу может быть получена с помощью введения метаболического фермента сахарозы, например, фруктокиназы, сахарозной PTS пермеазы, сахарозной гидролазы или инвертазы. Например, способность ассимилировать сахарозу может быть получена с помощью трансформации рекомбинантным вектором (pAscrSM, SEQ ID NO: 28), включающим ген, кодирующий Scr-PTS фермент, полученный из Streptococcus mutans, который описан в корейской патентной публикации №2010-0099572.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения микроорганизмом может быть Е. coli, в котором metA на хромосоме E. coli заменен на metA11 (SEQ ID NO: 27), который является мутантом, полученным с помощью устранения регуляции метионином по типу обратной связи, thrB и metB на хромосоме делегированы, и zwf элиминирован, и который способен утилизировать сахар-сырец с помощью трансформации рекомбинантным вектором, включающим scrKYABR, кодирующий фруктокиназу, сахарозную PTS пермеазу, сахарозную гидролазу и сахарозный транскрипционный регулятор, полученный из ассимилирующего сахарозу Streptococcus mutans.
В аспекте настоящего изобретения предложен способ продуцирования O-сукцинилгомосерина, включающий стадии культивирования микроорганизма рода Escherichia для продуцирования O-сукцинилгомосерина, в котором активность глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназы ослаблена или элиминирована по сравнению с ее эндогенной активностью, в среде, и извлечения O-сукцинилгомосерина из культуральной среды или культивируемого микроорганизма.
В способе продуцирования O-сукцинилгомосерина в соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящего изобретения культивирование O-сукцинилгомосерин- продуцирующего штамма может осуществляться в подходящей среде и условиях, известных в области техники. Процедуры культивирования могут быть легко скорректированы специалистами в данной области техники в соответствии с выбранным штаммом. Примеры процедур культивирования включают способы периодического типа, непрерывного типа и периодического типа с подпиткой, но не ограничиваются ими. Различные процедуры культивирования описаны, например, в литературе («Biochemical Engineering», James М. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp. 138-176).
Среда, используемая для культивирования, должна соответствовать требованиям культивирования конкретного штамма. Культуральные среды для различных микроорганизмов описаны в литературе («Manual of Methods for General Bacteriology», American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981). Эти среды содержат множество источников углерода, источников азота и следовых элементов. Источники углерода включают углеводы, такие как глюкоза, лактоза, сахароза, фруктоза, мальтоза, крахмал и целлюлоза; жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло и кокосовое масло; жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота; спирты, такие как глицерин и этанол; и органические кислоты, такие как уксусная кислота. Указанные источники углерода могут использоваться по отдельности или в сочетании. Источники азота включают органические источники азота, такие как пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, экстракт солода, жидкий кукурузный экстракт (CSL) и соевая мука, и неорганические источники азота, такие как мочевина, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Указанные источники азота могут использоваться по отдельности или в сочетании. Кроме того, среда может содержать первичный кислый фосфат калия, вторичный кислый фосфат калия и соответствующие им натрийсодержащие соли в качестве источника фосфора. Также среда может содержать соль металла, такую как сульфат магния или сульфат железа. Кроме того, также могут быть добавлены аминокислоты, витамины и подходящие предшественники.
Кроме того, для поддержания культуры в аэробных условиях в культуру можно вводить кислород или кислородосодержащий газ (например, воздух). Температура культуры обычно составляет 20-45°C, и в частности, 25-40°C. Культивирование может продолжаться до тех пор, пока образование предшественника L-метионина не достигнет желаемого уровня, и время культивирования может составлять от 10 ч до 160 ч.
Полезные эффекты изобретения
O-сукцинилгомосерин-продуцирующий штамм настоящего изобретения эффективно продуцирует O-сукцинилгомосерин, который может использоваться при получении L-метионина. Полученный таким образом L-метионин может широко применяться в производстве кормов для животных или кормовых добавок, а также пищевых продуктов для человека или пищевых добавок.
Вариант осуществления изобретения
Далее в этом документе настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры. Однако данные примеры приводятся только в целях иллюстрации, и объем настоящего изобретения не предполагает ограничения этими примерами.
Ссылочный пример 1. Получение O-сукцинилгомосерин-продуцирующего штамма
1-1 Делеция гена metB
Для повышения аккумуляции O-сукцинилгомосерина штамм получали с помощью делеции гена metB, кодирующего цистатионин-гамма-синтазу, которая участвует в разложении O-сукцинилгомосерина.
В штамме W3110 Е. coli (K12) дикого типа ген metB, кодирующий цистатионин-гамма-синтазу, делетировали. Известно, что цистатионин-гамма-синтаза связывается с различными предшественниками метионина в клетках, тем самым образуя различные побочные продукты. Таким образом, сверхэкспрессия цистатионинсинтазы может увеличивать число побочных реакций, снижая эффективность внутриклеточных реакций. Для делеции гена metB осуществляли метод делеции с использованием FRT-одностадийной ПЦР (PNAS (2000), Vol. 97, p. 6640-6645). Сначала ПЦР проводили с использованием праймеров SEQ ID NO: 1 и 2 и вектора pKD3 (PNAS (2000) Vol. 197, pp. 6640-6645) в качестве матрицы для получения делеционной кассеты.
SEQIDNO: 1:
5'-TTACTCTGGTGCCTGACATTTCACCGACAAAGCCCAGGGAACTTCATCACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'
SEQ ID NO: 2:
5'-CGCTGCGCCAGCTCCATACGCGGCACCAGCGTTCGCAACCCACGTAGCAGCATATGAATATCCTCCTTAG-3'
ПЦР проводили в следующих условиях: 30 циклов, состоящих из денатурации при 95°C в течение 30 секунд, отжига при 55°C в течение 30 секунд и удлинения при 72°C в течение 1 минуты. Полученный таким образом продукт ПЦР подвергали электрофорезу на 1,0% агарозном геле, с последующим элюированием и очисткой полосы размером 1,1 т.п.н. Полученный таким образом фрагмент ДНК электропорировали в штамм W3110 Е. coli (K12), предварительно трансформированный вектором pKD46 (PNAS (2000) Vol. 97, p. 6640-6645). Перед электропорацией штамм W3110, трансформированный pKD46, культивировали при 30°C в среде LB, содержащей 200 мкг/л ампициллина и 5 мМ L-арабинозы до тех пор, пока OD600 не достигала 0,5. Затем штамм промывали трижды 10% глицерином. Электропорацию проводили при 2500 В. Полученный штамм сеяли штрихом в среду LB для чашек Петри, содержащую 30 мкг/л хлорамфеникола, с последующим культивированием при 37°C в течение 1-2 суток. Затем отбирали штамм, проявляющий устойчивость.
ПЦР проводили с использованием отобранного штамма в качестве матрицы и праймеров SEQ ID NO: 3 и 4 в описанных выше условиях. Делецию гена metB подтверждали идентификацией гена размером 1,5 т.п.н на 1,0% агарозном геле.
SEQ ID NO: 3: 5'-TATTCGCCGCTCCATTCAGC-3'
SEQ ID NO: 4: 5'-TACCCCTTGTTTGCAGCCCG-3'
Штамм, в котором была подтверждена делеция гена metB, далее трансформировали вектором рСР20 (PNAS (2000) vol. 97, p. 6640-6645) и культивировали в среде LB, содержащей 100 мкг/л ампицилина. Затем ПЦР проводили в тех же самых условиях, и элиминирование хлорамфеникольного маркера подтверждали наблюдением меньшего по размерам ПЦР-продукта на 1,0% агарозном геле. Наконец, получали штамм с делегированным геном metB. Полученный ауксотрофный по метионину штамм был назван CC03-0132.
1-2. Деления гена thxB
Для повышения продукции O-сукцинилгомосерина из гомосерина делегировали ген thrB, который является геном, кодирующим гомосеринкиназу. В частности, при использовании треонин-продуцирующего штамма, делеция гена thrB является необходимой, поскольку активность утилизации гомосерина очень высока. Для делеции гена thrB в штамме CC03-0132, полученном в ссылочном примере 1-1, осуществляли метод делеции с использованием FRT-одностадийной ПЦР (PNAS (2000), Vol. 97, p. 6640-6645). Для делеции гена thrB ПЦР проводили с использованием праймеров SEQ ID NO: 5 и 6 и вектора pKD3 (PNAS (2000) Vol. 97, p. 6640-6645) в качестве матрицы для получения делеционной кассеты.
SEQIDNO: 5:
5'-CATGGTTAAAGTTTATGCCCCGGCTTCCAGTGCCAATATGAGCGTCGGGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'
SEQ ID NO: 6:
5'-GGAGATACCGCTCGCTACCGCGCCGATTTCCGCGACCGCCTGCCGCGCCTCATATGAATATCCTCCTTAG-3'
ПЦР проводили в следующих условиях: 30 циклов, состоящих из денатурации при 95°C в течение 30 секунд, отжига при 55°C в течение 30 секунд и удлинения при 72°C в течение 1 минуты. Полученный таким образом продукт ПЦР подвергали электрофорезу на 1,0% агарозном геле, с последующим элюированием и очисткой полосы размером 1,1 т.п.н. Полученный таким образом фрагмент ДНК электропорировали в штамм СС03-0132, предварительно трансформированный вектором pKD46 (PNAS (2000) Vol. 97, p. 6640-6645). Для электропорации штамм СС03-0132, трансформированный pKD46, культивировали при 30°C в среде LB, содержащей 200 мкг/л ампициллина и 5 мМ L-арабинозы до тех пор, пока OD600 не достигала 0,5. Затем штамм промывали трижды 10% глицерином. Электропорацию проводили при 2500 B. Полученный штамм сеяли штрихом в среду LB для чашек Петри, содержащую 30 мкг/л хлорамфеникола, с последующим культивированием при 37°C в течение 1-2 суток. Затем отбирали штамм, проявляющий устойчивость.
ПЦР проводили с использованием отобранного штамма в качестве матрицы и праймеров SEQ ID NO: 7 и 8 в описанных выше условиях. Делецию гена thrB подтверждали идентификацией гена размером 1,5 т.п.н на 1,0% агарозном геле.
SEQ ID NO: 7: 5'-ACTCGACGATCTCTTTGCC-3'
SEQ ID NO: 8: 5'-ACGCCGAGAGGATCTTCGCAG-3'
Подтвержденный таким образом штамм затем трансформировали вектором pCP20 (PNAS (2000) vol. 97, p. 6640-6645) и культивировали в среде LB, содержащей 100 мкг/л ампицилина. Затем ПЦР проводили в тех же самых условиях, и элиминирование хлорамфеникольного маркера подтверждали наблюдением меньшего по размерам ПЦР-продукта на 1,0% агарозном геле. Наконец, получали штамм с делегированным геном thrB. Полученный таким образом штамм был назван СС03-0133.
1-3. Деления гена metA
Для введения устойчивого к регуляции по типу обратной связи гена metA, в хромосому, аутентичный хромосомный ген metA на основе штамма СС03-0133, который получали с помощью делеции генов metB и thrB в штамме W3110 Е. coli (К 12), делегировали. Для делеции гена metA осуществляли метод делеции с использованием FRT-одностадийной ПЦР (PNAS (2000), Vol. 97, p. 6640-6645). Для делеции гена metA ПЦР проводили с использованием праймеров SEQ ID NO: 9 и 10 и вектора pKD3 (PNAS (2000) Vol. 97, pp. 6640-6645) в качестве матрицы для получения делеционной кассеты.
SEQ ID NO: 9:
5'-TCAGCTGTTGCGCATCGATTCCCGTGAATCGCGCAACACGCCCGCAGAGCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'
SEQ ID NO: 10:
5'-CCGTCACAAAGGCAATGCGCTTATCTTTACTGGCAAACAGATATGCATCCCATATGAATATCCTCCTTAG-3'
ПЦР проводили в следующих условиях: 30 циклов, состоящих из денатурации при 95°C в течение 30 секунд, отжига при 55°C в течение 30 секунд и удлинения при 72°C в течение 1 минуты. Полученный таким образом продукт ПЦР подвергали электрофорезу на 1,0% агарозном геле, с последующим элюированием и очисткой полосы размером 1,1 т.п.н. Полученный таким образом фрагмент ДНК электропорировали в штамм СС03-0133, предварительно трансформированный вектором pKD46 (PNAS (2000) Vol. 97, p. 6640-6645). Для электропорации штамм СС03-0133, трансформированный pKD46, культивировали при 30°C в среде LB, содержащей 200 мкг/л ампициллина и 5 мМ L-арабинозы до тех пор, пока OD600 не достигала 0,5. Затем штамм промывали трижды 10% глицерином. Электропорацию проводили при 2500 В. Полученный штамм сеяли штрихом в среду LB для чашек Петри, содержащую 30 мкг/л хлорамфеникола, с последующим культивированием при 37°C в течение 1-2 суток. Затем отбирали штамм, проявляющий устойчивость.
ПЦР проводили с использованием отобранного штамма в качестве матрицы и праймеров SEQ ID NO: 11 и 12 в описанных выше условиях. Делецию гена metA подтверждали идентификацией гена размером 1,5 т.п.н. на 1,0% агарозном геле.
SEQ ID NO: 11: 5'-CTCATTAACGTTGGTTGTCA-3'
SEQ ID NO: 12: 5'-TATCTTGCTGCTGCTGAATG-3'
Подтвержденный таким образом штамм затем трансформировали вектором pCP20 (PNAS (2000) vol. 97, p. 6640-6645) и культивировали в среде LB, содержащей 100 мкг/л ампицилина. Затем ПЦР проводили в тех же самых условиях, и элиминирование хлорамфеникольного маркера подтверждали наблюдением меньшего по размерам ПЦР-продукта на 1,0% агарозном геле. Наконец, получали штамм с делегированным геном metA. Полученный таким образом штамм был назван СС03-0134.
1.4. Инсерция гена metA11
- Получение вектора pSG для инсерции metA11
Большая часть активности гомосеринсукцинилтрансферазы регулируется ингибированием по типу обратной связи небольшим количеством метионина, добавляемого в среду, и, поэтому, мутант, в котором была устранена регуляция метионином по типу обратной связи, был замещен для повышенного образования предшественника L-метионина, O-сукцинилгомосерина. Для замещения хромосомного гена metA дикого типа, кодирующего гомосеринсукцинилтрансферазу E. coli, на metA11 (SEQ ID NO: 27), кодирующий мутант, в котором устранена регуляция метионином по типу обратной связи, получали pSG-metA11 вектор для инсерции. Согласно корейской патентной публикации №2009-0106365 была получена информация о последовательности оснований гена metA11, и на основе данной последовательности оснований праймеры (SEQ ID NO: 13 и 14), включающие от ATG до ORF гена metA11 и сайты узнавания для рестрикционных ферментов EcoRI и SacI, были синтезированы. ПЦР проводили с использованием плазмиды pMetA11-CL в качестве матрицы (корейская патентная публикация №2009-0106365), которая была получена путем лигирования гена metA11 вектором pCL1920, и праймеров следующих SEQ ID NO.
SEQ ID NO: 13: 5'-ggccgaattcatgccgattcgtgtgccgga-3'
SEQ ID NO: 14: 5'-ggccgagctcgttaatccagcgttggattca-3'
ПЦР проводили с использованием pfu-X ДНК-полимеразы (SolGent; SPX16-R250), и условиями ПЦР были: 30 циклов, состоящих из денатурации при 95°C в течение 30 секунд, отжига при 55°C в течение 30 секунд и удлинения при 72°C в течение 2 минут. В результате, был получен продукт ПЦР амплифицированного metA11 ORF, включающий сайты узнавания для рестрикционных ферментов EcoRI и SacI на обоих концах. Полученный в результате ПЦР ген metA11 обрабатывали рестрикционными ферментами EcoRI и SacI и лигировали вектором pSG76-C (Nucleic Acids Res. 1999 Nov 15; 27(22):4409-15), который обрабатывали рестрикционными ферментами EcoRI и SacI для клонирования гена. Наконец, получали рекомбинантный вектор pSG-metA11 клонированного гена metA11.
- Получение штамма с инсертированным геном metA11
Штамм СС03-0134, полученный в ссылочном примере 1-3, трансформировали с получением pSG-metA11, который был вектором для инсерции гена metA11, и культивировали в среде LB Cm (10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl, 10 г/л триптона и 30 мкг/л хлорамфеникола). Затем выбирали колонию, проявляющую устойчивость к хлорамфениколу. Выбранный трансформант представлял собой штамм, в котором вектор pSG-metA11 был преимущественно инсертирован в хромосомный metA. Штамм с инсертированным геном metA11 трансформировали вектором pST76-ASceP (Nucleic Acids Res. 1999 Nov 15; 27(22): 4409-15), экспрессирующим I-SceI, который является рестрикционным ферментом, расщепляющим I-SceI в векторе pSG, и штамм, выращиваемый в LB-Amp (10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl, 10 г/л триптона и 100 мкг/л хлорамфеникола), отбирали. Этот штамм, отобранный таким путем, являлся штаммом, в котором metA дикого типа был замещен на metA11 и инсертированный вектор pSG76-C был удален. Полученный штамм был назван Е. coli СС03-0038.
Пример 1. Ослабление и деления гена zwf
1-1. Ослабление гена zwf
- Получение вектора pSG для замещения инициирующего кодона гена zwf
Для ослабления гена zwf в штамме СС03-0038, полученном в ссылочном примере 1-4, применяли способ замещения инициирующего кодона ATG области ORF гена zwf на GTG. ПЦР проводили с использованием праймеров SEQ ID NO: 15 и 16 и SEQ ID NO: 17 и 18, и генома Е. coli W3110 в качестве матрицы.
SEQ ID NO: 15: 5'-ggccgaattcctgaaagaaatcgaaatgcag-3'
SEQ ID NO: 16: 5'-cacgtcattctccttaagaattc-3'
SEQ ID NO: 17: 5'-gaattcttaaggagaatgacgtg-3'
SEQ ID NO: 18: 5'-ggccgagctcgggcatggcaaagtagttaatg-3'
ПЦР проводили с использованием pfu-X ДНК-полимеразы (SolGent; SPX16-R250), и ПЦР проводили в следующих условиях: 30 циклов, состоящих из денатурации при 95°C в течение 30 секунд, отжига при 55°C в течение 30 секунд и удлинения при 72°C в течение 1 минуты. ПЦР со сплайсингом перекрывающимися расширениями (SOE, Splicing by Overlap Extension) проводили с использованием двух фрагментов, полученных таким образом в качестве матриц. В результате, были получены область zwf, включающая сайты узнавания для рестрикционных ферментов EcoRI и SacI на обоих концах, и инициирующий кодон GTG. Рестрикционные ферменты EcoRI и SacI были обработаны на концах полученного фрагмента, включая сайты узнавания для ферментов, и клонированы в вектор pSG76-C (Nucleic Acids Res. 1999 Nov 15; 27(22): 4409-15), обработанный рестрикционными ферментами EcoRI и SacI путем лигирования. Наконец, получали рекомбинантный вектор pSG-zwf(GTG).
- Получение штамма с замещением инициирующего кодона гена zwf
pSG-zwf(GTG), который был получен для замещения инициирующего кодона гена zwf, как описано выше, трансформировали в штамм СС03-0038, полученный в ссылочном примере 1-4, и культивировали в среде LB_Cm (10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl, 10 г/л триптона и 30 мкг/л хлорамфеникола). Затем выбирали колонию, проявляющую устойчивость к хлорамфениколу. Выбранный трансформант представлял собой штамм, в котором вектор pSG-zwf(GTG) был преимущественно инсертирован в хромосомный zwf. Выбранный штамм трансформировали pST76-ASceP (Nucleic Acids Res. 1999 Nov 15; 27(22): 4409-15), экспрессирующим I-SceI, который является рестрикционным ферментом, расщепляющим I-SceI на вектор pSG, и штамм, выращиваемый в LB-Amp (10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl, 10 г/л триптона и 100 мкг/л хлорамфеникола), отбирали. Этот штамм, отобранный таким образом, являлся штаммом, в котором ген zwf был ослаблен замещением инициирующего кодона ATG гена zwf на GTG, и затем инсертированный вектор pSG76-C был удален. Полученный штамм был назван СС03-0038zwfGTG.
1-2. Деления гена zwf
Для делеции гена zwf в штамме СС03-0038, полученном в ссылочном примере 1-4, осуществляли метод делеции с использованием FRT-одностадийной ПЦР (PNAS (2000), Vol. 97, p. 6640-6645). Для делеции гена zwf ПЦР проводили с использованием праймеров SEQ ID NO: 19 и 20 и вектора pKD3 (PNAS (2000) Vol. 97, p. 6640-6645) в качестве матрицы для получения делеционной кассеты.
SEQ ID NO: 19:
5'-CAAGTATACCCTGGCTTAAGTACCGGGTTAGTTAACTTAAGGAGAATGACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'
SEQ ID NO: 20:
5'-CTGCGCAAGATCATGTTACCGGTAAAATAACCATAAAGGATAAGCGCAGATACATATGAATATCCTCCTTAG-3'
ПЦР проводили в следующих условиях: 30 циклов, состоящих из денатурации при 95°C в течение 30 секунд, отжига при 55°C в течение 30 секунд и удлинения при 72°C в течение 1 минуты. Полученный таким образом продукт ПЦР подвергали электрофорезу на 1,0% агарозном геле, с последующим элюированием и очисткой полосы размером 1,1 т.п.н. Полученный таким образом фрагмент ДНК электропорировали в штамм СС03-0038, предварительно трансформированный вектором pKD46 (PNAS (2000) Vol. 97, p. 6640-6645). Для электропорации штамм СС03-0038, трансформированный pKD46, культивировали при 30°C в среде LB, содержащей 200 мкг/л ампициллина и 5 мМ арабинозы, до тех пор, пока OD600 не достигала 0,5. Затем штамм промывали трижды 10% глицерином. Электропорацию проводили при 2500 В. Полученный штамм сеяли штрихом в среду LB для чашек Петри, содержащую 30 мкг/л хлорамфеникола, с последующим культивированием при 37°C в течение 1-2 суток. Затем отбирали штамм, проявляющий устойчивость.
ПЦР проводили с использованием отобранного штамма в качестве матрицы и праймеров SEQ ID NO: 21 и 22 в описанных выше условиях. Делецию гена zwf подтверждали идентификацией гена размером 2 т.п.н. на 1,0% агарозном геле.
SEQ ID NO: 21: 5'-CATAACATGATCAGTGTCAGAT-3'
SEQ ID NO: 22: 5'-CGCGTAACAATTGTGGATTCAT-3'
Идентифицированный таким образом штамм был назван СС03-0156.
1-3. Получение O-сукцинилгомосерин-продуцирующего штамма на основе треонин-продуцирующего штамма
Треонин-продуцирующий штамм, E. coli KCCM 10541P, описанный в международной патентной публикации WO 2005/075625, использовали для делеции генов metB, thrB и метА таким же образом, как описано в ссылочном примере 1, и затем устойчивый к регуляции по типу обратной связи ген metA11 вводили для получения штамма для продуцирования O-сукцинилгомосерина, который был назван CJM2-A11. Кроме того, штамм с делегированным геном zwf получали таким же образом, как описано в примере 1-2, и назвали CJM2-A11Z.
Пример 2. Ферментация для получения O-сукцинилгомосерина
Для изучения влияния делеции гена zwf в штамме, полученном в примере 1, проводили культивирование в колбе Эрленмейера. Состав среды в колбе был таким, как в приведенной ниже таблице 1.
Далее, плазмиду pAscrSM (SEQ ID NO: 28), имеющую последовательность scrKYABR (ниже называется «scrO»), описанную в корейской патентной публикации №2009-0018128, вводили для получения штамма, способного утилизировать сахар-сырец, с последующим культивированием в колбе. Состав среды в колбе был таким, как в приведенной ниже таблице 2. Штаммы, полученные указанным выше способом, были названы CC03-0038/pAscrSM, CC03-0038zwfGTG/pAscrSM, CC03-0156/pAscrSM, CJM2-A11/pAscrSM и CJM2-A11Z/pAscrSM, соответственно.
Каждый из штаммов СС03-0038, CC03-0038zwfGTG, СС03-0156, CJM2-A11, CJM2-A11Z, CC03-0038/pAscrSM, CC03-0038zwfGTG/pAscrSM, CC03-0156/pAscrSM, CJM2-A11/pAscrSM и CJM2-A11Z/pAscrSM инокулировали в среды LB для чашек Петри и культивировали при 33°C в течение ночи. Одиночную колонию инокулировали в 2 мл среды LB, с последующим культивированием при 33°C в течение 2 ч. Культуру инокулировали в 250 мл колбе Эрленмейера, содержащей 25 мл среды в колбе при OD600=0,5, с последующим культивированием при 33°C, 200 об/мин в течение 48 ч. Для сравнения продуцирования O-сукцинилгомосерина проводили ВЭЖХ. Результаты приведены в таблице 3 ниже.
Результаты культивирования в колбе показали, что штаммы с ослабленным или делегированным геном zwf CC03-0038zwfGTG, СС03-0156, CJM2-A11Z, СС03-0038zwfGTG/pAscrSM, СС03-0156/pAscrSM, и CJM2-A11Z/pAscrSM демонстрируют продукцию O-сукцинилгомосерина, которая на 8,9-40,0% выше, чем для соответствующих контрольных штаммов. Кроме того, было отмечено уменьшение образования гомосерина, что позволяет предположить, что образование сукцинил-КоА повысилось за счет усиления цикла TCA.
Авторы настоящего изобретения подтвердили, что O-сукцинилгомосерин может быть получен с высоким выходом путем ослабления или делеции гена zwf в штамме СС03-0038 и штамме CJM2-A11. Штамм СС03-0156 депонировали в соответствии с условиями Будапештского договора в Корейском центре культур микроорганизмов (КССМ) 22 ноября 2013 года под номером доступа KCCM11487P.
Что касается применения гена zwf для усиления цикла TCA, следует понимать, что ослабление или делеция гена zwf не ограничивается Е. coli, но точно так же применимо для всех микроорганизмов, имеющих цикл TCA, включая род Escherichia, род Corynebacterium, дрожжи и т.д., для получения высокого выхода O-сукцинилгомосерина.
Claims (16)
1. Микроорганизм рода Escherichia для продуцирования О-сукцинилгомосерина, в котором:
- активность глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназы ослаблена или элиминирована по сравнению с ее эндогенной активностью,
- активности одной или более из цистатионин-гамма-синтазы и гомосеринкиназы элиминированы по сравнению с их эндогенными активностями у микроорганизма дикого типа,
- активность гомосерин-O-сукцинилтрансферазы усилена по сравнению с ее эндогенной активностью у микроорганизма дикого типа, и
- продукция О-сукцинилгомосерина увеличена по сравнению с продукцией у микроорганизма дикого типа.
2. Микроорганизм рода Escherichia по п. 1, в котором глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназа имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23.
3. Микроорганизм рода Escherichia по п. 1, в котором цистатионин-гамма-синтаза имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24 и гомосеринкиназа имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25.
4. Микроорганизм рода Escherichia по п. 1, в котором гомосерин-O-сукцинилтрансфераза имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
5. Микроорганизм рода Escherichia по любому из пп. 1-4, который является Escherichia coli (E.coli).
6. Способ получения О-сукцинилгомосерина, включающий:
культивирование микроорганизма по п. 1 в среде, в результате чего продукция О-сукцинилгомосерина увеличивается по сравнению с продукцией у микроорганизма дикого типа, и
извлечение О-сукцинилгомосерина из культуральной среды или культивируемого микроорганизма.
7. Способ получения О-сукцинилгомосерина по п. 6, в котором микроорганизмом является E.coli.
8. Микроорганизм рода Escherichia по п. 1, в котором ген, кодирующий глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназу, представляет собой ген zwf.
9. Микроорганизм рода Escherichia по п. 1, в котором ген, кодирующий цистатионин-гамма-синтазу, представляет собой ген metB и ген, кодирующий гомосеринкиназу, представляет собой ген thrB.
10. Микроорганизм рода Escherichia по п. 1, в котором ген, кодирующий гомосерин-О-сукцинилтрансферазу, представляет собой ген metA, и активность гомосерин-O-сукцинилтрансферазы увеличена путем замены гена metA на ген metA11.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020140043187A KR101580785B1 (ko) | 2014-04-10 | 2014-04-10 | O-숙시닐호모세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-숙시닐호모세린의 생산방법 |
KR10-2014-0043187 | 2014-04-10 | ||
PCT/KR2015/000677 WO2015156484A1 (ko) | 2014-04-10 | 2015-01-22 | O-숙시닐호모세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-숙시닐호모세린의 생산방법 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2019116782A Division RU2723183C2 (ru) | 2014-04-10 | 2015-01-22 | О-сукцинилгомосерин-продуцирующий микроорганизм и способ получения о-сукцинилгомосерина с его использованием |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2016144104A RU2016144104A (ru) | 2018-05-11 |
RU2016144104A3 RU2016144104A3 (ru) | 2018-05-11 |
RU2691581C2 true RU2691581C2 (ru) | 2019-06-14 |
Family
ID=54288031
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016144104A RU2691581C2 (ru) | 2014-04-10 | 2015-01-22 | О-сукцинилгомосерин - продуцирующий микроорганизм и способ получения о-сукцинилгомосерина с его использованием |
RU2019116782A RU2723183C2 (ru) | 2014-04-10 | 2015-01-22 | О-сукцинилгомосерин-продуцирующий микроорганизм и способ получения о-сукцинилгомосерина с его использованием |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2019116782A RU2723183C2 (ru) | 2014-04-10 | 2015-01-22 | О-сукцинилгомосерин-продуцирующий микроорганизм и способ получения о-сукцинилгомосерина с его использованием |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10570429B2 (ru) |
EP (1) | EP3130665B1 (ru) |
JP (1) | JP6360563B2 (ru) |
KR (1) | KR101580785B1 (ru) |
CN (1) | CN106459890B (ru) |
ES (1) | ES2885852T3 (ru) |
HU (1) | HUE056914T2 (ru) |
PL (1) | PL3130665T3 (ru) |
RU (2) | RU2691581C2 (ru) |
WO (1) | WO2015156484A1 (ru) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108977375B (zh) * | 2018-07-09 | 2019-04-30 | 南京中医药大学 | 一种地衣芽孢杆菌及其在非水相中制备木犀草素c环琥珀酰糖苷衍生物的方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2307169C1 (ru) * | 2006-07-27 | 2007-09-27 | Михаил Сергеевич Гельфанд | Способ исследования и прогнозирования пути биосинтеза метионина в родственных геномах коринебактерий |
WO2008013432A1 (en) * | 2006-07-28 | 2008-01-31 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing l-methionine precursor and method of producing l-methionine and organic acid from the l-methionine precursor |
RU2355759C1 (ru) * | 2007-08-14 | 2009-05-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АРОМАТИЧЕСКОЙ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН ydiB, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЛОЖНОГО ЭФИРА НИЗШИХ АЛКИЛОВ АЛЬФА-L-АСПАРТИЛ-L-ФЕНИЛАЛАНИНА |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2215784C2 (ru) * | 2001-06-28 | 2003-11-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ, ШТАММ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ L-АМИНОКИСЛОТЫ (ВАРИАНТЫ) |
DE10126164A1 (de) | 2001-05-30 | 2002-12-05 | Degussa | Für das metD-gen kodierende Nukleotidsequenzen |
WO2003008604A2 (en) * | 2001-07-18 | 2003-01-30 | Degussa Ag | Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family which contain an attenuated aceb gene |
CN101400799A (zh) | 2006-03-09 | 2009-04-01 | 巴斯夫欧洲公司 | 生产β-赖氨酸的方法 |
CN102732578B (zh) | 2006-03-30 | 2016-02-17 | 巴斯夫欧洲公司 | 生产尸胺的方法 |
EP2808382B1 (en) * | 2007-04-11 | 2016-03-16 | CJ CheilJedang Corporation | Compositions and methods of producing methionine |
KR101136248B1 (ko) | 2008-04-04 | 2012-04-20 | 씨제이제일제당 (주) | L-메치오닌 전구체 생산 균주 및 이를 이용한 l-메치오닌 전구체의 생산 방법 |
US9005952B2 (en) | 2008-04-04 | 2015-04-14 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing L-methionine precursor and the method of producing L-methionine precursor using the microorganism |
US7851180B2 (en) * | 2008-04-04 | 2010-12-14 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing L-methionine precursor and the method of producing L-methionine precursor using the microorganism |
WO2011158975A1 (en) * | 2010-06-15 | 2011-12-22 | Paik Kwang Industrial Co., Ltd. | Production process for amino acids of the aspartate family using microorganisms |
CN104254606B (zh) * | 2012-01-11 | 2019-01-18 | 韩国科学技术院 | 新型合成-调控sRNA及其制备方法 |
-
2014
- 2014-04-10 KR KR1020140043187A patent/KR101580785B1/ko active IP Right Grant
-
2015
- 2015-01-22 WO PCT/KR2015/000677 patent/WO2015156484A1/ko active Application Filing
- 2015-01-22 CN CN201580024453.0A patent/CN106459890B/zh active Active
- 2015-01-22 HU HUE15776244A patent/HUE056914T2/hu unknown
- 2015-01-22 ES ES15776244T patent/ES2885852T3/es active Active
- 2015-01-22 JP JP2016561835A patent/JP6360563B2/ja active Active
- 2015-01-22 RU RU2016144104A patent/RU2691581C2/ru active
- 2015-01-22 US US15/303,196 patent/US10570429B2/en active Active
- 2015-01-22 PL PL15776244T patent/PL3130665T3/pl unknown
- 2015-01-22 RU RU2019116782A patent/RU2723183C2/ru active
- 2015-01-22 EP EP15776244.4A patent/EP3130665B1/en active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2307169C1 (ru) * | 2006-07-27 | 2007-09-27 | Михаил Сергеевич Гельфанд | Способ исследования и прогнозирования пути биосинтеза метионина в родственных геномах коринебактерий |
WO2008013432A1 (en) * | 2006-07-28 | 2008-01-31 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing l-methionine precursor and method of producing l-methionine and organic acid from the l-methionine precursor |
RU2355759C1 (ru) * | 2007-08-14 | 2009-05-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АРОМАТИЧЕСКОЙ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН ydiB, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЛОЖНОГО ЭФИРА НИЗШИХ АЛКИЛОВ АЛЬФА-L-АСПАРТИЛ-L-ФЕНИЛАЛАНИНА |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
NICOLAS C ET AL. Response of the central metabolism of Escherichia coli to modified expression of the gene encoding the glucose-6-phosphate dehydrogenase // FEBS Lett. 2007 Aug 7;581(20):3771-6. Epub 2007 Jul 3. * |
PAKULA A.A. Genetic analysis of protein stability and function. Anna. Rev. Genet., 1989, 23:289-3 * |
PAKULA A.A. Genetic analysis of protein stability and function. Anna. Rev. Genet., 1989, 23:289-310, с. 305-306. * |
ZHAO J. ET AL. Effect of zwf gene knockout on the metabolism of Escherichia coli grown on glucose or acetate // Metabolic Engineering, 2004, 6, pp. 164-174, D2. 10, с. 305-306. * |
ZHAO J. ET AL. Effect of zwf gene knockout on the metabolism of Escherichia coli grown on glucose or acetate // Metabolic Engineering, 2004, 6, pp. 164-174, D2. NICOLAS C ET AL. Response of the central metabolism of Escherichia coli to modified expression of the gene encoding the glucose-6-phosphate dehydrogenase // FEBS Lett. 2007 Aug 7;581(20):3771-6. Epub 2007 Jul 3. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2016144104A (ru) | 2018-05-11 |
EP3130665A1 (en) | 2017-02-15 |
RU2019116782A3 (ru) | 2019-12-19 |
WO2015156484A1 (ko) | 2015-10-15 |
KR20150117548A (ko) | 2015-10-20 |
EP3130665A4 (en) | 2017-08-23 |
ES2885852T3 (es) | 2021-12-15 |
BR112016023342A2 (pt) | 2018-07-03 |
JP2017510287A (ja) | 2017-04-13 |
EP3130665B1 (en) | 2021-08-18 |
CN106459890B (zh) | 2020-11-27 |
KR101580785B1 (ko) | 2015-12-29 |
RU2019116782A (ru) | 2019-06-13 |
PL3130665T3 (pl) | 2022-01-03 |
RU2723183C2 (ru) | 2020-06-09 |
CN106459890A (zh) | 2017-02-22 |
JP6360563B2 (ja) | 2018-07-18 |
US20170101656A1 (en) | 2017-04-13 |
HUE056914T2 (hu) | 2022-03-28 |
RU2016144104A3 (ru) | 2018-05-11 |
US10570429B2 (en) | 2020-02-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6607974B2 (ja) | O−アセチルホモセリンを生産する微生物及びそれを用いてo−アセチルホモセリンを生産する方法 | |
KR101335841B1 (ko) | 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드 및 이를 발현하는 미생물 | |
JP5536496B2 (ja) | O−アセチル−ホモセリン生産菌株およびこれを用いてo−アセチチル−ホモセリンを生産する方法 | |
JP6375391B2 (ja) | O−アセチル−ホモセリンを生産する微生物及びこれを用いてo−アセチル−ホモセリンを生産する方法 | |
JP2020078312A (ja) | L−アミノ酸の生産方法 | |
EP3369821A1 (en) | Corynebacterium sp. microorganism having l-isoleucine producing ability and method for producing l-isoleucine by using same | |
JP6412147B2 (ja) | L−スレオニン産生能を有する組み換えエシェリキア属微生物およびこれを用いたl−スレオニンの産生方法 | |
JP2018529354A (ja) | L−トレオニンを生産する組み換え微生物及びそれを用いてl−トレオニンを生産する方法 | |
EP3061814B1 (en) | Microorganism producing o-succinyl homoserine and method for producing o-succinyl homoserine by using same | |
RU2691581C2 (ru) | О-сукцинилгомосерин - продуцирующий микроорганизм и способ получения о-сукцинилгомосерина с его использованием | |
RU2674891C2 (ru) | Микроорганизм, обладающий способностью продуцировать о-сукцинилгомосерин или янтарную кислоту, и способ продуцирования янтарной кислоты или о-сукцинилгомосерина посредством его применения | |
JP6386551B2 (ja) | O−スクシニルホモセリンの生産のための微生物及びこれを用いたo−スクシニルホモセリンの生産方法 | |
KR101555750B1 (ko) | O-숙시닐호모세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-숙시닐호모세린의 생산방법 | |
EP3196300B1 (en) | Microorganism with improved l-lysine productivity, and method for producing l-lysine by using same | |
BR112016023342B1 (pt) | Microrganismo produtor de o-succinilhomosserina e método para produção de o-succinilhomosserina utilizando o mesmo |