CN101400799A - 生产β-赖氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供通过构建重组微生物和培养所述微生物生产β－赖氨酸的方法，其中所述微生物具有去调控的赖氨酸－2，3－氨基变位酶基因和至少一个去调控的选自组(i)的基因，所述组(i)由天冬氨酸激酶，天冬氨酸半醛脱氢酶，二氢吡啶二羧酸合酶，二氢吡啶二羧酸还原酶，四氢吡啶二羧酸琥珀酰基化酶，琥珀酰－氨基－酮庚二酸氨基转移酶，琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰基酶，二氨基庚二酸差向异构酶，二氨基庚二酸脱氢酶，精氨酰tRNA合成酶，二氨基庚二酸脱羧酶，丙酮酸羧化酶，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，葡萄糖－6－磷酸脱氢酶，转酮酶，转醛酶，6－磷酸葡糖酸内酯酶，果糖1，6－二磷酸酶，高丝氨酸脱氢酶，磷酸烯醇式丙酮酸羧基激酶，琥珀酰辅酶A合成酶，甲基丙二酰辅酶A变位酶组成，条件是如果天冬氨酸激酶作为基因(i)去调控，则非天冬氨酸激酶的至少第二基因(i)必须去调控。

Description

生产β-赖氨酸的方法
技术领域
本发明涉及一种生产β-赖氨酸的方法。更具体地，本发明涉及重组微生物的使用，所述微生物包括去调控形式的、生产β-赖氨酸所必需的DNA分子。
背景技术
虽然与对应的α-氨基酸相比而言，β-氨基酸较少，但其仍以游离形式和存于多肽中的形式存在于自然界中。Cardillo和Tomasini，Chem.Soc.Rev.25:77(1996)；Sewald，Amino Acids 11:397(1996)。由于β-氨基酸比对应的α-氨基酸是更强的碱和更弱的酸，因此，含有β-氨基酸而非α-氨基酸的多肽具有不同的骨架原子模式，导致新的性质。
在20世纪50年代，L-β-赖氨酸在由链霉菌属(Streptomyces)所产生的几种强碱性肽抗生素中被鉴定到。通过水解产生L-β-赖氨酸的抗生素包括紫霉素，黄链菌素A，紫放线菌素，玫瑰丝菌素和地霉素。Stadtman，Adv.Enzymol.Relat.Areas Molec.Biol.38:413(1973)。β-赖氨酸也是由真菌诺卡氏菌属(Nocardia)所产抗生素，如菌霉素，的组分，并且β-赖氨酸可用于制备其他的生物学活性化合物。然而，β-赖氨酸的化学合成是耗费时间的，需要昂贵的原料，并且产生外消旋混合物。
发明概述
一方面，本发明提供通过构建重组微生物和培养所述微生物生产β-赖氨酸的方法，其中所述微生物具有去调控的赖氨酸-2，3-氨基变位酶和至少一个去调控的基因，该基因选自于赖氨酸生物合成途径中必需的基因。
另一方面，本发明提供β-氨基-ε-己内酰胺的生产方法，其包括上述用于β-赖氨酸生产的步骤。
另一方面，本发明提供ε-己内酰胺的生产方法，其包括上述用于β-赖氨酸生产的步骤。
发明详述
在下述的发明详述中，许多术语被广泛地使用。在此提供定义以利于本发明的理解。
术语β-赖氨酸指L-β-赖氨酸。
启动子：一段DNA序列，其指导结构基因转录产生mRNA。通常，启动子位于基因的5’区，靠近结构基因的起始密码子。如果启动子为诱导型启动子，则转录速率将响应于诱导物而增加。相反，如果启动子为组成型启动子，则转录速率不受诱导物的调控。
增强子：一种启动子元件。增强子可以提高特定基因转录成mRNA的效率，而不论该增强子相对于转录起始位点的距离或方向。
表达。表达是指由结构基因产生多肽的过程。该过程涉及基因转录为mRNA和该mRNA翻译为多肽。
克隆载体。一种DNA分子，如质粒，粘粒、噬菌粒或噬菌体，其具有在宿主细胞中自主复制的能力，且其可以用于基因操作中转化细胞。克隆载体通常含有一个或少数限制性内切酶识别位点，在这些位点处外源DNA序列可以以可确定的方式插入，而不导致载体的必需生物学功能的丧失；此外，还包括标记基因，该标记基因适用于鉴定和选择已经转化了该克隆载体的细胞。标记基因通常包括提供四环素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。
表达载体。一种DNA分子，其包含编码外源蛋白的克隆的结构基因，其提供外源蛋白在重组宿主中的表达。通常，克隆基因的表达被置于(即，有效地连接到)某些调控序列，如启动子和增强子序列的控制之下。启动子序列可以是组成型或是诱导型。
重组宿主。重组宿主可以是含有克隆载体或表达载体的任何原核或真核细胞。该术语也旨在包括已通过基因工程在宿主细胞的染色体或基因组中包含了克隆基因的那些原核或真核细胞。适合的宿主的例子见Sambrook等，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)[＂Sambrook＂].
本文中，基本上纯的蛋白质是指，如通过聚丙烯酰胺-十二烷基硫酸钠凝胶电泳(SDS-PAGE)后的单一条带所表明的，该期望的纯化蛋白质基本上不含污染的细胞成分。术语“基本上纯”还意在通过本领域技术人员所用的一种或多种纯度或同质性特征描述同质的分子。例如，基本上纯的赖氨酸2，3-氨基变位酶将显示出处于参数的标准实验偏差范围内的恒定和重复性特征，所述参数例如：分子量，色谱迁移，氨基酸组成，氨基酸序列，封闭或未封闭的N-端，HPLC洗脱曲线，生物活性，及其他此类参数。然而，该术语不意在排除赖氨酸2，3-氨基变位酶与其他化合物的人工的或合成的混合物。另外，该术语不意在排除从重组宿主中分离的赖氨酸2，3-氨基变位酶融合蛋白。
第一方面，本发明提供通过构建重组微生物和培养所述微生物生产β-赖氨酸的方法，所述微生物具有去调控的赖氨酸-2，3-氨基变位酶和至少一个去调控的选自组(i)的基因，组(i)由天冬氨酸激酶，天冬氨酸半醛脱氢酶，二氢吡啶二羧酸合酶，二氢吡啶二羧酸还原酶，四氢吡啶二羧酸琥珀酰基化酶(succinylase)，琥珀酰-氨基-酮庚二酸氨基转移酶，琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰基酶(desuccinylase)，二氨基庚二酸差向异构酶，二氨基庚二酸脱氢酶，精氨酰tRNA合成酶，二氨基庚二酸脱羧酶，丙酮酸羧化酶，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，葡萄糖6-磷酸脱氢酶，转酮酶，转醛酶，6-磷酸葡糖酸内酯酶，果糖1，6-二磷酸酶，高丝氨酸脱氢酶，磷酸烯醇式丙酮酸羧基激酶，琥珀酰辅酶A合成酶，甲基丙二酰辅酶A变位酶组成，条件是如果天冬氨酸激酶基作为基因(i)去调控，则非天冬氨酸激酶的至少第二基因(i)必须去调控。
本发明的方法学涉及重组微生物，优选包括如本文所述的载体或基因(例如，野生型和/或突变的基因)，和/或以导致β-赖氨酸生产的方式培养。
术语“重组”微生物包括已被遗传改变、修饰或工程化(例如，基因工程化)从而与其来源自的天然微生物相比展现出改变的，修饰的或不同的基因型和/或表型(例如，当遗传修饰影响微生物的编码核酸序列时)的微生物(如细菌，酵母细胞，真菌细胞等)。
术语“去调控(deregulated)”包括基因产物(例如，赖氨酸-2，3-氨基变位酶)的表达对比该微生物操作之前的表达或未经操作的可比微生物中的表达而言水平较低或较高。在一个实施方案中，可以对微生物进行遗传操作(例如，基因工程化)，使基因产物以高于或低于该微生物操作之前的表达或未经操作的可比微生物中的表达的水平表达。遗传操作可包括，但不限于，改变或修饰与特定基因的表达相关的调控序列或位点(例如，通过去除强启动子，诱导型启动子或多个启动子)，修改特定基因的染色体定位，改变毗邻特定基因的核酸序列，如核糖体结合位点或转录终止子，减少特定基因的拷贝数，修饰参与转录特定基因和/或翻译特定基因产物的蛋白(例如，调节蛋白，抑制子，增强子，转录激活因子等)，或本领域常规用于去调控特定基因的表达的任何其他常规手段(包括但不限于反义核酸分子的使用，或其他的敲除或阻断靶标蛋白的表达的方法)。
术语“去调控的赖氨酸-2，3-氨基变位酶”也指将赖氨酸-2，3-氨基变位酶活性引入到之前未观察到赖氨酸-2，3-氨基变位酶活性的微生物中，如通过引入一个或多个拷贝的异源赖氨酸-2，3-氨基变位酶基因到微生物中，优选利用基因工程方法进行。
赖氨酸2，3-氨基变位酶催化L-赖氨酸可逆异构化为β-赖氨酸。由近端梭菌(Clostridium subterminale)SB4株中分离的该酶是一个具有明显相同的亚基的六聚体蛋白，如由扩散和沉降系数所确定的，其分子量为285,000。Chirpich等，J.Biol.Chem.245:1778(1970)；Aberhart等，J.Am.Chem.Soc.105:5461(1983)；Chang等，Biochemistry 35:11081(1996)。该梭菌酶含有铁-硫簇，钴和锌，和5′-磷酸吡哆醛，并且它可由S-腺苷甲硫氨酸激活。不像典型的腺苷酰钴胺素依赖性氨基变位酶，该梭菌酶不包含或要求任何种类的维生素B12辅酶。
梭菌赖氨酸2，3-氨基变位酶的核苷酸和预测的氨基酸序列(SEQ IDNOs：1和2)公开于US6,248,874B1中。
编码梭菌赖氨酸2，3-氨基变位酶基因的DNA分子，可以使用具有基于SEQ ID NO：1的核苷酸序列的多聚核苷酸探针，筛选cDNA或基因组文库而获得。如，合适的文库可经由自近端梭菌SB4株(ATCC No.29748)获得基因组DNA并根据标准方法构建文库而制备。见，例如，Ausubel等(编)，SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，第3版，2-1至2-13页和5-1至5-6页(John Wiley & Sons，Inc.1995)。
备选地，梭菌赖氨酸2，3-氨基变位酶基因可使用互为引物的长寡核苷酸通过合成DNA分子而获得。见，例如，Ausubel等(编)，CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，8.2.8至8.2.13页(1990)[＂Ausubel＂]。此外，也可见Wosnick等，Gene 60:115(1987)；和Ausubel等(编)，SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，第3版，8-8至8-9页(John Wiley&Sons，Inc.1995)。利用聚合酶链式反应的成熟技术提供了合成至少2千碱基长度的DNA分子的能力。见Adang等，Plant Molec.Biol.21:1131(1993)；Bambot等，PCR Methods andApplications 2:266(1993)；Dillon等，＂聚合酶链式反应用于快速构建合成基因，＂METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.15：PCRPROTOCOLS：CURRENT METHODS AND APPLICATIONS，White(ed.)，263-268页，(Humana Press，Inc.1993)；Holowachuk等，PCRMethods Appl.4:299(1995)。
可以产生相比于亲本酶含有保守氨基酸改变的梭菌赖氨酸2，3-氨基变位酶变体。即，可获得SEQ ID NO：2中包含一个或多个氨基酸替换的变体，其中以烷基氨基酸替代梭菌赖氨酸2，3-氨基变位酶的氨基酸序列中的烷基氨基酸，以芳族氨基酸替代梭菌赖氨酸2，3-氨基变位酶的氨基酸序列中的芳族氨基酸，以含硫氨基酸替代梭菌赖氨酸2，3-氨基变位酶的氨基酸序列中的含硫氨基酸，以含羟基的氨基酸替代梭菌赖氨酸2，3-氨基变位酶的氨基酸序列中的含羟基的氨基酸，以酸性氨基酸替代梭菌赖氨酸2，3-氨基变位酶的氨基酸序列中的酸性氨基酸，以碱性氨基酸替代梭菌赖氨酸2，3-氨基变位酶的氨基酸序列中的碱性氨基酸，或以羧酸氨基酸替代梭菌赖氨酸2，3-氨基变位酶的氨基酸序列中的二碱基一羧酸氨基酸。
在常见氨基酸中，例如，“保守氨基酸替代”可以由以下各组中的氨基酸之间的替代来说明：(1)甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸，(2)苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸，(3)半胱氨酸和蛋氨酸，(4)丝氨酸和苏氨酸，(5)天冬氨酸和谷氨酸，(6)谷氨酰胺和天冬酰胺，(7)赖氨酸，精氨酸和组氨酸。
于梭菌赖氨酸2，3-氨基变位酶中的保守氨基酸改变，可通过SEQ IDNO：1.中所述核苷酸的核苷酸替换而引入。这种“保守氨基酸”变体可以，如通过寡核苷酸定向诱变，接头分区诱变，利用聚合酶链式反应的诱变等获得。见Ausubel等，同上引文，8.0.3-8.5.9页；Ausubel等(编)，SHORTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，第3版，8-10至8-22页(John Wiley & Sons，Inc.1995)。一般地也可见McPherson(ed.)，DIRECTED MUTAGENESIS：A PRACTICAL APPROACH，IRL Press(1991)。变体转换L-赖氨酸为L-β-赖氨酸的能力可使用标准酶活性分析试验，如在此所述的分析试验来确定。
来自近端梭菌之外的其它来源，如来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或大肠杆菌(Escherichia coli)的赖氨酸2，3-氨基变位酶已公开于US6,248,874B1中。该美国专利中涉及赖氨酸2，3-氨基变位酶的分离，SEQID NOs及表达的部分特此明确地并入作为参考。
优选的本发明赖氨酸2，3-氨基变位酶是来源于近端梭菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的赖氨酸2，3-氨基变位酶，及它们的等价基因，所述等价基因与对应的“原始”基因产物具有高达80％，优选90％，最优选95％和98％的序列一致性(基于氨基酸序列)，并仍具有赖氨酸2，3-氨基变位酶的生物学活性。这些等价基因可容易地通过以本领域所熟知的方法引入核苷酸替换、缺失或插入而构建。
另一本发明的优选实施方案是源于近端梭菌的赖氨酸2，3-氨基变位酶(US6,248,874B1的SEQ ID NO：2)，其通过应用谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的密码子用法返译为DNA。该赖氨酸2，3-氨基变位酶多核苷酸序列用于在棒杆菌属(Corynebacterium)的微生物，尤其是谷氨酸棒状杆菌中表达赖氨酸2，3-氨基变位酶。
除了去调控的赖氨酸2，3-氨基变位酶基因，根据本发明的微生物还必须具有至少一个去调控的选自组(i)的基因。该组(i)是在赖氨酸生物合成中起关键作用的一组基因，由天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰基化酶、琥珀酰-氨基-酮庚二酸氨基转移酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰基酶、二氨基庚二酸差向异构酶、二氨基庚二酸脱氢酶、精氨酰tRNA合成酶、二氨基庚二酸脱羧酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、葡萄糖6-磷酸脱氢酶、转酮酶、转醛酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、果糖1，6-二磷酸酶、高丝氨酸脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧基激酶、琥珀酰辅酶A合成酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶组成。
根据本发明的方法至少一个组(i)的基因必须被去调控。根据本发明，优选一个以上的组(i)的基因，例如：二，三，四，五，六，七，八，九，十个基因在微生物中被去调控。
组(i)的基因和基因产物在本领域中是已知的。EP 1108790公开了高丝氨酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶基因的突变，这些突变对重组棒状杆菌生产赖氨酸的生产力具有有利的影响。WO 00/63388公开了天冬氨酸激酶基因的突变，该突变对重组棒状杆菌生产赖氨酸的生产力具有有利的影响。就上文所述基因的突变，将EP 1108790及WO 00/63388并入作为参考。
在下表中针对每个基因/基因产物，提及了相应基因的可能去调控方式。在表的“去调控”列中引用的文献和文件就基因去调控方面并入此处作为参考。在表中所提及的方式为相应基因的去调控的优选实施方案。
表1
 
酶(基因产物) 基因 去调控
 
天冬氨酸激酶 ask 经点突变解除反馈抑制(Eggeling等，(编)，Handbook ofCorynebacterium glutamicum，20.2.2页(CRC press，2005))和扩增)
天冬氨酸半醛脱氢酶 asd 扩增
二氢吡啶二羧酸合酶 dapA 扩增
二氢吡啶二羧酸还原酶 dapB 扩增
四氢吡啶二羧酸琥珀酰基化酶 dapD 扩增
琥珀酰-氨基-酮庚二酸氨基转移酶 dapC 扩增
琥珀酰-二氨基庚二酸脱琥珀酰基酶 dapE 扩增
二氨基庚二酸脱氢酶 ddh 扩增
二氨基庚二酸差向异构酶 dapF 扩增
精氨酰tRNA合成酶 argS 扩增
二氨基庚二酸脱羧酶 lysA 扩增
丙酮酸羧化酶 pycA 经点突变解除反馈抑制(EP1108790)及扩增
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 ppc 扩增
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 zwf 经点突变解除反馈抑制(US2003/0175911)及扩增
转酮酶 tkt 扩增
转醛酶 tal 扩增
6-磷酸葡糖酸内酯酶 pgl 扩增
果糖1，6-二磷酸酶 fbp 扩增
高丝氨酸脱氢酶 hom 经点突变衰减(EP1108790)
 
磷酸烯醇式丙酮酸羧基激酶 pck 经突变或其他方式敲除或沉默
琥珀酰辅酶A合成酶 sucC 经点突变衰减(WO 05/58945)
甲基丙二酰辅酶A变位酶 经点突变衰减(WO 05/58945)
天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰基化酶、琥珀酰-氨基-酮庚二酸氨基转移酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰基酶、二氨基庚二酸差向异构酶、二氨基庚二酸脱氢酶、精氨酰tRNA合成酶、二氨基庚二酸脱羧酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、葡萄糖6-磷酸脱氢酶、转酮酶、转醛酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、果糖1，6-二磷酸酶基因的去调控的一个优选方法为增加基因活性的“向上”突变，如提高酶活性的基因扩增、使用强表达信号和/或点突变。
高丝氨酸脱氢酶，磷酸烯醇式丙酮酸羧基激酶，琥珀酰辅酶A合成酶，甲基丙二酰辅酶A变位酶基因的去调控的一个优选方法为降低基因活性的“向下”突变，如基因缺失或破坏、使用弱表达信号和/或点突变。
如果天冬氨酸激酶作为基因(i)组的成员被去调控，那么至少第二基因(i)成员——非天冬氨酸激酶——也必须被去调控。
为了表达根据本发明的去调控的基因，编码酶的DNA序列必须与在表达载体中控制转录表达的调控序列有效连接，然后导入原核或真核宿主细胞。除了转录调控序列如启动子和增强子外，表达载体还可以包括翻译调节序列和标记基因，所述标记基因适用于选择携带该表达载体的细胞。
在原核宿主中用于表达的合适的启动子可以是可阻遏的，组成型的或可诱导的。合适的启动子是本领域技术人员熟知的，包括能够识别T4，T3，Sp6和T7聚合酶的启动子，λ噬菌体的PR和PL启动子，大肠杆菌的trp，recA，热休克，lacUV5，tac，lpp-lacλpr，phoA，gal，trc和lacZ启动子，枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶和σ28特异性启动子，芽孢杆菌属(Bacillus)的噬菌体的启动子，链霉菌属启动子，λ噬菌体的int启动子，pBR322的β-内酰胺酶基因的bla启动子，和氯霉素乙酰转移酶基因的CAT启动子。原核启动子见Glick的综述，J.Ind.Microbiol.1:277(1987)；Watson等，MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE，第4版，Benjamin Cummins(1987)；Ausubel等，同上引文，和Sambrook等，同上引文。
用于赖氨酸2，3-氨基变位酶的表达的优选启动子是谷氨酸棒状杆菌的sodA启动子。为了改善表达，终止子，如谷氨酸棒状杆菌的groEL终止子可插入到赖氨酸2，3-氨基变位酶基因的下游。
在原核宿主中表达蛋白质的方法是本领域技术人员熟知的。见，如，Williams等，＂使用质粒载体在大肠杆菌中表达外源蛋白质并使用特异性多克隆抗体纯化，＂DNA CLONING 2：EXPRESSION SYSTEMS，第2版，Glover等(编)，15-58页(Oxford University Press1995)。也见Ward等，＂抗体的遗传操作和表达，＂MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLESAND APPLICATIONS，137-185页(Wiley-Liss，Inc.1995)；及见Georgiou，＂在细菌中表达蛋白质，＂PROTEIN ENGINEERING：PRINCIPLES AND PRACTICE，Cleland等(编)，101-127页(John Wiley& Sons，Inc.1996)。
表达载体可利用各种技术导入细菌宿主细胞，包括氯化钙转化，电穿孔等。如，见Ausubel等(编)，SHORT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY，第3版，1-1至1-24页(John Wiley & Sons，Inc.1995)。
本发明的一个重要方面涉及培养本文所述的重组微生物，以便产生期望的化合物β-赖氨酸。术语“培养”包括本发明的活微生物的维持和/或生长(如培养物或菌株的维持和/或生长)。在一个实施方案中，本发明的微生物培养在液体培养基中。在另一实施方案中，本发明的微生物培养在固体培养基或半固体培养基中。在一优选的实施方案中，本发明的微生物培养在包括必须养分或有利于微生物的维持和/或生长的养分的培养基(例如，灭菌的液体培养基)中。
可用碳源包括糖和碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪，如豆油，葵花籽油，花生油和椰子油，脂肪酸，如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇类，如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸。在一优选的实施方案中，葡萄糖，果糖或蔗糖用作碳源。这些物质可单独使用或作为混合物使用。
可用氮源包括有机含氮化合物，如蛋白胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浆，大豆粉和尿素，或无机化合物，如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。该氮源可单独使用或作为混合物使用。可用磷源是磷酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或对应的含钠盐。培养基中还必须含有生长所必需的金属盐，如硫酸镁或硫酸铁。最后，除上述物质外，还可以使用必需的促生长物质，例如，氨基酸和维生素。合适的前体也可添加到培养基中。所述的饲养物质可作为单一一批添加到培养基中或适当地在培养过程中添加。
优选地，本发明的微生物在受控的pH条件下进行培养。术语“受控的pH”包括可导致期望的精细化学品，例如，β-赖氨酸生产的任何pH值。在一个实施方案中，微生物培养在pH值约为7的条件下。在另一实施方案中，在6.0和8.5之间的pH培养微生物。期望的pH值可以通过本领域技术人员已知的任何方法来维持。例如，碱性化合物，如氢氧化钠，氢氧化钾，氨，或氨水，或酸性化合物，如磷酸或硫酸，可以用来适当地控制培养基的pH值。
也优选地，本发明的微生物培养在受控的通气条件下。术语“受控的通气”包括足够的通气(例如，氧)以导致期望的精细化学品，例如，β-赖氨酸的产生。在一个实施方案中，通气可通过调节培养基中的氧水平，例如，通过调节培养基中的溶氧量来进行控制。优选地，培养物的通气通过搅拌培养物来控制。搅拌可以利用螺旋桨或类似的机械搅拌设备，通过旋转或摇动生长容器(如发酵罐)或通过各种泵设备来提供。通气还可以通过让无菌空气或氧气通过培养基(例如，通过发酵混合物)来控制。也优选，本发明的微生物在无过量起泡的条件下(例如，通过消泡剂的添加，如加入脂肪酸聚乙二醇酯)培养。
此外，本发明的微生物可以培养在受控的温度条件下。术语“受控的温度”包括可以导致期望的精细化学品，例如，β-赖氨酸产生的任何温度。在一个实施方案中，受控的温度包括15℃和95℃之间的温度。在另一实施方案中，受控的温度包括15℃和70℃之间的温度。优选温度在20℃和55℃之间，更优选温度在30℃和45℃之间或30℃和50℃之间。
微生物可培养(如维持和/或生长)在液体培养基中，并且优选地通过常规的培养方法进行连续培养或间歇式培养，所述培养方法为如静置培养，试管培养，振荡培养(例如，旋转振荡培养，振荡摇瓶培养等)，通气旋动培养或发酵。在一个优选的实施方案中，微生物培养在摇瓶中。在一更优选的实施方案中，微生物培养在发酵罐中(例如，发酵方法)。本发明的发酵方法包括，但不仅限于，分批，补料分批和连续发酵方法。术语“分批方法”或“分批发酵”是指一个封闭的系统，其中培养基的组成，营养物，补充添加剂等在开始发酵时已设定，且不在发酵过程中改变，然而，可尝试控制诸如pH值和氧浓度等因素以防止培养基过度酸化和/或微生物死亡。术语“分批补料方法”或“分批补料”发酵是指随着发酵的进展添加一种或多种底物或补充物(例如，递增地或连续地添加)的分批发酵。术语“连续方法”或“连续发酵”是指这样的系统，在该系统中连续地将确定成分的发酵培养基加到发酵罐中并同时移出等量的已用过的培养基或“条件”培养基，优选用于回收期望的β-赖氨酸。各种这样的方法已经开发出来并且为本领域所熟知。
本发明的方法可以进一步包括回收β-赖氨酸的步骤。术语“回收”β-赖氨酸包括从培养基中提取，收获，分离或纯化该化合物。回收该化合物可以根据本领域已知的任何常规的分离或纯化方法完成，所述方法包括但不限于使用常规树脂处理(例如，阴离子或阳离子交换树脂，非离子型吸附树脂等)，使用常规吸附剂处理(例如，活性炭，硅酸，硅胶，纤维素，氧化铝等)，改变pH值，溶剂萃取法(例如，采用常规的溶剂，如乙醇，乙酸乙酯，己烷等)，蒸馏，透析，过滤，浓缩，结晶，重结晶，调节pH值，冷冻干燥等。例如β-赖氨酸可从培养基中首先通过去除微生物而回收。去除生物质后的发酵液然后通过或经过阳离子交换树脂以去除不想要的阳离子，然后通过或经过阴离子交换树脂以去除不需要的无机阴离子和比β-赖氨酸具有更强酸性的有机酸。
另一方面，本发明提供了用于β-氨基-ε-己内酰胺生产的方法，其包括如上所述用于β-赖氨酸生产的步骤。β-赖氨酸经过分子内环化形成β-氨基-ε-己内酰胺。该环化反应可在β-赖氨酸的分离和/或纯化之前直接完成，或是使用分离的β-赖氨酸进行。
另一方面，本发明提供了用于ε-己内酰胺生产的方法，其包括如上所述用于β-赖氨酸生产的步骤。正如上所述β-赖氨酸可经分子内环化形成β-氨基-ε-己内酰胺，而β-氨基-ε-己内酰胺可以通过选择性地脱氨而得到ε-己内酰胺。该脱氨方法在本领域中是已知的。
本发明的另一方面是生产酸的方法，其包括如上所述用于β-赖氨酸生产的步骤及随后β-赖氨酸的β-氨基官能团的脱氨。由此产生的ε-氨基己酸可转化为ε-己内酰胺或直接地——不经环化为内酰胺——经由已知的聚合技术转化为聚酰胺。
ε-己内酰胺是用于聚酰胺，特别是PA6生产的非常重要的单体。
实施例
1.近端梭菌赖氨酸2，3-氨基变位酶基因的克隆
根据具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)和腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)的赖氨酸2，3-氨基变位酶基因的上游和下游的保守区，设计一组寡核苷酸引物用于分离近端梭菌赖氨酸2，3-氨基变位酶基因(kamA)。使用PCR引物WKJ90/WKJ65和WKJ68/WKJ93，并使用近端梭菌的染色体作为模板，扩增上游和下游区的DNA片段，分别包括kamA基因的N端和C端序列。扩增DNA片段的序列分析完成后，进行纯化，得到含有kamA结构区的起始和终止序列的产物。基于已确定的上游和下游序列，合成PCR引物WKJ105/WKJ106，用于分离近端梭菌kamA基因的全序列。纯化扩增的PCR片段，用限制性酶Xho I和Mlu I消化，并连接到由相同限制性酶消化后的pClik5aMCS载体上(pClik5aMCS kamA)。
2.合成的近端梭菌赖氨酸2，3-氨基变位酶基因的克隆
近端梭菌kamA基因的密码子用法与谷氨酸棒状杆菌的十分不同，这可能导致在谷氨酸棒状杆菌赖氨酸生产菌株中基因表达的降低。为提高谷氨酸棒状杆菌中的基因表达，构建了合成的kamA基因，其适应于谷氨酸棒状杆菌的密码子用法并具有替换其自身启动子和终止子的谷氨酸棒状杆菌sodA启动子(Psod)和groEL终止子。合成的kamA基因与原始基因对比显示72％的核苷酸序列相似性。合成的kamA基因已克隆到pClik5aMCS载体上(pClik5aMCS syn_kamA)。
3.枯草芽孢杆菌赖氨酸2，3-氨基变位酶基因的克隆
含有枯草芽孢杆菌赖氨酸2，3-氨基变位酶基因(yodO)的DNA片段用PCR引物WKJ71/WKJ72自染色体DNA进行了扩增。扩增的DNA片段经纯化，Xho I和Mlu I消化后，插入到pClik5aMCS载体的Xho I和Mlu I切割位点之间(pClik5aMCS yodO)。
为增加基因的表达，在yodO基因的编码区的前面替换为谷氨酸棒状杆菌的sod A启动子。分别用PCR引物WKJ75/WKJ78和WKJ73/WKJ76从各染色体DNA上扩增含有sod A启动子和yodO基因的上游区的DNA片段，该片段作为模板与PCR引物WKJ73/WKJ78一起用于融合PCR以产生yodO上游-Psod产物。随后，Psod-控制的yodO基因利用WKJ73/WKJ74引物、及yodO上游-Psod和yodO编码区(使用引物WKJ77/WKJ74扩增的)作为模板，经融合PCR产生。PCR产物经纯化，Xho I和Mlu I消化后，插入pClik5aMCS载体(pClik5aMCSPsod yodO)。
4.大肠杆菌赖氨酸2，3-氨基变位酶基因的克隆
以PCR引物WKJ29/WKJ30及大肠杆菌染色体作为模板来扩增赖氨酸2，3-氨基变位酶基因(yjeK)。扩增的PCR片段经纯化，Xho I和Nde I限制性酶消化后，连接到经相同限制性酶消化的pClik5aMCS载体上(pClik5aMCS yjeK)。
为增加该基因的表达，在yjeK基因的起始密码子的前面替换为谷氨酸棒状杆菌的sod A启动子。含有sod A启动子和包括下游区的yjeK基因编码区的DNA片段分别采用PCR引物WKJ31/OLD47及WKJ32/WKJ30自各染色体DNA扩增，该DNA片段作为模板与WKJ31/WKJ30引物用于融合PCR产生Psod-yjeK基因。PCR片段经纯化，Xho I和Nde I消化后，插入pClik5aMCS载体的Xho I-Nde I切割位点中(pClik5aMCSPsod yjeK)。
所用寡核苷酸引物：
WKJ29 gagagagactcgagttctacgcgagtaccggtcag
WKJ30 caacagcaatgcatatgaataattaaaggttatgc
WKJ31 gagagagactcgagtagctgccaattattccggg
WKJ32 tacgaaaggattttttacccatggcgcatattgtaaccct
WKJ65 cagtctgcatcgctaacatc
WKJ68 ggctctagaaccagtaggat
WKJ71 gagagagagctcgagaagctttttaatcgaggcgt
WKJ72 ctctctctcacgcgtaagcttgagctgctgatatgtcaggc
WKJ73 tcccgaaagtttatggtgaa
WKJ74 gagagagactcgagtagctgccaattattccggg
WKJ75 acgaaaggattttttacccatgaacatcattgccattatg
WKJ76 ctctctctcactagtgctcaatcacatattgccca
WKJ77 gagagagactcgagccggaagcgatggcggcatc
WKJ78 tacgaaaggattttttacccatgagttctgccaagaagat
WKJ90 cctaacacagaaatgtc
WKJ93 tcctttgtaatatcgc
WKJ105 atcttcttggcagaactcatgggtaaaaaatcctttcgta
WKJ106 gagagagatctagatagctgccaattattccggg
OLD47 gggtaaaaaatcctttcgtag
表2.所用质粒
 
质粒 特性
pClik5aMCS 大肠杆菌/谷氨酸棒状杆菌穿梭载体，Kmr
pClik5aMCS kamA pClik5aMCS携带近端梭菌赖氨酸2，3-氨基变位酶基因(kamA)
pClik5aMCS syn_kamA pClik5aMCS携带由sodA启动子、适应于谷氨酸棒状杆菌密码子用法的kamA基因及groEL终止子组成的、合成的近端梭菌kamA
pClik5aMCS yodO pClik5aMCS携带枯草芽孢杆菌赖氨酸2，3-氨基变位酶基因(yodO)
pClik5aMCS Psod yodO pClik5aMCS携带与谷氨酸棒状杆菌sodA启动子融合的枯草芽孢杆菌yodO
pClik5aMCS yjeK pClik5aMCS携带大肠杆菌赖氨酸2，3-氨基变位酶基因(yjeK)
pClik5aMCS Psod yjeK pClik5aMCS携带与谷氨酸棒状杆菌sodA启动子融合的大肠杆菌yjeK
5.谷氨酸棒状杆菌的β-赖氨酸生产菌株的构建
为构建重组β-赖氨酸生产菌株，用具有赖氨酸2，3-氨基变位酶基因的重组质粒转化赖氨酸生产菌LU11271，其中所述生产菌LU11271是由谷氨酸棒状杆菌野生型菌株ATCC 13032通过将点突变T311I并入天冬氨酸激酶基因中，使二氨基庚二酸脱氢酶基因加倍和破坏磷酸烯醇式丙酮酸羧基激酶基因而构建的。
6.在摇瓶培养中生产β-赖氨酸
摇瓶实验在重组菌株上进行以检测β-赖氨酸的生产。如WO2005059139所述的，使用与赖氨酸生产相同的培养基和条件。为了对照，宿主菌株和具有pClik5aMCS的重组菌株平行检测。菌株于30℃过夜在CM琼脂上进行预培养，将培养的细胞收集到含有1.5ml 0.9％ NaCl的微管中，且涡旋后通过610nm吸光度测定细胞密度。对于主培养，用悬浮的细胞接种10ml生产培养基以达到1.5的初始OD，所述生产培养基包含在高压灭菌的100ml Erlenmeyer摇瓶中具有0.5g CaCO3。主培养于旋转摇床(Infors AJ118，Bottmingen，Switzerland)上于30℃200rpm进行48-78小时。为了监测细胞的生长，0.1ml培养液混合0.9ml1N HCl以消除CaCO3，并在适当稀释后于610nm测定吸光度。采用HPLC法(Agilent 1100 Series LC system)测定β-赖氨酸、赖氨酸及残余的糖，包括葡萄糖，果糖和蔗糖的浓度。
正如下表显示，与对照菌株相比，在含有合成的近端梭菌kamA基因的重组菌株的培养液中观测到β-赖氨酸的积累，这表明合成的近端梭菌kamA基因在谷氨酸棒状杆菌中具有功能。另外，合成的kamA基因的表达经SDS-PAGE已证实。
表3.具有近端梭菌kamA扩增的菌株的摇瓶培养物
Figure A200780008292D00191

Claims (9)

1.通过构建重组微生物和培养所述微生物生产β-赖氨酸的方法，其中所述微生物具有去调控的赖氨酸-2，3-氨基变位酶基因和至少一个去调控的选自组(i)的基因，所述组(i)由天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰基化酶、琥珀酰-氨基-酮庚二酸氨基转移酶、琥珀酰-二氨基庚二酸脱琥珀酰基酶、二氨基庚二酸差向异构酶、二氨基庚二酸脱氢酶、精氨酰tRNA合成酶、二氨基庚二酸脱羧酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、转酮酶、转醛酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、果糖1，6-二磷酸酶、高丝氨酸脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧基激酶、琥珀酰辅酶A合成酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶组成，条件是如果天冬氨酸激酶作为基因(i)去调控，则非天冬氨酸激酶的至少第二基因(i)必须被去调控。
2.根据权利要求1的方法，其中微生物属于棒状杆菌属。
3.根据权利要求1的方法，其中微生物是谷氨酸棒状杆菌。
4.根据权利要求1的方法，其中去调控的赖氨酸2，3-氨基变位酶对于该微生物为异源赖氨酸2，3-氨基变位酶。
5.根据权利要求1的方法，其中重组微生物具有源于梭菌属、芽孢杆菌属或埃希氏杆菌属的赖氨酸2，3-氨基变位酶。
6.根据权利要求1的方法，其中赖氨酸2，3-氨基变位酶具有近端梭菌、枯草芽孢杆菌或大肠杆菌的赖氨酸2，3-氨基变位酶的多肽序列或与对应的原始多肽具有至少80％的同一性的、具有赖氨酸2，3-氨基变位酶活性的多肽序列。
7.用于β-氨基-ε-己内酰胺生产的方法，包括如权利要求1所述的步骤。
8.用于ε-己内酰胺生产的方法，包括如权利要求1所述的步骤。
9.用于ε-氨基己酸生产的方法，包括如权利要求1所述的步骤。
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