CN101765659B - L-赖氨酸的生产方法 - Google Patents
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Abstract
通过在培养基中培养下述具有L-赖氨酸生产能力的大肠杆菌,并从该培养基收集L-赖氨酸,来生产L-赖氨酸,所述大肠杆菌经过修饰而降低了内消旋α,ε-二氨基庚二酸合成途径的1种或2种以上的酶,例如2,3,4,5-四氢吡啶-2,6-二羧酸N-琥珀酰转移酶、琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰基酶或二氨基庚二酸差向异构酶的活性,并且其中导入了编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因。
Description
技术领域
本发明涉及使用大肠杆菌的L-赖氨酸生产方法。L-赖氨酸是一种必需氨基酸,并被用作药物或者动物用饲料添加物等营养混合物的组分。
背景技术
L-赖氨酸等L-氨基酸是使用具有生产这些L-氨基酸的能力的棒状杆菌型细菌或埃希氏菌属细菌等氨基酸生产菌,采用发酵方法来工业生产的。作为这些氨基酸生产菌,为了提高生产力,人们使用了从自然界分离出来的菌株或该菌株的人工突变株或者通过基因重组而增强了L-氨基酸生物合成酶活性的重组体等。L-赖氨酸的生产方法包括例如专利文献1~4中所述的方法。
作为提高L-赖氨酸等氨基酸的生产能力的方法,除了有增加目的氨基酸的固有生物合成途径的酶的表达量的方法以外,还开发了通过修饰呼吸链途径来改善能量效率的方法(专利文献5)、通过扩增烟酰胺核苷酸转氢酶基因来提高烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸生产能力的方法(专利文献6)。
此外,作为对各种氨基酸的生物合成的共有途径进行修饰的方法,已知有补给途径经过修饰的L-氨基酸生产菌,如增加了丙酮酸羧化酶活性的棒状杆菌型细菌L-赖氨酸生产菌(专利文献7)、缺损了丙酮酸激酶的埃希氏菌属L-赖氨酸生产菌(专利文献8)、缺损了苹果酸醌氧化还原酶(malatequinine oxidoreductase)的棒状杆菌型细菌L-赖氨酸生产菌(专利文献9)等。
作为L-赖氨酸的前体,有内消旋α,ε-二氨基庚二酸(以下也称“meso-DAP”)。meso-DAP不但是L-赖氨酸的前体,而且同时作为细胞壁的构成成分,也是细菌生长所必需的物质。关于埃希氏菌属(Escherichia)细菌的meso-DAP合成,已知meso-DAP是从其前体2,3,4,5-四氢吡啶-2,6-二羧酸(以下也称“THDP”)通过属于meso-DAP合成途径的四种酶的功能来合成的,这四种酶是:2,3,4,5-四氢吡啶-2,6-二羧酸N-琥珀酰转移酶(以下也称“DapD”,非专利文献1)、琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶(以下也称“DapC”,非专利文献2)、琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰基酶(以下也称“DapE”,非专利文献3)、以及二氨基庚二酸差向异构酶(以下也称“DapF”,非专利文献4)。已经清楚在棒状杆菌型细菌中另外存在一条以THDP为前体的meso-DAP合成途径,其使用meso-DAP脱氢酶(以下也称“二氨基庚二酸脱氢酶”或“DDH”)通过一步反应从THDP合成meso-DAP,而且还已知DDH表达对于meso-DAP的生产是有用的(专利文献10)。此外,已经公开了如下内容:在考察埃希氏菌属细菌L-赖氨酸生物合成的限速步骤的过程中,将编码棒状杆菌型细菌DDH的基因导入埃希氏菌属的L-赖氨酸生产菌中,作为增强属于meso-DAP合成途径的酶的活性的替代手段,来进行L-赖氨酸生产。然而,人们并未预想到,当在埃希氏菌属细菌中表达DDH时,降低属于meso-DAP合成途径的酶的活性对L-赖氨酸生产是有效的。
专利文献1特开平10-165180号公报
专利文献2特开平11-192088号公报
专利文献3特开2000-253879号公报
专利文献4特开2001-057896号公报
专利文献5特开2002-17363号公报
专利文献6特许第2817400号公报
专利文献7特表2002-508921号公报
专利文献8国际公开第WO03/008600号小册子
专利文献9美国专利申请公开第0044943号
专利文献10特开昭61-289887号公报
专利文献11国际公开第WO2006/093322号公报
专利文献12美国专利申请公开第2006/0160191号公报
专利文献13美国专利6040160
非专利文献1Richaud,C.et al.,J.Biol.Chem.,259(23):14824-14828,1984
非专利文献2Heimberg,H.et al.,Gene.90(1):69-78,1990
非专利文献3Bouvier,J.et al.,J.Bacteriol.,174(16):5265-71,1992
非专利文献4Wiseman,J.S.et al.,J.Biol.Chem.,259(14):8907-14,1984
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的是提供L-赖氨酸生产能力提高的大肠杆菌以及使用该大肠杆菌来生产L-赖氨酸的方法。
解决问题的方法
本发明人等对上述问题进行了深入研究,结果发现:通过对大肠杆菌进行修饰而降低属于meso-DAP合成途径的酶的活性,并且导入编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因,能够提高L-赖氨酸生产能力,从而基于上述认识完成了本发明。
即,本发明如下所述。
(1)一种具有L-赖氨酸生产能力的大肠杆菌,该大肠杆菌经过修饰而降低了内消旋α,ε-二氨基庚二酸合成途径的1种或2种以上的酶的活性,并且导入了编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因。
(2)前述的大肠杆菌,其中,所述内消旋α,ε-二氨基庚二酸合成途径的酶选自2,3,4,5-四氢吡啶-2,6-二羧酸N-琥珀酰转移酶、琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰基酶以及二氨基庚二酸差向异构酶。
(3)前述的大肠杆菌,其中,所述2,3,4,5-四氢吡啶-2,6-二羧酸N-琥珀酰转移酶、琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰基酶以及二氨基庚二酸差向异构酶分别由dapD基因、dapC基因、dapE基因以及dapF基因编码。
(4)前述的大肠杆菌,其中,内消旋α,ε-二氨基庚二酸合成途径的酶的活性是通过降低所述基因的表达量或破坏所述基因而降低的。
(5)前述的大肠杆菌,其经过修饰而至少降低了2,3,4,5-四氢吡啶-2,6-二羧酸N-琥珀酰转移酶活性。
(6)前述的大肠杆菌,其中,所述编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因是棒状杆菌型细菌的ddh基因。
(7)前述的大肠杆菌,其中,所述2,3,4,5-四氢吡啶-2,6-二羧酸N-琥珀酰转移酶是下述(A)或(B)所述的蛋白质:
(A)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白质;
(B)具有在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中包含1个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列,且具有2,3,4,5-四氢吡啶-2,6-二羧酸N-琥珀酰转移酶活性的蛋白质。
(8).前述的大肠杆菌,其中,所述琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶是下述(C)或(D)所述的蛋白质:
(C)具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的蛋白质;
(D)具有在SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中包含1个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列,且具有琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶活性的蛋白质。
(9).前述的大肠杆菌,其中,所述琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰基酶是下述(E)或(F)所述的蛋白质:
(E)具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的蛋白质;
(F)具有在SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列中包含1个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列,且具有琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰基酶活性的蛋白质。
(10).前述的大肠杆菌,其中,所述二氨基庚二酸差向异构酶是下述(G)或(H)所述的蛋白质:
(G)具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的蛋白质;
(H)具有在SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列中包含1个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列,且具有二氨基庚二酸差向异构酶活性的蛋白质。
(11).前述的大肠杆菌,其中,所述dapD基因是下述(a)或(b)所述的DNA:
(a)包含SEQ ID NO:1的碱基序列的DNA;或
(b)与SEQ ID NO:1的碱基序列或能够由该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交,且编码具有2,3,4,5-四氢吡啶-2,6-二羧酸N-琥珀酰转移酶活性的蛋白质的DNA。
(12).前述的大肠杆菌,其中所述dapC基因是下述(c)或(d)所述的DNA:
(c)包含SEQ ID NO:3的碱基序列的DNA;或
(d)与SEQ ID NO:3的碱基序列或能够由该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交、且编码具有琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶活性的蛋白质的DNA。
(13).前述的大肠杆菌,其中所述dapE基因是下述(e)或(f)所述的DNA:
(e)包含SEQ ID NO:5的碱基序列的DNA;或
(f)与SEQ ID NO:5的碱基序列或能够由该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交,且编码具有琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰基酶活性的蛋白质的DNA。
(14).前述的大肠杆菌,其中所述dapF基因是下述(g)或(h)所述的DNA:
(g)包含SEQ ID NO:7的碱基序列的DNA;或
(h)与SEQ ID NO:7的碱基序列或能够由该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交,且编码具有二氨基庚二酸差向异构酶活性的蛋白质的DNA。
(15).前述的大肠杆菌,其中,所述二氨基庚二酸脱氢酶是下述(I)或(J)所述的蛋白质:
(I)具有SEQ ID NO:10、12、14、16或18所示的氨基酸序列的蛋白质;
(J)具有在SEQ ID NO:10、12、14、16或18所示的氨基酸序列中包含1个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列,且具有二氨基庚二酸脱氢酶活性的蛋白质。
(16).前述的大肠杆菌,其中所述ddh基因是下述(i)或(j)所述的DNA:
(i)包含SEQ ID NO:9、11、13、15或17的碱基序列的DNA;或
(j)与SEQ ID NO:9、11、13、15或17的碱基序列或能够由该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交,且编码具有二氨基庚二酸脱氢酶活性的蛋白质的DNA。
(17).前述的大肠杆菌,该大肠杆菌还具有解除了由L-赖氨酸导致的反馈抑制的二氢吡啶二羧酸合酶,以及解除了由L-赖氨酸导致的反馈抑制的天冬氨酸激酶,并且该大肠杆菌的二氢吡啶二羧酸还原酶活性得到了增强。
(18).一种生产L-赖氨酸的方法,其特征在于,在培养基中培养权利要求1~17中任一项所述的大肠杆菌,并且从该培养基中收集L-赖氨酸。
发明的具体实施方式
以下对本发明进行具体说明。
<1>本发明的大肠杆菌
本发明的大肠杆菌(以下也称“本发明的细菌”)是具有L-赖氨酸生产能力、经过修饰而降低了属于meso-DAP合成途径的酶的活性、而且导入了编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因的大肠杆菌。
此外,本发明的优选的细菌,是除了具有上述性质外,还具有解除了由L-赖氨酸导致的反馈抑制的二氢吡啶二羧酸合酶以及解除了由L-赖氨酸导致的反馈抑制的天冬氨酸激酶,且二氢吡啶二羧酸还原酶活性得到了增强的细菌。
本发明的细菌可以这样获得:以具有L-赖氨酸生产能力的大肠杆菌作为亲本株,对其进行修饰而使得其属于meso-DAP合成途径的酶的活性降低,进而向其中导入编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因。对于降低属于meso-DAP合成途径的酶的活性的修饰,和编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因的导入这两者的顺序而言,没有特别限制。此外,L-赖氨酸生产的赋予可以在所述修饰和基因导入之间进行,还可以在最后进行。
就为了获得本发明的细菌而使用的大肠杆菌亲本株而言,没有特殊限制,具体地说可以利用Neidhardt等的著作(Neidhardt,F.C.et al.,Escherichiacoli and Salmonella Typhimurium,American Society for Microbiology,Washington D.C.,1029 table 1)中列举的微生物。具体而言,可以列举出原型野生株K12株来源的大肠杆菌W3110(ATCC 27325)、大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)等。
这些菌株可以从例如美国典型培养物保藏中心(地址12301 ParklawnDrive,Rockville,Maryland 20852,United States of America)通过分售获得。即,各菌株被给予了对应的登录号,可以利用该登录号通过分售获得。对应于各菌株的登录号见美国典型培养物保藏中心的目录。
<1-1>L-赖氨酸生产能力的赋予以及具有L-赖氨酸生产能力的大肠杆菌
作为大肠杆菌中的L-赖氨酸生产菌的例子,可以列举出对L-赖氨酸类似物具有抗性的突变株。L-赖氨酸类似物可抑制大肠杆菌的生长,但在培养基中有L-赖氨酸共同存在时,这种抑制会被完全或部分地解除。作为L-赖氨酸类似物的例子,可以列举出氧代赖氨酸(oxalysine)、赖氨酸氧肟酸(lysinehydroxamate)、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、γ-甲基赖氨酸、α-氯己内酰胺等,但不限于此。对这些赖氨酸类似物具有抗性的突变株可以通过对大肠杆菌实施常规人工突变处理来获得。作为可用于L-赖氨酸生产的细菌菌株的具体例子,可以列举出大肠杆菌(E.coli)AJ11442(FERM BP-1543,NRRL B-12185;参照美国专利4,346,170)以及大肠杆菌VL611。在这些微生物中,L-赖氨酸对天冬氨酸激酶造成的反馈抑制已被解除。
WC196株可以用作大肠杆菌中的L-赖氨酸生产菌。该菌株是通过对大肠杆菌K-12来源的W3110株赋予AEC抗性而选育获得的。该菌株被命名为大肠杆菌AJ13069,于1994年12月6日保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心,305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6),保藏号FERMP-14690,并于1995年9月29日转为基于布达佩斯条约的国际保藏,保藏号FERM BP-5252(美国专利5,827,698)。
作为用于衍生L-赖氨酸生产菌的亲本株的例子,还可以列举出1种或1种以上的编码L-赖氨酸生物合成系统酶的基因的表达增加的菌株。作为这样的基因的例子,可以列举出编码二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)、天冬氨酸激酶(lysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)、二氨基庚二酸脱羧酶(lysA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)以及天冬氨酸酶(aspA)(EP 1253195 A)的基因,但不限于此。此外,亲本株中与能量效率相关的基因(cyo)(EP 1170376 A)、编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因(pntAB)(美国专利5,830,716)、ybjE基因(WO2005/073390)、编码谷氨酸脱氢酶的基因(gdhA)(Gene23:199-209(1983))或这些基因的组合表达水平增加也是可以的。括号内是所述基因的简称。
大肠杆菌的lysC基因的碱基序列如SEQ ID NO:21所示,编码的天冬氨酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。大肠杆菌的dapA基因的碱基序列如SEQ ID NO:23所示,编码的二氢吡啶二羧酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示。大肠杆菌的dapB基因的碱基序列如SEQ ID NO:25所示,编码的二氢吡啶二羧酸还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示。
已知大肠杆菌来源的野生型二氢吡啶二羧酸合酶受到L-赖氨酸的反馈抑制,而大肠杆菌来源的野生型天冬氨酸激酶受到L-赖氨酸的阻遏和反馈抑制。因此,在使用dapA基因和lysC基因时,这些基因优选是编码不受由L-赖氨酸导致的反馈抑制的突变型酶的突变型基因。
作为编码不受由L-赖氨酸导致的反馈抑制的突变型二氢吡啶二羧酸合酶的DNA,可以列举编码具有SEQ ID NO:24的第118位的组氨酸残基被酪氨酸残基取代而得的序列的蛋白质的DNA。此外,作为编码不受由L-赖氨酸导致的反馈抑制的突变型天冬氨酸激酶的DNA,可以列举对具有SEQID NO:22的第352位的苏氨酸残基被异亮氨酸残基取代、第323位的甘氨酸残基被天冬酰胺残基取代、第318位的甲硫氨酸被异亮氨酸取代而成的序列的AKIII编码的DNA(关于这些突变体,参照美国专利5661012以及6040160)。突变型DNA可以通过基于PCR等的定点突变法来获得。
已知的RSF1010来源的广宿主域质粒RSFD80、pCAB1、pCABD2(美国专利6040160)是包含编码具有如上文所述的突变的大肠杆菌突变型二氢吡啶二羧酸合酶的突变型dapA以及编码突变型天冬氨酸激酶的突变型lysC的质粒。经RSFD80转化的大肠杆菌JM109株(美国专利6040160)被命名为AJ12396,该菌株于1993年10月28日被保藏于通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心,305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6),保藏号FERM P-13936,并于1994年11月1日转为基于布达佩斯条约的国际保藏,保藏号FERM BP-4859。RSFD80可以从AJ12396株采用公知方法获得。pCAB1是在所述RSFD80中进一步插入大肠杆菌的dapB基因而制备的。此外,pCABD2是通过在该pCAB1中进一步插入乳发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌)2256株(ATCC13869)的ddh基因而制备的(美国专利6040160)。
作为L-赖氨酸生产菌或用于衍生L-赖氨酸生产菌的亲本株的例子,可以列举出催化从L-赖氨酸的生物合成途径中改道而生成L-赖氨酸以外的化合物的反应的酶的活性降低或缺损的菌株。作为催化从L-赖氨酸的生物合成途径中改道而生成L-赖氨酸以外的化合物的反应的酶的例子,可以列举出高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(美国专利5,827,698)、以及苹果酸酶(WO2005/010175)。这里,为了降低或缺损赖氨酸脱羧酶活性,优选降低编码赖氨酸脱羧酶的cadA基因和ldcC基因这两者的表达(国际公布第WO2006/038695号小册子)。
为了提高甘油同化性,本发明中使用的细菌的glpR基因(EP1715056)的表达可以被弱化,或者其glpA、glpB、glpC、glpD、glpE、glpF、glpG、glpK、glpQ、glpT、glpX、tpiA、gldA、dhaK、dhaL、dhaM、dhaR、fsa以及talC基因等甘油代谢基因(EP1715055A)的表达可以被强化。
<1-2>本发明的大肠杆菌的构建
接下来,对降低属于meso-DAP合成途径的酶的活性的修饰以及编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因的导入进行说明。
大肠杆菌所具有的meso-DAP合成途径是指从(S)-2,3,4,5-四氢吡啶-2,6-二羧酸((S)-2,3,4,5-四氢吡啶二羧酸)生成meso-DAP(内消旋-2,6-二氨基庚二酸、内消旋-α,ε-二氨基庚二酸、或内消旋-二氨基庚二酸)的途径,其由以下的4步反应催化。这些反应是可逆反应。在大肠杆菌中,meso-DAP合成途径也称为DapDCEF途径。
1)DapD(2,3,4,5-四氢吡啶-2,6-二羧酸N-琥珀酰转移酶)(EC 2.3.1.117)
琥珀酰-CoA+(S)-2,3,4,5-四氢吡啶-2,6-二羧酸+H2O→CoA+N-琥珀酰-L-2-氨基-6-酮庚二酸(N-succinyl-L-2-amino-6-oxoheptanedioate)
DapD由dapD基因编码。大肠杆菌的dapD基因的序列如SEQ ID NO:1所示,DapD的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
DapD的酶活性可以参考S.A,Simms等的方法(J.Biol.Chem.,1984,Mar10;259(5):2734-2741)来测定。
2)DapC(琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶)(也称SDAP氨基转移酶)(EC2.6.1.17)
N-琥珀酰-LL-2,6-二氨基庚二酸+2-酮戊二酸→N-琥珀酰-L-2-氨基-6-酮庚二酸+L-谷氨酸
DapC由dapC基因编码。大肠杆菌的dapC基因的序列如SEQ ID NO:3所示,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
DapC的酶活性可以采用Thilo,M.等的方法(J.Bacteriol.,2000,Jul;182(13):3626-3631)来测定。
3)DapE(琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰基酶)(也称SDAP脱琥珀酰化酶)(EC 3.5.1.18)
N-琥珀酰-LL-2,6-二氨基庚二酸+H2O→琥珀酸+LL-2,6-二氨基庚二酸
DapE由dapE基因编码。大肠杆菌的dapE基因的序列如SEQ ID NO:5所示,氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
DapE的酶活性可以采用Lin,Y.K.等的方法(J.Biol.Chem.,1988,Feb5;263(4):1622-1627)来测定。
4)DapF(二氨基庚二酸差向异构酶(EC5.1.1.7)
LL-2,6-二氨基庚二酸→内消旋-2,6-二氨基庚二酸(meso-2,6-diaminopimalate)
DapF由dapF基因编码。大肠杆菌的dapF基因的序列如SEQ ID NO:7所示,氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
DapF的酶活性可以参考Wiseman,J.S.等的方法(J.Biol.Chem.,1984,Jul 25;259(14):8907-8914)来测定。
此外,在本发明中,DDH(二氨基庚二酸脱氢酶)(EC1.4.1.16)是可逆地从内消旋-2,6-二氨基庚二酸生成(S)-2,3,4,5-四氢吡啶-2,6-二羧酸的酶,其催化以下的反应。
内消旋-2,6-二氨基庚二酸+H2O+NADP+→(S)-2,3,4,5-四氢吡啶-2,6-二羧酸+NH3+NADPH+H+
DDH的酶活性可以参考Misono,H.等的方法(J.Biol.Chem.,255,10599-10605,1980)来测定。
编码DDH的ddh基因在埃希氏菌属细菌中是不存在的,可以使用谷氨酸棒杆菌(SEQ ID NO:9)、乳发酵短杆菌(SEQ ID NO:11)、Corynebacteriumefficiens(SEQ ID NO:13)等棒状杆菌型细菌的ddh基因。
谷氨酸棒杆菌ATCC13032的ddh基因(NCgl2528)登录于GenbankNP_601818.2 GI:23308957,Corynebacterium efficiens的ddh基因(CE2498)登录于NP_739108.1 GI:25029054。
此外,除了棒状杆菌型细菌以外,还可以利用Herminiimonasarsenicoxydans的ddh基因(SEQ ID NO:15)、多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)的ddh基因(SEQ ID NO:17)。Herminiimonas arsenicoxydans的ddh基因登录于Genbank YP_001100730.1GI:134095655,多形拟杆菌的ddh基因登录于NP_810892.1 GI:29347389。
上述各基因以及所述的L-赖氨酸生物合成系统酶基因不仅限于具有上述基因信息的基因或者具有公知序列的基因,也可以是这些基因的同源物、人工修饰体等具有保守突变的基因,只要无损于所编码的蛋白质的功能即可。也就是说,可以是编码具有在公知的蛋白质的氨基酸序列中包含1个或者数个位置上的1个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加等而成的序列的蛋白质的基因。
这里,“1个或者数个”因氨基酸残基在蛋白质立体结构中的位置或氨基酸残基的种类而异,具体地说优选为1~20个、更优选1~10个、更优选1~5个。保守突变的代表是保守取代。所谓保守取代,当取代位点是芳香族氨基酸时为Phe、Trp和Tyr之间,当取代位点是疏水氨基酸时为Leu、Ile和Val之间,是极性氨基酸时为Gln和Asn之间,是碱性氨基酸时为Lys、Arg和His之间,当是酸性氨基酸时为Asp和Glu之间,是具有羟基的氨基酸时为Ser和Thr之间的相互取代的突变。视为保守取代的取代具体包括例如:用Ser或Thr取代Ala;用Gln、His或Lys取代Arg;用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn;用Asn、Glu或Gln取代Asp;用Ser或Ala取代Cys;用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln;用Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu;用Pro取代Gly;用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His;用Leu、Met、Val或Phe取代Ile;用Ile、Met、Val或Phe取代Leu;用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys;用Ile、Leu、Val或Phe取代Met;用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe;用Thr或Ala取代Ser;用Ser或Ala取代Thr;用Phe或Tyr取代Trp;用His、Phe或Trp取代Tyr;和用Met、Ile或Leu取代Val。此外,这样的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等还包括因基于提供所述基因的微生物的个体差异、种间差异等情形而天然发生的突变(mutant或variant)而产生的那些取代、缺失、插入、添加或倒位。这样的基因可以通过对公知基因的碱基序列进行修饰,例如采用定点突变法使得所编码的蛋白质的特定部位的氨基酸残基包含取代、缺失、插入或添加来获得。
而且,具有如上所述的保守突变的基因可以是编码这样的蛋白质的基因,所述蛋白质相对于编码的氨基酸序列整体具有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、特别优选97%以上的同源性,且具有与野生型蛋白质等同的功能。而且,在本说明书中,“同源性”(homology)”有时指“同一性”(identity)。
此外,可以将基因的序列中的各密码子分别替换成易于在基因所导入的宿主中使用的密码子。
具有保守突变的基因可以通过突变剂处理等用于常规突变处理的方法来获得。
此外,基因还可以是这样的DNA:其在严格条件下与能够从公知的基因序列制备的探针、例如上文所述基因序列或其互补序列杂交,且编码具有与公知的基因产物等同的功能的蛋白质。这里,“严格条件”是指形成所谓特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件。举一实例,有这样的条件:在该条件下,具有高同源性的DNA之间,例如具有80%以上,优选90%以上,更优选95%以上,特别优选具有97%以上同源性的DNA之间相互杂交,而同源性较之为低的DNA之间则不发生杂交;或者是这样的条件:在与常规Southern杂交的洗涤条件即60℃,1×SSC、0.1%SDS,优选0.1×SSC、0.1%SDS,更优选68℃,0.1×SSC、0.1%SDS相当的盐浓度和温度下,洗涤一次,更优选两次至三次的条件。
作为探针,也可以使用基因的互补序列的一部分。这样的探针可以使用基于公知基因序列制作的寡核苷酸作为引物,以包含这些碱基序列的DNA片段为模板进行PCR来制作。例如,当使用300bp左右长度的DNA片段作为探针时,杂交的洗涤条件可以是例如50℃、2×SSC、0.1%SDS。
“经过修饰而降低了meso-DAP合成途径的酶活性”是指:经过了修饰而使得属于meso-DAP合成途径(以下也称“DapDCEF途径”)的酶、具体地是DapD、DapC、DapE以及DapF这4种酶中的至少一种的活性完全消失,或者与大肠杆菌的非修饰株例如野生株相比活性降低。
被降低活性的酶可以是DapD、DapC、DapE以及DapF中的任何酶,并且可以是1种或2种以上。优选DapDCEF途径的上游侧的酶的活性,特别优选的是进行修饰而至少降低DapD的活性。
所谓降低了DapDCEF途径的酶活性,优选是指,例如,DapDCEF途径的各种酶活性与非修饰株例如野生株相比,每个菌体降低至50%以下、优选30%以下,更优选10%以下。
此处,作为对照的大肠杆菌包括例如作为野生株的原型野生株K12株来源的大肠杆菌W3110(ATCC 27325)、大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)等。
关于使得DapDCEF途径的酶活性降低的修饰,具体地说可以这样来实现:缺损染色体上的编码DapDCEF途径的酶的基因,具体地是dapD、dapC、dapE或dapF基因的编码区域的一部分或全部,或者对启动子、ShineDargarno(SD)序列等表达调节序列进行修饰等。此外,通过对表达调节序列以外的非翻译区域进行修饰也能够降低基因的表达量。而且,还可以缺失整个基因,包括染色体上的基因上下游序列。此外,还可以通过采用基因重组在染色体上的编码酶的区域中导入氨基酸取代(错义突变)、或者导入终止密码子(无义突变)、或者导入一~二个碱基的添加或缺失的移框突变来实现(Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997)Proceedings of theNational Academy of Sciences,USA 95 5511-5515(1998),Journal of BiologicalChemistry 266,20833-20839(1991))。
在本发明中,优选利用同源重组,通过缺损染色体上的基因的表达调节序列例如启动子区域、或编码区域、或非编码区域的一部分或全部,或者通过在这些区域中插入其它序列,来降低细胞内的酶活性。然而,还可以通过照射X射线或紫外线,或通过使用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等突变剂进行的常规突变处理来进行修饰,只要该修饰使得DapDCEF途径的酶活性降低即可。
表达调节序列的修饰优选为1个碱基以上、更优选2个碱基以上、特别优选3个碱基以上。此外,当缺失编码区域时,发生缺失的区域可以是N末端区域、内部区域、C末端区域中的任何区域,也可以是编码区域整体,只要产生的酶蛋白质的功能降低或缺失即可。通常,缺失的区域越长,越能够切实地使基因失活。此外,优选的是,要缺失的区域的上游和下游的阅读框不一致。
当在编码区域中插入其它序列的场合,基因的任何区域都可以插入,且插入的序列越长,越能够切实地使编码酶的基因失活。优选的是插入部位的上下游序列的阅读框不一致。作为所述其它序列,没有特殊限制,只要其能够降低或缺损酶蛋白质的功能即可,包括例如:携带抗生素抗性基因或对L-赖氨酸生产有用的基因的转座子等。
为了对染色体上的基因进行诸如所述的修饰,例如可以这样来实现:制作经过修饰而缺失了基因的部分序列、不产生正常发挥功能的酶蛋白质的缺失型基因,用包含该基因的DNA转化细菌,使缺失型基因与染色体上的基因之间发生同源重组,从而将染色体上的基因替换成缺失型基因。缺失型基因所编码的酶蛋白质即使产生也具有与野生型酶蛋白质不同的立体结构,其功能降低或消失。基于利用如上所述的同源重组的基因取代的基因破坏已经确立,包括下述方法:称为“Red驱动整合(Red-driven integration)”的方法(Datsenko,K.A,and Wanner,B.L.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.97:6640-6645(2000))、Red驱动整合法与λ噬菌体来源的切出系统(Cho,E.H.,Gumport,R.I.,Gardner,J.F.J.Bacteriol.184:5200-5203(2002))相结合的方法(参照WO2005/010175号)等使用线性DNA的方法,或者使用含有温度敏感复制起点的质粒、可接合转移的质粒的方法,利用在宿主内不具有复制起点的自杀载体的方法,等等(美国专利6303383、或特开平05-007491号)。
基因转录量的降低可以通过将从该基因转录的mRNA的量与野生株或非修饰株进行比较来确认。评价mRNA量的方法包括例如Northern杂交、RT-PCR等(Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press,Coldspring Harbor(USA),2001))。
基因所编码的蛋白质的量降低可以通过使用抗体进行western印迹来确认(Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001))。
为了在大肠杆菌中导入编码DDH的基因(ddh),例如,可以利用质粒、噬菌体等载体用ddh基因转化大肠杆菌。这样的载体包括例如pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等。DDH基因可以使用该基因固有的启动子,也可以使用在大肠杆菌中高效发挥功能的启动子,只要DDH基因能在大肠杆菌中表达即可。这样的启动子包括例如lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体的PR启动子、PL启动子、tet启动子等。
此外,ddh基因也可以通过利用转导、转座子(Berg,D.E.and Berg,C.M.,Bio/Technol.,1,417(1983))、Mu噬菌体(特开平2-109985)或同源性重组(Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Lab.(1972))的方法整合到大肠杆菌的染色体上。而且,还可以使整合到染色体上的ddh基因发生转移,来提高拷贝数。
ddh基因导入的确认可以通过例如Southern杂交来进行。此外,导入ddh基因的大肠杆菌具有DDH活性,可以通过例如采用味园春雄,发酵与工业(発酵と工業)45,964(1987)中记载的方法测定DDH活性来确认。此外,也可以使用抗体通过的western印迹检测DDH。
<2>L-赖氨酸的生产方法
本发明的L-赖氨酸生产方法用培养基培养本发明的细菌,在该培养基中或菌体内生成并蓄积L-赖氨酸,并从该培养基或菌体收集L-赖氨酸。
作为所使用的培养基,可以使用在利用微生物的L-赖氨酸发酵生产中传统上使用的培养基。即,可以使用含有碳源、氮源、无机离子以及视需要而定的其它有机成分的常规培养基。这里,作为碳源,可以使用葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、淀粉水解物等糖类,甘油、山梨醇等醇类,富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸类。作为氮源,可以使用硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等无机铵盐,大豆水解物等有机氮、氨气、氨气水等。作为有机微量营养源,理想的是掺入适量的维生素B1、L-高丝氨酸等要求的物质或酵母提取物等。除此之外,还可以视需要少量添加磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。而且,本发明中使用的培养基可以是天然培养基,也可以是合成培养基,只要是包含碳源、氮源、无机离子以及视需要而定的其它有机微量成分的培养基即可。
特别地,在本发明中优选使用甘油作为碳源。甘油可以是作为试剂的甘油,但理想的是使用工业生产的含杂质的甘油。例如,理想的是使用通过用于生物柴油燃料生产的酯化反应来工业生产的甘油(Mu Y,et al,Biotechnol Lett.,28,1755-91759(2006),Haas MJ,et al;Bioresour Technol.97,4,671-8678(2006))。
本发明的培养基中所含的甘油可以作为单独的碳源,也可以使用除甘油之外还添加了其它碳源的混合培养基。作为其它碳源,优选葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、废糖蜜、淀粉水解物以及生物质水解而得到的糖液等糖类,乙醇等醇类,富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸类。当使用混合培养基时,优选甘油相对于培养基中的总碳源的比率为50%以上、60%以上、理想的是70%以上、更理想的是80%以上、特别理想的是90%以上。
培养可以在好氧条件下实施1~7天,培养温度可以是24℃~37℃,培养中的pH可以是5~9。而且,pH调整可以使用无机或者有机的酸性或者碱性物质,还可以使用氨气等。从发酵液中回收L-赖氨酸可以通过组合使用常规的离子交换树脂法、沉淀法及其它公知方法来实施。而且,当L-赖氨酸在菌体内蓄积时,可以例如利用超声波等破碎菌体,再离心分离除去菌体而得到上清,然后用离子交换树脂法等回收L-赖氨酸。
而且,还可以通过采用下述方法进行发酵,并回收赖氨酸的方法来进行生产,所述方法中控制培养中的pH为6.5~9.0、培养结束时培养基的pH为7.2~9.0,并且控制发酵中发酵罐内压力为正,或者,向培养基中供给二氧化碳或含有二氧化碳的混合气体,使得存在培养基中的碳酸氢根离子和/或碳酸根离子为至少2g/L以上的培养期,并且以所述碳酸氢根离子和/或碳酸根离子作为以碱性氨基酸为主的阳离子的反荷离子(参照特开2002-065287号,美国专利申请公开2002025564)。
实施例
以下,通过实施例更具体地说明本发明。
〔实施例1〕dapD被破坏的L-赖氨酸生产菌的构建
<1-1>dapD基因破坏株的构建
首先,使用大肠杆菌野生型株MG1655株进行dapD破坏株的构建。
以pMW118(λattL-Kmr-λattR)(参照国际公布第WO2006093322号公报)质粒为模板,以SEQ ID NO:19以及20所示的、在引物3’末端具有对应于λ噬菌体附着位点的序列attL和attR的两端的序列、在引物5’末端具有对应于作为目的基因的dapD基因的一部分的序列的合成寡核苷酸为引物进行PCR,采用美国专利申请公开第2006/0160191号公报以及WO2005/010175所述的λ-red法构建了MG1655ΔdapD::att-Km株。λ-red法中Km抗性重组体的获得是通过于37℃在含Km(卡那霉素)(50mg/L)的L-琼脂培养基上进行平板培养,并选择Km抗性重组体来进行的。
<1-2>用ΔdapD::att-kan转化L-赖氨酸生产菌WC196LC/pCABD2株
从<1-1>中所得的MG1655ΔdapD::att-Km株按常规方法获得P1溶胞产物,以采用美国专利申请公开第2006/0160191号公报所述的方法构建的L-赖氨酸生产菌WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株作为宿主,采用P1转化法构建了WC196ΔcadAΔldcCΔdapD::att-Km/pCABD2株。WC196ΔcadAΔldc株是采用将Red驱动整合法(Datsenko,K.A.and Wanner,B.L.,2000.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97:6640-6645)与λ噬菌体来源的切出系统(Cho,E.H.,Gumport,R.I.,Gardner,J.F.J.Bacteriol.184:5200-5203(2002))相结合的方法(参照WO2005/010175号)破坏了大肠杆菌WC196的赖氨酸脱羧酶基因cadA和ldc而得到的菌株。在该菌株中导入pCABD2而得的菌株为WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2。
目标转化株可以通过于37℃在含Km(卡那霉素)(50mg/L)和Sm(链霉素)(20mg/L)的L-琼脂培养基上进行平板培养,并选择Km抗性且Sm抗性的重组体来获得。
此外,将这些菌株于37℃在含20mg/L链霉素的L培养基中进行培养至终OD600≈0.6,然后加入与培养液等量的40%甘油溶液并搅拌,再以适当的量进行分装,于-80℃保存。这称作甘油保存液。
〔实施例2〕dapD被破坏的L-赖氨酸生产菌的L-赖氨酸生产能力评价
融解实施例1中所得菌株的甘油保存液,取100μL均匀涂布在含20mg/L链霉素的L平板上,于37℃培养24小时。将所得平板上的约1/8量的菌体悬浮在0.5mL的生理盐水中,用分光光度计U-2000(日立)测定波长600nm的浊度。将所得包含菌体的悬浊液接种在500mL坂口烧瓶中的含20mg/L链霉素的发酵培养基(MS培养基,组成如下述)20mL中,其中接种的液量使得波长600nm的浊度为0.15,用往复式振荡培养装置在搅拌速度114rpm、温度37℃的条件下培养约24小时。培养后,使用Biotec AnalyzerAS210(SAKURA精机)测定培养基中蓄积的L-赖氨酸的量,以及残存的葡萄糖。此外,使用Biotec Analyzer BF-5(王子计测机器)测定培养基中蓄积的甘油。
〔发酵培养基组成,g/L〕
葡萄糖或甘油 40
(NH4)2SO4 24
K2HPO4 11.0
MgSO4·7H2O 1.0
FeSO4·7H2O 0.01
MnSO4·5H2O 0.01
酵母提取物 2.0
用KOH调整至pH7.0,于115℃高压灭菌10分钟(但葡萄糖或甘油以及MgSO4·7H2O另行灭菌)后,加入符合药典的CaCO3 30g/L(180℃,干热灭菌2小时)。添加20mg/L的链霉素。
结果如表1所示(OD表示26倍稀释后于吸光度660nm测定而得的菌体量,Lys(g/L)表示烧瓶中蓄积的L-赖氨酸蓄积量,葡萄糖(g/L)、甘油(g/L)表示培养基中残存的葡萄糖、甘油的量,收率(%)表示从基质收获的L-赖氨酸的收率)。由表1可知,与dapD基因未缺损的WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株相比,WC196ΔcadAΔldcCΔdapD::att-Km/pCABD2株蓄积了更多量的L-赖氨酸。
表1
MS葡萄糖培养基
菌株名 | O.D.(x26) | Lys(g/L) | 葡萄糖(g/L) | 收率(%) |
WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株 | 0.361 | 8.28 | 18.67 | 38.82 |
WC196ΔcadAΔldcCΔdapD::att-Km/pCABD2株 | 0.377 | 8.75 | 18.13 | 40.01 |
MS甘油培养基
菌株名 | O.D.(x26) | Lys(g/L) | 甘油(g/L) | 收率(%) |
WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株 | 0.248 | 2.79 | 28.64 | 24.57 |
WC196ΔcadAΔldcCΔdapD::att-Km/pCABD2株 | 0.320 | 5.10 | 23.69 | 31.12 |
〔序列表的说明〕
SEQ ID NO:1:大肠杆菌dapD的碱基序列
SEQ ID NO:2:大肠杆菌DapD的氨基酸序列
SEQ ID NO:3:大肠杆菌dapC的碱基序列
SEQ ID NO:4:大肠杆菌DapC的氨基酸序列
SEQ ID NO:5:大肠杆菌dapE的碱基序列
SEQ ID NO:6:大肠杆菌DapE的氨基酸序列
SEQ ID NO:7:大肠杆菌dapF的碱基序列
SEQ ID NO:8:大肠杆菌DapF的氨基酸序列
SEQ ID NO:9:谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)的ddh基因的碱基序列
SEQ ID NO:10:谷氨酸棒杆菌的DDH的氨基酸序列
SEQ ID NO:11:乳发酵短杆菌(B.lactofermentum)的ddh基因的碱基序列
SEQ ID NO:12:乳发酵短杆菌的DDH的氨基酸序列
SEQ ID NO:13:C.efficiens的ddh基因的碱基序列
SEQ ID NO:14:C.efficiens的DDH的氨基酸序列
SEQ ID NO:15:H.arsenicoxydans的ddh基因的碱基序列
SEQ ID NO:16:H.arsenicoxydans的DDH的氨基酸序列
SEQ ID NO:17:多形拟杆菌(B.thetaiotaomicron)的ddh基因的碱基序列
SEQ ID NO:18:多形拟杆菌的DDH的氨基酸序列
SEQ ID NO:19:dapD基因缺失用引物
SEQ ID NO:20:dapD基因缺失用引物
SEQ ID NO:21:大肠杆菌lysC的碱基序列
SEQ ID NO:22:大肠杆菌LysC的氨基酸序列
SEQ ID NO:23:大肠杆菌dapA的碱基序列
SEQ ID NO:24:大肠杆菌DapA的氨基酸序列
SEQ ID NO:25:大肠杆菌dapB的碱基序列
SEQ ID NO:26:大肠杆菌DapB的氨基酸序列
工业实用性
根据本发明,在依照使用大肠杆菌的发酵方法进行L-赖氨酸的生产中,能够提高L-赖氨酸的生产量和/或发酵收率。此外,本发明能够用于大肠杆菌的L-赖氨酸生产菌的选育。
Claims (7)
1.一种生产L-赖氨酸的方法,其包括在培养基中培养具有L-赖氨酸生产能力的大肠杆菌,并从培养基收集L-赖氨酸,其特征在于该大肠杆菌经过修饰而通过破坏编码2,3,4,5-四氢吡啶-2,6-二羧酸N-琥珀酰转移酶的dapD基因而降低了2,3,4,5-四氢吡啶-2,6-二羧酸N-琥珀酰转移酶的活性,并且其中该大肠杆菌中导入了编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因是棒状杆菌型细菌的ddh基因,所述棒状杆菌型细菌选自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutam icum)、乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)和Corynebacterium efficiens。
3.根据权利要求1所述的方法,其中,所述2,3,4,5-四氢吡啶-2,6-二羧酸N-琥珀酰转移酶是由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
4.根据权利要求1所述的方法,其中,所述dapD基因是由SEQ ID NO:1的碱基序列组成的DNA。
5.根据权利要求1所述的方法,其中,所述二氨基庚二酸脱氢酶是由SEQ ID NO:10、12、14、16或18所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
6.根据权利要求2所述的方法,其中,所述ddh基因是由SEQ ID NO:9、11、13、15或17的碱基序列组成的DNA。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法,其中选自下组的一种或多种编码L-赖氨酸生物合成酶的基因的表达增加:二氢吡啶二羧酸合酶、天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、二氨基庚二酸脱羧酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸半醛脱氢酶以及天冬氨酸酶。
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