KR20100000665A

KR20100000665A - 라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 및 이를 이용한라이신 생산방법

Info

Publication number: KR20100000665A
Application number: KR1020080060246A
Authority: KR
Inventors: 장재우; 임상조; 최종수; 김철하
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2008-06-25
Filing date: 2008-06-25
Publication date: 2010-01-06
Also published as: KR101012590B1

Abstract

본 발명은 라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물에 관한 것으로, 바람직하게는 아스파테이트 키나제를 암호화하는 유전자(lysC) 및 디히드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 유전자(dapA)를 조절하는 조절유전자인 aspR의 활성이 감소 또는 파괴되어 있는 라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 상기 미생물을 이용하여 라이신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

L-라이신, 코리네박테리움, aspR, lysC, dapA

Description

라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 및 이를 이용한 라이신 생산방법 {A corynebacterium having enhanced L-lysine productivity and a method of producing L-lysine using the corynebacterium}

코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물은 전통적으로 아미노산과 핵산관련물질의 생산에 가장 널리 이용되는 산업용 미생물로서, 주로 L-라이신(lysine), L-트레오닌(threonine), L-아르기닌(arginine), L-쓰레오닌, 및 글루탐산 등의 아미노산 및 각종 핵산을 포함한 사료, 의약품 및 식품 등의 분야에서 다양한 용도를 갖는 화학물질을 생산하는데 이용되는 그람양성세균이며, 생육에 비 오틴을 요구한다. 세포분열시 직각으로 굽어지는 특징을 가지고 있으며, 생성된 대사물질에 대한 분해활성이 낮은 것도 이 균이 가지는 장점 중 하나이다.

L-라이신은 L-아미노산의 하나로서, 기타 아미노산의 흡수를 증가시킴으로써 사료의 질을 향상시킬 수 있는 능력으로 인해 동물 사료 보충물로서 상업적으로 사용되고 있고, 인체 의학에서는 특히 주입용 용액제의 성분으로서 사용되며, 제약 산업에도 사용되고 있다. 그러므로, 라이신을 산업적으로 생산하는 것은 경제적으로 중요한 산업 공정이 되어 왔다.

라이신의 생산 효율을 개선시키기 위한 방법으로, 종래에는 라이신 생합성 관련 유전자가 강화된 코리네박테리움 균주 및 이를 이용한 L-라이신 생산방법이 알려져 있었다 (미국특허 제6,746,855, 미국특허 제6,221,636호). 또한, 라이신 생합성 관련 유전자를 항생제 저항성 염기서열이 없이 강화하는 방법으로는 유전자의 카피수를 증가시키는 방법과 돌연변이에 의한 효소활성의 증가에 의한 것이 보고되어 있다.

또 다른 방법으로는 라이신 생합성 관련 유전자의 전사를 조절하는 유전자의 조작에 의해 강화시키는 방법이 있다. 조절유전자는 활성화 조절인자와 저해 조절인자의 두가지 형태가 있다. 활성화 조절인자는 증폭을 통해 활성화를 강화시키는 방법이 사용되며, 저해 조절인자는 결실을 통해 활성을 강화시키는 방법이 사용된다(Functional determinants of transcription factors in Escherichia coli: protein families and binding sites, Robert Hoffmann. TRENDS in Genetics Vol.19 75-79, 2003). 조절유전자의 조작을 통해 라이신 생합성 유전자를 강화시키 는 방법은 기존 방법보다 몇가지 장점을 가진다. 첫째, 라이신 생합성 유전자의 변형이 없기 때문에 활성에 영향을 주지 않는다. 둘째, 유전자의 카피수를 증가시키는 방법은 상동적인 부위끼리의 교차작용으로 쉽게 카피수가 줄어들어 불안정하지만 조절유전자의 결실을 통한 조작은 상대적으로 안정하다. 셋째, 라이신 생합성 유전자는 다수의 유전자를 연속적으로 조작을 해야 목적하는 효과를 얻을 수 있지만 조절 유전자는 하나의 유전자 조작만으로 같은 효과를 볼 수 있다.

한편, 라이신 생합성에 있어서 코리네박테리움에서 lysC 유전자가 중요한 역할을 한다는 것은 널리 공지되어 있고, 라이신 생산주와 야생주의 DNA 칩을 이용하여 전사체를 비교한 결과 lysC 유전자가 전사수준에서 조절받고 있다는 것이 보고되어 있었으나, 그 조절단백질에 대해서는 보고되어 있지 않았다 (A leuC mutation leading to increased L-lysine production and rel-independent global expression changes in Corynebacterium glutamicum., Masato Ikeda, Appl Microbiol Biotechnol 72:783-789, 2006). 또한, 현재까지 코리네박테리움에서 라이신 생합성 유전자 특히, lysC 유전자와 dapA 유전자를 조절하는 조절단백질에 대해 밝혀지지 않았기 때문에 조절유전자를 조작하여 라이신 생합성 유전자를 강화시킨 보고는 없었다.

이에, 본 발명자들은 코리네박테리움 균주를 이용하여 L-라이신을 생산하는데 있어서 생산원가를 낮추고 수율을 높일 수 있는 L-라이신의 제조방법에 대해 광 범위한 연구를 수행하여 왔으며 그 결과, 코리네박테리움 균주에서 aspR 을 파괴함으로써 L-라이신 생산 미생물의 생산성을 향상시킬 수 있다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 aspR 유전자가 내재적 조절 활성에 비하여 감소된 것을 특징으로 하는, 라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 미생물을 배양하는 단계 및 상기 배양액에서 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신의 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 하나의 양태로서 본 발명은 aspR 유전자가 내재적 조절 활성에 비하여 감소된 것을 특징으로 하는 라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물에 관한 것이다.

aspR 유전자는 그 핵산서열이 이미 미국국립보건원 유전자은행 NIH GenBank에 NCBI 등록번호 NC_003450, NCgl2886로 공지되어 있으나(서열번호 15), 그 기능이 밝혀지지 않았던 유전자이다. 본 발명자들은 본 발명에서 최초로 상기 유전자가 lysC와 dapA 유전자의 프로모터 부위에 결합하여 lysC 및 dapA의 전사를 조절하는 전사 조절단백질을 코딩하는 유전자임을 밝혀내고 이를 aspR 이라고 명명하였고, 이후 본원에서는 aspR이라 기술한다.

본 발명자들은 다음과 같은 방법으로 aspR 가 전사 조절단백질임을 입증하였다.

구체적으로, 라이신 생합성 유전자인 aspB (아스파테이트 아미노트란스퍼라제를 코딩하는 유전자), lysC (아스파테이트 키나제를 코딩하는 유전자), asd (아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나제를 코딩하는 유전자), dapA (디히드로디피콜리네이트 신타제를 코딩하는 유전자), dapB (디히드로디피콜리네이트 리덕타제를 코딩하는 유전자) 및 lysA (디아미노디피멜레이트 디카르복실라제를 코딩하는 유전자)에 대하여 야생주와 라이신 생산균주의 전사 조절 양상을 비교분석하기 위하여 DNA 칩을 이용한 결과, lysC, dapA 및 lysA 유전자만이 야생주에 비해 mRNA 수준상으로 강화되었음을 확인하였다. 이는 상기 유전자들이 전사 수준에서 조절이 되고 있음을 말하고 있으며, 이에 상응되는 조절유전자가 있음을 암시하는 것이다.

이에, lysC, dapA 유전자의 프로모터 부위의 300 에서 500 염기쌍의 DNA를 사용하여, 본 발명자들은 상기 특정 DNA 에 결합하는 조절단백질을 탐색하였다.

구체적으로, 전사수준의 조절유전자가 특정 DNA에 결합하는 특성을 이용하여 특정 유전자를 조절하는 조절단백질을 탐색하였다. 우선, lysC 유전자 및 dapA 유전자 DNA를 바이오틴으로 표지화된 프라이머를 사용하여 PCR 증폭한 뒤, 아가로스 표면에 스트렙타빈으로 코팅된 물질에 붙였다. 바이오틴과 스트렙타빈은 서로 강하 게 결합하는 성질을 가지고 있기 때문에 아가로스 표면위의 스트렙타빈과 바이오틴을 연결되어 특정 DNA가 아가로스 표면에 표지된다. 이것에 코리네박테리움으로부터 추출된 전체 단백질 용액을 섞어 주면, lysC 유전자 및 dapA 유전자 DNA에 결합하는 단백질들이 결합하게 되어 lysC 유전자 및 dapA 유전자 DNA에 결합하는 단백질을 분리할 수 있다. 분리된 단백질은 SDS-PAGE를 이용하여 크기별로 분리한 뒤 질량분석기를 이용하여 동정하여 단백질을 알 수 있다.

이러한 방법을 통해 탐색한 결과, lysC와 dapA 유전자의 프로모터 부위에 결합하는 전사 조절단백질을 코딩하는 유전자 aspR(서열번호 15)을 발견할 수 있었다.

본 발명에서, 내재적 조절 활성이란 코리네박테리움 속 미생물이 천연의 상태로 가지고 있는 효소의 활성상태를 의미하는 것으로, 구체적으로 코리네박테리움 속 미생물이 천연적으로 가지고 있는 lysC와 dapA를 조절하는 활성을 의미한다. aspR 은 그 조절 형태가 발현을 저해하는 성격의 조절유전자이므로 aspR의 조절활성을 감소시킴으로써 상기 미생물의 lysC와 dapA의 발현이 강화되어 라이신 생산성이 증가하는 결과를 보인다.

바람직하게, 본 발명은 서열번호 15의 염기서열을 갖는 aspR 유전자가 포함하고 있는 코리네박테리움 속 미생물을 결실, 치환, 삽입 등의 유전자 조작에 의하여 aspR의 활성을 감소시키며, 더욱 바람직하게는 도 1의 개열지도를 갖는 재조합 벡터 pDZ-aspR 를 도입시킴으로써 aspR의 활성이 파괴되어 라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다. 상기 유전자의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동 재조합에 의하여 이루어질 수 있다.

본 발명에서 사용되는 코리네박테리움 균주는 코리네박테리움 속 미생물이면 어느 것이나 포함될 수 있다. 예를 들면, 상기 코리네박테리움 속 미생물에는, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 써모아미노게네스 (thermoaminogenes) FERM BP-1539, 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum) ATCC 14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼 (lactofermentum)　ATCC 13869, 이들로부터 제조된 L-아미노산 생산 돌연변이체 또는 균주, 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC11001 및 라이신 생합성 유전자 강화 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770이 포함되며, 바람직하게는 수탁번호 KFCC10881인 코리네박테리움 글루타미쿰이다. 또한, 상기와 같이 제작되어 lysC와 dapA의 유전자를 조절하는 aspR 유전자의 내재적 조절 활성이 감소된 코리네박테리움 속 미생물의 가장 바람직한 양태로, 수탁번호가 KCCM 10953P 인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881-aspR인 코리네박테리움 글루타미쿰이다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 aspR의 일부를 포함하는 벡터 pDZ-aspR 을 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881에 도입하여 얻은 형질전환체를 KFCC-10881-aspR 로 명명하고, 2008년 6월 4일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture center of Microorganisms, 이하, "KCCM"으로 약칭함)에 수탁번호 KCCM 10953P 로 기탁하였다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 미생물을 배양하는 단계 및 상기 배양액에서 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신의 생산 방법에 관한 것이다.

상기 배양은 널리 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 배양 온도, 배양 시간 및 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 이들 공지된 배양 방법은 문헌[Chmiel; Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991), 및 Storhas; Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)]에 상세히 기술되어 있다. 또한, 배양 방법에는 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(cintinuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함되며, 바람직하게는 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정 (fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리움 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다 (예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 사용될 수 있는 당원으로는 글루코즈, 사카로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라 기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유해야 한다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양은 원하는 L-아미노산의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성된다. L-라이신은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.

L-라이신을 회수하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법으로 세포 또는 배양 배지로부터 L-라이신을 분리해낼 수 있다. L-라이신 회수 방법의 예로서, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등의 방법이 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서는 기존에 서열은 공지되었으나 그 기능이 알려지지 않았던, lysC와 dapA 유전자의 전사를 조절하는 조절 단백질과 이를 코딩하는 유전자를 발견하였으며 aspR이라 명명하였다. aspR은 저해 조절 단백질로 그 기능을 밝혔으며 aspR 유전자를 결손시킴으로써 아스파테이트 키나제(lysC)와 디히드로디피콜리네이트 신타제(dapA) 유전자의 전사를 강화시켜 증가시킬 수 있는 방법을 제공한다. 이 방법은 직접 라이신 생합성 경로의 유전자들을 조작하지 않고 증가시킬 수 있는 특징이 있다

본 발명에 따른 aspR 유전자가 내재적 조절 활성에 비하여 감소된 것을 특징으로 하는 라이신 생산능이 향상된 미생물을 이용하면 직접 라이신 생합성 경로에 관여하는 다수의 유전자들을 조작하지 않고도 조절유전자 하나의 조작만으로 안정적이고 용이하게 라이신 생산율을 향상시킬 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: DNA chip 을 이용한 야생주와 라이신 생산주의 전사발현 양상비교실험

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032와 라이신 생산주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881를 5L 발효조에 배양한 후, 균체를 수집하였다. 상기 균체를 대상으로 게놈 DNA 칩(지노믹트리㈜, cDNA chip)을 이용하여 약 3,000개의 유전자의 mRNA 발현을 비교 조사하였다. [Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray, Patrick O. Brown (1995), Science Vol. 270. 467-470].

전체 유전자들 중에서 라이신 생합성 경로 유전자들의 발현를 비교한 결과, 아래 표 과 같이 lysC (아스파테이트 키나제를 코딩하는 유전자)와 dapA (디히드로디피콜리네이트 신타제를 코딩하는 유전자) 유전자의 발현이 야생주 대비 라이신 생산주에서 더 강한 것을 알 수 있었다.

유전자	발현비ratio (생산주/야생주)
유전자	1 배치	2 배치	평균
lysC	2.18	3.21	2.69
dapA	2.74	2.90	2.82

실시예 2: Ligand fishing 을 이용한 lysC , dapA 조절단백질 탐색

미국국립보건원 유전자은행 NIH GenBank를 근거로 하여 lysC 유전자(서열번호 13)와 dapA 유전자(서열번호 14)의 염기서열 정보 (NCBI 등록번호 NC_003450, lysC: NCgl0247, dapA:1896)를 확보하였다. 그 단백질의 오픈리딩프레임(ORF)의 앞부분에 위치한 예상프로모터 (서열번호 1: lysC 프로모터, 서열번호 2: dapA 프로모터)를 증폭하기 위해 보고된 염기서열에 근거하여 아래 표 2와 같이 두 쌍의 프라이머 (표 2, 서열번호 3 내지 6)를 합성하였다. 이 때 lysC-P-R 프라이머와 dapA-P-R 프라이머는 5' 끝단에 바이오틴으로 표지화시켰다.

프라이머	염기서열	서열번호
lysC-P-F	gattgttaatgccgatgctagggcg	3
lysC-P-R	ctttgtgcacctttcgatctacgtg	4
dapA-P-F	ctgttttcggtgattttgag	5
dapA-P-R	tccggtcttagctgttaaac	6

코리넥박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 각각 서열번호 3과 4 및 서열번호 5와 6 의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra ^TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 52℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 3분을 30회 반복하였다. 그 결과, 약 300bp의 프로모터 부위를 포함한 예상프로모터 부위 두 쌍 (lysC-P, dapA-P)을 얻었다. lysC-P(서열번호 1)는 서열번호 3와 4의 프라이머로 사용하여 증폭된 것이며, dapA-P(서열번호 2)는 서열번호 5과 6을 프라이머로 사용하여 증폭된 것이다.

상기에서 준비된 lysC 및 dapA 유전자의 프로모터 예상부위의 DNA를, 아가로스 표면에 스트렙타빈으로 코팅된 물질(PIERCE사, NeutraAvidin) 에 붙여주었다. 바이오틴과 스트렙타빈은 서로 강하게 결합하는 성질을 가지고 있기 때문에 아가로스 표면위의 스트렙타빈과 바이오틴이 연결되어 상기에 제작된 DNA들이 아가로스 표면에 표지된다. 이것에 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 추출된 전체 단백질 용액을 섞어 주어, 각 유전자의 프로모터 DNA에 결합하는 단백질들을 결합시킨 후 세척과정과 용리 과정을 통해 프로모터에 결합하는 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질은 12% SDS-PAGE를 이용하여 크기별로 분리한 뒤 차이가 나는 단백질 밴드를 오려 펩신으로 가수분해 시킨 뒤 가수분해물을 질량분석기를 이용하여 동정하였다.

동정한 결과, lysC 유전자와 dapA 유전자의 프로모터 부위에 같은 단백질이 결합하는 것을 발견하였고, 그 단백질이 아직 정확한 기능이 밝혀지지 않은 putative transcriptional regulator로 밝혀 졌다. 본 발명에서는 이 단백질을 코딩하는 유전자를 aspR로 명명하였다. aspR 유전자는 미국국립보건원 유전자은행 NIH GenBank를 근거로 하여 aspR 유전자(서열번호 15)의 염기서열 정보 (NCBI 등록번호 NC_003450, NCgl2886)를 확보하였다.

실시예 3: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래 aspR 유전자 클로닝 및 재조합벡터 ( pDZ - aspR ) 제작, aspR 결손 균주 개발

상기 실시예 2에서 확보된 aspR 유전자 염기서열 정보에 근거하여 한 쌍의 프라이머 (표 3, 서열번호 7 내지 10)를 합성하였다.

코리넥박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 7 내지 10의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra ^TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 52℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 3분을 30회 반복하였다.

프라이머	염기서열	서열번호
aspR-A-F	gccgaccaatgaaacgaccc	7
aspR-A-R	tcacagagcggcggaaatag	8
aspR-B-F	aagacctggtggatatcatt	9
aspR-B-R	gaggaagacggccaagggcg	10

그 결과, 약 300bp의 aspR 유전자 두 쌍 (aspR-A, aspR-B)을 얻었다. aspR-A(서열번호 11)는 서열번호 7와 8을 프라이머로 사용하여 증폭된 것이며, aspR-B(서열번호 12)는 서열번호 9과 10을 프라이머로 사용하여 증폭된 것이다. 상기 증폭 산물을 BD In-Fusion kit (BD)를 이용하여 미리 SalI 제한효소로 처리한 pDZ 벡터에 클로닝하여 pDZ-aspR 벡터를 얻었다. 도 1은 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ-aspR 를 나타내는 도면이다.

제작된 pDZ-aspR 벡터를 기특허 균주인 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881 에 형질전환 (Appl. Microbiol.Biotechnol. 52:541-545, 1999에 의한 형질전환법 이용) 후, 카나마이신 (kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별 배지에서 염색체상의 동 유전자와 상동성에 의해 삽입된 균주를 선별하였다. 벡터의 성공적인 염색체 삽입은 X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드)을 포함한 고체배지에서 푸른색을 나타내는가 여부를 확인함으로써 가능하였다.

1차 염색체 삽입된 균주를 영양 배지에서 진탕배양 (30℃, 8시간)한 후, 각각 10^-4으로부터 10^-10까지 희석하여, X-gal을 포함하고 있는 고체배지에 도말하였다. 대부분의 콜로니가 푸른색을 띄는데 반해 낮은 비율로 나타나는 백색의 콜로니를 선별함으로써, 2차 교차 (crossover)에 의해 삽입된 염색체상의 벡터 서열이 제거된 균주를 선별하였다. 2차 교차 과정을 거쳐 aspR 유전자를 결손시킨 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881-aspR를 얻었다. 프라이머 (표 4)를 이용한 PCR로 최종 확인하였다.

프라이머	염기서열	서열번호
aspR-A-F	gccgaccaatgaaacgaccc	7
aspR-B-R	gaggaagacggccaagggcg	10

실시예 4: DNA chip 과 qRT - PCR 을 이용한 aspR 결손 균주와 모균주 전사발현 비교실험

코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-180881과 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881-aspR를 플라스크에서 배양한 후, 균체를 수집하였다. 상기 균체를 대상으로 실시예1에서 같이 게놈 DNA 칩(지노믹트리㈜, cDNA chip)을 이용하여 약 3,000개의 유전자의 mRNA 발현을 비교 조사하였다.

전체 유전자들 중에서 lysC 유전자 및 dapA 유전자의 발현를 비교한 결과, 아래 표 5과 같이 aspR 유전자가 결실된 균주에서 모균주대비 발현이 증가되었음을 확인하였다.

유전자	발현비 ratio (KFCC-10881-aspR/KFCC-10881)
lysC	1.4
dapA	1.2

DNA chip결과를 재확인 하기 위해서 qRT-PCR 방법(Quantitative RT-PCR: pitfalls and potential, KE Vrana, BioTechniques 26:112-125. 1999)을 이용하여 lysC mRNA의 양을 비교하였다. 도 2과 같이 DNA chip결과와 동일하게 aspR이 결실되어 있는 균주에서 mRNA 의 양이 많음을 확인하였다.

실시예 5: aspR 결손 균주에서의 아스파테이트 키나제 활성 측정

라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881-aspR의 아스파테이트 키나제 활성을 아스파르틸 하이드록사메이트를 이용한 측정법(Pecher J-F, Capony J-P (1968) On the colorimetric determination of acyl phosphates. Anal Biochem 22: 536~539)으로 측정한 결과 aspR 결손 균주가 모균주보다 1.77배 높은 활성을 갖게 됨을 확인했다.

균주	활성 (nmole/mg/min)
균주	1차	2차	3차	평균	Fold
KFCC-10881	10.34	13.51	13.31	12.39	1
KFCC-10881-aspR	22.36	21.29	21.95	21.86	1.77

실시예 6: aspR 결손 균주에서의 라이신 생산

실시예 3에서 최종적으로 제작된 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타니쿰 KFCC-10881-aspR를 L-라이신 생산을 위해 아래와 같은 방법으로 배양하였다.

하기의 종 배지 25 ml를 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 모균주 와 KFCC-10881 과 KFCC-10881-aspR를 접종하고 30 ℃에서 20 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 하기의 생산 배지 24 ml를 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 120 시간 동안 (200 rpm)으로 진탕 배양하였다.

배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 L-라이신의 생산량을 측정하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881 와 KFCC-10881-aspR에 대한 배양액 중의 L-라이신 대한 결과는 아래 표 7과 같았다.

균주	라이신 (g/l)
균주	배치 1	배치 2	배치 3
KFCC-10881	17.34	17.55	16.70
KFCC-10881-aspR	18.32	18.45	18.70

종배지 ( pH 7.0)

원당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH₂PO₄ 4 g, K₂HPO₄ 8 g, MgSO₄ 7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)

생산배지 ( pH 7.0)

포도당 100 g, (NH₄)₂SO₄ 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분 (Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH₂PO₄ 1 g, MgSO₄ 7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO₃ 30 g (증류수 1리터 기준)

상기의 표 7에서 나타낸 바와 같이, aspR유전자가 결실된 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881-aspR는 모균주 KFCC-10881 에 비하여 라이신 생산이 약 10% 증가되었음을 확인할 수 있었다.

도 1은 코리네박테리움 aspR 유전자 결실용 벡터 pDZ-aspR를 나타내는 도면이다.

도 2는 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881 과 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 10881-aspR 의 상대적인 lysC mRNA 발현량을 나타낸 그래프이다.

<110> CJ Cheiljedang Corporation <120> A corynebacterium having enhanced L-lysine productivity and a method of producing L-lysine using the corynebacterium <130> PA080171/KR <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 300 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> promoter <222> (1)..(300) <223> lysC promoter <400> 1 gattgttaat gccgatgcta gggcgaaaag cacggcgagc agattgcttt gcacttgatt 60 cagggtagtt gactaaagag ttgctcgcga agtagcacct gtcacttttg tctcaaatat 120 taaatcgaat atcaatatat ggtctgttta ttggaacgcg tcccagtggc tgagacgcat 180 ccgctaaagc cccaggaacc ctgtgcagaa agaaaacact cctctggcta ggtagacaca 240 gtttataaag gtagagttga gcgggtaact gtcagcacgt agatcgaaag gtgcacaaag 300 300 <210> 2 <211> 310 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> promoter <222> (1)..(310) <223> dapA promoter <400> 2 ctgttttcgg tgattttgag attgaaactt tggcagacgg atcgcaaatg gcaacaagcc 60 cgtatgtcat ggacttttaa cgcaaagctc acacccacga gctaaaaatt catatagtta 120 agacaacatt tttggctgta aaagacagcc gtaaaaacct cttgctcgtg tcaattgttc 180 ttatcggaat gtggcttggg cgattgttat gcaaaagttg ttaggttttt tgcggggttg 240 tttaaccccc aaatgaggga agaaggtaac cttgaactct atgagcacag gtttaacagc 300 taagaccgga 310 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification of lysC promoter <400> 3 gattgttaat gccgatgcta gggcg 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification of lysC promoter <400> 4 ctttgtgcac ctttcgatct acgtg 25 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification of dapA promoter <400> 5 ctgttttcgg tgattttgag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification of dapA promoter <400> 6 tccggtctta gctgttaaac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification of aspR-A <400> 7 gccgaccaat gaaacgaccc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification of aspR-A <400> 8 tcacagagcg gcggaaatag 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification of aspR-B <400> 9 aagacctggt ggatatcatt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification of aspR-B <400> 10 gaggaagacg gccaagggcg 20 <210> 11 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aspR-A <400> 11 gccgaccaat gaaacgaccc tctagaagca tcgtttagaa ttgcttttaa gtgaataagg 60 aacagcacag aattaaggcc tcggagttat cgctcacgct acttctcaag tgacgccaag 120 gtaagttgta ctttttctgt ccaaattatt gctttttccg tagataggtt atcgaacgga 180 aattacttgg caataccgct atgctggcag gcatgcctaa tttaaacgct gaggagctag 240 cagtccgcgt gcgacccgcg ctgacaaaac tctacgttct ctatttccgc cgctctgtga 300 300 <210> 12 <211> 274 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aspR-B <400> 12 aagacctggt ggatatcatt actgagcttg cagaggtgta cggtagctgg aaagagaccg 60 acagcggttc ttaacagttt tctccatctc aactccggaa tttgatgaaa caaccccttc 120 gcgtacttat ttcttgtcga cccgaagaaa attcgggtgg caaacgtagt gaacaaaatg 180 atgctgtttt tgagttcgcc gcatggctag ctcgtacttc agacatcaat gttcgtggaa 240 tcacaacttt catacgccct tggccgtctt cctc 274 <210> 13 <211> 1266 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> gene <222> (1)..(1266) <223> lysC gene <400> 13 gtggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60 aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120 tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180 ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240 gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300 ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360 gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420 aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480 ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540 accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600 atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660 cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720 attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780 gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840 aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900 tcttctgtag aagacggcac caccgacatc accttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960 cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020 gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080 accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1140 tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200 ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260 cgctaa 1266 <210> 14 <211> 906 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> gene <222> (1)..(906) <223> dapA gene <400> 14 atgagcacag gtttaacagc taagaccgga gtagagcact tcggcaccgt tggagtagca 60 atggttactc cattcacgga atccggagac atcgatatcg ctgctggccg cgaagtcgcg 120 gcttatttgg ttgataaggg cttggattct ttggttctcg cgggcaccac tggtgaatcc 180 ccaacgacaa ccgccgctga aaaactagaa ctgctcaagg ccgttcgtga ggaagttggg 240 gatcgggcga agctcatcgc cggtgtcgga accaacaaca cgcggacatc tgtggaactt 300 gcggaagctg ctgcttctgc tggcgcagac ggccttttag ttgtaactcc ttattactcc 360 aagccgagcc aagagggatt gctggcgcac ttcggtgcaa ttgctgcagc aacagaggtt 420 ccaatttgtc tctatgacat tcctggtcgg tcaggtattc caattgagtc tgataccatg 480 agacgcctga gtgaattacc tacgattttg gcggtcaagg acgccaaggg tgacctcgtt 540 gcagccacgt cattgatcaa agaaacggga cttgcctggt attcaggcga tgacccacta 600 aaccttgttt ggcttgcttt gggcggatca ggtttcattt ccgtaattgg acatgcagcc 660 cccacagcat tacgtgagtt gtacacaagc ttcgaggaag gcgacctcgt ccgtgcgcgg 720 gaaatcaacg ccaaactatc accgctggta gctgcccaag gtcgcttggg tggagtcagc 780 ttggcaaaag ctgctctgcg tctgcagggc atcaacgtag gagatcctcg acttccaatt 840 atggctccaa atgagcagga acttgaggct ctccgagaag acatgaaaaa agctggagtt 900 ctataa 906 <210> 15 <211> 474 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> gene <222> (1)..(474) <223> aspR gene <400> 15 atgctggcag gcatgcctaa tttaaacgct gaggagctag cagtccgcgt gcgacccgcg 60 ctgacaaaac tctacgttct ctatttccgc cgctctgtga attctgacct ctcgggtcca 120 cagctcacta ttttgagtcg cctggaagaa aacggcccat cccgaattag tcgcatcgcg 180 gaacttgaag atattcgtat gccaaccgct tcgaatgctc tgcatcagct ggagcaactc 240 aacctggttg agcgtatccg cgacaccaaa gaccgccgag gcgtgcaggt tcagctcact 300 gatcatggac gcgaagagct tgagcgcgtg aacaatgaac gaaacgcaga gatggctcga 360 ctccttgaaa tgctcacccc agagcagctg gaacgtaccg aagacctggt ggatatcatt 420 actgagcttg cagaggtgta cggtagctgg aaagagaccg acagcggttc ttaa 474

Claims

aspR 유전자가 내재적 조절 활성에 비하여 감소된 것을 특징으로 하는, 라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물.
제1항에 있어서, 상기 aspR 유전자는 아스파테이트 키나제를 암호화하는 유전자(lysC) 및 디히드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 유전자(dapA)를 조절하는 활성을 가지는 조절 유전자임을 특징으로 하는 미생물.
제1항에 있어서, 상기 aspR 유전자는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 미생물.
제1항에 있어서, 코리네박테리움 속 미생물의 aspR 유전자가 결실, 치환 및 삽입에 의하여 내재적 조절 활성이 감소된 것을 특징으로 하는 미생물.
제1항에 있어서, 코리네박테리움 속 미생물에 aspR 유전자의 일부를 포함하 는 재조합 벡터가 도입되어 내재적 조절 활성이 감소된 것을 특징으로 하는 미생물.
제5항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 1의 개열지도를 갖는 벡터 pDZ-aspR임을 특징으로 하는 미생물.
제5항에 있어서, 상기 벡터가 수탁번호 KFCC10881인 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에 도입되어 제조된 것을 특징으로 하는 미생물.
제1항에 있어서, 상기 라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881-aspR(수탁번호 KCCM 10953P)인 미생물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 배양액에서 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신의 생산 방법.