CN108026147A - 生产o-乙酰-高丝氨酸的微生物和使用其生产o-乙酰-高丝氨酸的方法 - Google Patents

生产o-乙酰-高丝氨酸的微生物和使用其生产o-乙酰-高丝氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本公开内容涉及能够排出O‑乙酰‑高丝氨酸的蛋白质和其新型突变，具有该蛋白质的增加表达和生产O‑乙酰‑高丝氨酸能力的微生物，和使用其生产O‑乙酰‑高丝氨酸的方法。

Description

生产O-乙酰-高丝氨酸的微生物和使用其生产O-乙酰-高丝氨 酸的方法
[技术领域]
本公开内容涉及具有输出O-乙酰高丝氨酸活性的蛋白质和其新型修饰的蛋白质、具有增强该蛋白质表达的能够生产O-乙酰高丝氨酸的微生物、和使用该微生物生产O-乙酰高丝氨酸的方法。
[背景技术]
甲硫氨酸，其可以通过化学和生物合成生产，被用作合成输液和药物以及合成饲料和食品添加剂的原材料。近来，公开了两步法，其用于通过酶转化反应从经由发酵生产的L- 甲硫氨酸前体生产L-甲硫氨酸(国际专利公布号WO 2008/013432)。国际专利公布号WO2008/013432公开了O-琥珀酰高丝氨酸和O-乙酰高丝氨酸可以被用作两步法中的甲硫氨酸前体，并且对于经济的大规模生产甲硫氨酸而言以高产量生产甲硫氨酸前体是非常重要的。
LeuE称为亮氨酸输出蛋白。作为属于高丝氨酸/高丝氨酸内酯外排蛋白(effluxprotein) (RhtB)家族的蛋白质中的一种，LeuE是在内膜中存在的蛋白质并且已知作为推定的未表征转运蛋白具有输出亮氨酸和其类似物的作用。
在与LeuE相关的现有技术中，已知的是可以通过增强leuE(yeaS)基因的氨基酸序列或其修饰的氨基酸序列生产嘌呤核苷或嘌呤核苷酸，并且氨基酸生产的量可以提高。另外，具有输出半胱氨酸活性的修饰的leuE是已知的。
[公开内容]
[技术问题]
本公开内容的发明人已经进行了许多努力来提高O-乙酰高丝氨酸的生产，并且结果，他们已经发现了具有输出O-乙酰高丝氨酸活性的蛋白质和其修饰的蛋白质，从而完成本公开内容。
[技术方案]
本公开内容的目标是提供具有输出O-乙酰高丝氨酸活性的多肽。
本公开内容的另一个目标是提供编码该多肽的多核苷酸。
本公开内容的仍另一个目标是提供生产O-乙酰高丝氨酸的埃希氏杆菌属的微生物，在该微生物中包括或者过表达具有输出O-乙酰高丝氨酸活性的多肽。
本公开内容的仍另一个目标是提供生产O-乙酰高丝氨酸的方法，其包括：在培养基中培养生产O-乙酰高丝氨酸的埃希氏杆菌属的微生物；和从培养的微生物或培养的培养基回收O-乙酰高丝氨酸。
本公开内容的仍另一个目标是提供生产L-甲硫氨酸的方法，其包括：在培养基中培养生产O-乙酰高丝氨酸的埃希氏杆菌属的微生物；和通过利用甲硫醇和甲硫氨酸-转化酶处理培养的微生物或者培养的培养基或者从培养的微生物或培养的培养基回收的O-乙酰高丝氨酸，将O-乙酰高丝氨酸转化为L-甲硫氨酸。
[发明的有益效果]
本公开内容的微生物——包括修饰的LeuE或LeuE，其为内膜蛋白——具有增强的输出O-乙酰高丝氨酸的活性，并且因此可以增强O-乙酰高丝氨酸的生产效率。因此，本公开内容的微生物可以被用于有效生产O-乙酰高丝氨酸。另外，以高效率生产的O-乙酰高丝氨酸可以被用于经济的大规模生产L-甲硫氨酸。
[最佳模式]
为了实现上述目标，本公开内容的一方面提供了具有输出O-乙酰高丝氨酸活性的多肽，其中选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置1处的缬氨酸、位置30处的亮氨酸、位置95处的苯丙氨酸和位置165处的苯丙氨酸的至少一个氨基酸被另一个氨基酸置换。
如本文所使用，术语“O-乙酰高丝氨酸”，其是微生物的甲硫氨酸生物合成途径中的特定中间物质，指的是L-高丝氨酸的乙酰衍生物。O-乙酰高丝氨酸已知为通过使高丝氨酸与乙酰辅酶A反应——通过高丝氨酸乙酰转移酶催化——生产，并且其具有式C6H11NO4。
如本文所使用，术语“具有输出O-乙酰高丝氨酸活性的肽”指的是具有将微生物细胞中的O-乙酰高丝氨酸输出至细胞外部功能的多肽。具体地，肽可以指具有输出O-乙酰高丝氨酸活性的LeuE蛋白和其修饰的蛋白质，但是肽不被具体地限于此，只要它具有输出 O-乙酰高丝氨酸的活性。
如本文所使用，关于氨基酸转运蛋白，术语“LeuE”——其为属于高丝氨酸/高丝氨酸内酯外排蛋白(RhtB)家族的蛋白质——指的是存在于内膜中的蛋白质，但是其确切功能未知。在这方面，本公开内容的发明人首先确认了LeuE特异性输出O-乙酰高丝氨酸。
LeuE可以是衍生自埃希氏杆菌属的微生物的蛋白质，并且具体地是衍生自大肠杆菌的 LeuE，但是具有输出O-乙酰高丝氨酸活性的任何LeuE可以包含在本公开内容的范围内，对于微生物的起源没有限制。
具体地，具有输出O-乙酰高丝氨酸活性的肽可以是具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质。另外地，该肽可以是具有如此氨基酸序列的蛋白质：该氨基酸序列与SEQ IDNO:1的氨基酸序列具有基本上相同的或等价的输出O-乙酰高丝氨酸的活性，同时与SEQ IDNO:1的氨基酸序列具有至少70％、具体地至少80％、并且更具体地至少90％的同源性。可选地，肽可以是具有这样的同源性的氨基酸序列，其与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有基本上相同或等价的输出O-乙酰高丝氨酸的活性，在该氨基酸序列的部分中存在缺失、修饰、置换或添加，并且显而易见的是该肽也属于本公开内容的范围。
如本文所使用，术语具有输出O-乙酰高丝氨酸活性的多肽的“修饰的多肽”指的是如此多肽：其与天然的野生型多肽或未修饰的多肽相比具有增强的输出O-乙酰高丝氨酸的活性。具体地，修饰的多肽是如此肽：由于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中至少一个氨基酸的修饰，其与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽相比具有增强的输出O-乙酰高丝氨酸的活性。
例如，修饰的多肽可以是如此多肽：在其中选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置1处的缬氨酸、位置30处的亮氨酸、位置95处的苯丙氨酸和位置165处的苯丙氨酸的至少一个氨基酸被另一个氨基酸置换。具体地，修饰的多肽可以是如此多肽：其中SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置1处的缬氨酸被甲硫氨酸置换；SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置30处的苯丙氨酸被选自丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和精氨酸的任一种置换；SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置95处的亮氨酸被选自缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、脯氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、色氨酸和精氨酸的任一种置换；或SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置165处的苯丙氨酸被选自丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和精氨酸的任一种置换。更具体地，修饰的多肽可以是如此多肽：其中SEQID NO:1的氨基酸序列中的位置1处的缬氨酸被甲硫氨酸置换；SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置30处的苯丙氨酸被选自丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸和组氨酸的任一种置换；SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置95处的亮氨酸被选自缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸和组氨酸的任一种置换；或SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置165处的苯丙氨酸被选自丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、色氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸和组氨酸的任一种置换。甚至更具体地，修饰的多肽可以是如此多肽：其中SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置1处的缬氨酸被甲硫氨酸置换；和SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置30处的苯丙氨酸、位置95处的亮氨酸和位置165处的苯丙氨酸被另一种氨基酸置换。甚至更具体地，修饰的多肽可以是由SEQ ID NO:2、133、134、137、138、141或142的氨基酸序列组成的多肽。具体地，修饰的多肽可以是具有如此氨基酸序列的蛋白质：该氨基酸序列与修饰的多肽的氨基酸序列具有基本上相同的或等价的增强的输出O-乙酰高丝氨酸的活性，同时与上述氨基酸序列具有至少 70％、具体地至少80％、并且更具体地至少90％的同源性。可选地，在与修饰的多肽的氨基酸序列具有这样的同源性并具有基本上相同的或等价的增强的输出O-乙酰高丝氨酸的活性的氨基酸序列中，氨基酸序列可以是在该氨基酸序列的部分中存在缺失、修饰、置换或添加的氨基酸序列。该多肽是多肽的修饰的多肽的实例，其与天然的野生型多肽或未修饰的多肽相比具有增强的输出O-乙酰高丝氨酸的活性，但是多肽不限于此。如本文所使用，术语“天然状态或未修饰状态”指的是本公开内容中引入相应多肽的或引入活性修改尚未实现的状态。
如本文所使用，术语“同源性”指的是编码蛋白质的基因的两个氨基酸序列或核酸序列的核苷酸或氨基酸残基之间的同一性程度，其在将它们的具体比较区域进行比对以最大程度地彼此匹配之后确定。当同源性足够高时，相应基因的表达产物可以具有相同或相似的活性。序列同一性百分比可以使用已知的序列比较程序(例如，BLAST(NCBI)、CLC MainWorkbench(CLC bio)、MegAlign(DNASTAR Inc)等)来测定。
本公开内容的方面提供了编码具有输出O-乙酰高丝氨酸活性的多肽的多核苷酸。在本公开内容中，具有输出O-乙酰高丝氨酸活性的多肽与上面解释的相同。
例如，多核苷酸可以是如此多核苷酸：其中起始密码子被ATG置换并且可以是SEQID NO:4、135、136、139、140、143或144的核苷酸序列，但是核苷酸序列不限于此。另外地，关于多核苷酸，核苷酸序列和编码相同氨基酸序列的其修饰的核苷酸序列基于密码子简并也包括在本公开内容中。例如，核苷酸序列可以被修饰以具有最佳密码子，这取决于正在使用的微生物。
具体地，核苷酸序列可以是如下核苷酸序列：其编码与上述核苷酸序列具有基本上相同的或等价的输出O-乙酰高丝氨酸的活性，同时与上述氨基酸序列具有至少70％、具体地至少80％、并且更具体地至少90％的同源性的氨基酸序列。可选地，核苷酸序列可以是能够在严格条件下与探针杂交以编码具有输出O-乙酰高丝氨酸活性的蛋白质的序列，该探针可以由已知基因序列制备(例如，与上述核苷酸序列的全部或部分互补的序列)。如本文所使用，术语“严格条件”指的是其中形成所谓的特异性杂合物同时不形成非特异性杂合物的条件。例如，严格条件可以包括如此条件：在该条件下具有高同源性(例如，80％或更多、具体地90％或更多、更具体地95％或更多、甚至更具体地97％或更多、并且甚至更具体地99％或更多)的基因可以在它们之间杂交，而具有其较低同源性的基因不能彼此杂交；或者用于常规DNA杂交的条件(即，在对应于60℃，1×SSC和0.1％SDS的盐浓度和温度下；具体地在60℃，0.1×SSC和0.1％SDS下；并且更具体地在68℃，0.1×SSC和0.1％SDS 下洗涤一次，并且具体地两次或三次的条件)(Sambrook et al.,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,3rd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001))。用于杂交的探针可以任选地是与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列的一部分。可以使用基于已知序列制备的寡核苷酸作为引物和包含这样的核苷酸序列的基因片段作为模板通过PCR制备这样的探针。例如，作为探针，可以使用大约300bp的基因片段。更具体地，当大约300bp的基因片段被用作探针时，50℃，2×SSC和0.1％SDS的条件被列为杂交的洗涤条件。
在本公开内容中使用的基因，它们编码的蛋白质序列和启动子序列可以由已知数据库获得(例如，NCBI的基因库)，但是不限于此。
本公开内容的方面涉及微生物，在该微生物中包括或者过表达具有输出O-乙酰高丝氨酸活性的多肽或其修饰的多肽。具体地，微生物可以是生产O-乙酰高丝氨酸或其修饰的多肽的微生物，在其中包括或过表达由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的多肽。
具有输出O-乙酰高丝氨酸活性的多肽和其修饰的多肽与上面解释的相同。
如本文所使用，术语“生产O-乙酰高丝氨酸的微生物”指的是在微生物中能够生产O-乙酰高丝氨酸并将其输出至培养基的微生物。生产O-乙酰高丝氨酸的活性可以通过天然或人工突变或物种改良而提供或增强。具体地，可以包括生产O-乙酰高丝氨酸的那些微生物，而不管它们的微生物起源，只要它们可以生产O-乙酰高丝氨酸。在实施方式中，微生物可以是属于埃希氏杆菌属的微生物，并且更具体地是大肠杆菌。
同时，在本公开内容中，生产O-乙酰高丝氨酸的微生物可以是修饰的微生物，在其中关于相关机制比如高丝氨酸生物合成相关途径和与输出O-乙酰高丝氨酸相关的机制等，另外地引入已知修饰从而除了LeuE之外增强O-乙酰高丝氨酸的生产力。
本公开内容的另一个具体实施方式可以涉及生产O-乙酰高丝氨酸的微生物，在其中另外地，胱硫醚合成酶的活性被失活。具体地，微生物可以是如此微生物：在其中编码胱硫醚合成酶(metB)的基因缺失或者其表达与未修饰的微生物的表达相比变弱，但是不限于此。 metB基因的氨基酸序列可以由已知数据库获得并且可以非限制性地包括具有胱硫醚合成酶活性的任何氨基酸序列(例如，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质)。具有SEQID NO:5的氨基酸序列的蛋白质可以是由SEQ ID NO:6的核苷酸序列编码的蛋白质，但是不限于此。
另外地，本公开内容的仍另一个具体实施方式可以涉及生产O-乙酰高丝氨酸的微生物，在该微生物中另外地，高丝氨酸激酶的活性被失活。具体地，微生物可以是如此微生物，在该微生物中高丝氨酸激酶的活性与未修饰的微生物的其内源活性相比降低或高丝氨酸激酶的活性被移除。例如，微生物可以是如此微生物：在该微生物中编码高丝氨酸激酶的基因(thrB)连接至与天然启动子相比较弱的启动子，或者被修饰或缺失以具有弱的活性，但是启动子不限于此。thrB基因的氨基酸序列可以由已知数据库获得并且可以非限制性地包括具有高丝氨酸激酶活性的任何氨基酸序列(例如，具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的蛋白质)。具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的蛋白质可以是由SEQ ID NO:8的核苷酸序列编码的蛋白质，但是不限于此。
如本文所使用，术语蛋白质的“失活”指的是微生物的蛋白质的活性与微生物在天然野生型蛋白质或未修饰的蛋白质中所具有的酶活性相比降低的情况；蛋白质根本不表达的情况；或蛋白质表达但是不展现活性的情况。失活是包括如下情况的概念：由于编码酶的基因的修饰等，酶自身的活性与微生物原始具有的酶的活性相比降低或被移除；由于编码酶的基因的表达或翻译的抑制，细胞中酶的整体活性水平与微生物的野生型菌株原始具有的酶的活性相比降低或被移除；部分或全部基因缺失；和其组合；但是失活不限于此。
酶的失活可以通过应用本领域中公知的各种方法实现。方法的实例可以包括将染色体上编码酶的基因置换为被修饰以降低酶活性的基因的方法，包括酶活性被移除时的情况；在染色体上编码酶的基因的表达控制序列中引入修饰的方法；将编码酶的基因的表达控制序列置换为具有弱活性或不具有活性的序列的方法；使染色体上编码酶的基因的部分或全部缺失的方法；在染色体上引入互补结合至基因的转录物的反义寡核苷酸(例如反义RNA)，从而抑制mRNA翻译为酶的方法；将与SD序列互补的序列人工地并入编码酶的基因的SD 序列的上游，形成二级结构，从而使得核糖体附接至其不可能的方法；将启动子并入开放阅读框(ORF)的3′端以诱导反转录(反转录工程化(RTE))的方法，等，还包括其组合，但是方法不具体地限于此。
修饰表达控制序列的方法可以通过在表达控制序列的核酸序列中缺失、插入、非保守性或保守性置换、或其组合诱导表达控制序列的修饰从而进一步减弱表达控制序列的活性来执行；或者通过置换为具有较弱活性的核酸来执行。表达控制序列可以包括启动子、操纵子序列、编码核糖体结合区的序列和控制转录和翻译的终止的序列，但是不限于此。
而且，染色体上的基因序列可以通过在基因序列中缺失、插入、非保守性或保守性置换、或其组合在序列中诱导修饰以便进一步减弱酶活性进行修饰；或者通过置换为被改进以具有较弱活性的基因序列或者被改进以不具有活性的基因序列进行修饰，但是方法不限于此。
另外地，使编码酶的基因的部分或全部缺失的方法可以通过使用菌株内用于染色体插入的载体将染色体内编码内源靶蛋白的多核苷酸置换为在核酸序列中具有部分缺失的多核苷酸或标记基因来执行。在使基因的部分或全部缺失的方法的示例性实施方式中，可以使用通过同源重组使基因缺失的方法，但是方法不限于此。
如本文所使用，术语“部分”可以根据多核苷酸的种类而改变，并且其可以具体地指 1至300个，更具体地1至100个，并且甚至更具体地1至50个，但是不具体地限于此。
如本文所使用，术语“同源重组”指的是在具有相互同源性的遗传链基因座处经由交换发生的遗传重组。
而且，本公开内容的仍另一个具体实施方式可以涉及生产O-乙酰高丝氨酸的微生物，在其中另外地，高丝氨酸乙酰转移酶的活性与未修饰的微生物的活性相比增强。具体地，微生物可以是其中高丝氨酸乙酰转移酶的活性与未修饰的微生物的活性相比增强的微生物，并且具体地，可以是其中具有增强活性的编码高丝氨酸乙酰转移酶的修饰的metA基因被引入的微生物。修饰的metA基因可以是编码高丝氨酸乙酰转移酶的基因，其中高丝氨酸乙酰转移酶的第111个氨基酸被置换为谷氨酸并且高丝氨酸乙酰转移酶的第112个氨基酸被置换为组氨酸，但是不限于此。修饰的metA基因可以非限制性地包括与其野生型的活性相比具有增强的高丝氨酸乙酰转移酶活性的任何氨基酸序列，并且例如，可以是具有SEQID NO:10的氨基酸序列的蛋白质。修饰的metA基因的制备和其用途的实施方式，具有增强的高丝氨酸乙酰转移酶活性的菌株等，在韩国专利号10-1335841中公开，并且该专利的整个说明书可以作为本公开内容的参考文献被并入本文。
另外，本公开内容的仍另一个具体实施方式可以涉及属于埃希氏杆菌属的生产O-乙酰高丝氨酸的微生物，在其中另外地，天冬氨酸半醛脱氢酶、吡啶核苷酸转氢酶、或其组合的活性与未修饰的微生物的活性相比增强。
另外地，本公开内容的仍另一个具体实施方式可以涉及生产O-乙酰高丝氨酸的微生物，在其中另外地，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、或其组合的活性与未修饰的微生物的活性相比增强。如本文所使用的，术语“增强”指的是增强微生物具有的蛋白质的活性水平。蛋白质活性的增强不被限制，只要与天然的野生型蛋白质或未修饰的蛋白质相比其可以增强每种蛋白质的活性，如靶蛋白活性的增强。增强可以通过选自如下的方法执行：i)增加编码每种蛋白质的多核苷酸的拷贝数的方法，ii)在表达控制序列中引入修饰用于增加多核苷酸的表达的方法，iii)在染色体上修饰多核苷酸序列用于增强每种蛋白质的活性的方法，和iv)其组合。具体地，增强可以通过选自如下的方法执行：将包括编码每种蛋白质的核苷酸序列的多核苷酸插入染色体的方法，在将多核苷酸引入载体系统后将其引入微生物的方法，将具有增强活性的启动子引入编码每种蛋白质的核苷酸序列的上游区或者在其启动子上引入具有修饰的每种蛋白质的方法，修饰5′-UTR区中的核苷酸序列的方法，和引入编码每种蛋白质的核苷酸序列的修饰的核苷酸序列的方法，但是增强的方法不限于此。
本公开内容的仍另一个方面涉及生产O-乙酰高丝氨酸的方法，其包括在培养基中培养生产O-乙酰高丝氨酸的埃希氏杆菌属的微生物。
具体地，上述方法涉及用于生产O-乙酰高丝氨酸的方法，其包括在培养基中培养生产 O-乙酰高丝氨酸的埃希氏杆菌属的微生物，和从培养的微生物或培养的培养基回收O-乙酰高丝氨酸。
如本文所使用的，术语“培养”指的是在适当调整的环境中生长微生物。在本公开内容中，可以使用本领域中公知的适合培养基和培养条件执行培养过程。培养过程可以由本领域普通技术人员根据选择的菌株容易地调节以便使用。培养可以以本领域中已知的分批过程、连续培养、补料(fetch)-分批培养等执行，但是不具体地限于此。用于培养本公开内容的微生物的培养基和其它培养条件可以不具体地限制，而是可以使用常规地用于培养埃希氏杆菌属的微生物的任何培养基。具体地，本公开内容的微生物可以在需氧条件下在包含适合的碳、氮、和磷源，无机化合物，氨基酸和/或维生素的普通培养基中培养，同时调节温度、pH等。
在本公开内容中，碳源可以包括糖类，比如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇等；醇类，比如糖醇、丙三醇等；有机酸比如丙酮酸、乳酸、柠檬酸等；氨基酸，比如谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸等，但是碳源不限于此。另外地，可以使用天然有机营养物比如淀粉水解物、糖蜜、赤糖糊、米糠、木薯、蔗渣、玉米浆等。具体地，可以使用糖类比如葡萄糖和无菌预处理的糖蜜(即，转化为还原糖的糖蜜)，并且另外地，可以非限制性地使用适合量的各种其它碳源。这些碳源可以单独或以至少两种的组合使用。
氮源的实例可以包括无机氮源(例如，氨、硫酸铵、氯化铵、醋酸铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵等)；氨基酸(谷氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺等)；和有机氮源(例如，蛋白胨、N-Z胺、肉膏、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浆、酪蛋白水解酶、鱼或其分解产物、脱脂豆饼或其分解产物等)。这些氮源可以单独或以至少两种的组合使用，但是不限于此。
磷源的实例可以包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、和与其相应的包含钠的盐。待使用的无机化合物的实例可以包括氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙等。另外地，可以包括氨基酸、维生素和/或适合的前体，但是不限于此。这些介质或前体可以以分批培养过程或连续培养过程被加入至培养物，但是不限于此。
在本公开内容的培养时期期间，可以通过以适合方式将化合物比如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸、硫酸等加入至培养物调节培养物的pH。另外，在培养时期期间，可以加入消泡剂比如脂肪酸聚乙二醇酯以阻止泡沫生成。另外地，为了维持培养物的需氧状态，可以将氧或含氧气体注入培养物，而为了维持培养物的厌氧和微需氧状态，氮、氢、或二氧化碳气体可以被注入而不注入空气。
培养温度可以正常地为从27℃至37℃，并且具体地从30℃至35℃，但是培养温度不限于此。另外地，培养可以继续直到可以获得期望物质(一种或多种)的产生，并且具体地持续10小时至100小时，但是不限于此。
O-乙酰高丝氨酸的回收可以使用培养本公开内容的微生物的方法进行。例如，可以使用本领域中已知的适合方法从培养物回收靶O-乙酰高丝氨酸(例如，分批型培养、连续培养或补料-分批培养等)。例如，可以使用方法比如离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶、HPLC等，并且另外地，可以使用在本领域中已知的适合方法的组合方法。
回收方法可以包括分离方法和/或纯化方法。
本公开内容的方面涉及生产L-甲硫氨酸的方法，其包括在培养基中培养生产O-乙酰高丝氨酸的埃希氏杆菌属的微生物；和通过利用甲硫醇和甲硫氨酸-转化酶处理培养的微生物或者培养的培养基或者从培养的微生物或培养的培养基回收的O-乙酰高丝氨酸，将O- 乙酰高丝氨酸转化为L-甲硫氨酸。
例如，甲硫氨酸可以由O-乙酰高丝氨酸生产，其由在培养基中生产O-乙酰高丝氨酸的埃希氏杆菌属的微生物的培养物通过两步法(韩国专利号10-0905381)回收。
两步法包括通过使用具有将O-乙酰高丝氨酸转化为甲硫氨酸的活性的酶，使用O-乙酰高丝氨酸和甲硫醇作为底物或者包含该酶的菌株进行酶反应生产L-甲硫氨酸和有机酸的方法。
甲硫氨酸-转化酶包括将O-乙酰高丝氨酸转化为甲硫氨酸的所有酶，并且特别是O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶，但是不限于此。
具体地，待使用的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶可以是衍生自属于钩端螺旋体属、色杆菌属(genus Chromobacterium)和生丝单胞菌属(genus Hyphomonas)的微生物菌株的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶，并且更具体地是衍生自属于迈氏钩端螺旋体(Leptospirameyeri)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aurogenosa)、海王生丝单胞菌(Hyphomonasneptunium)和紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)属的微生物菌株的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶。
上述反应在下面示出：
CH3SH+O-乙酰-L-高丝氨酸<＝>醋酸盐+甲硫氨酸
这样的生产甲硫氨酸的另外方法在韩国专利号10-0905381中公开，并且该专利的整个说明书可以被包括作为本公开内容的参考文献。
[具体实施方式]
在下文，将通过示例性实施方式详细地描述本公开内容。但是，这些示例性实施方式仅出于说明的目的被提供并且不意欲限制本公开内容的范围。
参考实施例1：生产O-乙酰高丝氨酸的菌株的制备
1-1.野生型大肠杆菌中metB基因的缺失
为了制造生产O-乙酰高丝氨酸的菌株，使用大肠杆菌，其是埃希氏杆菌属的微生物中的代表性微生物。为了该目的，大肠杆菌K12W3110(ATCC 27325)——一种野生型大肠杆菌——自美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection)(ATCC)获得并使用。制备在大肠杆菌K12 W3110菌株中具有编码胱硫醚γ合成酶的metB基因(SEQ ID NO:6)和编码高丝氨酸激酶的thrB基因(SEQ ID NO:8)缺陷的菌株。如此制备的生产O-乙酰高丝氨酸的菌株被命名为W3-BT。关于metB和thrB基因缺失菌株的缺失的实施方式在韩国专利号 10-0905381或国际专利公布号WO 2008/013432中公开(具体地参见韩国专利号10-0905381 的实施例1-1和1-2)，并且该专利的整个说明书可以被包括作为本公开内容的参考文献。
1-2.制备引入具有高丝氨酸乙酰转移酶活性的修饰的metA基因的菌株
为了增强在参考实施例1-1中获得的菌株中的高丝氨酸乙酰转移酶的活性，尝试将编码具有增强活性的高丝氨酸乙酰转移酶的修饰的metA基因(SEQ ID NO:10)引入菌株。在制备这样的菌株的尝试中，通过在韩国专利号10-1335841的实施例1和3中描述的方法制备 pCL_Pcj1_metA(EH)质粒。
然后，为了制备替代盒作为通过将其引入菌株置换上面制备的修饰的metA基因的方式，使用pKD3载体作为模板连同SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的引物进行PCR。具体地，重复进行PCR持续总计30个循环，其中在94℃下进行变性30秒，在55℃下退火 30秒，并在72℃下延伸2分钟。
对于替代盒的metA(EH)部分，使用pCL-Pcj1-metA(EH)作为模板连同SEQ ID NO:19 和SEQ ID NO:20的引物进行PCR，而对于metA野生型部分，使用SEQ ID NO:21和SEQ IDNO:22的引物，并且从而获得各自的PCR产物。基于3种PCR产物，使用SEQ ID NO:19 和SEQID NO:22的引物制备含有氯霉素标记的metA(EH)替代盒，并且通过电穿孔引入在参考实施例1-1中制备的W3-BT菌株，其转化有pKD46载体。
被确认已经通过上述方法引入的菌株再次转化有pCP20载体并且在LB培养基中培养。将该菌株命名为W3-BTA，在该菌株中氯霉素标记被移除并且metA基因被替换为metA(EH)。
关于具有增强的高丝氨酸乙酰转移酶等的活性的菌株的实施方式在韩国专利号10-1335841或国际专利公布号WO 2012/087039中公开，并且该专利的整个说明书可以被包括作为本公开内容的参考文献。
1-3.制备包括ppc、aspC和asd基因的2个拷贝的菌株
为了增加在参考实施例1-2中制备的W3-BTA菌株的O-乙酰高丝氨酸的生产力，引入增强生物合成途径的已知策略。尝试制备菌株，在其中基因——其与参与由磷酸烯醇丙酮酸生物合成草酰乙酸的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、参与由草酰乙酸生物合成天冬氨酸的天冬氨酸氨基转移酶和参与由β-天冬氨酰磷酸生物合成高丝氨酸的天冬氨酸半醛脱氢酶相关联——被扩增至2个拷贝，即ppc、aspC和asd基因被扩增至2个拷贝。
为了制备菌株，通过在韩国专利号10-1117012的实施例1-1至1-3中公开的方法制备 pSG-2ppc、pSG-2aspC和pSG-2asd质粒，上述质粒被引入W3-BTA菌株，并且通过在该韩国专利的实施例1-5中描述的方法制备菌株，在其中3种不同的基因被顺序地扩增至2个拷贝。如此制备的菌株被命名为W3-BTA2PCD(＝WCJM)。
关于具有增强的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶和天冬氨酸半醛脱氢酶等的活性的菌株的实施方式在韩国专利号10-0905381或国际专利公布号WO 2008/013432 中公开，并且该专利的整个说明书可以被包括作为本公开内容的参考文献。
1-4.烧瓶培养实验
为了测试在参考实施例1-2和1-3中制备的菌株中O-乙酰高丝氨酸生产的量，进行锥形瓶培养。将W3110、W3-BTA和WCJM菌株接种在LB培养基中并在33℃下培养过夜。将单菌落接种在3mL LB培养基中并且在33℃下培育5小时，在含有25mL用于生产O- 乙酰高丝氨酸的培养基的250mL锥形瓶中稀释200倍，并且在33℃、200rpm下再次培育30小时，并通过HPLC分析确认O-乙酰高丝氨酸生产的量。使用的培养基的组成在下面的表1中概括。
[表1]生产O-乙酰高丝氨酸的烧瓶培养基的组成
组成 浓度(每升)
葡萄糖 40g
硫酸铵 17g
KH2PO4 1.0g
MgSO4·7H2O 0.5g
FeSO4·7H2O 5mg
MnSO4·8H2O 5mg
ZnSO4 5mg
碳酸钙 30g
酵母提取物 2g
甲硫氨酸 0.15g
苏氨酸 0.15g
在使用上述培养基培养30小时之后，通过HPLC分析确认O-乙酰高丝氨酸生产的量，并且结果在下面的表2中概括。
[表2]通过烧瓶培养的O-乙酰高丝氨酸生产
OD(562nm) 葡萄糖消耗(g/L) O-AH(g/L)
W3110 14.2 40 0
W3-BTA 8.4 36 0.9
WCJM 9.6 35 1.2
如在上面的表2中所见的，在野生型菌株W3110中根本不生产O-乙酰高丝氨酸，但是W3-BTA菌株以0.9g/L的浓度生产O-乙酰高丝氨酸(O-AH)，并且具有增强的生物合成途径的WCJM菌株以1.2g/L的浓度生产O-乙酰高丝氨酸(O-AH)。
实施例1：增加O-乙酰高丝氨酸生产力的膜蛋白的选择
本公开内容的发明人进行尝试以应用衍生自大肠杆菌的LeuE(SEQ ID NO:1)——其被公开为膜蛋白但是没有公开输出O-乙酰高丝氨酸和生产O-乙酰高丝氨酸的活性——至 O-乙酰高丝氨酸生产。
为了增强菌株中的leuE基因，使用pCL载体的SmaI限制位点克隆leuE基因。
首先，为了制备leuE基因，使用SEQ ID NO:11和12的引物进行PCR持续总计30 个循环，其中在94℃下进行变性30秒，在55℃下退火30秒，并在68℃下延伸1分钟。所得到的PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳并且从800bp带纯化DNA。纯化的DNA利用限制酶SmaI在37℃下处理过夜，并且在另外的纯化之后，使用T4连接酶克隆leuE基因和pCL载体。在使用克隆的质粒转化大肠杆菌DH5之后，将转化的大肠杆菌DH5在含有壮观霉素(50μg/mL)的LB平板培养基上进行选择以获得质粒。将如此制备的质粒引入 W3-BTA和WCJM菌株，其是生产O-乙酰高丝氨酸的菌株。它们分别被命名为 W3-BTA/pCL-leuE和WCJM/pCL-leuE，并且对它们的O-乙酰高丝氨酸的生产力进行烧瓶评估。
另外，作为对照组，空载体pCL1920以与上面描述的相同方法引入W3-BTA和WCJM菌株，并且分别被命名为W3-BTA/pCL1920和WCJM pCL1920，并且对它们的O-乙酰高丝氨酸的生产力进行烧瓶评估。
具体地，将每种菌株平板接种在LB固体培养基上并且在33℃培养箱中培养过夜。将在LB平板培养基中培养过夜的菌株的单菌落接种在3mL LB培养基中并且在33℃下培育5小时，在含有用于生产O-乙酰高丝氨酸的25mL培养基的250mL锥形瓶中稀释200倍，并且在33℃、200rpm下再次培育30小时，并且通过HPLC分析确认O-乙酰高丝氨酸生产的量。结果在下面的表3中概括。
[表3]通过烧瓶培养测量O-乙酰高丝氨酸生产
如在上面的表3中可见的，引入有leuE质粒的WCJM菌株与引入有空载体的对照菌株相比显示了较低的OD，并且WCJM菌株也显示了较高的葡萄糖消耗。但是，WCJM菌株以1.5g/L的浓度生产O-乙酰高丝氨酸，并且这不能确认O-乙酰高丝氨酸生产的增加是由于野生型leuE的引入。但是，能够控制OD和增加葡萄糖消耗速率的结果确认了菌株的潜在输出活性。因此，通过结构建模尝试选择与野生型菌株相比具有增强的输出O-乙酰高丝氨酸活性的修饰的菌株。
实施例2：制备具有leuE的起始密码子的修饰的质粒并且评估O-乙酰高丝氨酸生 产力
野生型leuE的起始密码子已知是gtg，其编码氨基酸缬氨酸。为了确认通过改变起始密码子为atg(即，编码甲硫氨酸的密码子)leuE蛋白的增强效果，进行基于在实施例1中制备的质粒改变起始密码子的实验。具体地，SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的第一个氨基酸被置换为甲硫氨酸以增强输出O-乙酰高丝氨酸的活性。更具体地，制备leuE(ATG)修饰。为了制备leuE(ATG)修饰，使用SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:146的引物，并且通过位点特异性诱变(位点定向诱变试剂盒，Stratagene，USA)制备修饰的leuE(ATG)基因。现有野生型质粒被命名为WT，并且起始密码子变体质粒被命名为WT_ATG，并且如此制备的质粒被引入WCJM菌株和对其O-乙酰高丝氨酸的生产力进行烧瓶评估。
具体地，将每种菌株平板接种在LB固体培养基上并且在33℃培养箱中培养过夜。将在LB平板培养基中培养过夜的菌株接种在25mL效价培养基中并且在33℃、200rpm下培育40小时。结果在下面的表4中概括。
[表4]通过烧瓶培养测量O-乙酰高丝氨酸生产
OD(562nm) 葡萄糖消耗(g/L) O-AH(g/L)
WCJM/pCL-leuE WT 8.4 36 1.5
WCJM/pCL-leuE WT(ATG) 7.6 39 2.6
如上面的表4中可见的，引入具有起始密码子修饰的pCL-leuE WT(ATG)质粒的菌株与野生型菌株相比显示了较低的OD，但是显示了更快的葡萄糖消耗。引入具有起始密码子修饰的pCL-leuE WT(ATG)质粒的菌株以2.6g/L的浓度生产O-乙酰高丝氨酸，其与野生型菌株相比是多达173％的生产力增加。
实施例3：制备leuE修饰的质粒和评估O-乙酰高丝氨酸的生产力
3-1.制备leuE修饰的质粒
进行实验以基于在实施例1和2中制备的两种质粒——即plasmidpCL-leuE WT和pCL-leuE WT(ATG)——制备三种修饰的多肽——其被预期为与野生型leuE相比具有更强的输出活性——中的每种。具体地，leuE修饰的位置经由结构建模选择以增强输出O-乙酰高丝氨酸的活性，并且SEQ ID NO:1和2的氨基酸序列中位置30、95和165处的氨基酸分别被置换为不同氨基酸。
更具体地，制备L95V、F30A和F165A修饰。对于L95V修饰的制备，使用SEQ ID NO:13和14的引物；对于F30A修饰，使用SEQ ID NO:25和26的引物；并且对于F165A 修饰，使用SEQID NO:27和28的引物。使用位点定向诱变试剂盒(Stratagene,USA)连同上面描述的引物集(set)中的每个制备修饰的leuE基因。基于现有野生型质粒WT，分别地，修饰的质粒L95V被命名为WT_M3；修饰的质粒F30A被命名为WT_M4，并且修饰的质粒 F165A被命名为WT_M6。另外，基于具有起始密码子修饰的质粒(即，WT(ATG))，分别地，修饰的质粒L95V被命名为WT(ATG)_M3，修饰的质粒F30A被命名为WT(ATG)_M4，并且修饰的质粒F165A被命名为WT(ATG)_M6。如此制备的修饰的质粒被引入WCJM菌株以评估烧瓶中O-乙酰高丝氨酸的生产力。
具体地，将每种菌株平板接种在LB平板培养基上并且在33℃培养箱中培养过夜。将在LB固体培养基中培养过夜的菌株接种在25mL效价培养基中，并且然后在33℃培养箱中在200rpm下培养40小时。结果在下面的表5中概括。
[表5]通过烧瓶培养测量O-乙酰高丝氨酸生产
OD(562nm) 葡萄糖消耗(g/L) O-AH(g/L)
WCJM/pCL1920 9.6 35 1.3
WCJM/pCL-leuE WT 8.4 36 1.5
WCJM/pCL-leuE WT_M3 8.2 38 2.3
WCJM/pCL-leuE WT_M4 7.9 38 3.7
WCJM/pCL-leuE WT_M6 8.0 39 4.8
WCJM/pCL-leuE WT(ATG) 7.6 39 2.6
WCJM/pCL-leuE WT(ATG)_M3 7.5 40 3.1
WCJM/pCL-leuE WT(ATG)_M4 7.3 39 3.6
WCJM/pCL-leuE WT(ATG)_M6 7.5 40 4.9
如在上面的表5中可见的，引入leuE修饰的质粒的所有3种菌株显示了与野生型相比降低的OD，但是所有这3种菌株与野生型菌株相比显示了更快的葡萄糖消耗，并且具体而言，WT(ATG)_M6菌株显示了以4.9g/L的浓度生产O-乙酰高丝氨酸，因而显示了最高的O-乙酰高丝氨酸的生产力。因此，确认了本公开内容的所有这3种菌株显示了增强的O-乙酰高丝氨酸的生产力。另外地，确认了当通过修饰leuE的起始密码子增加蛋白质表达的量时，O-乙酰高丝氨酸的生产力进一步增强。
3-2.制备生物合成途径基因和修饰的质粒
为了最大化O-乙酰高丝氨酸的生产力，制备能够增强高丝氨酸的生物合成途径的质粒。为了将天冬氨酸半醛脱氢酶、吡啶核苷酸转氢酶、以及野生型LeuE和修饰的LeuE克隆入pCL载体，asd和pntAB基因首先被引入pCL载体。
首先，在获得asd和pntAB基因中，进行PCR持续总计30个循环，其中在94℃下进行变性30秒，在55℃下退火30秒，并在68℃下延伸3分钟，对于asd基因使用SEQ ID NO:15和16的引物并且对于pntAB基因使用SEQ ID NO:17和18的引物。所得到的PCR 产物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳，并且纯化分别从1.4kb(asd)和3kb(pntAB)大小的带获得的DNA。
使用sewing PCR(一种技术：在该技术中两个基因的重叠部分首先在不使用任何引物的情况下连接，并且然后使用引物在两端处扩增)连接纯化的两个基因。sewing PCR的条件为进行上面描述的PCR持续10个循环，并且然后在加入SEQ ID NO:15和18的引物之后进行PCR持续20个循环。结果，制备了asd-pntAB基因的组合片段，并且通过电泳进行纯化。纯化的片段和pCL载体在37℃下利用SmaI处理过夜，进一步纯化，并且使用T4 连接酶制备pCL-asd-pntAB质粒。
将leuE基因克隆入如此制备的质粒。在克隆中，具体地，为了获得leuE基因，使用SEQ ID NO:29和30的引物，进行PCR持续总计30个循环，其中在94℃下进行变性30 秒，在55℃下退火30秒，并在68℃下延伸1分钟。
将所得到的PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳并且纯化获得自800bp的DNA。纯化的DNA和pCL载体利用KpnI在37℃下处理过夜，进一步纯化，并且克隆leuE基因和 pCL-asd-pntAB载体。将克隆的质粒转化入大肠杆菌DH5α，并且将转化的大肠杆菌DH5α接种在含有壮观霉素(50μg/mL)的LB平板培养基中并且从其获得质粒。将如此制备的质粒引入WCJM菌株——其是生产O-乙酰高丝氨酸的菌株，并且对其O-乙酰高丝氨酸的生产力进行烧瓶评估。如此制备的质粒为总计4种，并且使用野生型和在实施例2-1中制备的 3种修饰的菌株。通过电穿孔将4种质粒引入WCJM菌株并且以与在实施例3-1中相同的方式进行烧瓶评估。结果在下面的表6-1中显示。
[表6]通过烧瓶培养测量O-乙酰高丝氨酸生产
OD(562nm) 葡萄糖消耗(g/L) O-AH(g/L)
WCJM/pCL-asd-pntAB 9.8 36 1.8
WCJM/pCL-asd-pntAB-leuE WT 9.5 37 2.0
WCJM/pCL-asd-pntAB-leuE WT_M3 8.2 38 3.0
WCJM/pCL-asd-pntAB-leuE WT_M4 7.5 38 4.2
WCJM/pCL-asd-pntAB-leuE WT_M6 7.8 38 5.9
如在上面的表6中可见的，由于同时增强生物合成途径和leuE修饰，O-乙酰高丝氨酸的生产力进一步提高。具体而言，在其中引入pCL-asd-pntAB-leuE WT_M6质粒的菌株的情况下，与野生型菌株相比OD降低，但是该菌株显示了更快的葡萄糖消耗并且以5.9g/L的浓度生产O-乙酰高丝氨酸，这在菌株中是最高的。
实施例4：通过饱和诱变制备leuE修饰并且评估O-乙酰高丝氨酸的生产力
4-1.通过饱和诱变制备具有leuE修饰的菌株以及其评估
通过饱和诱变制备修饰以生产不同类型的氨基酸置换的3种leuE变体，其已经显示了高的O-乙酰高丝氨酸的生产力。分别使用17种M3突变、M4突变和M6突变，使用在实施例2中制备的质粒作为模板制备置换的氨基酸。细节在下面的表7中示出。
[表7]
具体地，通过使用在上面的表7中示出的引物进行位点定向诱变试剂盒(Stratagene, USA)制备leuE修饰的基因。将质粒引入WCJM菌株并且以与实施例3-1相同的方式评估烧瓶。结果在下面的表8中示出。
[表8]通过烧瓶培养测量O-乙酰高丝氨酸生产
如在上面的表8中可见的，作为评估修饰的菌株中的每种的结果，在OD和葡萄糖消耗速率方面存在轻微区别。但是，发现与用作对照组的WCJM/pCL1920和WCJM/ pCL-leuE WT菌株相比，所有上面的修饰的菌株具有增强的O-乙酰高丝氨酸生产的量。
4-2.在具有高产量的O-乙酰高丝氨酸的菌株中制备具有增强的leuE修饰的菌株 并且评估其O-乙酰高丝氨酸的生产力
公开了如此方法，其用于通过使用衍生自野生型W3110的经由NTG突变能够生产苏氨酸的菌株生产能够生产O-乙酰高丝氨酸的菌株(国际专利公布号WO 2012/087039)。具体而言，如此制备的以高产量生产O-乙酰高丝氨酸的菌株以登录号KCCM11146P保藏于韩国微生物保藏中心。
尝试O-乙酰高丝氨酸的生产力是否可以通过基于上述菌株引入leuE基因和其修饰菌株进一步增强。
具体地，leuE基因和其3种修饰的菌株通过电穿孔引入。引入的菌株分别被命名为KCCM11146P/pCL1920、KCCM11146P/pCL-leuE WT、KCCM11146P/pCL-leuE M3、 KCCM11146P/pCL-leuE M4和KCCM11146P/pCL-leuE M6。为了测量leuE基因和其3种修饰的菌株的O-乙酰高丝氨酸的生产力，进行烧瓶培养评估。具体地，LB培养基被接种4 种上述菌株并且在33℃下培育过夜。然后，将单菌落接种入3mL LB培养基并且再次在 33℃下培养5小时，在含有用于生产O-乙酰高丝氨酸的25mL培养基的250mL锥形瓶中稀释200倍，并且再次在33℃、200rpm下培育30小时，并且通过HPLC分析来确认O- 乙酰高丝氨酸生产的量。实验的结果在下面的表9中概括。
[表9]通过烧瓶培养测量O-乙酰高丝氨酸生产
OD(562nm) 葡萄糖消耗(g/L) O-AH(g/L)
KCCM11146P/pCL1920 18.3 40 14.2
KCCM11146P/pCL-leuE WT 17.9 40 16.3
KCCM11146P/pCL-leuE M3 17.5 40 16.9
KCCM11146P/pCL-leuE M4 16.8 40 19.2
KCCM11146P/pCL-leuE M6 17.2 40 18.8
如在上面的表9中可见的，确认了通过仅将pCL1920引入KCCM11146P菌株制备的菌株生产14.2g/L的O-乙酰高丝氨酸，并且leuE WT菌株也显示了与原始菌株相比O-乙酰高丝氨酸生产量的增加。另外，所有3种修饰的菌株显示了OD的降低，而M4菌株显示了O-乙酰高丝氨酸生产的最高产量(19.2g/L)。M4和M6菌株显示了O-乙酰高丝氨酸生产量的增加。
本公开内容的发明人确认了在“KCCM11146P/pCL-leuE M3、M4和M6菌株”中O- 乙酰高丝氨酸生产增加，“KCCM11146P/pCL-leuE M3、M4和M6菌株”是基于KCCM11146P 菌株的M3、M4和M6的3种leuE修饰的菌株。结果，它们将菌株命名为“CA05-4009”、“CA05-4010”和“CA05-4011”，并且分别以登录号KCCM11645P、KCCM11646P和 KCCM11647P在2014年12月15日保藏于KCCM。
实施例5：使用生产的O-乙酰高丝氨酸培养液和转移酶生产L-甲硫氨酸
进行如此实验，该实验用于通过使用在实施例4中获得的O-乙酰高丝氨酸的培养液和 O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶——其是将O-乙酰高丝氨酸转化为甲硫氨酸的酶——制备L- 甲硫氨酸。
O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶——一种转化酶——通过在韩国专利号10-1250651的实施例1-2中提供的方法制备，并且测量使用在韩国专利号10-1250651的实施例3中提供的方法通过转化反应生产的L-甲硫氨酸的量。对于用作底物的O-乙酰高丝氨酸，使用在本公开内容的实施例4中获得的KCCM11146P-pCL-leuE M4的培养液(O-AH浓度；19.2g/L)，并且由其生产的L-甲硫氨酸的浓度在下面的表10中显示。
[表10]
如在上面的表10中可见的，确认了在实施例4中获得的KCCM11146P-pCL-leuE M4菌株的培养液中包含的O-乙酰高丝氨酸以79％的转化率转化为甲硫氨酸持续10分钟。从该结果，确认了可以使用本公开内容的菌株成功地生产甲硫氨酸。
从上文，本公开内容所属领域的技术人员将能够理解本公开内容可以以其它具体形式体现而不改变本公开内容的技术概念或基本特征。在这方面，本文公开的示例性实施方式仅出于说明性目的并且不应当被解释为限制本公开内容的范围。相反，本公开内容意欲不仅覆盖示例性实施方式而且覆盖各种替代方案、修改、等价方案和可以包含在本公开内容的精神和范围内的其它实施方式，如由所附权利要求书所限定的。
国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约
国际表格
原始保藏接收证明
由该页下部确定的国际保藏机构根据第7.1条发出
至：CJ第一制糖株式会社
CJ第一制糖中心
330，DONGHO-RO，JUNG-GU，首尔，
100-400，大韩民国
证明上述翻译与原文内容没有相互违背
2015年6月3日
专利代理人Son Min印
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2015年6月3日
专利代理人Son Min印。
<110> CJ第一制糖株式会社
<120> 生产O-乙酰-高丝氨酸的微生物和使用其生产O-乙酰-高丝氨酸的方法
<130> OPA16042
<150> KR 10-2015-0079358
<151> 2015-06-04
<160> 146
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 212
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 1
Val Phe Ala Glu Tyr Gly Val Leu Asn Tyr Trp Thr Tyr Leu Val Gly
1 5 10 15
Ala Ile Phe Ile Val Leu Val Pro Gly Pro Asn Thr Leu Phe Val Leu
20 25 30
Lys Asn Ser Val Ser Ser Gly Met Lys Gly Gly Tyr Leu Ala Ala Cys
35 40 45
Gly Val Phe Ile Gly Asp Ala Val Leu Met Phe Leu Ala Trp Ala Gly
50 55 60
Val Ala Thr Leu Ile Lys Thr Thr Pro Ile Leu Phe Asn Ile Val Arg
65 70 75 80
Tyr Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Tyr Leu Gly Ser Lys Ile Leu Tyr
85 90 95
Ala Thr Leu Lys Gly Lys Asn Ser Glu Ala Lys Ser Asp Glu Pro Gln
100 105 110
Tyr Gly Ala Ile Phe Lys Arg Ala Leu Ile Leu Ser Leu Thr Asn Pro
115 120 125
Lys Ala Ile Leu Phe Tyr Val Ser Phe Phe Val Gln Phe Ile Asp Val
130 135 140
Asn Ala Pro His Thr Gly Ile Ser Phe Phe Ile Leu Ala Ala Thr Leu
145 150 155 160
Glu Leu Val Ser Phe Cys Tyr Leu Ser Phe Leu Ile Ile Ser Gly Ala
165 170 175
Phe Val Thr Gln Tyr Ile Arg Thr Lys Lys Lys Leu Ala Lys Val Gly
180 185 190
Asn Ser Leu Ile Gly Leu Met Phe Val Gly Phe Ala Ala Arg Leu Ala
195 200 205
Thr Leu Gln Ser
210
<210> 2
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LeuE 变体
<400> 2
Met Phe Ala Glu Tyr Gly Val Leu Asn Tyr Trp Thr Tyr Leu Val Gly
1 5 10 15
Ala Ile Phe Ile Val Leu Val Pro Gly Pro Asn Thr Leu Phe Val Leu
20 25 30
Lys Asn Ser Val Ser Ser Gly Met Lys Gly Gly Tyr Leu Ala Ala Cys
35 40 45
Gly Val Phe Ile Gly Asp Ala Val Leu Met Phe Leu Ala Trp Ala Gly
50 55 60
Val Ala Thr Leu Ile Lys Thr Thr Pro Ile Leu Phe Asn Ile Val Arg
65 70 75 80
Tyr Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Tyr Leu Gly Ser Lys Ile Leu Tyr
85 90 95
Ala Thr Leu Lys Gly Lys Asn Ser Glu Ala Lys Ser Asp Glu Pro Gln
100 105 110
Tyr Gly Ala Ile Phe Lys Arg Ala Leu Ile Leu Ser Leu Thr Asn Pro
115 120 125
Lys Ala Ile Leu Phe Tyr Val Ser Phe Phe Val Gln Phe Ile Asp Val
130 135 140
Asn Ala Pro His Thr Gly Ile Ser Phe Phe Ile Leu Ala Ala Thr Leu
145 150 155 160
Glu Leu Val Ser Phe Cys Tyr Leu Ser Phe Leu Ile Ile Ser Gly Ala
165 170 175
Phe Val Thr Gln Tyr Ile Arg Thr Lys Lys Lys Leu Ala Lys Val Gly
180 185 190
Asn Ser Leu Ile Gly Leu Met Phe Val Gly Phe Ala Ala Arg Leu Ala
195 200 205
Thr Leu Gln Ser
210
<210> 3
<211> 639
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 3
gtgttcgctg aatacggggt tctgaattac tggacctatc tggttggggc catttttatt 60
gtgttggtgc cagggccaaa taccctgttt gtactcaaaa atagcgtcag tagcggtatg 120
aaaggcggtt atcttgcggc ctgcggtgta tttattggcg atgcggtatt gatgtttctg 180
gcatgggctg gagtggcgac attaattaag accaccccga tattattcaa cattgtacgt 240
tatcttggtg cgttttattt gctctatctg gggagtaaaa ttctttacgc gaccctgaag 300
ggtaaaaata gcgaggccaa atccgatgag ccccaatacg gtgctatttt taaacgcgcg 360
ttaattttga gcctgactaa tccgaaagcc attttgttct atgtgtcgtt tttcgtacag 420
tttatcgatg ttaatgcccc acatacggga atttcattct ttattctggc ggcgacgctg 480
gaactggtga gtttctgcta tttgagcttc ctgattatat ctggtgcttt tgtcacgcag 540
tacatacgta ccaaaaagaa actggctaaa gttggcaact cactgattgg tttgatgttc 600
gtgggtttcg ctgcccgact ggcgacgctg caatcctga 639
<210> 4
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LeuE 变体
<400> 4
atgttcgctg aatacggggt tctgaattac tggacctatc tggttggggc catttttatt 60
gtgttggtgc cagggccaaa taccctgttt gtactcaaaa atagcgtcag tagcggtatg 120
aaaggcggtt atcttgcggc ctgcggtgta tttattggcg atgcggtatt gatgtttctg 180
gcatgggctg gagtggcgac attaattaag accaccccga tattattcaa cattgtacgt 240
tatcttggtg cgttttattt gctctatctg gggagtaaaa ttctttacgc gaccctgaag 300
ggtaaaaata gcgaggccaa atccgatgag ccccaatacg gtgctatttt taaacgcgcg 360
ttaattttga gcctgactaa tccgaaagcc attttgttct atgtgtcgtt tttcgtacag 420
tttatcgatg ttaatgcccc acatacggga atttcattct ttattctggc ggcgacgctg 480
gaactggtga gtttctgcta tttgagcttc ctgattatat ctggtgcttt tgtcacgcag 540
tacatacgta ccaaaaagaa actggctaaa gttggcaact cactgattgg tttgatgttc 600
gtgggtttcg ctgcccgact ggcgacgctg caatcctga 639
<210> 5
<211> 386
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 5
Met Thr Arg Lys Gln Ala Thr Ile Ala Val Arg Ser Gly Leu Asn Asp
1 5 10 15
Asp Glu Gln Tyr Gly Cys Val Val Pro Pro Ile His Leu Ser Ser Thr
20 25 30
Tyr Asn Phe Thr Gly Phe Asn Glu Pro Arg Ala His Asp Tyr Ser Arg
35 40 45
Arg Gly Asn Pro Thr Arg Asp Val Val Gln Arg Ala Leu Ala Glu Leu
50 55 60
Glu Gly Gly Ala Gly Ala Val Leu Thr Asn Thr Gly Met Ser Ala Ile
65 70 75 80
His Leu Val Thr Thr Val Phe Leu Lys Pro Gly Asp Leu Leu Val Ala
85 90 95
Pro His Asp Cys Tyr Gly Gly Ser Tyr Arg Leu Phe Asp Ser Leu Ala
100 105 110
Lys Arg Gly Cys Tyr Arg Val Leu Phe Val Asp Gln Gly Asp Glu Gln
115 120 125
Ala Leu Arg Ala Ala Leu Ala Glu Lys Pro Lys Leu Val Leu Val Glu
130 135 140
Ser Pro Ser Asn Pro Leu Leu Arg Val Val Asp Ile Ala Lys Ile Cys
145 150 155 160
His Leu Ala Arg Glu Val Gly Ala Val Ser Val Val Asp Asn Thr Phe
165 170 175
Leu Ser Pro Ala Leu Gln Asn Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Leu Val
180 185 190
Leu His Ser Cys Thr Lys Tyr Leu Asn Gly His Ser Asp Val Val Ala
195 200 205
Gly Val Val Ile Ala Lys Asp Pro Asp Val Val Thr Glu Leu Ala Trp
210 215 220
Trp Ala Asn Asn Ile Gly Val Thr Gly Gly Ala Phe Asp Ser Tyr Leu
225 230 235 240
Leu Leu Arg Gly Leu Arg Thr Leu Val Pro Arg Met Glu Leu Ala Gln
245 250 255
Arg Asn Ala Gln Ala Ile Val Lys Tyr Leu Gln Thr Gln Pro Leu Val
260 265 270
Lys Lys Leu Tyr His Pro Ser Leu Pro Glu Asn Gln Gly His Glu Ile
275 280 285
Ala Ala Arg Gln Gln Lys Gly Phe Gly Ala Met Leu Ser Phe Glu Leu
290 295 300
Asp Gly Asp Glu Gln Thr Leu Arg Arg Phe Leu Gly Gly Leu Ser Leu
305 310 315 320
Phe Thr Leu Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Ile Ser His
325 330 335
Ala Ala Thr Met Thr His Ala Gly Met Ala Pro Glu Ala Arg Ala Ala
340 345 350
Ala Gly Ile Ser Glu Thr Leu Leu Arg Ile Ser Thr Gly Ile Glu Asp
355 360 365
Gly Glu Asp Leu Ile Ala Asp Leu Glu Asn Gly Phe Arg Ala Ala Asn
370 375 380
Lys Gly
385
<210> 6
<211> 1161
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 6
atgacgcgta aacaggccac catcgcagtg cgtagcgggt taaatgacga cgaacagtat 60
ggttgcgttg tcccaccgat ccatctttcc agcacctata actttaccgg atttaatgaa 120
ccgcgcgcgc atgattactc gcgtcgcggc aacccaacgc gcgatgtggt tcagcgtgcg 180
ctggcagaac tggaaggtgg tgctggtgca gtacttacta ataccggcat gtccgcgatt 240
cacctggtaa cgaccgtctt tttgaaacct ggcgatctgc tggttgcgcc gcacgactgc 300
tacggcggta gctatcgcct gttcgacagt ctggcgaaac gcggttgcta tcgcgtgttg 360
tttgttgatc aaggcgatga acaggcatta cgggcagcgc tggcagaaaa acccaaactg 420
gtactggtag aaagcccaag taatccattg ttacgcgtcg tggatattgc gaaaatctgc 480
catctggcaa gggaagtcgg ggcggtgagc gtggtggata acaccttctt aagcccggca 540
ttacaaaatc cgctggcatt aggtgccgat ctggtgttgc attcatgcac gaaatatctg 600
aacggtcact cagacgtagt ggccggcgtg gtgattgcta aagacccgga cgttgtcact 660
gaactggcct ggtgggcaaa caatattggc gtgacgggcg gcgcgtttga cagctatctg 720
ctgctacgtg ggttgcgaac gctggtgccg cgtatggagc tggcgcagcg caacgcgcag 780
gcgattgtga aatacctgca aacccagccg ttggtgaaaa aactgtatca cccgtcgttg 840
ccggaaaatc aggggcatga aattgccgcg cgccagcaaa aaggctttgg cgcaatgttg 900
agttttgaac tggatggcga tgagcagacg ctgcgtcgtt tcctgggcgg gctgtcgttg 960
tttacgctgg cggaatcatt agggggagtg gaaagtttaa tctctcacgc cgcaaccatg 1020
acacatgcag gcatggcacc agaagcgcgt gctgccgccg ggatctccga gacgctgctg 1080
cgtatctcca ccggtattga agatggcgaa gatttaattg ccgacctgga aaatggcttc 1140
cgggctgcaa acaaggggta a 1161
<210> 7
<211> 310
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 7
Met Val Lys Val Tyr Ala Pro Ala Ser Ser Ala Asn Met Ser Val Gly
1 5 10 15
Phe Asp Val Leu Gly Ala Ala Val Thr Pro Val Asp Gly Ala Leu Leu
20 25 30
Gly Asp Val Val Thr Val Glu Ala Ala Glu Thr Phe Ser Leu Asn Asn
35 40 45
Leu Gly Arg Phe Ala Asp Lys Leu Pro Ser Glu Pro Arg Glu Asn Ile
50 55 60
Val Tyr Gln Cys Trp Glu Arg Phe Cys Gln Glu Leu Gly Lys Gln Ile
65 70 75 80
Pro Val Ala Met Thr Leu Glu Lys Asn Met Pro Ile Gly Ser Gly Leu
85 90 95
Gly Ser Ser Ala Cys Ser Val Val Ala Ala Leu Met Ala Met Asn Glu
100 105 110
His Cys Gly Lys Pro Leu Asn Asp Thr Arg Leu Leu Ala Leu Met Gly
115 120 125
Glu Leu Glu Gly Arg Ile Ser Gly Ser Ile His Tyr Asp Asn Val Ala
130 135 140
Pro Cys Phe Leu Gly Gly Met Gln Leu Met Ile Glu Glu Asn Asp Ile
145 150 155 160
Ile Ser Gln Gln Val Pro Gly Phe Asp Glu Trp Leu Trp Val Leu Ala
165 170 175
Tyr Pro Gly Ile Lys Val Ser Thr Ala Glu Ala Arg Ala Ile Leu Pro
180 185 190
Ala Gln Tyr Arg Arg Gln Asp Cys Ile Ala His Gly Arg His Leu Ala
195 200 205
Gly Phe Ile His Ala Cys Tyr Ser Arg Gln Pro Glu Leu Ala Ala Lys
210 215 220
Leu Met Lys Asp Val Ile Ala Glu Pro Tyr Arg Glu Arg Leu Leu Pro
225 230 235 240
Gly Phe Arg Gln Ala Arg Gln Ala Val Ala Glu Ile Gly Ala Val Ala
245 250 255
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Pro Thr Leu Phe Ala Leu Cys Asp Lys
260 265 270
Pro Glu Thr Ala Gln Arg Val Ala Asp Trp Leu Gly Lys Asn Tyr Leu
275 280 285
Gln Asn Gln Glu Gly Phe Val His Ile Cys Arg Leu Asp Thr Ala Gly
290 295 300
Ala Arg Val Leu Glu Asn
305 310
<210> 8
<211> 933
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 8
atggttaaag tttatgcccc ggcttccagt gccaatatga gcgtcgggtt tgatgtgctc 60
ggggcggcgg tgacacctgt tgatggtgca ttgctcggag atgtagtcac ggttgaggcg 120
gcagagacat tcagtctcaa caacctcgga cgctttgccg ataagctgcc gtcagaacca 180
cgggaaaata tcgtttatca gtgctgggag cgtttttgcc aggaactggg taagcaaatt 240
ccagtggcga tgaccctgga aaagaatatg ccgatcggtt cgggcttagg ctccagtgcc 300
tgttcggtgg tcgcggcgct gatggcgatg aatgaacact gcggcaagcc gcttaatgac 360
actcgtttgc tggctttgat gggcgagctg gaaggccgta tctccggcag cattcattac 420
gacaacgtgg caccgtgttt tctcggtggt atgcagttga tgatcgaaga aaacgacatc 480
atcagccagc aagtgccagg gtttgatgag tggctgtggg tgctggcgta tccggggatt 540
aaagtctcga cggcagaagc cagggctatt ttaccggcgc agtatcgccg ccaggattgc 600
attgcgcacg ggcgacatct ggcaggcttc attcacgcct gctattcccg tcagcctgag 660
cttgccgcga agctgatgaa agatgttatc gctgaaccct accgtgaacg gttactgcca 720
ggcttccggc aggcgcggca ggcggtcgcg gaaatcggcg cggtagcgag cggtatctcc 780
ggctccggcc cgaccttgtt cgctctgtgt gacaagccgg aaaccgccca gcgcgttgcc 840
gactggttgg gtaagaacta cctgcaaaat caggaaggtt ttgttcatat ttgccggctg 900
gatacggcgg gcgcacgagt actggaaaac taa 933
<210> 9
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
高丝氨酸O-乙酰转移酶
<400> 9
Met Pro Ile Arg Val Pro Asp Glu Leu Pro Ala Val Asn Phe Leu Arg
1 5 10 15
Glu Glu Asn Val Phe Val Met Thr Thr Ser Arg Ala Ser Gly Gln Glu
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Ile Arg Pro Leu Lys Val Leu Ile Leu Asn Leu Met Pro Lys Lys Ile
35 40 45
Glu Thr Glu Asn Gln Phe Leu Arg Leu Leu Ser Asn Ser Pro Leu Gln
50 55 60
Val Asp Ile Gln Leu Leu Arg Ile Asp Ser Arg Glu Ser Arg Asn Thr
65 70 75 80
Pro Ala Glu His Leu Asn Asn Phe Tyr Cys Asn Phe Glu Asp Ile Gln
85 90 95
Asp Gln Asn Phe Asp Gly Leu Ile Val Thr Gly Ala Pro Leu Glu His
100 105 110
Val Glu Phe Asn Asp Val Ala Tyr Trp Pro Gln Ile Lys Gln Val Leu
115 120 125
Glu Trp Ser Lys Asp His Val Thr Ser Thr Leu Phe Val Cys Trp Ala
130 135 140
Val Gln Ala Ala Leu Asn Ile Leu Tyr Gly Ile Pro Lys Gln Thr Arg
145 150 155 160
Thr Glu Lys Leu Ser Gly Val Tyr Glu His His Ile Leu His Pro His
165 170 175
Ala Leu Leu Thr Arg Gly Phe Asp Asp Ser Phe Leu Ala Pro His Ser
180 185 190
Arg Tyr Ala Asp Phe Pro Ala Ala Leu Ile Arg Asp Tyr Thr Asp Leu
195 200 205
Glu Ile Leu Ala Glu Thr Glu Glu Gly Asp Ala Tyr Leu Phe Ala Ser
210 215 220
Lys Asp Lys Arg Ile Ala Phe Val Thr Gly His Pro Glu Tyr Asp Ala
225 230 235 240
Gln Thr Leu Ala Gln Glu Phe Phe Arg Asp Val Glu Ala Gly Leu Asp
245 250 255
Pro Asp Val Pro Tyr Asn Tyr Phe Pro His Asn Asp Pro Gln Asn Thr
260 265 270
Pro Arg Ala Ser Trp Arg Ser His Gly Asn Leu Leu Phe Thr Asn Trp
275 280 285
Leu Asn Tyr Tyr Val Tyr Gln Ile Thr Pro Tyr Asp Leu Arg His Met
290 295 300
Asn Pro Thr Leu Asp
305
<210> 10
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
高丝氨酸O-乙酰转移酶
<400> 10
atgccgattc gtgtgccgga cgagctaccc gccgtcaatt tcttgcgtga agaaaacgtc 60
tttgtgatga caacttctcg tgcgtctggt caggaaattc gtccacttaa ggttctgatc 120
cttaacctga tgccgaagaa gattgaaact gaaaatcagt ttctgcgcct gctttcaaac 180
tcacctttgc aggtcgatat tcagctgttg cgcatcgatt cccgtgaatc gcgcaacacg 240
cccgcagagc atctgaacaa cttctactgt aactttgaag atattcagga tcagaacttt 300
gacggtttga ttgtaactgg tgcgccgctg gaacatgtgg agtttaatga tgtcgcttac 360
tggccgcaga tcaaacaggt gctggagtgg tcgaaagatc acgtcacctc gacgctgttt 420
gtctgctggg cggtacaggc cgcgctcaat atcctctacg gcattcctaa gcaaactcgc 480
accgaaaaac tctctggcgt ttacgagcat catattctcc atcctcatgc gcttctgacg 540
cgtggctttg atgattcatt cctggcaccg cattcgcgct atgctgactt tccggcagcg 600
ttgattcgtg attacaccga tctggaaatt ctggcagaga cggaagaagg ggatgcatat 660
ctgtttgcca gtaaagataa gcgcattgcc tttgtgacgg gccatcccga atatgatgcg 720
caaacgctgg cgcaggaatt tttccgcgat gtggaagccg gactagaccc ggatgtaccg 780
tataactatt tcccgcacaa tgatccgcaa aatacaccgc gagcgagctg gcgtagtcac 840
ggtaatttac tgtttaccaa ctggctcaac tattacgtct accagatcac gccatacgat 900
ctacggcaca tgaatccaac gctggattaa 930
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
cccgggtttt cactggagca tgcctga 27
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
cccggggcgc tgaaaacggt ttattcc 27
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
gctactgacg ctattcgcga gtacaaacag ggtatt 36
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
cttcagggtc gcgtacacaa ttttactccc cagata 36
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
cccgggaact caaattccct gataat 26
<210> 16
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
agacagttac accgtttaaa gtaccctgct ctatttaa 38
<210> 17
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
ttaaatagag cagggtactt taaacggtgt aactgtct 38
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
cccgggcggc ctcagcagag gccgtc 26
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
aattgatatc atgccgattc gtgtgccgg 29
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
aattaagcct gctgaggtac gtttcgg 27
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
cagcaggtga ataaatttta ttc 23
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
cgcgaatgga agctgtttcc 20
<210> 23
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
tttccgaaac gtacctcagc aggtgtaggc tggagctgct tc 42
<210> 24
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
gaataaaatt tattcacctg ctgcatatga atatcctcct tag 43
<210> 25
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
gggccaaata ccctggcggt actcaaaaat agcgtc 36
<210> 26
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
gacgctattt ttgagtaccg ccagggtatt tggccc 36
<210> 27
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
aaagccattt tgttctctgt gtcgtttttc gtacag 36
<210> 28
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 28
ctgtacgaaa aacgacacag agaacaaaat ggcttt 36
<210> 29
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
ggtacctttt cactggagca tgcctga 27
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
ggtaccgcgc tgaaaacggt ttattcc 27
<210> 31
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
tatctgggga gtaaaatttt ttacgcgacc ctgaag 36
<210> 32
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
cttcagggtc gcgtaaaaaa ttttactccc cagata 36
<210> 33
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
tatctgggga gtaaaattgc gtacgcgacc ctgaag 36
<210> 34
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
cttcagggtc gcgtacgcaa ttttactccc cagata 36
<210> 35
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 35
tatctgggga gtaaaattgg ctacgcgacc ctgaag 36
<210> 36
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 36
cttcagggtc gcgtagccaa ttttactccc cagata 36
<210> 37
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 37
tatctgggga gtaaaattac ctacgcgacc ctgaag 36
<210> 38
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 38
cttcagggtc gcgtaggtaa ttttactccc cagata 36
<210> 39
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 39
tatctgggga gtaaaattaa ctacgcgacc ctgaag 36
<210> 40
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 40
cttcagggtc gcgtagttaa ttttactccc cagata 36
<210> 41
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 41
tatctgggga gtaaaattga ttacgcgacc ctgaag 36
<210> 42
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 42
cttcagggtc gcgtaatcaa ttttactccc cagata 36
<210> 43
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 43
tatctgggga gtaaaattca ttacgcgacc ctgaag 36
<210> 44
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 44
cttcagggtc gcgtaatgaa ttttactccc cagata 36
<210> 45
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 45
tatctgggga gtaaaattat ttacgcgacc ctgaag 36
<210> 46
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 46
cttcagggtc gcgtaaataa ttttactccc cagata 36
<210> 47
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 47
tatctgggga gtaaaatttc ttacgcgacc ctgaag 36
<210> 48
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 48
cttcagggtc gcgtaagaaa ttttactccc cagata 36
<210> 49
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 49
tatctgggga gtaaaattcc gtacgcgacc ctgaag 36
<210> 50
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 50
cttcagggtc gcgtacggaa ttttactccc cagata 36
<210> 51
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 51
tatctgggga gtaaaattta ttacgcgacc ctgaag 36
<210> 52
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 52
cttcagggtc gcgtaataaa ttttactccc cagata 36
<210> 53
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 53
tatctgggga gtaaaattca gtacgcgacc ctgaag 36
<210> 54
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 54
cttcagggtc gcgtactgaa ttttactccc cagata 36
<210> 55
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 55
tatctgggga gtaaaattaa atacgcgacc ctgaag 36
<210> 56
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 56
cttcagggtc gcgtatttaa ttttactccc cagata 36
<210> 57
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 57
tatctgggga gtaaaattga atacgcgacc ctgaag 36
<210> 58
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 58
cttcagggtc gcgtattcaa ttttactccc cagata 36
<210> 59
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 59
tatctgggga gtaaaatttg ctacgcgacc ctgaag 36
<210> 60
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 60
cttcagggtc gcgtagcaaa ttttactccc cagata 36
<210> 61
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 61
tatctgggga gtaaaatttg gtacgcgacc ctgaag 36
<210> 62
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 62
cttcagggtc gcgtaccaaa ttttactccc cagata 36
<210> 63
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 63
tatctgggga gtaaaattcg ttacgcgacc ctgaag 36
<210> 64
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 64
cttcagggtc gcgtaacgaa ttttactccc cagata 36
<210> 65
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 65
gggccaaata ccctgtgggt actcaaaaat agcgtc 36
<210> 66
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 66
gacgctattt ttgagtaccc acagggtatt tggccc 36
<210> 67
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 67
gggccaaata ccctgctggt actcaaaaat agcgtc 36
<210> 68
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 68
gacgctattt ttgagtacca gcagggtatt tggccc 36
<210> 69
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 69
gggccaaata ccctggtggt actcaaaaat agcgtc 36
<210> 70
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 70
gacgctattt ttgagtacca ccagggtatt tggccc 36
<210> 71
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 71
gggccaaata ccctgggcgt actcaaaaat agcgtc 36
<210> 72
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 72
gacgctattt ttgagtacgc ccagggtatt tggccc 36
<210> 73
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 73
gggccaaata ccctgtctgt actcaaaaat agcgtc 36
<210> 74
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 74
gacgctattt ttgagtacag acagggtatt tggccc 36
<210> 75
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 75
gggccaaata ccctgaacgt actcaaaaat agcgtc 36
<210> 76
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 76
gacgctattt ttgagtacgt tcagggtatt tggccc 36
<210> 77
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 77
gggccaaata ccctggatgt actcaaaaat agcgtc 36
<210> 78
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 78
gacgctattt ttgagtacat ccagggtatt tggccc 36
<210> 79
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 79
gggccaaata ccctgcatgt actcaaaaat agcgtc 36
<210> 80
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 80
gacgctattt ttgagtacat gcagggtatt tggccc 36
<210> 81
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 81
gggccaaata ccctgattgt actcaaaaat agcgtc 36
<210> 82
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 82
gacgctattt ttgagtacaa tcagggtatt tggccc 36
<210> 83
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 83
gggccaaata ccctgccggt actcaaaaat agcgtc 36
<210> 84
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 84
gacgctattt ttgagtaccg gcagggtatt tggccc 36
<210> 85
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 85
gggccaaata ccctgtatgt actcaaaaat agcgtc 36
<210> 86
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 86
gacgctattt ttgagtacat acagggtatt tggccc 36
<210> 87
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 87
gggccaaata ccctgcaggt actcaaaaat agcgtc 36
<210> 88
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 88
gacgctattt ttgagtacct gcagggtatt tggccc 36
<210> 89
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 89
gggccaaata ccctgaaagt actcaaaaat agcgtc 36
<210> 90
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 90
gacgctattt ttgagtactt tcagggtatt tggccc 36
<210> 91
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 91
gggccaaata ccctggaagt actcaaaaat agcgtc 36
<210> 92
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 92
gacgctattt ttgagtactt ccagggtatt tggccc 36
<210> 93
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 93
gggccaaata ccctgtgcgt actcaaaaat agcgtc 36
<210> 94
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 94
gacgctattt ttgagtacgc acagggtatt tggccc 36
<210> 95
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 95
gggccaaata ccctgaccgt actcaaaaat agcgtc 36
<210> 96
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 96
gacgctattt ttgagtacgg tcagggtatt tggccc 36
<210> 97
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 97
gggccaaata ccctgcgtgt actcaaaaat agcgtc 36
<210> 98
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 98
gacgctattt ttgagtacac gcagggtatt tggccc 36
<210> 99
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 99
acgctggaac tggtgagttg gtgctatttg agcttc 36
<210> 100
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 100
gaagctcaaa tagcaccaac tcaccagttc cagcgt 36
<210> 101
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 101
acgctggaac tggtgagtct gtgctatttg agcttc 36
<210> 102
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 102
gaagctcaaa tagcacagac tcaccagttc cagcgt 36
<210> 103
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 103
acgctggaac tggtgagtgt gtgctatttg agcttc 36
<210> 104
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 104
gaagctcaaa tagcacacac tcaccagttc cagcgt 36
<210> 105
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 105
acgctggaac tggtgagtgg ctgctatttg agcttc 36
<210> 106
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 106
gaagctcaaa tagcagccac tcaccagttc cagcgt 36
<210> 107
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 107
acgctggaac tggtgagttc ttgctatttg agcttc 36
<210> 108
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 108
gaagctcaaa tagcaagaac tcaccagttc cagcgt 36
<210> 109
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 109
acgctggaac tggtgagtaa ctgctatttg agcttc 36
<210> 110
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 110
gaagctcaaa tagcagttac tcaccagttc cagcgt 36
<210> 111
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 111
acgctggaac tggtgagtga ttgctatttg agcttc 36
<210> 112
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 112
gaagctcaaa tagcaatcac tcaccagttc cagcgt 36
<210> 113
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 113
acgctggaac tggtgagtca ttgctatttg agcttc 36
<210> 114
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 114
gaagctcaaa tagcaatgac tcaccagttc cagcgt 36
<210> 115
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 115
acgctggaac tggtgagtat ttgctatttg agcttc 36
<210> 116
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 116
gaagctcaaa tagcaaatac tcaccagttc cagcgt 36
<210> 117
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 117
acgctggaac tggtgagtcc gtgctatttg agcttc 36
<210> 118
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 118
gaagctcaaa tagcacggac tcaccagttc cagcgt 36
<210> 119
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 119
acgctggaac tggtgagtta ttgctatttg agcttc 36
<210> 120
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 120
gaagctcaaa tagcaataac tcaccagttc cagcgt 36
<210> 121
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 121
acgctggaac tggtgagtca gtgctatttg agcttc 36
<210> 122
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 122
gaagctcaaa tagcactgac tcaccagttc cagcgt 36
<210> 123
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 123
acgctggaac tggtgagtaa atgctatttg agcttc 36
<210> 124
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 124
gaagctcaaa tagcatttac tcaccagttc cagcgt 36
<210> 125
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 125
acgctggaac tggtgagtga atgctatttg agcttc 36
<210> 126
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 126
gaagctcaaa tagcattcac tcaccagttc cagcgt 36
<210> 127
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 127
acgctggaac tggtgagttg ctgctatttg agcttc 36
<210> 128
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 128
gaagctcaaa tagcagcaac tcaccagttc cagcgt 36
<210> 129
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 129
acgctggaac tggtgagtac ctgctatttg agcttc 36
<210> 130
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 130
gaagctcaaa tagcaggtac tcaccagttc cagcgt 36
<210> 131
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 131
acgctggaac tggtgagtcg ttgctatttg agcttc 36
<210> 132
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 132
gaagctcaaa tagcaacgac tcaccagttc cagcgt 36
<210> 133
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LeuE 变体
<400> 133
Val Phe Ala Glu Tyr Gly Val Leu Asn Tyr Trp Thr Tyr Leu Val Gly
1 5 10 15
Ala Ile Phe Ile Val Leu Val Pro Gly Pro Asn Thr Leu Phe Val Leu
20 25 30
Lys Asn Ser Val Ser Ser Gly Met Lys Gly Gly Tyr Leu Ala Ala Cys
35 40 45
Gly Val Phe Ile Gly Asp Ala Val Leu Met Phe Leu Ala Trp Ala Gly
50 55 60
Val Ala Thr Leu Ile Lys Thr Thr Pro Ile Leu Phe Asn Ile Val Arg
65 70 75 80
Tyr Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Tyr Leu Gly Ser Lys Ile Val Tyr
85 90 95
Ala Thr Leu Lys Gly Lys Asn Ser Glu Ala Lys Ser Asp Glu Pro Gln
100 105 110
Tyr Gly Ala Ile Phe Lys Arg Ala Leu Ile Leu Ser Leu Thr Asn Pro
115 120 125
Lys Ala Ile Leu Phe Tyr Val Ser Phe Phe Val Gln Phe Ile Asp Val
130 135 140
Asn Ala Pro His Thr Gly Ile Ser Phe Phe Ile Leu Ala Ala Thr Leu
145 150 155 160
Glu Leu Val Ser Phe Cys Tyr Leu Ser Phe Leu Ile Ile Ser Gly Ala
165 170 175
Phe Val Thr Gln Tyr Ile Arg Thr Lys Lys Lys Leu Ala Lys Val Gly
180 185 190
Asn Ser Leu Ile Gly Leu Met Phe Val Gly Phe Ala Ala Arg Leu Ala
195 200 205
Thr Leu Gln Ser
210
<210> 134
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LeuE 变体
<400> 134
Met Phe Ala Glu Tyr Gly Val Leu Asn Tyr Trp Thr Tyr Leu Val Gly
1 5 10 15
Ala Ile Phe Ile Val Leu Val Pro Gly Pro Asn Thr Leu Phe Val Leu
20 25 30
Lys Asn Ser Val Ser Ser Gly Met Lys Gly Gly Tyr Leu Ala Ala Cys
35 40 45
Gly Val Phe Ile Gly Asp Ala Val Leu Met Phe Leu Ala Trp Ala Gly
50 55 60
Val Ala Thr Leu Ile Lys Thr Thr Pro Ile Leu Phe Asn Ile Val Arg
65 70 75 80
Tyr Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Tyr Leu Gly Ser Lys Ile Val Tyr
85 90 95
Ala Thr Leu Lys Gly Lys Asn Ser Glu Ala Lys Ser Asp Glu Pro Gln
100 105 110
Tyr Gly Ala Ile Phe Lys Arg Ala Leu Ile Leu Ser Leu Thr Asn Pro
115 120 125
Lys Ala Ile Leu Phe Tyr Val Ser Phe Phe Val Gln Phe Ile Asp Val
130 135 140
Asn Ala Pro His Thr Gly Ile Ser Phe Phe Ile Leu Ala Ala Thr Leu
145 150 155 160
Glu Leu Val Ser Phe Cys Tyr Leu Ser Phe Leu Ile Ile Ser Gly Ala
165 170 175
Phe Val Thr Gln Tyr Ile Arg Thr Lys Lys Lys Leu Ala Lys Val Gly
180 185 190
Asn Ser Leu Ile Gly Leu Met Phe Val Gly Phe Ala Ala Arg Leu Ala
195 200 205
Thr Leu Gln Ser
210
<210> 135
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LeuE 变体
<400> 135
gtgttcgctg aatacggggt tctgaattac tggacctatc tggttggggc catttttatt 60
gtgttggtgc cagggccaaa taccctgttt gtactcaaaa atagcgtcag tagcggtatg 120
aaaggcggtt atcttgcggc ctgcggtgta tttattggcg atgcggtatt gatgtttctg 180
gcatgggctg gagtggcgac attaattaag accaccccga tattattcaa cattgtacgt 240
tatcttggtg cgttttattt gctctatctg gggagtaaaa ttgtgtacgc gaccctgaag 300
ggtaaaaata gcgaggccaa atccgatgag ccccaatacg gtgctatttt taaacgcgcg 360
ttaattttga gcctgactaa tccgaaagcc attttgttct atgtgtcgtt tttcgtacag 420
tttatcgatg ttaatgcccc acatacggga atttcattct ttattctggc ggcgacgctg 480
gaactggtga gtttctgcta tttgagcttc ctgattatat ctggtgcttt tgtcacgcag 540
tacatacgta ccaaaaagaa actggctaaa gttggcaact cactgattgg tttgatgttc 600
gtgggtttcg ctgcccgact ggcgacgctg caatcctga 639
<210> 136
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LeuE 变体
<400> 136
atgttcgctg aatacggggt tctgaattac tggacctatc tggttggggc catttttatt 60
gtgttggtgc cagggccaaa taccctgttt gtactcaaaa atagcgtcag tagcggtatg 120
aaaggcggtt atcttgcggc ctgcggtgta tttattggcg atgcggtatt gatgtttctg 180
gcatgggctg gagtggcgac attaattaag accaccccga tattattcaa cattgtacgt 240
tatcttggtg cgttttattt gctctatctg gggagtaaaa ttgtgtacgc gaccctgaag 300
ggtaaaaata gcgaggccaa atccgatgag ccccaatacg gtgctatttt taaacgcgcg 360
ttaattttga gcctgactaa tccgaaagcc attttgttct atgtgtcgtt tttcgtacag 420
tttatcgatg ttaatgcccc acatacggga atttcattct ttattctggc ggcgacgctg 480
gaactggtga gtttctgcta tttgagcttc ctgattatat ctggtgcttt tgtcacgcag 540
tacatacgta ccaaaaagaa actggctaaa gttggcaact cactgattgg tttgatgttc 600
gtgggtttcg ctgcccgact ggcgacgctg caatcctga 639
<210> 137
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LeuE 变体
<400> 137
Val Phe Ala Glu Tyr Gly Val Leu Asn Tyr Trp Thr Tyr Leu Val Gly
1 5 10 15
Ala Ile Phe Ile Val Leu Val Pro Gly Pro Asn Thr Leu Ala Val Leu
20 25 30
Lys Asn Ser Val Ser Ser Gly Met Lys Gly Gly Tyr Leu Ala Ala Cys
35 40 45
Gly Val Phe Ile Gly Asp Ala Val Leu Met Phe Leu Ala Trp Ala Gly
50 55 60
Val Ala Thr Leu Ile Lys Thr Thr Pro Ile Leu Phe Asn Ile Val Arg
65 70 75 80
Tyr Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Tyr Leu Gly Ser Lys Ile Leu Tyr
85 90 95
Ala Thr Leu Lys Gly Lys Asn Ser Glu Ala Lys Ser Asp Glu Pro Gln
100 105 110
Tyr Gly Ala Ile Phe Lys Arg Ala Leu Ile Leu Ser Leu Thr Asn Pro
115 120 125
Lys Ala Ile Leu Phe Tyr Val Ser Phe Phe Val Gln Phe Ile Asp Val
130 135 140
Asn Ala Pro His Thr Gly Ile Ser Phe Phe Ile Leu Ala Ala Thr Leu
145 150 155 160
Glu Leu Val Ser Phe Cys Tyr Leu Ser Phe Leu Ile Ile Ser Gly Ala
165 170 175
Phe Val Thr Gln Tyr Ile Arg Thr Lys Lys Lys Leu Ala Lys Val Gly
180 185 190
Asn Ser Leu Ile Gly Leu Met Phe Val Gly Phe Ala Ala Arg Leu Ala
195 200 205
Thr Leu Gln Ser
210
<210> 138
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LeuE 变体
<400> 138
Met Phe Ala Glu Tyr Gly Val Leu Asn Tyr Trp Thr Tyr Leu Val Gly
1 5 10 15
Ala Ile Phe Ile Val Leu Val Pro Gly Pro Asn Thr Leu Ala Val Leu
20 25 30
Lys Asn Ser Val Ser Ser Gly Met Lys Gly Gly Tyr Leu Ala Ala Cys
35 40 45
Gly Val Phe Ile Gly Asp Ala Val Leu Met Phe Leu Ala Trp Ala Gly
50 55 60
Val Ala Thr Leu Ile Lys Thr Thr Pro Ile Leu Phe Asn Ile Val Arg
65 70 75 80
Tyr Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Tyr Leu Gly Ser Lys Ile Leu Tyr
85 90 95
Ala Thr Leu Lys Gly Lys Asn Ser Glu Ala Lys Ser Asp Glu Pro Gln
100 105 110
Tyr Gly Ala Ile Phe Lys Arg Ala Leu Ile Leu Ser Leu Thr Asn Pro
115 120 125
Lys Ala Ile Leu Phe Tyr Val Ser Phe Phe Val Gln Phe Ile Asp Val
130 135 140
Asn Ala Pro His Thr Gly Ile Ser Phe Phe Ile Leu Ala Ala Thr Leu
145 150 155 160
Glu Leu Val Ser Phe Cys Tyr Leu Ser Phe Leu Ile Ile Ser Gly Ala
165 170 175
Phe Val Thr Gln Tyr Ile Arg Thr Lys Lys Lys Leu Ala Lys Val Gly
180 185 190
Asn Ser Leu Ile Gly Leu Met Phe Val Gly Phe Ala Ala Arg Leu Ala
195 200 205
Thr Leu Gln Ser
210
<210> 139
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> leuE 变体
<400> 139
gtgttcgctg aatacggggt tctgaattac tggacctatc tggttggggc catttttatt 60
gtgttggtgc cagggccaaa taccctggcg gtactcaaaa atagcgtcag tagcggtatg 120
aaaggcggtt atcttgcggc ctgcggtgta tttattggcg atgcggtatt gatgtttctg 180
gcatgggctg gagtggcgac attaattaag accaccccga tattattcaa cattgtacgt 240
tatcttggtg cgttttattt gctctatctg gggagtaaaa ttctttacgc gaccctgaag 300
ggtaaaaata gcgaggccaa atccgatgag ccccaatacg gtgctatttt taaacgcgcg 360
ttaattttga gcctgactaa tccgaaagcc attttgttct atgtgtcgtt tttcgtacag 420
tttatcgatg ttaatgcccc acatacggga atttcattct ttattctggc ggcgacgctg 480
gaactggtga gtttctgcta tttgagcttc ctgattatat ctggtgcttt tgtcacgcag 540
tacatacgta ccaaaaagaa actggctaaa gttggcaact cactgattgg tttgatgttc 600
gtgggtttcg ctgcccgact ggcgacgctg caatcctga 639
<210> 140
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> leuE 变体
<400> 140
atgttcgctg aatacggggt tctgaattac tggacctatc tggttggggc catttttatt 60
gtgttggtgc cagggccaaa taccctggcg gtactcaaaa atagcgtcag tagcggtatg 120
aaaggcggtt atcttgcggc ctgcggtgta tttattggcg atgcggtatt gatgtttctg 180
gcatgggctg gagtggcgac attaattaag accaccccga tattattcaa cattgtacgt 240
tatcttggtg cgttttattt gctctatctg gggagtaaaa ttctttacgc gaccctgaag 300
ggtaaaaata gcgaggccaa atccgatgag ccccaatacg gtgctatttt taaacgcgcg 360
ttaattttga gcctgactaa tccgaaagcc attttgttct atgtgtcgtt tttcgtacag 420
tttatcgatg ttaatgcccc acatacggga atttcattct ttattctggc ggcgacgctg 480
gaactggtga gtttctgcta tttgagcttc ctgattatat ctggtgcttt tgtcacgcag 540
tacatacgta ccaaaaagaa actggctaaa gttggcaact cactgattgg tttgatgttc 600
gtgggtttcg ctgcccgact ggcgacgctg caatcctga 639
<210> 141
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LeuE 变体
<400> 141
Val Phe Ala Glu Tyr Gly Val Leu Asn Tyr Trp Thr Tyr Leu Val Gly
1 5 10 15
Ala Ile Phe Ile Val Leu Val Pro Gly Pro Asn Thr Leu Phe Val Leu
20 25 30
Lys Asn Ser Val Ser Ser Gly Met Lys Gly Gly Tyr Leu Ala Ala Cys
35 40 45
Gly Val Phe Ile Gly Asp Ala Val Leu Met Phe Leu Ala Trp Ala Gly
50 55 60
Val Ala Thr Leu Ile Lys Thr Thr Pro Ile Leu Phe Asn Ile Val Arg
65 70 75 80
Tyr Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Tyr Leu Gly Ser Lys Ile Leu Tyr
85 90 95
Ala Thr Leu Lys Gly Lys Asn Ser Glu Ala Lys Ser Asp Glu Pro Gln
100 105 110
Tyr Gly Ala Ile Phe Lys Arg Ala Leu Ile Leu Ser Leu Thr Asn Pro
115 120 125
Lys Ala Ile Leu Phe Tyr Val Ser Phe Phe Val Gln Phe Ile Asp Val
130 135 140
Asn Ala Pro His Thr Gly Ile Ser Phe Phe Ile Leu Ala Ala Thr Leu
145 150 155 160
Glu Leu Val Ser Ala Cys Tyr Leu Ser Phe Leu Ile Ile Ser Gly Ala
165 170 175
Phe Val Thr Gln Tyr Ile Arg Thr Lys Lys Lys Leu Ala Lys Val Gly
180 185 190
Asn Ser Leu Ile Gly Leu Met Phe Val Gly Phe Ala Ala Arg Leu Ala
195 200 205
Thr Leu Gln Ser
210
<210> 142
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LeuE 变体
<400> 142
Met Phe Ala Glu Tyr Gly Val Leu Asn Tyr Trp Thr Tyr Leu Val Gly
1 5 10 15
Ala Ile Phe Ile Val Leu Val Pro Gly Pro Asn Thr Leu Phe Val Leu
20 25 30
Lys Asn Ser Val Ser Ser Gly Met Lys Gly Gly Tyr Leu Ala Ala Cys
35 40 45
Gly Val Phe Ile Gly Asp Ala Val Leu Met Phe Leu Ala Trp Ala Gly
50 55 60
Val Ala Thr Leu Ile Lys Thr Thr Pro Ile Leu Phe Asn Ile Val Arg
65 70 75 80
Tyr Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Tyr Leu Gly Ser Lys Ile Leu Tyr
85 90 95
Ala Thr Leu Lys Gly Lys Asn Ser Glu Ala Lys Ser Asp Glu Pro Gln
100 105 110
Tyr Gly Ala Ile Phe Lys Arg Ala Leu Ile Leu Ser Leu Thr Asn Pro
115 120 125
Lys Ala Ile Leu Phe Tyr Val Ser Phe Phe Val Gln Phe Ile Asp Val
130 135 140
Asn Ala Pro His Thr Gly Ile Ser Phe Phe Ile Leu Ala Ala Thr Leu
145 150 155 160
Glu Leu Val Ser Ala Cys Tyr Leu Ser Phe Leu Ile Ile Ser Gly Ala
165 170 175
Phe Val Thr Gln Tyr Ile Arg Thr Lys Lys Lys Leu Ala Lys Val Gly
180 185 190
Asn Ser Leu Ile Gly Leu Met Phe Val Gly Phe Ala Ala Arg Leu Ala
195 200 205
Thr Leu Gln Ser
210
<210> 143
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> leuE 变体
<400> 143
gtgttcgctg aatacggggt tctgaattac tggacctatc tggttggggc catttttatt 60
gtgttggtgc cagggccaaa taccctgttt gtactcaaaa atagcgtcag tagcggtatg 120
aaaggcggtt atcttgcggc ctgcggtgta tttattggcg atgcggtatt gatgtttctg 180
gcatgggctg gagtggcgac attaattaag accaccccga tattattcaa cattgtacgt 240
tatcttggtg cgttttattt gctctatctg gggagtaaaa ttctttacgc gaccctgaag 300
ggtaaaaata gcgaggccaa atccgatgag ccccaatacg gtgctatttt taaacgcgcg 360
ttaattttga gcctgactaa tccgaaagcc attttgttct atgtgtcgtt tttcgtacag 420
tttatcgatg ttaatgcccc acatacggga atttcattct ttattctggc ggcgacgctg 480
gaactggtga gtgcgtgcta tttgagcttc ctgattatat ctggtgcttt tgtcacgcag 540
tacatacgta ccaaaaagaa actggctaaa gttggcaact cactgattgg tttgatgttc 600
gtgggtttcg ctgcccgact ggcgacgctg caatcctga 639
<210> 144
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> leuE 变体
<400> 144
atgttcgctg aatacggggt tctgaattac tggacctatc tggttggggc catttttatt 60
gtgttggtgc cagggccaaa taccctgttt gtactcaaaa atagcgtcag tagcggtatg 120
aaaggcggtt atcttgcggc ctgcggtgta tttattggcg atgcggtatt gatgtttctg 180
gcatgggctg gagtggcgac attaattaag accaccccga tattattcaa cattgtacgt 240
tatcttggtg cgttttattt gctctatctg gggagtaaaa ttctttacgc gaccctgaag 300
ggtaaaaata gcgaggccaa atccgatgag ccccaatacg gtgctatttt taaacgcgcg 360
ttaattttga gcctgactaa tccgaaagcc attttgttct atgtgtcgtt tttcgtacag 420
tttatcgatg ttaatgcccc acatacggga atttcattct ttattctggc ggcgacgctg 480
gaactggtga gtgcgtgcta tttgagcttc ctgattatat ctggtgcttt tgtcacgcag 540
tacatacgta ccaaaaagaa actggctaaa gttggcaact cactgattgg tttgatgttc 600
gtgggtttcg ctgcccgact ggcgacgctg caatcctga 639
<210> 145
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 145
ataattaaag aggttaatat gttcgctgaa tacggg 36
<210> 146
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 146
cccgtattca gcgaacatat taacctcttt aattat 36
PCT/RO/134表

Claims (19)

1.一种具有输出O-乙酰高丝氨酸活性的多肽，其中选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置1处的缬氨酸、位置30处的苯丙氨酸、位置95处的亮氨酸和位置165处的苯丙氨酸的至少一个氨基酸被另一个氨基酸置换。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置1处的缬氨酸被甲硫氨酸置换；SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置30处的苯丙氨酸被选自丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸和组氨酸的任一种置换；SEQ IDNO:1的氨基酸序列中的位置95处的亮氨酸被选自缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸和组氨酸的任一种置换；或SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置165处的苯丙氨酸被选自丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸和组氨酸的任一种置换。
3.根据权利要求1所述的多肽，其中SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置1处的缬氨酸被甲硫氨酸置换；并且SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置30处的苯丙氨酸、位置95处的亮氨酸或位置165处的苯丙氨酸被另一种氨基酸置换。
4.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽选自SEQ ID NO:2、133、134、137、138、141和142的氨基酸序列。
5.一种多核苷酸，其编码权利要求1所述的具有输出O-乙酰高丝氨酸活性的多肽。
6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸的起始密码子另外地被ATG置换。
7.根据权利要求5所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸选自SEQ ID NO:4、135、136、139、140、143和144的核酸序列。
8.一种生产O-乙酰高丝氨酸的埃希氏杆菌属的微生物，其中包括或过表达由SEQ IDNO:1的氨基酸序列组成的多肽或其修饰的多肽。
9.根据权利要求8所述的微生物，其中关于所述修饰的多肽，选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置1处的缬氨酸、位置30处的亮氨酸、位置95处的苯丙氨酸和位置165处的苯丙氨酸的至少一个氨基酸被另一个氨基酸置换。
10.根据权利要求8所述的微生物，其中关于所述修饰的多肽，SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置1处的缬氨酸被甲硫氨酸置换；SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置30处的苯丙氨酸被选自丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸和组氨酸的任一种置换；SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置95处的亮氨酸被选自缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸和组氨酸的任一种置换；或SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置165处的苯丙氨酸被选自丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸和组氨酸的任一种置换。
11.根据权利要求9所述的多肽，其中关于所述修饰的多肽，SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置1处的缬氨酸被甲硫氨酸置换；并且SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置30处的苯丙氨酸、位置95处的亮氨酸或位置165处的苯丙氨酸被另一种氨基酸置换。
12.根据权利要求8所述的微生物，其中所述埃希氏杆菌属的微生物是大肠杆菌。
13.根据权利要求8所述的微生物，其中另外地，胱硫醚合成酶的活性被失活。
14.根据权利要求8所述的微生物，其中另外地，高丝氨酸激酶的活性被失活。
15.根据权利要求8所述的微生物，其中另外地，高丝氨酸乙酰转移酶的活性与未修饰的微生物的活性相比增强。
16.根据权利要求8所述的微生物，其中另外地，天冬氨酸半醛脱氢酶、吡啶核苷酸转氢酶、或其组合的活性与未修饰的微生物的活性相比增强。
17.一种生产O-乙酰高丝氨酸的方法，其包括：
在培养基中培养权利要求8-16中任一项所述的生产O-乙酰高丝氨酸的埃希氏杆菌属的微生物；和
从培养的微生物或培养的培养基回收O-乙酰高丝氨酸。
18.一种生产L-甲硫氨酸的方法，其包括：
在培养基中培养权利要求8-16中任一项所述的生产O-乙酰高丝氨酸的埃希氏杆菌属的微生物；和
通过利用甲硫醇和甲硫氨酸-转化酶处理培养的微生物或者培养的培养基或者从培养的微生物或培养的培养基回收的O-乙酰高丝氨酸，将O-乙酰高丝氨酸转化为L-甲硫氨酸。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述甲硫氨酸-转化酶是O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶。
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