MX2014007385A - Procedimiento para producir l-lisina usando microorganismos que tienen capacidad para producir l-lisina. - Google Patents

Procedimiento para producir l-lisina usando microorganismos que tienen capacidad para producir l-lisina.

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Abstract

La presente invención se refiere a un polinucleótido modificado que codifica aspartato quinasa; EC: 2.7.2.4 en lo sucesivo en el presente documento denominado LysC), transcetolasa; (EC: 2.2.1.1 en lo sucesivo en el presente documento denominado Tkt) o piruvato carboxilasa (EE: 6.4.1.1 en lo sucesivo en lo sucesivo en el presente documento denominado Pyc), en el que el cordón de inicio está sustituido con ATG, un vector que incluye el mismo, un microorganismo transformado con el vector, y un procedimiento para producir L-lisina utilizando el mismo.

Description

PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR L-LISINA USANDO MICROORGANISMOS QUE TIENEN CAPACIDAD PARA PRODUCIR L-LISINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un polinucleótido modificado en el que un codón de inicio está sustituido con ATG, un vector que comprende el mismo, un microorganismo que comprende el polinucleótido, y un procedimiento para producir L-lisina usando el mismo.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las cepas del genero Corynebacteríum, específicamente Corynebacterium glutamicum, son microorganismos Gram-positivos que se usan extensivamente para producir L-lisina. La L-lisina se usa para pienso de animales, medicinas y cosméticos para seres humanos, y se produce mediante la fermentación de la cepa de Corynebacterium.
Convencionalmente, se conocen una cepa del género Corynebacterium que tiene genes de biosíntesis de sina potenciados y un procedimiento para producir L-lisina usando los mismos. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 6.746.855 desvela un procedimiento para producir L-lisina cultivando Corynebacterium que tiene una expresión potenciada del gen lysE (gen portador de exportación de lisina), y adicionalmente genes introducidos seleccionados del grupo constituido por un gen dapA, un gen fysC, un gen pyc y un gen dapB.
Otro procedimiento es amplificar genes en la ruta de biosíntesis de lisina o modificar un promotor. Por ejemplo, la solicitud de Patente coreana abierta a inspección pública N° 2009-0082702 y 2009-0084099 desvelan un procedimiento para producir L-lisina introduciendo promotores mejorados de ddh y el operón lysC-asd en Corynebacterium. La solicitud de Patente coreana abierta a inspección pública N° 2008-0025355 desvela un procedimiento para mejorar la productividad de lisina amplificando el número de copias de los genes en la ruta de biosíntesis de lisina, que son aspB, lysC, asd, dapA, dapB, lysA y pyc, en el cromosoma.
Por otra parte, el codón de inicio que se reconoce por ribosomas para iniciar la traducción en el cromosoma es habitualmente ATG. La traducción puede controlarse de acuerdo con el codón de inicio del gen, y la secuencia del codón de inicio es importante en la regulación de la actividad de la proteína. Sin embargo, aunque ATG es el codón de inicio común entre los genes de biosíntesis de lisina derivados de Corynebacterium glutamicum, el codón de inicio de los genes lysC y pyc es GTG, y TTG es para el gen tkt en la ruta de pentosa fosfato que contiene el codón de inicio de TTG (referencia: J. Biotechnol., 104: 5- Los presentes inventores han realizado muchos intentos para encontrar un procedimiento para mejorar la productividad de lisina y, como resultado, han descubierto que el codón de inicio de los genes lysC, tkt y pyc naturales pueden sustituirse con ATG para potenciar las actividades de aspartato quinasa, transcetolasa y piruvato carboxilasa sobre sus actividades endógenas, completando de este modo la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un objetivo de la presente invención es proporcionar un polinucleotido modificado que codifique aspartato quinasa (EC:2.7.2.4; en lo sucesivo en el presente documento denominado LysC), transcetolasa (EC:2.2.1.1; en lo sucesivo en el presente documento denominado Tkt) o piruvato carboxilasa (EC:6.4.1.1; en lo sucesivo en el presente documento denominado Pyc), en el que el codón de inicio del polinucléotido se sustituye con ATG.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un vector que comprenda uno o más polinucleótidos modificados que codifiquen aspartato quinasa, transcetolasa o piruvato carboxilasa, en el que el codón de inicio del polinucléotido esté sustituido con ATG.
Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar un microorganismo, en el que una o más de las enzimas tengan actividad potenciada en comparación con su actividad endógena.
Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar un procedimiento para producir L-lisina, que comprenda las etapas de cultivar el microorganismo y recuperar L-lisina del microorganismo cultivado o el caldo de cultivo.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS En un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido modificado que codifica aspartato quinasa (EC:2.7.2.4; en lo sucesivo en el presente documento denominado LysC), transcetolasa (EC:2.2.1.1; en lo sucesivo en el presente documento denominado Tkt) o piruvato carboxilasa (EC:6.4.1.1; en lo sucesivo en el presente documento denominado Pyc), en el que el codón de inicio del polinucleótido está sustituido con ATG.
Cada polinucleótido que codifica aspartato quinasa, transcetolasa o piruvato carboxilasa tambien puede incluir una sustitución, deleción, inserción o adición parcial en el polinucleótido, siempre que cada uno de ellos tenga la actividad enzimática, y puede tener 70 % o más de homología, específicamente 80 % o más de homología, más específicamente 90 % o más de homología, y mucho más específicamente 95 % o más de homología y más específicamente 100 % de homología basándose en el polinucleótido conocido.
Como se usa en el presente documento, el término “homología (homólogo)” significa el grado de similitud entre las secuencias de nucleótidos del gen lysC, el gen tkt o el gen pyc natural y las secuencias de nucleótidos de los genes modificados correspondientes de los mismos, es decir, el gen lysC, el gen tkt o el gen pyc modificado, en el que una parte de los polinucleótidos está sustituido, suprimido, insertado o añadido.
Como se usa en el presente documento, la expresión “codón de inicio” significa 3 nucleótidos correspondientes a un punto de inicio de la traducción cuando se traduce una secuencia codificante de ARNm (ARN mensajero) en una proteína. En general, son codones de inicio hallados en el cromosoma de microorganismos ATG (AUG en ARNm), GTG (GUG en ARNm) y TTG (UUG en ARNm), y existen en una relación de 62,5 %~66,5 %, 23,1 %~24,3 % y 10,3 %~13,2 % de acuerdo con el resultado del análisis de la secuencia genómica completa de Corynebacterium glutamicum (referencia: Handbook of Corynebacterium glutamicum, 40p, Lothar Eggeling y Michael Bott, 2005).
Entre los genes de biosíntesis de lisina derivados de Corynebacterium presentados hasta ahora, lysC y pyc tienen el codón de inicio de GTG y tkt tiene el codón de inicio de TTG. El codón de inicio de estos genes no es ATG, que se considera una característica única de Corynebacterium.
El polinucleótido modificado de acuerdo con la presente invención se caracteriza porque el codón de inicio del gen lysC, tkt o pyc está sustituido con ATG, y estos polinucleótidos modificados que tienen dicho codón de inicio sustituido se han modificado en primer lugar por los presentes inventores. En más detalle, el codón de inicio GTG del polinucleótido que codifica aspartato quinasa (LysC) o piruvato carboxilasa (Pyc) está sustituido con ATG, y el codón de inicio TTG del polinucleótido que codifica transcetolasa (Tkt) está sustituido con ATG en la presente invención. Más específicamente, las secuencias de los genes lysC, tkt o pyc son las SEC ID N°: 13, 14 y 15, respectivamente, las secuencias de los genes que tienen el codón de inicio sustituido como ATG se representan por SEC ID N°: 16, 17 y 18, respectivamente.
Las sustituciones de bases de los codones de inicio pueden realizarse por cualquier procedimiento conocido en la téenica, por ejemplo, mutagénesis específica, recombinación homologa, pero no se limita a los mismos.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un vector que comprende uno o más polinucleótidos modificados de los polinucleótidos modificados que codifican aspartato quinasa, transcetolasa o piruvato carboxilasa, en los que el codón de inicio del polinucleótido está sustituido con ATG.
Los polinucleótidos modificados que tienen el codón de inicio sustituido como ATG y que codifican aspartato quinasa, transcetolasa o piruvato carboxilasa, que está comprendido en el vector de la presente invención, pueden incluir aquellos en los que una parte de los polinucleótidos está sustituida, suprimida, insertada o añadida, siempre que tengan actividad enzimática, y pueden tener 70 % o más de homología, específicamente 80 % o más de homología, más específicamente 90 % o más de homología, mucho más específicamente 95 % o más de homología y más específicamente 100 % de homología.
Además, los polinucleótidos modificados que tienen el codón de inicio sustituido como ATG y que codifican aspartato quinasa, transcetolasa o piruvato carboxilasa, que está comprendido en el vector de la presente invención, pueden incluir además solamente una parte del gen que codifica aspartato quinasa, transcetolasa o piruvato carboxilasa, siempre que tengan el codón de inicio sustituido como ATG.
Como se usa en el presente documento, el termino “vector” se refiere a una construcción de ADN que contiene una secuencia de bases que está unida operativamente a una secuencia de control adecuada, para expresar un gen diana en un huésped adecuado. Las secuencias de control pueden incluir un promotor para iniciar la transcripción, una cierta secuencia operadora para controlar dicha transcripción, una secuencia que codifica un sitio de unión a ribosoma adecuado en el ARNm, y una secuencia para controlar la terminación de la transcripción y traducción. El vector usado en la presente invención no está particularmente limitado, y puede ser cualquier vector conocido en la téenica, siempre que sea replicable en el huésped. Por ejemplo, el vector puede ser un plásmido, una partícula de fago o un inserto de genoma potencial, y es específicamente pDZ (Patente coreana N° 10-0924065), pero no se limita al mismo. Una vez transformado en un huésped adecuado, el vector puede replicarse o actuar de forma independiente del genoma del huésped, o puede integrarse en el genoma en sí mismo.
Específicamente, se adquirió una secuencia de nucleótidos (SEC ID N°: 13, 14 o 15) que comprendía el codón de inicio del gen lysC, tkt o pyc, y, basándose en esta secuencia, se sintetizaron cebadores que tenían el codón de inicio sustituido como ATG. Se llevó a cabo PCR usando los cebadores y un ADN cromosómico de una cepa productora de L-lisina como un molde, para obtener ADN del que se sustituye un extremo con ATG. Este fragmento de ADN obtenido de este modo se clonó en un vector para obtener un vector recombinante final. Más específicamente, en la presente invención, se construyeron los vectores pDZ-lysC(ATG), pDZ-tkt(ATG) y pDZ-pyc(ATG), respectivamente.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona un microorganismo que incluye uno o más polinucleótidos modificados que tienen el codón sustituido como ATG y que codifican enzimas seleccionadas del grupo constituido por aspartato quinasa, transcetolasa y piruvato carboxilasa, y después mejoradas en los niveles de traducción de ARNm transcritos de los polinucleótidos a proteínas, dando como resultado actividades potenciadas de una o más de las enzimas en comparación con actividades endógenas de las mismas. El microorganismo de la presente invención puede tener actividades potenciadas de aspartato quinasa, transcetolasa o piruvato carboxilasa, usando los polinucleótidos modificados en combinaciones de uno, dos o tres de los mismos, en los que los polinucleótidos modificados codifican las enzimas correspondientes y están sustituidos con ATG en el codón de inicio.
Para sustituir con ATG los codones de inicio de los genes diana en el cromosoma del microorganismo, pueden usarse diversos procedimientos conocidos en la teenica. Por ejemplo, las secuencias de codón de inicio de los genes lysC, tkt y pyc endógenos en el microorganismo pueden sustituirse en el cromosoma. Como alternativa, los genes correspondientes que tienen secuencias de codón de inicio sustituidas pueden introducirse en el microorganismo en forma de un plásmido.
El microorganismo puede ser cualquier cepa, siempre que tenga productividad de L-lisina. Específicamente puede ser un microorganismo de Corynebacterium sp. o Brevibacterium sp. Los ejemplos de los microorganismos de Corynebacterium sp. o Brevibacterium sp. incluyen Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869. Además, pueden incluirse variantes productoras de L-lisina o cepas derivadas de las mismas, por ejemplo, Corynebacterium glutamicum KCCM11016P (este microorganismo se desveló como KFCC10881, y se volvió a depositar en una Autoridad Depositaría Internacional según el Tratado de Budapest con el N° de Referencia KCCM11016P, Patente coreana N° 10-0159812, Patente coreana N° 10-0397322) y Corynebacterium glutamicum KFCC 11001. Además, puede ser Corynebacterium glutamicum con el N° de referencia KCCM11016P.
Específicamente, se transformó Corynebacterium glutamicum con el N° de referencia KCCM11016P con un vector que comprendía polinucleótido que codifica aspartato quinasa, transcetolasa o piruvato carboxilasa en el que el codón de inicio está sustituido con ATG, para obtener Corynebacterium glutamicum recombinante. Más específicamente, se introdujo el vector pDZ-lysC(ATG), pDZ-tkt(ATG) o pDZ-pyc(ATG) en Corynebacterium glutamicum con el N° de referencia KCCM11016P, respectivamente, para obtener cada Corynebacteríum glutamicum recombinante.
Además, el microorganismo puede transformarse con un vector que comprende dos o más polinucleótidos de los polinucleótidos que codifican aspartato quinasa, transcetolasa o piruvato carboxilasa y que tienen el codón de inicio sustituido como ATG. Específicamente, el vector pDZ-tkt(ATG) que comprende el gen del que se ha sustituido el codón de inicio con ATG y codifica transcetolasa se transforma en Corynebacteríum glutamicum KCCM11016P-lysC, en el que el codón de inicio GTG de lysC está sustituido con ATG, y mediante un segundo cruce, los codones de inicio de lysC y tkt en el cromosoma se sustituyen con ATG para obtener Corynebacteríum glutamicum KCCM11016P-lysC. Además, el vector pDZ-pyc(ATG) que comprende el polinucleótido del que se ha sustituido el codón de inicio con ATG y codifica piruvato carboxilasa se transforma en KCCM11016P-lysC, en el que el codón de inicio GTG de lysC está sustituido con ATG, y mediante un segundo cruce, los codones de inicio de lysC y pyc en el cromosoma se sustituyen con ATG para obtener KCCM11016P-lysC-pyc. Además, el vector pDZ-tkt(ATG) se transforma en KCCM11016P-lysC-pyc como se ha preparado anteriormente, en el que el codón de inicio GTG de lysC y pyc está sustituido con ATG, y mediante el segundo cruce, los codones de inicio de lysC, pyc y tkt en el cromosoma se sustituyen con ATG para obtener KCCM11016P-lysC-pyc-tkt. Se ha confirmado que los codones de inicio de lysC, pyc y tkt tambien pueden sustituirse con ATG en otras cepas productoras de lisina que pertenecen a Corynebacteríum glutamicum, KFCC10750 (este microrganismo se desveló como KFCC10750, y se volvió a depositar en una Autoridad Depositaría Internacional según el Tratado de Budapest con el N° de Referencia KCCM11347P, Patente coreana N° 10-0073610), KCCM10770P (Patente coreana N° 10-0924065), CJ3P (Genome Biology 2012, 13:R40) de la misma manera. Estos resultados sugieren que los polinucleótidos modificados de la presente invención pueden introducirse de forma estable en diversas cepas que pertenecen a Corynebacteríum sp., aumentando de este modo la productividad de L-lisina.
Específicamente, el transformante KCCM11016P-lysC-pyc-tkt, que se obtuvo introduciendo vectores pDZ-lysC(ATG), pDZ-tkt(ATG) y pDZ-pyc(ATG) incluyendo los polinucleótidos que codifican aspartato quinasa, transcetolasa y piruvato carboxilasa en Corynebacterium glutamicum KCCM11016P se designó Corynebacterium glutamicum CA01-2059, y se depositó el 2 de mayo de 2011 en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos (en lo sucesivo en el presente documento abreviado “KCCM”), que es una Autoridad Depositaría Internacional según el Tratado de Budapest, con el N° de referencia KCCM11188P. Se ha depositado por una Autoridad Depositaría Internacional según el Tratado de Budapest.
El microorganismo de acuerdo con la presente invención se caracteriza porque los codones de inicio de los genes naturales que codifican las enzimas anteriores están sustituidos con ATG, y por lo tanto, el microorganismo tiene actividades potenciadas de aspartato quinasa, transcetolasa y piruvato carboxilasa en comparación con actividades endógenas del mismo, resultantes de una mejora notable en los niveles de traducción de los ARNm transcritos de los genes lysC, tkty pyc en las proteínas.
Como se usa en el presente documento, la expresión “actividad endógena” significa la actividad de una enzima en un microorganismo nativo, y por ejemplo, la actividad de aspartato quinasa, transcetolasa o piruvato carboxilasa en un microorganismo nativo que pertenece a Corynebacterium sp. La expresión “actividad endógena potenciada” significa que la actividad está mejorada adicionalmente en comparación con la de la enzima nativa.
Específicamente, cuando se comparó la actividad aspartato quinasa de la cepa en la que se sustituyó el codón de inicio del gen lysC con ATG con la de la cepa parental KCCM11016P, se observó un aumento de 2,73 veces en la actividad aspartato quinasa (Tabla 4). Además, cuando se comparó la actividad transcetolasa de la cepa en la que el codón de inicio del gen tkt se sustituyó con ATG con la de la cepa parental KCCM11016P, se observó un aumento de 3,5 veces en la actividad transcetolasa (Tabla 5). Además, cuando se comparó la actividad piruvato carboxilasa de la cepa en la que el codón de inicio del gen pyc está sustituido con ATG con la de la cepa parental KCCM11016P, se observó un aumento de 1,89 veces en la actividad piruvato carboxilasa (Tabla 6).
Se descubrió que la productividad de L-lisina del microorganismo puede aumentarse mejorando la actividad de aspartato quinasa, transcetolasa, piruvato carboxilasa o una combinación de las mismas.
En la presente invención, se midieron las cantidades de L-lisina producida en las cepas productoras de L-lisina, Corynebacterium glutamicum KCCM11016P-lysC, KCCM1 1016P-tkt, KCCM11016P-pyc, KCCM11016 P-lysC-tkt , KCCM11016P-lysC-pyc, y KCCM11016P-lysC-pyc-tkt, y como resultado, mostraron una mejora notable en la producción de L-lisina en comparación con la cepa parental KCCM11016P (Tabla 7). Además, otras cepas productoras de lisina pertenecientes a Corynebacterium glutamicum, KFCC10750 (Patente coreana N° 10-0073610), KCCM10770P (Patente coreana N° 10-0924065) y CJ3P (Genome Biology 2012, 13:R40), en las que los codones de inicio de lysC, pyc y tkt se sustituyeron con ATG, mostraron una mejora notable en la producción de L-lisina en comparación con la cepa parental (Tablas 8-10). Estos resultados sugieren que los microorganismos que tienen un tipo de polinucleótidos modificados que codifican LysC, Tkt o Pyc, o que tienen dos tipos de los polinucleótidos modificados que codifican las enzimas, o que tienen tres tipos de polinucleótidos modificados que codifican las enzimas y que tienen el codón de inicio sustituido como ATG en el cromosoma, tambien mostraron productividad de L-lisina notablemente mejorada en comparación con el microorganismo natural que tiene el codón de inicio GTG o TTG.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona un procedimiento para producir L-lisina, que comprende las etapas de cultivar el microorganismo como se ha descrito anteriormente; y recuperar L-lisina del microorganismo cultivado o el caldo de cultivo.
Para el cultivo, pueden usarse diversos procedimientos para producir L-lisina usando un microorganismo que se conocen ampliamente en la téenica. El cultivo puede llevarse a cabo de acuerdo con el procedimiento ampliamente conocido, y las condiciones para el cultivo, incluyendo temperatura, tiempo, pH del medio, etc. pueden controlarse apropiadamente. Se proporciona una descripción detallada del cultivo en el siguiente documento [Chmiel; Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991), y Storhas; Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)]. Además, el cultivo puede incluir cultivo discontinuo, cultivo continuo y cultivo semicontinuo. Específicamente, puede manejarse un procedimiento discontinuo, semicontinuo o semicontinuo repetido de una manera continua, pero la presente invención no se limita a los mismos.
Para su uso en el cultivo, un medio debe satisfacer el requisito de emplear una cepa particular. Se conocen bien medios de cultivo para microorganismos que pertenecen a Corynebacteríum sp. (por ejemplo, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., Estados Unidos, 1981). Las fuentes para usar pueden incluir sacáridos y carbohidratos tales como glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, almidón y celulosa; aceites y lípidos tales como aceite de soja, aceite de semilla de girasol, aceite de ricino y aceite de coco; ácidos grasos tales como ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico; alcoholes tales como glicerol y etanol; y ácidos orgánicos tales como ácido acetico. Estos materiales pueden usarse por separado o en combinación. Las fuentes de nitrógeno para usar pueden incluir peptona, extracto de levadura, caldo de carne, extracto de malta, agua de macerado de maíz, harina de soja y urea, o compuestos inorgánicos tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Estas fuentes de nitrógeno pueden usarse por separado o en combinación. Las fuentes de fósforo para usar pueden incluir hidrogenofosfato dipotásico, dihidrogenofosfato potásico y sales de sodio correspondientes. Además, los medios de cultivo pueden contener sales metálicas tales como sulfato de magnesio o sulfato de hierro esenciales para el crecimiento. Finalmente, pueden usarse nutrientes esenciales tales como aminoácidos y vitaminas además de las sustancias anteriores. Además, pueden añadirse precursores apropiados a los medios de cultivo. Estos materiales pueden añadirse apropiadamente al cultivo durante cultivos en un modo discontinuo o continuo.
El pH del medio de cultivo puede ajustarse con un compuesto básico tal como hidróxido sódico, hidróxido potásico o amoniaco, o un compuesto ácido tal como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. La generación de espuma debe restringirse usando un agente antiespumante tal como poliglicol éster de ácidos grasos. Los medios de cultivo pueden mantenerse en condiciones aerobias introduciendo oxígeno o un gas que contenga oxígeno (por ejemplo, aire) en los mismos. La temperatura de cultivo está típicamente entre 20 y 45 °C y específicamente entre 25 y 40 °C. Despues se continúa el cultivo hasta que se produce una cantidad máxima de L-lisina. A este respecto, puede conseguirse en un periodo de 10 a 160 horas. Después de producirse, la L-lisina puede exportarse al medio de cultivo o puede permanecer dentro de las células.
Además, el procedimiento para producir L-lisina de la presente invención comprende la etapa de recuperar L-lisina del microorganismo cultivado o del caldo de cultivo. El procedimiento para recuperar L-lisina del microorganismo o el caldo de cultivo se conoce ampliamente en la téenica. Los ejemplos de procedimiento de recuperación de L-lisina pueden incluir filtración, cromatografía de intercambio aniónico, cristalización y HPLC, pero no se limitan a los mismos.
Ejemplos En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá en más detalle con referencia a los Ejemplos. Sin embargo, estos Ejemplos son para fines ilustrativos solamente y no se pretende que la invención se limite a estos Ejemplos.
En los Ejemplos, se construyeron vectores recombinantes para sustituir con ATG el codón de inicio GTG o TTG del gen lysC que codifica aspartato quinasa, del gen tkt que codifica transcetolasa, y del gen pyc que codifica piruvato carboxilasa derivado de la cepa productora de lisina, Corynebacterium glutamicum KCCM11016P. El vector se transformó en la cepa de Corynebacterium glutamicum KCCM11016P para obtener una cepa que tuviera el codón de inicio sustituido en el cromosoma, preparando de este modo una cepa que tuviera productividad de lisina mejorada.
La cepa de Corynebacterium glutamicum KCCM11016P usada en la presente invención es una cepa que es resistente a S-(2-aminoetil) cisteína (en lo sucesivo en el presente documento denominada AEC) y es permeable a homoserina, preparada por mutación artificial usando Corynebacterium glutamicum natural (ATCC 13032) como una cepa parental (desvelada como KFCC10881. Véase Patente coreana N° 10-0159812 y Patente coreana N° 10-0397322). Además la cepa KFCC10750 es una cepa productora de L-lisina de Corynebacterium glutamicum que es auxótrofa para homoserina y resistente a un análogo de L-lisina, 4-azaleucina y un antibiótico rifampicina, preparado por mutación artificial (Patente coreana N° 10-0073610), la cepa KCCM10770P es una cepa productora de L-lisina derivada de KCCM11016P, que conserva dos copias de 6 tipos de los genes que constituyen la ruta de biosíntesis de lisina en el cromosoma (Patente coreana N° 10-0924065), y la cepa CJ3P es una cepa de Corynebacterium glutamicum que tiene productividad de L-lisina introduciendo cada una de las mutaciones P458S, V59A y T311I en tres tipos de genes pyc, hom y lysC naturales, basándose la descripción de Binder y col. (Genome Biology 2012, 13:R40).
Ejemplo 1; Construcción del vector recombinante (pDz-lysC (ATG)) que tiene el codón de inicio ATG sustituido en IvsC derivado de Corynebacterium glutamicum v Preparación de una cepa que tiene el codón de inicio sustituido Se usó pDZ (vease Patente coreana N° 10-09245065) como un vector básico para el vector recombinante, que se construyó de la siguiente manera. (1) Construcción del vector recombinante pDZ-lysC(ATG) Para adquirir el gen lysC derivado de Corynebacterium glutamicum, se usó ADN cromosómico de una cepa productora de lisina ( Corynebacterium glutamicum KCCM11016P) preparada por mutación artificial como un molde. Basándose en el genbank en los Institutos Nacionales de la Salud de Estados Unidos (NIH GenBank), se adquirió una secuencia de nucleótidos (SEC ID N°: 13) que contenía la región de codón de inicio del gen lysC (NCBI N° de referencia NC 003450, Ncgl0247), y, basándose en esta secuencia, se sintetizaron dos pares de cebadores (Tabla 1 , SEC ID N° 1-4) para sustituir el codón de inicio GTG con ATG.
Se llevó a cabo PCR usando ADN cromosómico de KCCM11016P como un molde y cebadores de la siguiente Tabla 1. Se usó la ADN polimerasa de Alta Fidelidad PfuUltra™ (Stratagene) como una polimerasa, y se realizó PCR con 30 ciclos de desnaturalización a 96 °C durante 30 segundos; hibridación a 55 °C durante 30 segundos; y polimerización a 72 °C durante 30 segundos. Se clonaron dos fragmentos de ADN obtenidos de este modo en el vector pDZ tratado con enzima de restricción Xbal usando un kit de clonación de PCR In-Fusion (Clontech), y finalmente, se construyó un vector recombinante pDZ-lysC(ATG). (2) Preparación de la cepa El vector pDZ-lysC(ATG) construido de este modo se transformó en KCCM110106P por un procedimiento de pulsos electricos (mediante el uso del procedimiento de transformación de acuerdo con Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545), y después se seleccionaron cepas, en las que se insertó el gen en el cromosoma por recombinación homologa, en un medio de selección que contenía 25 mg/l de kanamicina. La inserción cromosómica exitosa del vector se confirmó por el color azul de las colonias en un medio sólido que contenía X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-(p-D-galactósido)). La cepa con la primera inserción cromosómica se cultivó en agitación (30 °C, 8 horas) en un medio nutriente. Después, la cepa cultivada se diluyó en serie de 10-4 a 1010, y el cultivo diluido se sembró en placas en un medio sólido que contenía X-gal. La mayoría de las colonias mostraron color azul, mientras que también existían colonias blancas a un nivel bajo. Seleccionando las colonias blancas, se seleccionaron las cepas en las que la secuencia de nucleótidos en la región de codón de inicio de lysC estaba sustituida mediante un segundo cruce. La sustitución de nucleótidos del codón de inicio en la cepa seleccionada se confirmó finalmente por PCR usando los cebadores de SEC ID N°: 1 y 4 y después analizando la secuencia de nucleótidos del sitio diana.
[Tabla 1] Ejemplo 2: Construcción del vector recombinante (pDz-tkt(AGT)) que tiene el codón de inicio ATG sustituido en tkt derivado de Corvnebacterium glutamicum y Preparación de una cepa que tiene el codón de inicio sustituido Hay dos codones que se espera que sean un codón de inicio en la secuencia del gen tkt. Basándose en la distancia del RBS (sitio de unión ribosómico) y la proteómica, se determinó el codón cadena abajo como el codón de inicio en la presente invención. (1) Construcción del vector recombinante pDZ-tkt (ATG) Para adquirir el gen tkt derivado de Corynebacterium glutamicum, se usó ADN cromosómico de KCCM11016P como un molde. Basándose en el genbank en los Institutos Nacionales de la Salud de Estados Unidos (NIH GenBank), se adquirió una secuencia de nucleótidos (SEC ID N°: 14) que contenía la región del codón de inicio del gen tkt (NCBI N° de referencia NC_003450, Ncgl1512), y, basándose en esta secuencia, se sintetizaron dos pares de cebadores (Tabla 2, SEC ID N°: 5-8) para sustituir el codón de inicio TTG con ATG.
Se llevó a cabo PCR usando ADN cromosómico de KCCM11016P como un molde y cebadores de la siguiente Tabla 2 en las condiciones del Ejemplo 1-1. Se clonaron dos fragmentos de ADN obtenidos de este modo en el vector pDZ tratado con la enzima de restricción Xbal usando un kit de clonación de PCR In-Fusion (Clontech) y finalmente, se construyó un vector recombinante pDZ-tkt (ATG). (2) Preparación de una cepa El vector pDZ-tkt (ATG) construido de este modo se transformó en la cepa productora lisina KCCM11016P de la misma manera que en el Ejemplo 1-2, y se obtuvo KCCM11016P-tkt, en el que el codón de inicio de tkt en el cromosoma se sustituyó con ATG mediante un segundo cruce. La sustitución de nucleótidos del codón de inicio del gen se confirmó finalmente por PCR usando los cebadores de SEC ID N°: 5 y 8 y analizando despues la secuencia de nucleótidos del sitio diana.
[Tabla 2] Ejemplo 3: Construcción del vector recombinante (PDZ-PVC ) que tiene el codón de inicio ATG sustituido en pyc derivado de Corvnebacteríum qlutamicum y Preparación de una cepa que tiene el codón de inicio sustituido (1) Construcción del vector recombinante pDZ-pyc(ATG) Para adquirir el gen pyc derivado de Corynebacterium glutamicum, se usó el ADN cromosómico de KCCM11016P como un molde. Basándose en el genbank en los Institutos Nacionales de la Salud de Estados Unidos (NIH GenBank), se adquirió una secuencia de nucleótidos (SEC ID N°: 15) que contenía la región del codón de inicio del gen pyc (NCBI N° de referencia NC_003450, Ncgl0659), y basándose en esta secuencia, se sintetizaron dos pares de cebadores (Tabla 3, SEC ID N°: 9-12) para sustituir el codón de inicio GTG con ATG.
Se llevó a cabo PCR usando ADN cromosómico de KCCM11016P como un molde y cebadores de la siguiente Tabla 3 en las condiciones del Ejemplo 1-1. Se clonaron dos fragmentos de ADN obtenidos de este modo en el vector pDZ tratado con la enzima de restricción Xbal usando un kit de clonación de PCR In-Fusion (Clontech) y finalmente, se construyó un vector recombinante pDZ-pyc (ATG). (2) Preparación de una cepa El vector pDZ-pyc (ATG) construido de este modo se transformó en la cepa productora de sina KCCM11016P de la misma manera que en el Ejemplo 1-2, y se obtuvo KCCM11016P-pyc, en el que el codón de inicio de pyc en el cromosoma se sustituyó con ATG mediante un segundo cruce. La sustitución de nucleótidos del codón de inicio del gen se confirmó finalmente por PCR usando los cebadores de SEC ID N°: 9 y 12 y analizando después la secuencia de nucleótidos del sitio diana.
[Tabla 3] Ejemplo 4: Medición de la actividad enzimática de aspartato qumase en la cepa que tiene el codón de inicio ATG sustituido en el gen IvsC Las celulas en la fase exponencial se seleccionaron por centrifugación (5.000 rpm, 15 minutos) y se lavaron tres veces con tampón Tris.HCI 0,1 % (pH 8,0), y después se suspendieron en el mismo tampón para una turbidez a 610 nm de 160. Las células se rompieron durante 6 minutos usando una batidora de perlas después de añadir perlas de vidrio a 1,25 g/1,5 mi de la suspensión. El sobrenadante se recogió por centrifugación (15.000 rpm, 20 minutos), y se midió cuantitativamente con respecto a contenido de proteínas por un procedimiento de Bradford (Bradford, M.M 1976. Anal. Biochem. 72:248-254) y se usó como una solución de proteína en bruto para medir la actividad enzimática de aspartato quinasa (LysC). Para cuantificar la actividad enzimática de LysC, se añadieron aproximadamente 0,05 mi de la solución de proteína en bruto a una solución de reacción que contenía Tris.HCI 0,1 M (pH 8,0), cloruro de magnesio (MgCI2) 0,01 M, hidroxilamina.HCI 0,6 M (pH 7,0), ATP 4 mM y aspartato 0,2 M para iniciar la reacción. Se permitió que la mezcla reaccionara a 30 °C durante 30 minutos, y se añadió una solución de parada (FeCI2 10 %, TCA 3,3 %, HCI N 0,7) para terminar la reacción. El sobrenadante se recogió por centrifugación, y se midió la absorbancia a 540 nm. La unidad (U) de la actividad enzimática LysC se definió como nmol del hidroxamato de aspartato producidos por 1 mg de proteína durante 1 minuto.
Se observó que la cepa KCCM11016P-lysC tenía una actividad LysC 2,73 veces superior a la de la cepa parental KCCM11016P (Tabla 4).
[Tabla 4] Actividad enzimática de LysC Ejemplo 5: Medición de la actividad enzimática de transcetolasa en la cepa que tiene el codón de inicio ATG sustituido en el gen tkt Las celulas en la fase exponencial se recogieron por centrifugación (5.000 rpm, 15 minutos) y se lavaron tres veces con tampón Tris.HCI 0,1 % (pH 7,5), y después se suspendieron en el mismo tampón para una turbidez a 610 nm de 160. Las células se rompieron durante 6 minutos usando una batidora de perlas después de añadirse perlas de vidrio a 1,25 g/1,5 mi de la suspensión. El sobrenadante se recogió por centrifugación (15.000 rpm, 20 minutos), y se midió cuantitativamente con respecto a contenido de proteínas por un procedimiento de Bradford y se usó como una solución de proteína en bruto para medir la actividad enzimática de transcetolasa (Tkt). Para cuantificar la actividad enzimática de Tkt, se añadió la solución de proteína en bruto a una solución de reacción que contenía Tris.HCI 0,1 M (pH 7,5), D-R5P 10 mM, D-Xu5P 2 mM, ThDP 10 mM, MgCI2 1,2 mM, NADH 100 mM, 1 unidad de triosafosfato isomerasa, 1 unidad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa por 1 mi para iniciar la reacción. Se dejó que la mezcla reaccionara a 30 °C durante 20-30 minutos, y se midió la absorbancia a 340 nm. La unidad (U) de la actividad enzimática Tkt se definió como la cantidad (mg) de la enzima que cataliza la producción de 1 mhtioI de gliceraldehído 3-fosfato durante 1 minuto, y la actividad específica se definió como unidades/mg (Biochem.J. (2004)382, 759-767).
Se observó que la cepa KCCM11016P-tkt tenía una actividad tkt 3,5 veces superior a la de la cepa parental KCCM11016P (Tabla 5).
[Tabla 5] Actividad enzimática de Tkt Ejemplo 6: Medición de la actividad enzimática de piruvato carboxilasa en la cepa que tiene el codón de inicio ATG sustituido en el gen ove Se recogieron las celulas en la fase exponencial por centrifugación (5.000 rpm, 15 minutos) y se lavaron dos veces con tampón Tris.HCI 50 mM (pH 6,3), que contenía cloruro sódico 50 mM (NaCI), y después se suspendieron en tampón HEPES 100 mM (pH 7,5) que contenía glicerol al 20 %. Se añadió CTAB a la suspensión a una concentración de 0,3 %, y se dejó en hielo durante 1 minuto. Las células se recogieron por centrifugaron (5.000 rpm, 10 minutos) y después se suspendieron en tampón Tris.HCI 100 mM (pH 7,3). El contenido de proteína se midió de forma cuantitativa por un procedimiento de Bradford y se usó como una solución de proteína en bruto para medir la actividad enzimática de piruvato carboxilasa (Pyc). Para cuantificar la actividad enzimática de Pyc, se añadió la solución de proteína en bruto a una solución de reacción que contenía NaHCO3 25 mM, MgC 5 mM, piruvato 3 mM y ATP 4 mM para iniciar la reacción. Se dejó que la mezcla reaccionara a 30 °C durante 1,5 minutos, y se añadieron 80 mI de una solución de parada (ácido o-fosfórico 30 %) para terminar la reacción. El sobrenadante se recogió por centrifugación (12.000 rpm, 15 min, 4 °C). Se añadieron 50 mI del sobrenadante, Tris.HCI 150 mM (pH 7,8), NADH 150 mM y 2,5 U de lactato deshidrogenasa por 1 mi y se midió la absorbancia a 340 nm a 37 °C. La unidad (U) de la actividad enzimática Pyc se definió como nmol de lactato producidos por 1 mg de proteína durante 1 minuto.
Se observó que la cepa KCCM11016P-pyc tenía una actividad Pyc 1,89 veces superior a la de la cepa parental KCCM11016P (Tabla 6).
[Tabla 6] Actividad enzimática de Pyc Ejemplo 7: Desarrollo de cepas derivadas de KCCM11016P que tienen los codones de inicio ATG sustituidos en dos o más genes de los genes IvsC . tkt y PVC Como los vectores recombinantes, se usaron pDZ-lysC(ATG), pDZ-tkt(ATG), pDZ-pyc(ATG) preparados en los Ejemplos 1, 2 y 3 y el procedimiento de preparación es el siguiente.
El vector pDZ-tkt(ATG) se transformó en KCCM11016P-lysC del Ejemplo 1, en el que el codón de inicio GTG de lysC estaba sustituido con ATG, y mediante un segundo cruce, los codones de inicio de lysC y tkt en el cromosoma se sustituyeron con ATG para obtener KCCM11016P-lysC-tkt. La sustitución de nucleótidos del codón de inicio del gen se confirmó finalmente por PCR usando los cebadores de SEC ID N° 5 y 8 y despues analizando la secuencia de nucleótidos del sitio de diana.
De la misma manera que en el Ejemplo 1, el vector pDZ-pyc(ATG) se transformó en KCCM11016P-lysC del Ejemplo 1, en el que el codón de inicio GTG de lysC se sustituyó con ATG, y mediante un segundo cruce, los codones de inicio de lysC y pyc en el cromosoma se sustituyeron con ATG para obtener KCCM11016P-lysC-pyc. La sustitución de nucleótidos del codón de inicio del gen se confirmó finalmente por PCR usando los cebadores de SEC ID N° 9 y 12 y después analizando la secuencia de nucleótidos del sitio de diana.
El vector pDZ-tkt(ATG) se transformó en KCCM11016P-lysC-pyc del presente Ejemplo, en el que el codón de inicio GTG de lysC y pyc se sustituyó con ATG, y mediante un segundo cruce, los codones de inicio de lysC, pyc y tkt en el cromosoma se sustituyeron con ATG para obtener KCCM11016P-lysC-pyc-tkt. La sustitución de nucleótidos del codón de inicio del gen se confirmó finalmente por PCR usando los cebadores de SEC ID N° 5 y 8 y después analizando la secuencia de nucleótidos del sitio de diana.
Las combinaciones anteriores de los genes son para fines ilustrativos solamente, y no se pretende que el alcance de las combinaciones de genes se limite a las mismas.
Ejemplo 8: Producción de sina en la cepa que tiene el codón de inicio ATG sustituido Se cultivaron KCCM11016P-lysC, KCCM11016P-tkt, KCCM11016P-pyc, KCCM 11016P-lysC-tkt, KCCM 11016P-lysC-pyc, KCCM11016P-lysC-pyc-tkt preparadas finalmente en los Ejemplos 1, 2, 3 y 7 para producción de L-lisina por el siguiente procedimiento.
Se inoculó la cepa parental KCCM11016P y KCCM11016P-lysC, KCCM1 1016P-tkt, KCCM11016P-pyc, KCCM11016P-lysC-tkt, KCCM11016P-lysC-pyc, KCCM11016P-lysC-pyc-tkt en matraces con deflectores en esquina de 250 mi respectivos que contenían 25 mi del medio de siembra descrito posteriormente, y el resultante se cultivó a 30 °C con agitación a 200 rpm durante 20 horas. Se inoculó 1 mi del caldo de cultivo de siembra resultante en un matraz con deflectores en esquina de 250 mi que contenía 24 mi del medio de producción descrito posteriormente, y se cultivó a 30 °C con agitación (200 rpm) durante 120 horas.
Despues de completar el cultivo, se midió la cantidad de L-lisina producida por HPLC. Los resultados de medir L-lisina en los caldos de cultivo de KCCM11016P y KCCM1 1016P-lysC, KCCM11016P-tkt, KCCM 11016P-pyc, KCCM11016P-lysC-tkt, KCCM11016P-lysC-pyc, KCCM11016P-lysC-pyc-tkt se muestran en la siguiente Tabla 7.
[Tabla 7] Medio de siembra (pH 7,0) 20 g de azúcar sin procesar, 10 g de peptona, 5 g de extracto de levadura, 1 ,5 g de urea, 5 g de KH2P04, 8 g de K2HR04, 0,5 g de MgSO47 H2O, 100 mg de biotina, 1000 pg de tiamina-HCI, 2000 pg de pantotenato cálcico, 2000 pg de nicotinamida (en 1 litro de agua destilada).
Medio de producción (pH 7,0) 100 g de glucosa, 40 g de (NH )2S04, 2,5 g de proteína de soja, 5 g de sólidos de macerado de maíz, 3 g de urea, 1 g de KH2P04, 0,5 g de MgS047 H20, 100 pg de biotina, 1000 pg de tiamina-HCI, 2000 pg de pantotenato cálcico, 3000 pg de nicotinamida, 30 g de CaC03 (en 1 litro de agua destilada).
Como se muestra en la Tabla 7, se descubrió que Corynebacterium glutamicum KCCM1 1016P-lysC, KCCM11016P-tkt, KCCM11016P-pyc, KCCM11016P-lysC-tkt y KCCM11016P-lysC-pyc que tenían el codón de inicio ATG sustituido mostraban un aumento del 4-9 % en la productividad de L-lisina, en comparación con la cepa parental KCCM11016P. En particular, se descubrió que KCCM11016P-lysC-pyc-tkt en la que se habían introducido los tres genes mostraba un aumento en la productividad de L-lisina de hasta el 12 %, en comparación con la cepa parental KCCM1 1016P.
Eiemplo 9: Desarrollo de la cepa derivada de KFCC10750 que tiene los codones de inicio ATG sustituidos en los genes IvsC. tkt v o ve v comparación de la productividad de lisina Para examinar si la sustitución de los codones de inicio con ATG en los genes lysC, pyc y tkt tambien afecta a la productividad de lisina en otras cepas productoras de lisina que pertenecen a Corynebacteríum glutamicum, se introdujeron en la cepa productora de L-lisina Corynebacteríum glutamicum KFCC10750 (Patente coreana N° 10-0073610) los tres genes que mostraron el mejor efecto de aumento de la productividad de lisina en el Ejemplo 8 para preparar una cepa recombinante, que se denominó KFCC10750-lysC-pyc-tkt. La cepa se cultivó de la misma manera que en el Ejemplo 8, y se analizó la concentración de L-lisina (Tabla 8).
[Tabla 8] Como se muestra en la Tabla lysC-pyc-tkt con los tres genes introducidos mostró un aumento del 15 % en la productividad de lisina, en comparación con la cepa parental KFCC10750.
Ejemplo 10: Desarrollo de la cepa derivada de KCCM10770P que tiene los codones de inicio ATG sustituidos en los genes IvsC. tkt DVC V comparación de la productividad de lisina Se introdujeron en otra cepa productora de L-lisina Corynebacteríum glutamicum KCCM10770P (Patente coreana N° 10-0924065) los tres genes que mostraban el mejor efecto de aumento de la productividad de lisina en el Ejemplo 8 para preparar una cepa recombinante, que se denominó KCCM10770P-lysC-pyc-tkt. La cepa se cultivó de la misma manera que en el Ejemplo 8, y se analizó la concentración de L-lisina (Tabla 9).
[Tabla 9] Como se muestra en la Tabla 9, Corynebacteríum glutamicum KCCM10770-lysC-pyc-tkt con los tres genes introducidos mostró un aumento del 11 % en la productividad de lisina, en comparación con la cepa parental KCCM10770P.
Ejemplo 11: Desarrollo de la cepa derivada de CJ3P que tiene los codones de inicio ATG sustituidos en los genes IvsC. tkt DVC v comparación de la productividad de lisina Se introdujeron en otra cepa más productora de L-lisina Corynebacteríum glutamicum CJ3P (Binder y col. Genome Biology 2012, 13:R40) los tres genes que mostraban el mejor efecto de aumento de la productividad de lisina en el Ejemplo 8 para preparar una cepa recombinante, que se denominó CJ3P-lysC-pyc-tkt. La cepa se cultivó de la misma manera que en el Ejemplo 8, y se analizó la concentración de L-lisina (Tabla 10).
[Tabla 10] Como se muestra en la Tabla 10, Corynebacteríum glutamicum CJ3P-lysC-pyc-tkt con los tres genes introducidos mostró un aumento del 18 % en la productividad de lisina, en comparación con la cepa parental CJ3P.
Efecto de la invención La presente invención proporciona un microorganismo Corynebacteríum sp. que tiene productividad de L-lisina mejorada, en el que los codones de inicio de uno o más genes que codifican aspartato quinasa, transcetolasa o piruvato carboxilasa están sustituidos para potenciar las actividades de las enzimas correspondientes, en comparación con sus actividades endógenas en un microorganismo nativo.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un polinucleótido modificado que codifica aspartato quinasa (LysC), transcetolasa (Tkt) o piruvato carboxilasa (Pyc), caracterizado porque un codón de inicio del polinucleótido está sustituido con ATG.
2. El polinucleótido modificado de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el codón de inicio del polinucleótido que codifica aspartato quinasa (LysC) o piruvato carboxilasa (Pyc) es GTG y el codón de inicio del polinucleótido que codifica transcetolasa (Tkt) es TTG.
3. El polinucleótido modificado de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido modificado está representado por una secuencia de nucleótidos de SEC ID N° 16, 17 o 18.
4. Un vector caracterizado porque comprende uno o más polinucleótidos modificados seleccionados de los polinucleótidos modificados que codifican aspartato quinasa (LysC), transcetolasa (Tkt) y piruvato carboxilasa (Pyc), en el que un codón de inicio del polinucleótido está sustituido con ATG.
5. Un microorganismo modificado caracterizado porque tiene actividades potenciadas de una o más enzimas en comparación con actividades endógenas de las mismas, en el que las enzimas están seleccionadas de aspartato quinasa, transcetolasa y piruvato carboxilasa, y el codón de inicio de los polinucleótidos que codifican las enzimas está sustituido con ATG.
6. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque el microorganismo está transformado con el vector de la reivindicación 4.
7. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque el microorganismo es Corynebacteríum sp.
8. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque el microorganismo es Corynebacterium sp. Corynebacteríum glutamicum.
9. Un procedimiento para producir L-lisina, caracterizado porque comprende las etapas de cultivar el microorganismo tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8; y recuperar L-lisina del microorganismo cultivado o del caldo de cultivo.
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