JP2015500660A - Ｌ−リジン生産能を有する微生物を用いてｌ−リジンを生産する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、アスパラギン酸キナーゼ(aspartate kinase; EC: 2.7.2.4; LysC)、トランスケトラーゼ(transketolase; EC: 2.2.1.1; Tkt)、又はピルビン酸カルボキシラーゼ(pyruvate carboxylase; EC: 6.4.1.1; Pyc)をコードするそれぞれのポリヌクレオチドの開始コドンをＡＴＧに置換した変異型ポリヌクレオチド、それらを含むベクター、それらベクターにより形質転換された微生物、及びそれを用いてＬ−リジンを生産する方法に関する。
Description
本発明は、開始コドンをＡＴＧに置換した変異型ポリヌクレオチド、それらを含むベクター、それらのポリヌクレオチドを含む微生物、及びそれを用いてＬ−リジンを生産する方法に関する。
コリネバクテリウム(Corynebacterium)属微生物、特にコリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum)は、Ｌ−リジン生産に多く用いられるグラム陽性の微生物である。Ｌ−リジンは、動物飼料、人間の医薬品及び化粧品産業に使用されており、コリネバクテリウム属菌株を用いた発酵により生産されている。
従来、リジン生合成関連遺伝子が強化されたコリネバクテリウム属菌株及びそれを用いたＬ−リジンの生産方法が周知である。例えば、特許文献１には、ｌｙｓＥ遺伝子(リジン排出キャリア遺伝子)が強化され、ｄａｐＡ遺伝子、ｌｙｓＣ遺伝子、ｐｙｃ遺伝子及びｄａｐＢ遺伝子からなる群から選択される遺伝子がさらに導入されたコリネバクテリウムを培養してＬ−リジンを生産する方法が開示されている。
他の方法として、リジン生合成経路上の遺伝子を増幅する方法や、プロモーターを改変する方法が用いられてきた。例えば、特許文献２と特許文献３では、それぞれｄｄｈとｌｙｓＣ−ａｓｄオペロンのプロモーターを改良し、コリネバクテリウムに導入してＬ−リジンを生産する方法が開示されており、特許文献４では、リジン生合成経路遺伝子であるａｓｐＢ、ｌｙｓＣ、ａｓｄ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｌｙｓＡ、ｐｙｃを染色体内で２コピーに増幅してリジン生産効率を向上させる方法が開示されている。
一方、一般に染色体内の遺伝子の翻訳(translation)時にリボソームが認識して翻訳を開始する開始コドンはＡＴＧであり、遺伝子の開始コドンによって翻訳レベルが異なって調節されうるので、開始コドンの塩基配列はタンパク質活性調節において重要である。しかし、一般的な開始コドンであるＡＴＧとは異なり、コリネバクテリウムグルタミカム由来リジンの生合成関連遺伝子のうち、ｌｙｓＣとｐｙｃの開始コドンがＧＴＧであり、ペントースリン酸経路上に存在するｔｋｔの開始コドンがＴＴＧであることが確認された(非特許文献１)。
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本発明者らはリジン生産効率を向上させる方法を見出すために鋭意努力した結果、野生型であるｌｙｓＣ、ｔｋｔ及びｐｙｃ遺伝子の開始コドンをＡＴＧに置換することにより、アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ及びピルビン酸カルボキシラーゼの活性を内在的活性より増加させることができることを確認し、本発明を完成するに至った。
本発明の目的は、アスパラギン酸キナーゼ(aspartate kinase; EC: 2.7.2.4; 以下、ＬｙｓＣともいう)、トランスケトラーゼ(transketolase; EC: 2.2.1.1; 以下、Ｔｋｔともいう)、又はピルビン酸カルボキシラーゼ(pyruvate carboxylase; EC: 6.4.1.1; 以下、Ｐｙｃともいう)をコードするそれぞれのポリヌクレオチドの開始コドンをＡＴＧに置換した変異型ポリヌクレオチドを提供することである。
本発明の他の目的は、ＡＴＧに置換された開始コドンを有する、アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼをコードする変異型ポリヌクレオチドの少なくとも１つの変異型ポリヌクレオチドを含むベクターを提供することである。
さらに、本発明の他の目的は、前記酵素の少なくとも１つの酵素の活性が内在的活性より増加した微生物を提供することである。
さらに、本発明の他の目的は、微生物を培養する工程と、培養した微生物又は培養培地からＬ−リジンを回収する工程とを含む、Ｌ−リジンを生産する方法を提供することである。
本発明によれば、アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする各遺伝子、又は様々な組み合わせを含む全遺伝子の開始コドンを置換することにより、当該酵素の活性が天然微生物の内在的活性より増加し、Ｌ−リジンの生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物を提供することができる。
本発明の一態様は、アスパラギン酸キナーゼ(aspartate kinase; EC: 2.7.2.4; 以下、ＬｙｓＣともいう)、トランスケトラーゼ(transketolase; EC: 2.2.1.1; 以下、Ｔｋｔともいう)、又はピルビン酸カルボキシラーゼ(pyruvate carboxylase; EC: 6.4.1.1; 以下、Ｐｙｃともいう)をコードするそれぞれのポリヌクレオチドの開始コドンをＡＴＧに置換した変異型ポリヌクレオチドを提供する。
前記アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼをコードするそれぞれのポリヌクレオチドは、それぞれの酵素活性を有するものであれば、一部のヌクレオチドが置換、欠失、挿入及び付加されたものも含まれ、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％の相同性を有する。
本発明における「相同性(homologous)」とは、野生型のｌｙｓＣ遺伝子、ｔｋｔ遺伝子及びｐｙｃ遺伝子と、それらに対応する変異型遺伝子であって、一部のヌクレオチドが置換、欠失、挿入及び付加されたｌｙｓＣ遺伝子、ｔｋｔ遺伝子及びｐｙｃ遺伝子との核酸配列の同一性の程度を示すものである。
本発明における「開始コドン(initiation codon)」とは、ｍＲＮＡ(messenger RNA)のコード配列がタンパク質に翻訳される際の翻訳開始点に該当する３つのヌクレオチドを意味する。一般に微生物の染色体上で見られる開始コドンとしては、ＡＴＧ(ｍＲＮＡ上ではＡＵＧ)、ＧＴＧ(ｍＲＮＡ上ではＧＵＧ)、及びＴＴＧ(ｍＲＮＡ上ではＵＵＧ)があり、コリネバクテリウムグルタミカムの全ゲノム塩基配列の分析結果によれば、これらはそれぞれ６２．５％〜６６．５％、２３．１％〜２４．３％、及び１０．３％〜１３．２％の割合で存在することが分かる(非特許文献２)。
さらに、現在までに報告されているコリネバクテリウム由来のリジン生合成関連遺伝子のうちｌｙｓＣとｐｙｃはＧＴＧを開始コドンとして用い、ｔｋｔはＴＴＧを開始コドンとして用いる。すなわち、前記遺伝子はＡＴＧを開始コドンとして用いず、これはコリネバクテリウム固有の特徴とみなされる。
本発明による変異型ポリヌクレオチドは、前記ｌｙｓＣ、ｔｋｔ又はｐｙｃ遺伝子の開始コドンがＡＴＧに置換されたことを特徴とし、この開始コドンが置換された変異型ポリヌクレオチドは、本発明者らにより最初に見出されたものである。より具体的には、本発明により前記アスパラギン酸キナーゼ(ＬｙｓＣ)及びピルビン酸カルボキシラーゼ(Ｐｙｃ)をコードするポリヌクレオチドの開始コドンはＧＴＧからＡＴＧに置換され、前記トランスケトラーゼ(Ｔｋｔ)をコードするポリヌクレオチドの開始コドンはＴＴＧからＡＴＧに置換される。より好ましくは、前記ｌｙｓＣ、ｔｋｔ、ｐｙｃの遺伝子配列がそれぞれ配列番号１３、１４、１５である場合、開始コドンがＡＴＧに置換された遺伝子配列はそれぞれ配列番号１６、１７、１８である。
開始コドンの塩基置換は、当業界で公知の任意の方法、例えば、部位特異的突然変異(site-specific mutagenesis)、相同組換えにより行われるが、これらに限定されるものではない。
本発明の他の態様は、ＡＴＧに置換された開始コドンを有する、アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼをコードする変異型ポリヌクレオチドの少なくとも１つの変異型ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
本発明のベクターに含まれるＡＴＧに置換された開始コドンを有する、アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼをコードする変異型ポリヌクレオチドは、それぞれの酵素活性を有するものであれば、遺伝子の一部のヌクレオチドが置換、欠失、挿入及び付加されたものも含まれ、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％の相同性を有する。
また、本発明のベクターに含まれるＡＴＧに置換された開始コドンを有する、アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼをコードする変異型ポリヌクレオチドは、ＡＴＧに置換された開始コドンが含まれるものであれば、アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子の一部のみを含むものも含まれる。
本発明における「ベクター」とは、好適な宿主内で標的遺伝子を発現させることができるように、好適な調節配列に作動可能に連結された遺伝子の塩基配列を含有するＤＮＡ産物を意味する。前記調節配列は、転写を開始しうるプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列を含む。本発明において用いられるベクターは、宿主内で複製可能なものであれば特に限定されるものではなく、当業界で公知の任意のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ粒子、又は単に潜在的ゲノム挿入物であってもよく、好ましくは、ｐＤＺ(特許文献４)を用いることができるが、これらに限定されるものではない。ベクターは好適な宿主内に形質転換された後、宿主ゲノムに関係なく複製又は機能することができ、ゲノム自体に組み込まれてもよい。
具体的には、ｌｙｓＣ、ｔｋｔ又はｐｙｃ遺伝子のうち、開始コドン部位を含む塩基配列(それぞれ配列番号１３、１４及び１５)を確保し、それに基づいて開始コドンがＡＴＧに置換されたプライマーを合成した。このプライマーを用いて、Ｌ−リジン生産菌株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、一方の末端がＡＴＧに置換されたＤＮＡが得られた。得られたＤＮＡ断片をベクターにクローニングすることにより、最終的に組換えベクターが得られた。より具体的には、本発明において、それぞれベクターｐＤＺ−ｌｙｓＣ(ＡＴＧ)、ｐＤＺ−ｔｋｔ(ＡＴＧ)及びｐＤＺ−ｐｙｃ(ＡＴＧ)を作製した。
本発明のさらに他の態様は、ＡＴＧに置換された開始コドンを有する、アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素をコードする変異型ポリヌクレオチドを含み、これらから転写されたｍＲＮＡのタンパク質への翻訳レベルが向上した結果として、前記酵素の少なくとも１つの酵素の活性が内在的活性より増加した微生物を提供する。本発明の微生物は、ＡＴＧに置換された開始コドンを有する、アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼをコードする変異型ポリヌクレオチドを用いて、それぞれ１種、２種又は３種の組み合わせにより当該酵素の活性が増加した形態であってもよい。
微生物の染色体上で標的遺伝子の開始コドンをＡＴＧに置換するために、当業界で公知の様々な方法を用いることができる。例えば、微生物に内在するｌｙｓＣ、ｔｋｔ及びｐｙｃの開始コドン配列を染色体上に置換することができ、他の方法としては、開始コドン配列が置換された当該遺伝子をプラスミドの形態で微生物内に導入することもできる。
前記微生物には、Ｌ−リジン生産能を有する微生物であればあらゆるものが含まれるが、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属微生物であることが好ましく、例えば前記コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属微生物としては、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウムサーモアミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes)ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９、ブレビバクテリウムフラバム(Brevibacterium flavum)ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウムラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)ＡＴＣＣ１３８６９が挙げられる。また、これらから作製されたＬ−リジン生産突然変異体又は菌株、例えば、コリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ(前記微生物はＫＦＣＣ１０８８１で公開されたが、ブダペスト条約上の国際寄託機関に再寄託されてＫＣＣＭ１１０１６Ｐの寄託番号が与えられた；特許文献５，特許文献６)、コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１１００１が含まれ、最も好ましくは、受託番号ＫＣＣＭ１１０１６Ｐのコリネバクテリウムグルタミカムである。
具体的には、受託番号ＫＣＣＭ１１０１６Ｐのコリネバクテリウムグルタミカムを、それぞれＡＴＧに置換された開始コドンを有する、アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換することにより組換えコリネバクテリウムグルタミカムが得られ、より具体的には、受託番号ＫＣＣＭ１１０１６ＰのコリネバクテリウムグルタミカムにそれぞれベクターｐＤＺ−ｌｙｓＣ(ＡＴＧ)、ｐＤＺ−ｔｋｔ(ＡＴＧ)又はｐＤＺ−ｐｙｃ(ＡＴＧ)を導入することにより組換えコリネバクテリウムグルタミカムが得られた。
また、ＡＴＧに置換された開始コドンを有する、アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドの組み合わせにより２つ以上のポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換してもよい。具体的には、ＡＴＧに置換された開始コドンを有するトランスケトラーゼをコードする遺伝子を含むベクターであるｐＤＺ−ｔｋｔ(ＡＴＧ)ベクターを、ｌｙｓＣの開始コドンがＧＴＧからＡＴＧに置換されたコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣに形質転換し、２次交差過程を経ることによって、染色体上でｌｙｓＣとｔｋｔの開始コドンがＡＴＧに置換されたコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｔｋｔが得ることができた。また、ＡＴＧに置換された開始コドンを有するピルビン酸カルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターであるｐＤＺ−ｐｙｃ(ＡＴＧ)ベクターを、ｌｙｓＣの開始コドンがＧＴＧからＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣに形質転換し、２次交差過程を経ることにより、染色体上でｌｙｓＣとｐｙｃの開始コドンがＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃが得られた。また、ｐＤＺ−ｔｋｔ(ＡＴＧ)ベクターを、前記作製されたｌｙｓＣとｐｙｃの開始コドンがＧＴＧからＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃに形質転換し、２次交差過程を経ることにより、染色体上でｌｙｓＣ、ｐｙｃ及びｔｋｔの開始コドンがＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔが得られた。同様に、ＫＦＣＣ１０７５０(特許文献７)、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ(特許文献４)、ＣＪ３Ｐ(非特許文献３)のコリネバクテリウムグルタミカム属に属する他のリジン生産菌株においても、同様の方法でｌｙｓＣ、ｐｙｃ及びｔｋｔの開始コドンをＡＴＧに置換できることが確認された。これらの結果は、本発明の変異型ポリヌクレオチドが様々なコリネバクテリウム属菌株に安定して導入されてＬ−リジン生産量を増加させることができることを裏付けるものである。
特に、アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ及びピルビン酸カルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターｐＤＺ−ｌｙｓＣ(ＡＴＧ)、ｐＤＺ−ｔｋｔ(ＡＴＧ)及びｐＤＺ−ｐｙｃ(ＡＴＧ)をコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐに導入して得た形質転換体ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔをコリネバクテリウムグルタミカムＣＡ０１−２０５９と命名し、２０１１年５月２日付けでブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター(Korean Culture center of Microorganisms, 以下、「ＫＣＣＭ」略称する)に受託番号ＫＣＣＭ１１１８８Ｐとして寄託した。すなわち、前記寄託は、ブダペスト条約に基づいて国際寄託機関に寄託されたものである。
本発明による微生物は、前述したように野生型の開始コドンがそれぞれＡＴＧに置換されたことを特徴とし、それによりｌｙｓＣ、ｔｋｔ及びｐｙｃ遺伝子から転写された各ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳レベルが大幅に増加した結果、アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ及びピルビン酸カルボキシラーゼの酵素活性が野生型酵素の内在的活性より増加したことを特徴とする。
本発明における「内在的活性」とは、微生物が天然状態で有する酵素の活性状態を意味し、例えば、コリネバクテリウム属微生物が天然に有する、アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼの酵素活性を意味する。「内在的活性の増加」とは、天然状態の酵素活性に比べて活性がさらに向上したことを意味する。
具体的には、ｌｙｓＣ遺伝子の開始コドンがＡＴＧに置換された菌株が示すアスパラギン酸キナーゼ酵素活性を親菌株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐと比較した結果、２．７３倍増加したアスパラギン酸キナーゼ活性を示すことが確認された(表４)。また、ｔｋｔ遺伝子の開始コドンがＡＴＧに置換された菌株が示すトランスケトラーゼ酵素活性を親菌株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐと比較した結果、３．５倍増加したトランスケトラーゼ活性を示すことが確認された(表５)。また、ｐｙｃ遺伝子の開始コドンがＡＴＧに置換された菌株が示すピルビン酸カルボキシラーゼ活性を親菌株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐと比較した結果、１．８９倍増加したピルビン酸カルボキシラーゼ活性を示すことが確認された(表６)。
アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ又はその組み合わせの活性を増加させることにより、微生物のＬ−リジン生産性が向上する。
本発明において、具体的にＬ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｔｋｔ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｙｃ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｔｋｔ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔから生産されたＬ−リジン生産量を測定した結果、親菌株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐと比較して著しく向上したＬ−リジン生産量を示すことが分かった(表７)。同様に、ｌｙｓＣ、ｐｙｃ及びｔｋｔの開始コドンがＡＴＧに置換された、ＫＦＣＣ１０７５０(特許文献７)、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ(特許文献４)、ＣＪ３Ｐ(非特許文献３)のコリネバクテリウムグルタミカム属に属する他のリジン生産菌株においても、親菌株と比較して著しく向上したＬ−リジン生産量を示すことが分かった(表８〜１０)。このような結果は、染色体上でＡＴＧに変異した開始コドンを有するＬｙｓＣ、Ｔｋｔ、Ｐｙｃをコードする変異型ポリヌクレオチドをそれぞれ１種類ずつ保有する微生物、ＬｙｓＣ及びＴｋｔ、ＬｙｓＣ及びＰｙｃ、Ｔｋｔ及びＰｙｃをコードする変異型ポリヌクレオチドをそれぞれ２種類ずつ保有する微生物、ＬｙｓＣ、Ｔｋｔ及びＰｙｃをコードする変異型ポリヌクレオチドを３種類全て保有する微生物が野生型のＧＴＧ又はＴＴＧ開始コドンを有する微生物より著しく向上したＬ−リジン生産効率を示すことを裏付けるものである。
本発明のさらに他の態様は、前述した微生物を培養する工程と、培養した微生物又は培養培地からＬ−リジンを回収する工程とを含む、Ｌ−リジンを生産する方法を提供する。
前記培養は、微生物を用いてＬ−リジンを培養する当業界で周知の様々な方法を用いることができる。前記培養は、周知の方法で行うことができ、培養温度、培養時間、培地のｐＨなどの条件は適宜調節することができる。これら周知の培養方法は、非特許文献４及び５に詳細に記述されている。また、培養方法にはバッチ培養(batch culture)、連続培養(continuous culture)及び流加培養(fed-batch culture)が含まれ、好ましくは、バッチプロセス又は流加もしくは反復流加プロセス(fed batch or repeated fed batch process)で連続して培養することができるが 、これらに限定されるものではない。
培養に用いられる培地は、好適な方法で特定菌株の条件を満たさなければならない。コリネバクテリウム属微生物の培養培地は公知である(例えば、非特許文献６)。用いることのできる糖源としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースなどの糖及び炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナッツ油などの油脂、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸などの脂肪酸、グリセリン、エタノールなどのアルコール、酢酸などの有機酸が挙げられる。これらの物質は、単独で用いることもでき、混合物として用いることもできる。用いることのできる窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆ミール及び尿素、又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが挙げられる。窒素源は、単独で用いることもでき、混合物として用いることもできる。用いることのできるリン源としては、リン酸二水素カリウム又はリン酸水素二カリウム、若しくはそれらに相当するナトリウム含有塩が挙げられる。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウム又は硫酸鉄などの金属塩を含有しなければならない。前記物質以外にも、アミノ酸及びビタミンなどの必須成長物質が含まれてもよい。また、培養培地に好適な前駆体が用いられてもよい。前述した原料は、培養過程において培養物に好適な方法でバッチ式又は連続的に添加されてもよい。
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような塩化合物、又はリン酸、硫酸のような酸化合物を好適な方法で用いて培養物のｐＨを調節することができる。また、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。好気状態を保持するために、培養物内に酸素又は酸素含有気体(例えば、空気)を注入する。培養物の温度は、通常２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃である。培養は、Ｌ−リジンの所望の生成量が最大限に得られるまで続ける。このような目的で、通常１０〜１６０時間で達成される。Ｌ−リジンは、培養培地中に排出されるか、微生物中に含まれている場合もある。
また、本発明のＬ−リジンを生産する方法は、培養した微生物又は培養培地からＬ−リジンを回収する工程を含む。微生物又は培養培地からＬ−リジンを回収する方法は当業界で周知である。前記Ｌ−リジン回収方法には、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
発明を実施するための形態
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に示すものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に示すものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
本実施例においては、リジン生産菌株のコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐに由来するアスパラギン酸キナーゼの遺伝子ｌｙｓＣ、トランスケトラーゼの遺伝子ｔｋｔ、及びピルビン酸カルボキシラーゼの遺伝子ｐｙｃの開始コドンをＧＴＧ又はＴＴＧからＡＴＧに置換するための組換えベクターを作製した。前記ベクターをコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株に形質転換して染色体上の開始コドンが置換された菌株を得ることにより、リジン生産効率が増加した菌株を作製した。
本発明において用いるコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株は、コリネバクテリウムグルタミカム野生株(ＡＴＣＣ１３０３２)を親菌株として人工変異法により作製された、Ｓ−(２−アミノエチル)システイン(AEC)に対する耐性及びホモセリン流出(homoserine leaky)の特徴を有する菌株である(ＫＦＣＣ１０８８１で公開された。特許文献５、６参照)。また、ＫＦＣＣ１０７５０菌株は、人工変異法により作製されたホモセリン栄養要求性と、Ｌ−ロイシン類似体である４−アザロイシン及び抗生剤の一種であるリファンピシンに対する耐性とを有するコリネバクテリウムグルタミカムＬ−リジン生産菌株であり(特許文献７)、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ菌株は、リジン生合成経路構成遺伝子のうち６種を染色体上に２コピーずつ保有する、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ由来のＬ−リジン生産菌株であり(特許文献４)、ＣＪ３Ｐ菌株は、Ｂｉｎｄｅｒらにより報告された技術(非特許文献３)に基づいて、野生株のｐｙｃ、ｈｏｍ、ｌｙｓＣ遺伝子３種にそれぞれＰ４５８Ｓ、Ｖ５９Ａ、Ｔ３１１Ｉ変異を導入してＬ−リジン生産能を付与したコリネバクテリウムグルタミカム菌株である。
実施例１：コリネバクテリウムグルタミカム由来ｌｙｓＣの開始コドンがＡＴＧに置換された組換えベクター(ｐＤＺ−ｌｙｓＣ(ＡＴＧ))の作製、及び開始コドン置換菌株の作製
組換えベクターは、ｐＤＺ(特許文献４参照)を基本ベクターとして用いた。作製過程は次の通りである。
組換えベクターは、ｐＤＺ(特許文献４参照)を基本ベクターとして用いた。作製過程は次の通りである。
(１)ｐＤＺ−ｌｙｓＣ(ＡＴＧ)組換えベクターの作製
コリネバクテリウムグルタミカム由来ｌｙｓＣ遺伝子を確保するために、人工変異法により作製されたリジン生産菌株(コリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ)の染色体ＤＮＡを鋳型として用いた。米国国立保健研究所の遺伝子バンク(NIH GenBank)に基づいてｌｙｓＣ遺伝子(ＮＣＢＩ登録番号ＮＣ＿００３４５０，Ｎｃｇｌ０２４７)の開始コドン部位を含む塩基配列を確保し(配列番号１３)、これに基づいて開始コドンをＧＴＧからＡＴＧに置換するための２対のプライマー(表１，配列番号１〜４)を合成した。
コリネバクテリウムグルタミカム由来ｌｙｓＣ遺伝子を確保するために、人工変異法により作製されたリジン生産菌株(コリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ)の染色体ＤＮＡを鋳型として用いた。米国国立保健研究所の遺伝子バンク(NIH GenBank)に基づいてｌｙｓＣ遺伝子(ＮＣＢＩ登録番号ＮＣ＿００３４５０，Ｎｃｇｌ０２４７)の開始コドン部位を含む塩基配列を確保し(配列番号１３)、これに基づいて開始コドンをＧＴＧからＡＴＧに置換するための２対のプライマー(表１，配列番号１〜４)を合成した。
ＫＣＣＭ１１０１６Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型とし、下記表１のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ポリメラーゼにはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイファイＤＮＡポリメラーゼ(Stratagene社)を用いた。ＰＣＲ条件は、９６℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の重合反応を３０サイクル繰り返した。こうして得られた２つのＤＮＡ断片を、制限酵素ＸｂａＩで処理したｐＤＺベクターにＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ クローニングキット(Clontech社)でクローニングすることにより、最終的にｐＤＺ−ｌｙｓＣ(ＡＴＧ)組換えベクターを作製した。
(２)菌株の作製
作製したｐＤＺ−ｌｙｓＣ(ＡＴＧ)ベクターをＫＣＣＭ１１０１６Ｐに電気パルス法で形質転換し(非特許文献７による形質転換法を用いる)、その後カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する選択培地で染色体上の同遺伝子との相同性に基づいて挿入された菌株を選択した。ベクターの染色体挿入が成功したか否かは、Ｘ−ｇａｌ(５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド)を含む固体培地で青色を示すか否かにより確認することができる。染色体が１次挿入された菌株を栄養培地で振盪培養(３０℃，８時間)し、その後それぞれ１０−４から１０−１０に希釈し、Ｘ−ｇａｌを含む固体培地に塗抹した。ほとんどのコロニーが青色を示すのに対して、低い割合で出現する白色のコロニーを選択することにより、２次交差(crossover)によりｌｙｓＣの開始コドン部位の塩基配列が置換された菌株を選択した。選択した菌株の開始コドンの塩基置換が行われたか否かは、配列番号１及び４のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後標的部位の塩基配列分析過程を経て最終確認した。
作製したｐＤＺ−ｌｙｓＣ(ＡＴＧ)ベクターをＫＣＣＭ１１０１６Ｐに電気パルス法で形質転換し(非特許文献７による形質転換法を用いる)、その後カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する選択培地で染色体上の同遺伝子との相同性に基づいて挿入された菌株を選択した。ベクターの染色体挿入が成功したか否かは、Ｘ−ｇａｌ(５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド)を含む固体培地で青色を示すか否かにより確認することができる。染色体が１次挿入された菌株を栄養培地で振盪培養(３０℃，８時間)し、その後それぞれ１０−４から１０−１０に希釈し、Ｘ−ｇａｌを含む固体培地に塗抹した。ほとんどのコロニーが青色を示すのに対して、低い割合で出現する白色のコロニーを選択することにより、２次交差(crossover)によりｌｙｓＣの開始コドン部位の塩基配列が置換された菌株を選択した。選択した菌株の開始コドンの塩基置換が行われたか否かは、配列番号１及び４のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後標的部位の塩基配列分析過程を経て最終確認した。
実施例２：コリネバクテリウムグルタミカム由来ｔｋｔの開始コドンがＡＴＧに置換された組換えベクター(ｐＤＺ−ｔｋｔ(ＡＴＧ))の作製、及び開始コドン置換菌株の作製
ｔｋｔ遺伝子は配列上に開始コドンと予想される２つのコドンが存在するが、ＲＢＳ(リポゾーム結合部位)との距離プロテオミクス(proteomics)の結果とに基づいて、本発明においては下流に存在するコドンを開始コドンとした。
ｔｋｔ遺伝子は配列上に開始コドンと予想される２つのコドンが存在するが、ＲＢＳ(リポゾーム結合部位)との距離プロテオミクス(proteomics)の結果とに基づいて、本発明においては下流に存在するコドンを開始コドンとした。
(１)ｐＤＺ−ｔｋｔ(ＡＴＧ)組換えベクターの作製
コリネバクテリウムグルタミカム由来ｔｋｔ遺伝子を確保するために、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型として用いた。米国国立保健研究所のジェンバンク(NIH GenBank)に基づいてｔｋｔ遺伝子(ＮＣＢＩ登録番号ＮＣ＿００３４５０，Ｎｃｇｌ１５１２)の開始コドン部位を含む塩基配列を確保し(配列番号１４)、これに基づいて開始コドンをＴＴＧからＡＴＧに置換するための２対のプライマー(表２，配列番号５〜８)を合成した。
コリネバクテリウムグルタミカム由来ｔｋｔ遺伝子を確保するために、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型として用いた。米国国立保健研究所のジェンバンク(NIH GenBank)に基づいてｔｋｔ遺伝子(ＮＣＢＩ登録番号ＮＣ＿００３４５０，Ｎｃｇｌ１５１２)の開始コドン部位を含む塩基配列を確保し(配列番号１４)、これに基づいて開始コドンをＴＴＧからＡＴＧに置換するための２対のプライマー(表２，配列番号５〜８)を合成した。
ＫＣＣＭ１１０１６Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型とし、下記表２のプライマーを用いて実施例１−１の条件でＰＣＲを行った。こうして得られた２つのＤＮＡ断片を、制限酵素ＸｂａＩで処理したｐＤＺベクターにＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ クローニングキット(Clontech社)でクローニングすることにより、最終的にｐＤＺ−ｔｋｔ(ＡＴＧ)組換えベクターを作製した。
(２)菌株の作製
作製したｐＤＺ−ｔｋｔ(ＡＴＧ)ベクターを実施例１−２と同じ過程でリジン生産菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐに形質転換し、２次交差過程を経て染色体上でｔｋｔの開始コドンがＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｔｋｔを得た。遺伝子の開始コドンの塩基置換が行われた否かは、配列番号５及び８のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後標的部位の塩基配列分析により最終確認した。
作製したｐＤＺ−ｔｋｔ(ＡＴＧ)ベクターを実施例１−２と同じ過程でリジン生産菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐに形質転換し、２次交差過程を経て染色体上でｔｋｔの開始コドンがＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｔｋｔを得た。遺伝子の開始コドンの塩基置換が行われた否かは、配列番号５及び８のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後標的部位の塩基配列分析により最終確認した。
実施例３：コリネバクテリウムグルタミカム由来ｐｙｃの開始コドンがＡＴＧに置換された組換えベクター(ｐＤＺ−ｐｙｃ(ＡＴＧ))の作製、及び開始コドン置換菌株の作製
(１)ｐＤＺ−ｐｙｃ(ＡＴＧ)組換えベクターの作製
コリネバクテリウムグルタミカム由来ｐｙｃ遺伝子を確保するために、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型として用いた。米国国立保健研究所のジェンバンクに基づいてｐｙｃ遺伝子(ＮＣＢＩ登録番号ＮＣ＿００３４５０，Ｎｃｇｌ０６５９)の開始コドン部位を含む塩基配列を確保し(配列番号１５)、これに基づいて開始コドンをＧＴＧからＡＴＧに置換するための２対のプライマー(表３，配列番号９〜１２)を合成した。
(１)ｐＤＺ−ｐｙｃ(ＡＴＧ)組換えベクターの作製
コリネバクテリウムグルタミカム由来ｐｙｃ遺伝子を確保するために、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型として用いた。米国国立保健研究所のジェンバンクに基づいてｐｙｃ遺伝子(ＮＣＢＩ登録番号ＮＣ＿００３４５０，Ｎｃｇｌ０６５９)の開始コドン部位を含む塩基配列を確保し(配列番号１５)、これに基づいて開始コドンをＧＴＧからＡＴＧに置換するための２対のプライマー(表３，配列番号９〜１２)を合成した。
ＫＣＣＭ１１０１６Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型とし、下記表３のプライマーを用いて実施例１−１の条件でＰＣＲを行った。こうして得られた２つのＤＮＡ断片を、制限酵素ＸｂａＩで処理したｐＤＺベクターにＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ クローニングキット(Clontech社)でクローニングすることにより、最終的にｐＤＺ−ｐｙｃ(ＡＴＧ)組換えベクターを作製した。
(２)菌株の作製
作製したｐＤＺ−ｐｙｃ(ＡＴＧ)ベクターを実施例１−２と同じ過程でリジン生産菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐに形質転換し、２次交差過程を経て染色体上でｐｙｃの開始コドンがＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｙｃを得た。遺伝子の開始コドンの塩基置換が行われたか否かは、配列番号９及び１２のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後標的部位の塩基配列分析により最終確認した。
作製したｐＤＺ−ｐｙｃ(ＡＴＧ)ベクターを実施例１−２と同じ過程でリジン生産菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐに形質転換し、２次交差過程を経て染色体上でｐｙｃの開始コドンがＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｙｃを得た。遺伝子の開始コドンの塩基置換が行われたか否かは、配列番号９及び１２のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後標的部位の塩基配列分析により最終確認した。
実施例４：ｌｙｓＣ遺伝子の開始コドンがＡＴＧに置換された菌株におけるアスパラギン酸キナーゼ酵素活性の測定
対数期の菌体を遠心分離(５，０００ｒｐｍ，１５分)により回収し、０．１％Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ(ｐＨ８．０)緩衝液で３回洗浄し、その後同緩衝液で６１０ｎｍの濁度が１６０程度になるように懸濁した。懸濁液１．５ｍｌ当たり１．２５ｇのガラスビーズ(glass bead)を添加し、その後ビーズ式粉砕機(bead beater)を用いて６分間菌体を破砕した。遠心分離(１５，０００ｒｐｍ，２０分)により上清を回収し、ブラッドフォード方法(非特許文献８)によりタンパク質濃度を定量し、その後アスパラギン酸キナーゼ(ＬｙｓＣ)酵素活性の測定のための粗タンパク質溶液として用いた。ＬｙｓＣ酵素活性の測定は、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ(ｐＨ８．０)、０．０１Ｍ塩化マグネシウム(ＭｇＣｌ２)、０．６Ｍ塩酸ヒドロキシルアミン(Hydroxylamine.HCl)(ｐＨ７．０)、４ｍＭ ＡＴＰ、０．２Ｍアスパラギン酸塩(Aspartate)を含む反応液に０．０５ｍｌの粗タンパク質溶液を添加することにより反応を開始した。３０℃で３０分間反応させ、その後停止液(stop solution)(１０％ＦｅＣｌ２，３．３％ＴＣＡ，０．７Ｎ ＨＣｌ)を添加して反応を終了させ、遠心分離により上清を回収し、５４０ｎｍで吸光度を測定した。ＬｙｓＣ酵素活性単位(Ｕ)は、１分間に１ｍｇのタンパク質を生成するアスパラギン酸塩ヒドロキサメートのｎｍｏｌｅと定義した。
対数期の菌体を遠心分離(５，０００ｒｐｍ，１５分)により回収し、０．１％Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ(ｐＨ８．０)緩衝液で３回洗浄し、その後同緩衝液で６１０ｎｍの濁度が１６０程度になるように懸濁した。懸濁液１．５ｍｌ当たり１．２５ｇのガラスビーズ(glass bead)を添加し、その後ビーズ式粉砕機(bead beater)を用いて６分間菌体を破砕した。遠心分離(１５，０００ｒｐｍ，２０分)により上清を回収し、ブラッドフォード方法(非特許文献８)によりタンパク質濃度を定量し、その後アスパラギン酸キナーゼ(ＬｙｓＣ)酵素活性の測定のための粗タンパク質溶液として用いた。ＬｙｓＣ酵素活性の測定は、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ(ｐＨ８．０)、０．０１Ｍ塩化マグネシウム(ＭｇＣｌ２)、０．６Ｍ塩酸ヒドロキシルアミン(Hydroxylamine.HCl)(ｐＨ７．０)、４ｍＭ ＡＴＰ、０．２Ｍアスパラギン酸塩(Aspartate)を含む反応液に０．０５ｍｌの粗タンパク質溶液を添加することにより反応を開始した。３０℃で３０分間反応させ、その後停止液(stop solution)(１０％ＦｅＣｌ２，３．３％ＴＣＡ，０．７Ｎ ＨＣｌ)を添加して反応を終了させ、遠心分離により上清を回収し、５４０ｎｍで吸光度を測定した。ＬｙｓＣ酵素活性単位(Ｕ)は、１分間に１ｍｇのタンパク質を生成するアスパラギン酸塩ヒドロキサメートのｎｍｏｌｅと定義した。
ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ菌株が示すＬｙｓＣ活性を親菌株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐと比較した結果、２．７３倍増加したＬｙｓＣ活性を示すことが確認された(表４)。
実施例５：ｔｋｔ遺伝子の開始コドンがＡＴＧに置換された菌株におけるトランスケトラーゼ酵素活性の測定
対数期の菌体を遠心分離(５，０００ｒｐｍ，１５分)により回収し、０．１％Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ(ｐＨ７．５)緩衝液で３回洗浄し、その後同緩衝液で６１０ｎｍの濁度が１６０程度になるように懸濁した。懸濁液１．５ｍｌ当たり１．２５ｇのガラスビーズを添加し、その後ビーズ式粉砕機を用いて６分間菌体を破砕した。遠心分離(１５，０００ｒｐｍ，２０分)により上清を回収し、ブラッドフォード方法によりタンパク質濃度を定量し、その後トランスケトラーゼ(Ｔｋｔ)酵素活性の測定のための粗タンパク質溶液として用いた。Ｔｋｔ酵素活性の測定は、１ｍｌ当たり０．１Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１０ｍＭ Ｄ−Ｒ５Ｐ、２ｍＭ Ｄ−Ｘｕ５Ｐ、１０μＭ ＴｈＤＰ、１．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭ ＮＡＤＨ、１ｕｎｉｔトリオースリン酸イソメラーゼ(triosephosphate isomerase)、１ｕｎｉｔグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)を含む反応液に粗タンパク質溶液を添加することにより反応を開始した。３０℃で２０〜３０分間反応させ、３４０ｎｍで吸光度を測定した。Ｔｋｔ酵素活性単位(Ｕ)は、１分間に１μｍｏｌのグリセルアルデヒド３−リン酸(glyceraldehyde 3-phosphate)の形成を促進する酵素の量(ｍｇ)と定義し、比活性度(specific activity)はｕｎｉｔｓ／ｍｇと定義した(非特許文献９)。
対数期の菌体を遠心分離(５，０００ｒｐｍ，１５分)により回収し、０．１％Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ(ｐＨ７．５)緩衝液で３回洗浄し、その後同緩衝液で６１０ｎｍの濁度が１６０程度になるように懸濁した。懸濁液１．５ｍｌ当たり１．２５ｇのガラスビーズを添加し、その後ビーズ式粉砕機を用いて６分間菌体を破砕した。遠心分離(１５，０００ｒｐｍ，２０分)により上清を回収し、ブラッドフォード方法によりタンパク質濃度を定量し、その後トランスケトラーゼ(Ｔｋｔ)酵素活性の測定のための粗タンパク質溶液として用いた。Ｔｋｔ酵素活性の測定は、１ｍｌ当たり０．１Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１０ｍＭ Ｄ−Ｒ５Ｐ、２ｍＭ Ｄ−Ｘｕ５Ｐ、１０μＭ ＴｈＤＰ、１．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭ ＮＡＤＨ、１ｕｎｉｔトリオースリン酸イソメラーゼ(triosephosphate isomerase)、１ｕｎｉｔグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)を含む反応液に粗タンパク質溶液を添加することにより反応を開始した。３０℃で２０〜３０分間反応させ、３４０ｎｍで吸光度を測定した。Ｔｋｔ酵素活性単位(Ｕ)は、１分間に１μｍｏｌのグリセルアルデヒド３−リン酸(glyceraldehyde 3-phosphate)の形成を促進する酵素の量(ｍｇ)と定義し、比活性度(specific activity)はｕｎｉｔｓ／ｍｇと定義した(非特許文献９)。
ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｔｋｔ菌株が示すＴｋｔ活性を親菌株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐと比較した結果、３．５倍増加したＴｋｔ活性を示すことが確認された(表５)。
実施例６：ｐｙｃ遺伝子の開始コドンがＡＴＧに置換された菌株におけるピルビン酸カルボキシラーゼ酵素活性の測定
対数期の菌体を遠心分離(５，０００ｒｐｍ，１５分)により回収し、５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ(ｐＨ６．３)緩衝液で２回洗浄し、その後２０％グリセリンを含む１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ(ｐＨ７．５)緩衝液で懸濁した。懸濁液にＣＴＡＢを０．３％となるように添加し、その後氷中に１分間放置した。菌体を遠心分離(５，０００ｒｐｍ，１０分)により回収し、その後１００ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ(ｐＨ７．３)緩衝液で懸濁した。ブラッドフォード方法によりタンパク質濃度を定量し、その後ピルビン酸カルボキシラーゼ(Ｐｙｃ)酵素活性の測定のための粗タンパク質溶液として用いた。Ｐｙｃ酵素活性の測定は、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、３ｍＭピルビン酸塩、４ｍＭ ＡＴＰを含む反応液に粗タンパク質を添加することにより反応を開始した。３０℃で１．５分間反応させ、その後８０μｌの停止液(30% ο-リン酸)を添加して反応を終了させ、遠心分離(１２，０００ｒｐｍ，１５分，４℃)により上清を回収した。１ｍｌ当たり５０μｌの上清、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ(ｐＨ７．８)、１５０μＭ ＮＡＤＨ、２．５Ｕ乳酸デヒドロゲナーゼ(lactate dehydrogenase)を添加し、その後３７℃、３４０ｎｍで吸光度を測定した。Ｐｙｃ酵素活性単位(Ｕ)は、１分間に１ｍｇのタンパク質を生成する乳酸塩のｎｍｏｌｅと定義した。
対数期の菌体を遠心分離(５，０００ｒｐｍ，１５分)により回収し、５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ(ｐＨ６．３)緩衝液で２回洗浄し、その後２０％グリセリンを含む１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ(ｐＨ７．５)緩衝液で懸濁した。懸濁液にＣＴＡＢを０．３％となるように添加し、その後氷中に１分間放置した。菌体を遠心分離(５，０００ｒｐｍ，１０分)により回収し、その後１００ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ(ｐＨ７．３)緩衝液で懸濁した。ブラッドフォード方法によりタンパク質濃度を定量し、その後ピルビン酸カルボキシラーゼ(Ｐｙｃ)酵素活性の測定のための粗タンパク質溶液として用いた。Ｐｙｃ酵素活性の測定は、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、３ｍＭピルビン酸塩、４ｍＭ ＡＴＰを含む反応液に粗タンパク質を添加することにより反応を開始した。３０℃で１．５分間反応させ、その後８０μｌの停止液(30% ο-リン酸)を添加して反応を終了させ、遠心分離(１２，０００ｒｐｍ，１５分，４℃)により上清を回収した。１ｍｌ当たり５０μｌの上清、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ(ｐＨ７．８)、１５０μＭ ＮＡＤＨ、２．５Ｕ乳酸デヒドロゲナーゼ(lactate dehydrogenase)を添加し、その後３７℃、３４０ｎｍで吸光度を測定した。Ｐｙｃ酵素活性単位(Ｕ)は、１分間に１ｍｇのタンパク質を生成する乳酸塩のｎｍｏｌｅと定義した。
ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｙｃ菌株が示すＰｙｃ活性を親菌株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐと比較した結果、１．８９倍増加したＰｙｃ活性を示すことが確認された(表６)。
実施例７：ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ由来ｌｙｓＣ、ｔｋｔ、ｐｙｃ遺伝子のうち組み合わせにより少なくとも２つの遺伝子の開始コドンがＡＴＧに置換された菌株の開発
組換えベクターは、実施例１、２、３で作製したｐＤＺ−ｌｙｓＣ(ＡＴＧ)、ｐＤＺ−ｔｋｔ(ＡＴＧ)、ｐＤＺ−ｐｙｃ(ＡＴＧ)を用いた。作製過程は次の通りである。
組換えベクターは、実施例１、２、３で作製したｐＤＺ−ｌｙｓＣ(ＡＴＧ)、ｐＤＺ−ｔｋｔ(ＡＴＧ)、ｐＤＺ−ｐｙｃ(ＡＴＧ)を用いた。作製過程は次の通りである。
ｐＤＺ−ｔｋｔ(ＡＴＧ)ベクターを、実施例１で作製した、ｌｙｓＣの開始コドンがＧＴＧからＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣに形質転換し、２次交差過程を経て染色体上でｌｙｓＣとｔｋｔの開始コドンがＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｔｋｔを得た。遺伝子の開始コドンの塩基置換が行われたか否かは、配列番号５及び８のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後標的部位の塩基配列分析により最終確認した。
実施例１と同じ過程でｐＤＺ−ｐｙｃ(ＡＴＧ)ベクターを、実施例１で作製した、ｌｙｓＣの開始コドンがＧＴＧからＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣに形質転換し、２次交差過程を経て染色体上でｌｙｓＣとｐｙｃの開始コドンがＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃを得た。遺伝子の開始コドンの塩基置換が行われた否かは、配列番号９及び１２のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後標的部位の塩基配列分析により最終確認した。
ｐＤＺ−ｔｋｔ(ＡＴＧ)ベクターを、本実施例で作製した、ｌｙｓＣとｐｙｃの開始コドンがＧＴＧからＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃに形質転換し、２次交差過程を経て染色体上でｌｙｓＣ、ｐｙｃ及びｔｋｔの開始コドンがＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔを得た。遺伝子の開始コドンの塩基置換が行われたか否かは、配列番号５及び８のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後標的部位の塩基配列分析により最終確認した。
前述した遺伝子の組み合わせは例示的に示すものであり、遺伝子の組み合わせの範囲がこれらに限定されるものではない。
実施例８：開始コドンＡＴＧ置換菌株におけるリジンの生産
実施例１、２、３、７で最終的に作製したＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｔｋｔ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｙｃ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｔｋｔ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔをＬ−リジンの生産のために下記の方法で培養した。
実施例１、２、３、７で最終的に作製したＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｔｋｔ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｙｃ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｔｋｔ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔをＬ−リジンの生産のために下記の方法で培養した。
下記の種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのバッフル付三角フラスコに親菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｔｋｔ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｙｃ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｔｋｔ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔを接種し、３０℃で２０時間(２００ｒｐｍ)振盪培養した。下記の生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのバッフル付三角フラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃で１２０時間(２００ｒｐｍ)振盪培養した。
培養終了後に、ＨＰＬＣを用いた方法によりＬ−リジンの生産量を測定した。ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｔｋｔ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｙｃ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｔｋｔ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔに対する培養液中のＬ−リジンの生産量の結果は下記表７の通りである。
種培地(ｐＨ７．０)
原糖２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ(蒸留水１リットル中)
原糖２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ(蒸留水１リットル中)
生産培地(ｐＨ７．０)
ブドウ糖１００ｇ，(ＮＨ４)２ＳＯ４ ４０ｇ，大豆タンパク質２．５ｇ，コーンスティープソリッド(Corn Steep Solids)５ｇ，尿素３ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ(蒸留水１リットル中)
ブドウ糖１００ｇ，(ＮＨ４)２ＳＯ４ ４０ｇ，大豆タンパク質２．５ｇ，コーンスティープソリッド(Corn Steep Solids)５ｇ，尿素３ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ(蒸留水１リットル中)
上記表７に示すように、開始コドンがＡＴＧに置換されたコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｔｋｔ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｙｃ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｔｋｔ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃは、親菌株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐに比べて、Ｌ−リジン生産が４〜９％増加したことが確認され、特に、３種の形質が全て導入されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔは、親菌株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐに比べて、Ｌ−リジン生産が実に１２％も増加したことが確認された。
実施例９：ｌｙｓＣ、ｔｋｔ、ｐｙｃ遺伝子の開始コドンがＡＴＧに置換されたＫＦＣＣ１０７５０由来菌株の開発、及びリジン生産能の比較
コリネバクテリウムグルタミカムに属する他のリジン生産菌株においても、ｌｙｓＣ、ｐｙｃ、ｔｋｔ遺伝子の開始コドンをＡＴＧに置換した場合にリジン生産能増加効果があるかを確認するために、Ｌ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０７５０(特許文献７)に、実施例８で最も優れたリジン生産能増加効果を示した３種の形質を全て導入した組換え菌株を作製し、ＫＦＣＣ１０７５０−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔと命名した。実施例８と同様の方法で培養し、そのＬ−リジン濃度を分析した(表８)。
コリネバクテリウムグルタミカムに属する他のリジン生産菌株においても、ｌｙｓＣ、ｐｙｃ、ｔｋｔ遺伝子の開始コドンをＡＴＧに置換した場合にリジン生産能増加効果があるかを確認するために、Ｌ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０７５０(特許文献７)に、実施例８で最も優れたリジン生産能増加効果を示した３種の形質を全て導入した組換え菌株を作製し、ＫＦＣＣ１０７５０−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔと命名した。実施例８と同様の方法で培養し、そのＬ−リジン濃度を分析した(表８)。
上記表８に示すように、３種の形質が全て導入されたコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０７５０−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔは、親菌株ＫＦＣＣ１０７５０に比べて、リジン生産が１５％増加した。
実施例１０：ｌｙｓＣ、ｔｋｔ、ｐｙｃ遺伝子の開始コドンがＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１０７７０Ｐ由来菌株の開発、及びリジン生産能の比較
他のＬ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ(特許文献４)に、実施例８で最も優れたリジン生産能増加効果を示した３種の形質を全て導入した組換え菌株を作製し、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔと命名した。実施例８と同様の方法で培養し、そのＬ−リジン濃度を分析した(表９)。
他のＬ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ(特許文献４)に、実施例８で最も優れたリジン生産能増加効果を示した３種の形質を全て導入した組換え菌株を作製し、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔと命名した。実施例８と同様の方法で培養し、そのＬ−リジン濃度を分析した(表９)。
上記表９に示すように、３種の形質が全て導入されたコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔは、親菌株ＫＣＣＭ１０７７０Ｐに比べて、リジン生産が１１％増加した。
実施例１１：ＣＪ３Ｐ由来ｌｙｓＣ、ｔｋｔ、ｐｙｃ遺伝子の開始コドンがＡＴＧに置換された菌株の開発、及びリジン生産能の比較
さらに他のＬ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミカムＣＪ３Ｐ(非特許文献３)に、実施例８で最も優れたリジン生産能増加効果を示した３種の形質を全て導入した組換え菌株を作製し、ＣＪ３Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔと命名した。実施例８と同様の方法で培養し、そのＬ−リジン濃度を分析した(表１０)。
さらに他のＬ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミカムＣＪ３Ｐ(非特許文献３)に、実施例８で最も優れたリジン生産能増加効果を示した３種の形質を全て導入した組換え菌株を作製し、ＣＪ３Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔと命名した。実施例８と同様の方法で培養し、そのＬ−リジン濃度を分析した(表１０)。
上記表１０に示すように、３種の形質が全て導入されたコリネバクテリウムグルタミカムＣＪ３Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔは、親菌株ＣＪ３Ｐに比べて、リジン生産が１８％以上増加した。
また、ＡＴＧに置換された開始コドンを有する、アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドの組み合わせにより２つ以上のポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換してもよい。具体的には、ＡＴＧに置換された開始コドンを有するトランスケトラーゼをコードする遺伝子を含むベクターであるｐＤＺ−ｔｋｔ(ＡＴＧ)ベクターを、ｌｙｓＣの開始コドンがＧＴＧからＡＴＧに置換されたコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣに形質転換し、２次交差過程を経ることによって、染色体上でｌｙｓＣとｔｋｔの開始コドンがＡＴＧに置換されたコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｔｋｔが得ることができた。また、ＡＴＧに置換された開始コドンを有するピルビン酸カルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターであるｐＤＺ−ｐｙｃ(ＡＴＧ)ベクターを、ｌｙｓＣの開始コドンがＧＴＧからＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣに形質転換し、２次交差過程を経ることにより、染色体上でｌｙｓＣとｐｙｃの開始コドンがＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃが得られた。また、ｐＤＺ−ｔｋｔ(ＡＴＧ)ベクターを、前記作製されたｌｙｓＣとｐｙｃの開始コドンがＧＴＧからＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃに形質転換し、２次交差過程を経ることにより、染色体上でｌｙｓＣ、ｐｙｃ及びｔｋｔの開始コドンがＡＴＧに置換されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣ−ｐｙｃ−ｔｋｔが得られた。同様に、ＫＦＣＣ１０７５０(前記微生物はＫＦＣＣ１０７５０で公開されたが、ブダペスト条約上の国際寄託機関に再寄託されてＫＣＣＭ１１３４７Ｐの寄託番号が与えられた；特許文献７)、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ(特許文献４)、ＣＪ３Ｐ(非特許文献３)のコリネバクテリウムグルタミカム属に属する他のリジン生産菌株においても、同様の方法でｌｙｓＣ、ｐｙｃ及びｔｋｔの開始コドンをＡＴＧに置換できることが確認された。これらの結果は、本発明の変異型ポリヌクレオチドが様々なコリネバクテリウム属菌株に安定して導入されてＬ−リジン生産量を増加させることができることを裏付けるものである。
Claims (9)
- アスパラギン酸キナーゼ(ＬｙｓＣ)、トランスケトラーゼ(Ｔｋｔ)、又はピルビン酸カルボキシラーゼ(Ｐｙｃ)をコードするそれぞれのポリヌクレオチドの開始コドンをＡＴＧに置換した変異型ポリヌクレオチド。
- 前記アスパラギン酸キナーゼ(ＬｙｓＣ)又はピルビン酸カルボキシラーゼ(Ｐｙｃ)をコードするポリヌクレオチドの開始コドンがＧＴＧであり、前記トランスケトラーゼ(Ｔｋｔ)をコードするポリヌクレオチドの開始コドンがＴＴＧである請求項１に記載の変異型ポリヌクレオチド。
- 前記変異型ポリヌクレオチドが、配列番号１６、１７又は１８の塩基配列で表される請求項１に記載の変異型ポリヌクレオチド。
- ＡＴＧに置換された開始コドンを有する、アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼをコードする変異型ポリヌクレオチドを少なくとも１つ含むベクター。
- ＡＴＧに置換された開始コドンを有する、アスパラギン酸キナーゼ、トランスケトラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼをコードする変異型ポリヌクレオチドを少なくとも１つ含むことにより、前記酵素の少なくとも１つの酵素の活性が内在的活性より増加した微生物。
- 前記微生物が、請求項４のベクターで形質転換された請求項５に記載の微生物。
- 前記微生物が、コリネバクテリウム属微生物である請求項５に記載の微生物。
- 前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum)である請求項７に記載の微生物。
- 請求項５〜８のいずれかによる微生物を培養する工程と、
前記培養した微生物又は培養培地からＬ−リジンを回収する工程とを含む、Ｌ−リジンを生産する方法。
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