JP2011520462A - L−リシン生産の方法 - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/32—Processes using, or culture media containing, lower alkanols, i.e. C1 to C6
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
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Abstract
【選択図】なし
Description
それゆえに、一態様においては、本発明は、B.メタノリカスにおいてL−リシンを生産させる方法であって、該方法は、該B.メタノリカスにおいてAKIII酵素を過剰発現することを含むものである。AKIII酵素は、yclM遺伝子にコードされるAK活性を有する酵素として定義されてもよい。
B.メタノリカス宿主細胞をランダムに変異させて、AKIIIを過剰発現する変異体を選択すること、または、内在性のAKIIIの過剰発現を達成する部位特異的 またはその他の突然変異導入によって、改良されたまたは変異した)B.メタノリカス宿主細胞を使用してもよい。本発明の方法は、一実施態様においては、外来的に導入されたAKIIIをコードする遺伝子、特にはyclM遺伝子を含むB.メタノリカス宿主細胞(すなわちAKIIIをコードする遺伝子で形質転換されたB.メタノリカス)を培養するか、または増殖させることを含んでいてもよい。
(たとえば、以下を参照。
Kunstら、1997、Nature、390、249-256(GenBankアクセッション番号:NC_000964)にて開示されるバシラス サブチルス亜種サブチルス菌株168のAKIII(配列番号:5);
Reyら、2004、Genome Biol.、5、R77(GenBankアクセッション番号:NC_006270)にて開示されるバシラス リチェニホルミスATCC 14580(DSM13)のAKIII(配列番号:6);
Takamiら、2000、Nucleic Acids Res.、28、4317−4331(GenBankアクセッション番号:NC_002570)にて開示されるバシラス ハロドランス C−125(配列番号:7);
Chen、ら、2007、Nat. Biotechnol.、25、1007−1014(GenBankアクセッション番号:CP000560)にて開示されるバシラス アミロリクファシエンス FZB42のAKIII(配列番号:8);または
Glaserら、2001、Science 294、849-852(GenBankアクセッション番号:AL596172)にて開示されるリステリア イノキュア Clipl 1262のAKIII(配列番号:9))。
上記にて言及されたGenBankアクセッション番号は、全ゲノムのためのものであることから、AKIII配列の関連物については、特に、AKIIIをコードするそれらの一部、すなわち、GenBankの寄託において含まれる配列を参照すべきことが留意されよう。
高いストリジェンシー条件(0.lxSSC、0.1%SDS、65℃、洗浄条件:2xSSC、0.1%SDS、65℃、次いで、0.lxSSC、0.1%SDS、65℃)の下で、配列番号3の相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列または配列番号3のヌクレオチド配列と縮重するヌクレオチド配列でコードされるAKIII、
(ii)配列番号4にて示されるアミノ酸配列の全てもしくは一部を含むAKIIIか、または、配列番号4のアミノ酸配列に対して少なくとも50%の配列同一性(特には、配列番号4に対して、55、60、65、70、75または80%の配列同一性)を有するアミノ酸配列のAKIII。
(i)配列番号3にて示されるヌクレオチド配列の全てもしくは一部でコードされるか、または配列番号3に対して少なくとも50%の同一性(特には、配列番号3に対して、少なくとも55、60、65、70または75%の配列同一性)を有するヌクレオチド でコードされるAKIII、または
高いストリジェンシー条件(0.lxSSC、0.1%SDS、65℃、洗浄条件:2xSSC、0.1%SDS、65℃、次いで、0.lxSSC、0.1%SDS、65℃)の下で、配列番号3の相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列または配列番号3のヌクレオチド配列と縮重するヌクレオチド配列でコードされるAKIIIであるか、
(ii)配列番号4にて示されるアミノ酸配列の全てもしくは一部を含むAKIIIまたは、配列番号4のアミノ酸配列に対して少なくとも50%の配列同一性(特には、配列番号4に対して、少なくとも55、60、65、70、75または80%の配列同一性)を有するアミノ酸配列の全てもしくは一部を含むAKIII。
(i)配列番号3にて示されるヌクレオチド配列;
(ii)配列番号3にて示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも50%の配列同一性、特には少なくとも、50、55、60、65、70、75、77、79、80、81、83、85、86、87、88、89、90、91、93、95、97、98または99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列;
(iii)高いストリジェントなハイブリダイゼーション条件(0.1×SSC、0.1% SDS、65℃および洗浄条件:2×SSC、0.1%SDS、65℃、次いで、0.1×SSC、0.1%SDS、65℃) 下、配列番号3の相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列
(iv)配列番号3のヌクレオチド配列と、縮合するヌクレオチド配列;
(v) 配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または配列番号4で示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも50%の配列同一性、好ましくは少なくとも、50、60、65、70、75、80、82、84、86、88、90、92、94、95、96、97、98または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列;
(vi)上記(i)、(ii)、(iv)または(v)のヌクレオチド配列の一部であるヌクレオチド配列。
既に開示のpBM19の配列(Brautasetら、(2004)、上記)由来の、glpX、fba、pfk、rpeプロモーター、既に開示のhps+phiオペロンの配列(Brautasetら、(2004)、上記)由来の、hpsプロモーター。バシラス属については一般的に、近接種(例:バシリ目)に由来する任意のプロモーターが使用されてもよい。B.メタノリカスおよびその他の微生物の両方において使用され得るその他の微生物に由来するプロモーターは、本技術分野において周知なものであり、文献において広く記載されている。
(i)配列番号1または3に示されるヌクレオチド配列、
(ii)配列番号1にて示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも80%の配列同一性、特には少なくとも82、84、86、88、90、92、94、95、96、97、98または99%の配列同一性を有する核酸配列、
(iii)配列番号3にて示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも75%の配列同一性、特には少なくとも77、79、80、81、83、85、86、87、88、89、90、91、93、95、97、98または99%の配列同一性を有する核酸配列、
(iv)0.1×SSC、0.1%SDS、65℃であるハイブリダイゼーション条件および2×SSC、0.1%SDSの洗浄条件、次いで、0.1×SSC、0.1%SDS、65℃(高いストリジェントな条件)の下、(i)の相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列、
(v)配列番号1または3のヌクレオチド配列と縮重するヌクレオチド配列、
(vi)配列番号1もしくは3のヌクレオチド配列の一部、または配列番号1もしくは3の配列と縮重するヌクレオチド配列の一部であるヌクレオチド配列
(vii)(i)〜(vi)の何れか1つのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、または該配列からなる、AK活性を有するポリペプチド(または蛋白質)をコードする核酸分子を、好ましくは単離された該核酸分子を提供する。
(i)アミノ酸配列が配列番号2または4で示されるポリペプチドの全てまたは一部をコードするヌクレオチド配列;
(ii)配列番号2で示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも92、93、94、95、96、97、98または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドの全てまたは一部をコードするヌクレオチド配列;
(iii)配列番号4で示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも80%の配列同一性、好ましくは、82、84、86、88、90、92、94、95、96、97、98または99%の配列同一性を有するポリペプチドを全てまたは一部をコードするヌクレオチド配列;および
(iv)(i)〜(iii)の何れか1つのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列;
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、または該配列からなる、AK活性を有するポリペプチド(または蛋白質)をコードする核酸分子を、好ましくは単離された該核酸分子を提供する。
(i)配列番号2または4で示されるアミノ酸配列の全てまたは一部;
(ii)配列番号2で示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも90%の配列同一性を、好ましくは少なくとも92、93、94、95、96、97、98または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列の全てまたは一部;、および
(iii)配列番号4で示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも90%の配列同一性を、好ましくは少なくとも82、84、86、88、90、92、94、95、96、97、98または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列の全てまたは一部;
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を含むか、または該配列からなる蛋白質(またはポリペプチド)を提供するものである。
プログラム:Align Plus 4、バージョン4.10(Sci Ed Central Clone Manager Professional Suite)
DNA対比:全体対比、標準線形スコアリングマトリックス、ミスマッチペナルティー=2、オープンギャップペナルティー=4、拡張ギャップペナルティー=1
アミノ酸対比:全体対比、BLOSUM 62 スコアリングマトリックス。
材料および方法
生物学的材料、DNA操作および増殖条件
本研究にて使用された菌株およびプラスミドを、表1にて列挙する。
Skjerdalら(1996 (Appl. Micro. Biotechnol. 44(5): 635-642)に従い、0.02M 酢酸Naおよび2%テトラヒドロフランを含み、pH5.9である緩衝液を用いてアミノ酸を定量した。既に開示されたように、簡易的に洗浄および溶解された細胞培養物におけるアミノ酸含量の定量 、細胞内容量の理論的な推定 および、実験的に決定されたOD600当たり2.2x108細胞/mlの変換係数に基づいて、細胞内のアミノ酸濃度の計量を実施した(Brautasetら、(2003) Appl. Environ. Microbiol. 69(7): 3986-3995)。また、アンモニアを、製造元の使用説明)に従って(試料を1:1000に希釈し、さらに分析前に1:10000に希釈した、Spectroquant Ammonium-Test Kit (Merck)で測定した。
B.リチェニホルミス、B.ハロドランス、B.セレウス、リステリア イノキュア、L.モノサイトゲンおよびB.サブチルスにおけるyclM、mlpA、asd、dapGおよびymfAのDNA配列(それぞれ、GenBankアクセッション番号AE017333、BA000004、NC_004722、AL592022、AL591824およびAL009126)に基づく縮重プライマーを用いて、B.メタノリカスMGA3全DNAから推定AKIコーディング遺伝子およびAKIIIコーディング遺伝子をPCR増幅した。プライマー対(表2)mlpA−PPS−1 Fをasd−PPS−1 Rととともに(3.9kbフラグメントを産生する。)およびasd−PPS−1FをymfA−PPS−1Rとともに(3.3kbフラグメントを産生する。)用いて、重複フラグメントとしてasd、dapGおよびdapAを包含するMGA3のDNAフラグメントをPCR増幅した。また、これらのフラグメントの配列をプライマーウォーキング法によって決定した。
プライマーmdh−CDS−F1 およびpTBl.9−R1を用いて、pTBl.9mdhLからメタノールデヒドロゲナーゼ(mdh)コーディング領域を含むDNAフラグメントAをPCR増幅した。また、推定mdhプロモーター領域を、プライマーmdh−prom−F1およびmdh−prom−R1を用いて同じテンプレートからPCR増幅し、DNAフラグメントBを調製した。pTBl.9mdhLをPstI およびBamHIで消化し、ベクターのバックボーンフラグメントを、BamHI/Pcil消化DNAフラグメントBおよびPcil/PstI 消化DNAフラグメントAとともにライゲートした。また、2つのフラグメントと同じようにベクターのPCR増幅によって、2つのPciI部位を得られたベクターから除いた。フラグメント1では、プライマーmp−mdh−P2−F1およびmp−mdh−P2−R2を使用し、フラグメント2では、プライマーmp−mdh−P2−F2およびmp−mdh−P2−Rlを使用した。該2つのフラグメントを、SphIおよびKpnIで末端消化しライゲートして、pTBl.9mp−mdhを調製した。該pTBl.9mp−mdhは、mdhの上流とコーディング領域との間において、mdhプロモーターへのコーディング領域の融合を簡易化させるためのPciI部位を保有する。このPciI部位の挿入によって、mdh開始コドンの上流の4つのヌクレオチドを、原型のAAGAからCATGへと変換させた。
Brautasetら(2004、上記)によって開示されたプロトコールに基づいて、粗細胞抽出物を調製した。すなわち、MeOH200培地で、対数増殖期(OD600=1.9〜2.1)までB.メタノリカス細胞を増殖させ、20mlの細胞培養物を遠心分離(3,200xg、10分、10℃)によって回収した。次いで、上清を捨て、20mlの高塩緩衝液(9倍濃度でのMeOH200培地の塩緩衝液、pH7.2)で細胞を再懸濁した。再懸濁された培養物3mlを遠心分離し(3,200xg、10分、10℃)、上清を捨てて、ペレットを凍結し、−20℃にて保存した。該細胞を、氷上にて解凍して、AKアッセイ緩衝液(50mM リン酸カリウム、10mM MgSO4、pH7.5)3mlにて再懸濁して、3分間、超音波で分解した(Branson Sonifier250、出力制御3、30%、負荷サイクル)。次いで、遠心分離(3,200xg、20分、4℃)によって、細胞残滓を除去し、上清を細胞抽出物として回収して、後の酵素活性および全細胞蛋白分析ために氷上にて保存した。ヒドロキシルアミンからのアスパルチルヒドロキサム酸の形成によって、AK活性を定量した(Blackら、(1955)上記)。該反応混合物は、400μlの反応緩衝液(0.5M Tris−HCI、2M KCI、pH8.0)、200μlのヒドロキシルアミン溶液(2Mヒドロキシルアミン、pH8.0)、100μlのAAM溶液(0.1M L−アスパラギン酸、0.1M ATP、0.1M MgCl2、0.2M Tris−HCl、pH8.0)およびAKアッセイ緩衝液中で希釈された300μlの試料を含んでいた。1mlのFe溶液(10%(w/v)FeCl3、0.7M HCl中の3%(v/v)トリクロロ酢酸、使用前に滅菌ろ過)の添加によって、反応を停止するまで、反応混合物を、50℃、20分インキュベートした。アスパラチルヒドロキサム酸の形成を、すぐに、分光光度計(Shimadzu、UVl700)を用いて、540nmで測定した。該試料をアスパラチルヒドロキサム酸の標準物で交換したアッセイを実施して、吸光度をアスパラチルヒドロキサム酸濃度に関連付けた。AK活性の一単位を、上記条件下において、1分あたりアスパラチルヒドロキサム酸1μmolを産生するのに必要な酵素量として定義した(Black ら、(1955)上記)。ウシ血清アルブミンを標準物として用いたBradford法(Bio−Rad)によって、蛋白濃度を定量した。AKアッセイを3回行って、各蛋白濃度の測定においては、4並列で行った。測定AK活性値および蛋白濃度の平均値および標準偏差に基づき、General Formula for Error Propagation (Taylor (1997) An introduction to error analysis: the study of uncertainties in physical measurements. University Science Books: Sausalito、カリフォルニア. Section 3.11)を用いて、比AK活性の不確定度 を算出した。
B.メタノリカスにおける推定AKIIIをコードするyclM
アミノ酸配列のアラインメントに基づいて、縮重プライマーのセットを設計し(材料および方法を参照)、MGA3の全DNAをテンプレートとして該縮重プライマーのセットを用いて2kbのDNAフラグメントをPCR増幅した。この方法を用いてMGA3の全DNAから、推定yclM遺伝子をPCR増幅できた。2012bpのDNAフラグメントの配列を決定し、予想されるコーディング領域および上流配列の605bpを含むことを見出した(図2)。yclM遺伝子産物の推定一次配列(455アミノ酸)は、アミノ酸基準で、B.リチェニホルミスAKIII(74%)に対して全体の中で 最も高い同一性を示し、B.サブチルス菌株168のAKIIIに対して71%の同一性を有しており、これ ついては、AK活性が実験的に実証されている(Kobashiら、(2001) Biosci. Biotechnol. Biochem.、65(6):1391-1394)。また、この遺伝子産物は、B.サブチルスのAKIとAKIIとの両方に対して、低い一次配列の同一性を有する(それぞれ、23%、25%)。同時に、これらのデータは、B.メタノリカスyclM遺伝子が、推定されるAKIIIアイソザイムをコードすることを示唆している。
我々は、mdhおよびE.コリ―B.メタノリカス間のシャトルベクターであるpHP13に基づく、メタノリカスにおける、簡略化された遺伝子の過剰発現のためのツールとして、カセット発現系を構築した(Brautasetら、(2004)上記;Jakobsenら、(2006)上記)。mdh開始コドンに部分的に重複する特異な 制限部位およびコーディング領域の下流にある特異な制限部位を挿入することによって、このカセット系は、mdhプロモーター領域およびリボソーム結合部位に、任意コーディング領域のインフレーム融合のための簡単なクローニングストラテジーを提供するものである。
実施例1の材料および方法の項にて記載されていない追加情報
DNA操作および培養条件
一般的なクローニング、PCR、DNAシークエンシングおよび発酵を、実施例1で既に記載されたように実施した。また、Jakobsenら(2006) J Bacteriol.、188(8): 3063-3072において開示されたように、2×Mann10に等しいMann20培地を用いて、マンニトールにおけるB.メタノリカスの増殖を行った。
L−リシンの測定を、実施例1にて説明されているようなHPLCを用いて実施した。
B.メタノリカス培養物を、回収する前に、後期対数期(OD600=3)まで増殖させた。RNA保護を含めた細胞溶解、全RNA単離および、それに付随するcDNA合成を、他の 文献に記載されているように実施した(Jakobsen ら、2006、上記)。全RNA濃度を、NanoDrop(登録商標)ND−1000分光光度計(NanoDrop Technologies)を用いて定量した。また、我々 は、コンピューターソフトウェアPrimer ExpressR v 2.0 (Applied Biosystems)を用いて、リアルタイムPCR試験のプライマーを設計した。以下のプロファイルの下、ABI 7500 System(Applied Biosystems)で、PCR産物の検出を実施した。プライマー効率の試験のために、反応混合物を、95℃、10分間インキュベートして、ホットスタート型Taqポリメラーゼを活性化し、2段階のPCRプロトコール(95℃、15秒の変性工程、次いで、60℃、1分の複合型のアニーリング−伸長工程(蛍光データの獲得 を伴う))に供した。この工程を40サイクル繰り返した。95℃で15秒、60℃で1分の後サイクルと、95℃15秒の最終段階とによって、解離温度の決定をした。リアルタイム定量PCRによる比較研究のために、プライマーの効率試験に使用されたこの工程にプロファイルを準拠させた。データの獲得および分析を、SYBRシグナルでの標準反応の下、Sequence Detectionソフトウェアーバージョン.1.2.3(Applied Biosystems Inc.)で実施した。
pTH1mp−lysC
プラスミドpHP13(Jakobsenら、2006、上記)をPciIで消化し、得られた粘着末端をT4DNAポリメラーゼを用いて平滑化し、該末端を再度ライゲートしてプラスミドpTH1を調製した。プラスミドpHP13mp−lysC(実施例1)をPstI/EcoRIで消化し、2.6kbフラグメントを単離し、pTH1の対応部位にライゲートして、発現ベクターpTH1mp−lysCをクローニングするカセットを調製した。このベクターは、プラスミドHP13mp−lysCに類似しており、強力なmdhプロモーターの下流域およびmdh rbs領域のインフレームにあるの任意のコーディング遺伝子を一段階でクローニングするための、特異なPciI部位を有する。
以下のプライマー対を用いて、B.メタノリカス全DNAからasd(1117bp)、dapA(904bp)およびlysA(1322bp)のコーディング領域を有するDNAフラグメントをPCR増幅した。
asd−F:5´−GCGCACATGTGGGTCAAGAAAATGGTCTTC−3´(配列番号:30)
asd−R:5´−ATGGTACCTGCCCCCGAATTTTTGAAC−3´(配列番号:31)
dapA−F:5´−GCGCACATGTGGTTTCATTTGGTCGAATATC−3´(配列番号:32)
dapA−R:5´−ATGGTACCGGCAGTAAAAACTCCATTGAT−3´(配列番号:33)
lysA−F:5´−GCGCACATGTGTATTTTCATGGCACAACA−3´(配列番号:34)
lysA−R:5´−ATGGTACCGCAGCTTAGTATCTTACTCT−3´(配列番号:35)
なお、PciIおよびKpnI制限部位は、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーにおいて下線で示されている。得られたPCR産物を、PciI/KpnIで末端消化し、pTH1mp−lysCの対応部位にライゲートし(lysC遺伝子を置換する)、発現ベクターpTH1mp−asd、pTH1mp−dapA、pTH1mp−lysAをそれぞれ調製した。全てのプラスミドにおけるインサートを、DNAシークエンシングによって検証した。
プラスミドpTH1mp−lysAをSpeI/NcoIで消化し、1.8kbフラグメントを精製し、XbaI/NcoIで消化されたpHP13mp−yclMにライゲートして、発現ベクターpHP13mp−yclM+lysAを調製した。
プラスミドpHP13mp−yclMをSpeI/NcoIで消化し、1.9kbフラグメントを精製し、pTH1mp−dapA XbaI/NcoI部位にライゲートして、発現ベクターpTHmp−dapA+yclMを調製した。
pHP13およびmdhプロモーター用いた、追加のB.メタノリカス遺伝子の過剰発現ならびにL−リシン生産における効果
発酵槽において試験された、3つの異なるAKコードディング遺伝子(dapG、lysC、およびyclM)の過剰発現および、MGA3(野生型B.メタノリカス)でのL−リシン生産における効果は、実施例1にて説明されている。更なる研究において振とうフラスコ中で、同じ発現系(つまり、mdhプロモーターを有するpHP13)を用いて、L−リシン生合成経路にて追加された遺伝子を過剰発現させた(表5)。単一の遺伝子から得られた全ての結果に基づいて、我々は、同一の発現系を用いて、組み合わされた2以上の過剰発現を有するベクターを構築し、MGA3におけるL−リシン生産レベルの追加的な効果を証明した(表5参照)。
− 全ての発現遺伝子は、図1に記載され、ベクター構築物は、「材料および方法」の項において与えられている。
− 全ての組換え遺伝子については、mdhプロモーター(mdhP)によって転写が駆動される。
− 全ての組換え型遺伝子は、mdhリボソーム結合部位の翻訳制御下にある。
− 振とうフラスコにおける生産量は、該系統を発酵器において試験した場合に比べて、低いが、相対的な効果は同程度である。
糖類系増殖培地におけるL−リシン生産
我々は、マンニトール培地中における増殖でのL−リシン生産を、実施例3に記載の組換え菌株で、たとえば、lysAを過剰発現するMGA3(pTH1mp−lysA)で試験し、この結果は、メタノール培地において得られた類似データに比べて、これらの条件下では、生産レベルが同等か、さらに一層高いということを明確に示している(表5参照)。マンニトール培地およびメタノール培地の組成は、C源を除いては、同一である。
MeOH200:Jakobsenら(2006)(上記)にて開示されている。
Mann20:Jakobsenら(2006)(上記)にて開示されている2×Mann10に相当する。
Claims (22)
- B.メタノリカスにおいてL−リシンを生産する方法であって、該B.メタノリカスにおいてAKIII酵素を過剰発現することを含む方法。
- AKIII酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が、B.メタノリカスに導入されている、請求項1に記載の方法。
- AKIII酵素を過剰発現するB.メタノリカス微生物。
- AKIII酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を導入することによって、改変されている、請求項3に記載の微生物。
- 前記核酸分子が、バシラス・spのAKIIIをコードする遺伝子であるか、またはバシラス・spのAKIIIをコードする遺伝子に由来するものである、請求項2に記載の方法または請求項4に記載のB.メタノリカス。
- 前記核酸分子が、
(i) 下記のGenBankアクセッション番号の何れか1つで、寄託されたAKIII酵素をコードするヌクレオチド配列か、
(a)NC−000964(B.サブチルス亜種168株)(配列番号:5);
(b)NC−006270(B.リチェニホルミスATCC14580(DSM13))(配列番号:6);
(c)NC−002570(B.ハロドランス C−125)(配列番号:7);
(d)CPOO056O(B.アミロリクファシエンスF2B42)(配列番号:8);もしくは
(e)AL596172(リステリア イノキュア Clin 11262)(配列番号:9);
(ii)上記(i)における寄託されたヌクレオチド配列に対して、少なくとも50%の配列同一性を有するヌクレオチド配列か、
(iii)上記(i)に挙げられたヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列か、
(iv)上記(i)における寄託されたアミノ酸配列または上記(i)における寄託されたヌクレオチド配列から翻訳されたアミノ酸配列に対して、少なくとも50%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列か、
を含む、請求項2〜3の何れか一項に記載の方法または請求項4〜5の何れか一項に記載の微生物。 - 過剰発現されるAKIIIが、
(i)配列番号3にて示される ヌクレオチド配列の全てもしくは一部でコードされるか、または配列番号3に対して少なくとも50%の同一性(特には、配列番号3に対して、少なくとも55、60、65、70または75%の配列同一性)を有するヌクレオチド でコードされるAKIII、または
高いストリンジェントな 条件(0.lxSSC、0.1%SDS、65℃、洗浄条件:2xSSC、0.1%SDS、65℃、次いで、0.lxSSC、0.1%SDS、65℃)の下で、配列番号3の相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列または配列番号3のヌクレオチド配列と縮重するヌクレオチド配列でコードされるAKIIIであるか、
(ii)配列番号4にて示されるアミノ酸配列の全てもしくは一部を含むAKIIIまたは、配列番号4のアミノ酸配列に対して少なくとも50%の配列同一性(特には、配列番号4に対して、少なくとも55、60、65、70、75または80%の配列同一性)を有するアミノ酸配列の全てもしくは一部を含む AKIIIである、
請求項1〜5の何れか一項に記載の方法またはB.メタノリカス生物体。 - 前記AKIIIが、
(i)配列番号3に対して、少なくとも75%の配列同一性を有するヌクレオチド配列の全てもしくは一部でコードされているか、または
(ii)配列番号4に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列の全てもしくは一部を含む、
請求項7に記載の方法または微生物。 - 導入された前記核酸分子が前記微生物のAKIII酵素と相同性があるAKIII酵素をコードする、請求項2の方法または請求項4〜7の何れか一項に記載の微生物。
- 前記AKIIIがフィードバック阻害に対して感受性がある、請求項1〜9の何れか一項に記載の方法または微生物。
- 前記AKIIIがフィードバック阻害に対して抵抗性がある、請求項1〜9の何れか一項に記載の方法または微生物。
- 前記B.メタノリカスまたは前記微生物が、野生型のB.メタノリカスまたは野生型の微生物である、請求項1〜11の何れか一項に記載の方法または微生物。
- 前記B.メタノリカスまたは前記微生物が、リシン類似体 に対して、栄養要求性株であるか、または抵抗性を有する変異体である、請求項1〜11の何れか一項に記載の方法または微生物。
- 前記AKIIIが、前記微生物における他の遺伝子の発現または過剰発現とともに、過剰発現される、請求項1〜13の何れか一項に記載の方法または微生物。
- 前記AKIIIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が、非ネイティブ プロモーターから発現される、請求項1〜14の何れか一項に記載の方法または微生物。
- 前記プロモーターが、強力なプロモーターである、請求項15に記載の方法または微生物。
- 前記ヌクレオチドの発現が、転写抑制に支配されていない、請求項15または16に記載の方法または微生物。
- AK活性を有するポリペプチドをコードし、
(i)配列番号:1または3にて示されるヌクレオチド配列、
(ii)配列番号1にて示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも80%の配列同一性、特には少なくとも82、84、86、88、90、92、94、95、96、97、98または99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
(iii)配列番号3にて示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも75%の配列同一性、特には少なくとも77、79、80、81、83、85、86、87、88、89、90、91、93、95、97、98または99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
(iv)0.1×SSC、0.1%SDS、65℃であるハイブリダイゼーション条件および2×SSC、0.1%SDSの洗浄条件、次いで、0.1×SSC、0.1%SDS、65℃(高いストリジェントな条件)の下、(i)の相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列;
(v)配列番号1もしくは3のヌクレオチド配列と縮重するヌクレオチド配列;
(vi)配列番号1もしくは3のヌクレオチド配列の一部、または配列番号1もしくは3の配列と縮合するヌクレオチド配列の一部であるヌクレオチド配列;
(vii)(i)〜(vi)の何れか1つのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列;
(viii)アミノ酸配列が配列番号2または4で示されるポリペプチドの全てまたは一部をコードするヌクレオチド配列;
(ix)配列番号2で示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも92、93、94、95、96、97、98または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドの全てまたは一部をコードするヌクレオチド配列;
(x)配列番号4で示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも82、84、86、88、90、92、94、95、96、97、98または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドの全てまたは一部をコードするヌクレオチド配列;および
(xi)(viii)〜(x)の何れか1つのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列;
からなる群から選択されるヌクレオチドの配列を含む、または該配列からなる核酸分子。 - AK活性を有し、
(i)配列番号2または4で示されるアミノ酸配列の全てまたは一部、
(ii)配列番号2で示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも92、93、94、95、96、97、98または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列の全てまたは一部、および
(iii)配列番号4で示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも82、84、86、88、90、92、94、95、96、97、98または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列の全てまたは一部
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を含む、または該配列からなるポリペプチド。 - AKIII酵素をコードし、非ネイティブプロモーターに作動可能なように連結されている、配列番号3または配列番号4について、請求項18において規定された核酸分子を含む構築物。
- 請求項18または請求項20において規定された核酸分子または構築物を含むベクター。
- 請求項19〜21の何れか一項に記載の核酸分子、構築物またはベクターが導入された宿主微生物。
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