ES2626405T3

ES2626405T3 - Método de producción de L-lisina

Info

Publication number: ES2626405T3
Application number: ES09750085.4T
Authority: ES
Inventors: Trygve Brautaset; Oyvind Mejdell Jakobsen; Trond Ellingsen
Original assignee: Sinvent AS
Current assignee: Sinvent AS
Priority date: 2008-05-20
Filing date: 2009-05-15
Publication date: 2017-07-25
Anticipated expiration: 2029-05-15
Also published as: EP2297329B1; US8859244B2; JP5707318B2; US20110177568A1; JP2011520462A; WO2009141607A1; DK2297329T3; EP2297329A1; GB0809169D0

Abstract

Un método para producir L-lisina en B. methanolicus, comprendiendo dicho método introducir en dicho B. metanolicus una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima AKIII, de manera que se sobreexpresa una enzima AKIII, en la que dicha secuencia nucleotídica (i) es la secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO. 3 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 75% de identidad con SEQ ID NO. 3 (o más particularmente al menos 77, 79, 80, 81, 83, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 93, 95, 97, 98 o 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3) o una secuencia de nucleótidos que hibrida con el complemento de SEQ ID NO. 3 bajo condiciones de alta restricción (SSC 0.1x, SDS al 0.1%, 65ºC, y condiciones de lavado: SSC 2x, SDS al 0.1%, 65ºC, seguido de SSC 0.1x, SDS al 0.1%, 65ºC); o (ii) codifica la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO. 4 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 4 (o más particularmente al menos 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 4).

Description

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proteico (enzima AKIII) producida, que puede determinarse mediante cualquier método conveniente conocido en la técnica. Por ejemplo, la expresión puede determinarse midiendo la actividad proteica (es decir, la actividad de la proteína AKIII expresada). Alternativamente, la cantidad de proteína producida puede medirse para determinar el nivel de expresión, por ejemplo inmunoprecipitación Western u otros sistemas de detección de anticuerpos, o incluso por cualquier método de evaluación o cuantificación de proteína. También se puede utilizar PCR en tiempo real. El ensayo puede ser un ensayo in vivo o in vitro. Por tanto, la expresión (determinada, por ejemplo, mediante la detección de la actividad específica de AKIII) puede ser de 2, 3 o 4 veces o más superior a la que resulta del gen de codificación AKIII nativo (es decir endógeno), pero puede ser menor en otros sistemas o bajo otras condiciones.

La actividad de AKIII se puede determinar ensayando la actividad de la aspartoquinasa mediante procedimientos conocidos en la técnica y descritos en la bibliografía, por ejemplo como se detalla en los Ejemplos siguientes. Por tanto, la actividad de AK de una proteína codificada se puede determinar ensayando la formación de hidroxamato de aspartilo a partir de hidroxilamina como se describe por Black and Wright (Black et al., (1955) J. Biol. Chem., 213: 27-38).

Según la presente invención, la "sobreexpresión" puede significar simplemente que un gen AKIII adicional se expresa en el huésped más allá del gen nativo AKIII (yclM) presente endógenamente en ese huésped pero no se limita a dicho mecanismo. Puede incluir la expresión de un gen AKIII en un organismo en el que no contiene naturalmente tal gen.

Como se define aquí, la sobreexpresión de una enzima AKIII puede ser por cualquier medio conocido en la técnica, tal como introducir un gen (o poner, más generalmente, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos) que codifica un AKIII, por ejemplo una copia del gen, por ejemplo, expresada a partir de un promotor más fuerte o no regulado con relación al gen nativo, y/o introducir múltiples copias de una molécula/gen de ácido nucleico que codifica AKIII.

La invención en una realización puede proporcionar, por tanto, un método en el que se expresa un gen AKIII que no está sujeto a la represión transcripcional, por ejemplo por un producto de la ruta del aspartato o por un represor del gen AKIII endógeno.

El gen o genes introducidos pueden modificarse para hacer que se libere de la represión transcripcional, por ejemplo mediante la mutación o eliminación de elementos de reconocimiento para los represores transcripcionales o mediante el uso de elementos de control de la expresión (por ejemplo, promotores) que no están sujetos a regulación transcripcional por el regulador o reguladores transcripcionales que normalmente controlan la expresión del gen AKIII, por ejemplo que controlan la expresión en su situación nativa, por ejemplo, los represores transcripcionales que son productos de la ruta del aspartato. El gen endógeno de codificación de AKIII puede alternativamente o adicionalmente ser modificado de esta manera, o mediante la adición de un promotor más fuerte. Por lo tanto, la mutagénesis (incluyendo tanto aleatoria como dirigida) puede ser utilizada, por ejemplo, para mutar los elementos endógenos de control o reguladores para aumentar la expresión del gen AKIII endógeno (por ejemplo, aumentar la transcripción y/o la traducción). Alternativamente, el organismo puede ser diseñado para introducir elementos reguladores adicionales o alternativos.

En una realización particular, un gen que codifica AKIII puede expresarse a partir de un promotor no nativo o heterólogo (que es un promotor que es heterólogo con el gen que codifica AKIII, es decir, no es el promotor del gen AKIII nativo) y particularmente un promotor fuerte, no nativo o heterólogo. Por tanto, en esta realización el gen que codifica AKIII no se usa con su promotor nativo. Se puede introducir un gen que codifica AKIII que está bajo el control de un promotor no nativo. Como se hace referencia en la presente memoria, un promotor fuerte es uno que expresa un gen a un nivel alto, o al menos a un nivel más alto que el efectuado por su promotor nativo. El término “promotor fuerte” es un término bien conocido y ampliamente utilizado en la técnica y muchos promotores fuertes son conocidos en la técnica o pueden identificarse mediante experimentación rutinaria.

El uso de un promotor no nativo puede tener ventajosamente el efecto de aliviar el gen codificador de AKIII de la represión transcripcional, ya que al menos algunos de los elementos represivos estarán localizados en la región promotora nativa. Al reemplazar el promotor nativo con un promotor no nativo carente de elementos represivos que responden a los efectos de los productos de la vía, el gen que codifica AKIII se aliviará al menos parcialmente de la represión transcripcional.

En una realización preferida, el promotor no nativo es nativo de B. methanolicus. Alternativamente, dicho promotor es un promotor de metanol deshidrogenasa (mdh).

En una realización particularmente preferida, el promotor no nativo es el promotor de metanol deshidrogenasa (mdh) de B. methanolicus. Otros promotores funcionales en B. methanolicus incluyen cualquiera de los promotores de genes conocidos de B. methanolicus. A partir de la secuencia previamente publicada de pBM19 (Brautaset et al., (2004) supra) se han caracterizado experimentalmente los promotores siguientes: glpX, fba, pfk, promotores de rpe. A partir de la secuencia publicada anteriormente del operón hps + phi (Brautaset et al., (2004) supra): promotor hps. Para Bacillus generalmente se pueden usar promotores de especies estrechamente relacionadas (por ejemplo,

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compuestos de un carbono (por ejemplo metanol, metano) y materias primas complejas (por ejemplo, melazas, hidrolizados de proteínas). El sustrato se puede proporcionar en forma purificada o "aislada" o como parte de una mezcla cruda, no refinada o parcialmente refinada, por ejemplo un subproducto de otro proceso comercial o industrial. En el caso de un metilotróforo tal como B. methanolicus, se puede usar metanol como sustrato. Sin embargo, B. methanolicus crece también sobre otras sustancias, tales como azúcares, que pueden usarse, por ejemplo manitol, glucosa, maltosa, ribosa, acetato, glutamato, α-cetoglutarato (Schendel et al., 1990, supra). A continuación se muestra el uso de manitol como sustrato para B. methanolicus diseñado para sobreexpresar AKIII. Se observará que pueden alcanzarse altos niveles de producción de lisina, superando incluso los niveles de lisina alcanzables usando metanol.

Como se ha mencionado anteriormente, la presente invención se ha hecho posible en parte por la clonación, por primera vez, por los presentes inventores de los genes que codifican AKIII de B. methanolicus, yclM. Los inventores también han clonado por primera vez el gen que codifica AKI de B. methanolicus, dapG. Esto no se había logrado previamente, a pesar de los esfuerzos que dieron lugar a la identificación de lysC, que codifica AKII, de B. methanolicus (Schendel et al., (1992) supra). La secuencia de ácido nucleico de B. methanolicus dapG e yclM se exponen en las SEQ ID NO: 1 y 3, respectivamente, mientras que la secuencia de aminoácidos de las proteínas codificadas se muestra en SEQ ID NO: 2 y 4, respectivamente.

Por lo tanto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico, preferiblemente una molécula de ácido nucleico aislada, que codifica un polipéptido (o proteína) que tiene actividad de AK, o que es el complemento de la misma, que comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de:

(i): una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 1 o 3,

(ii): una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia, más particularmente al menos 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos como se expone En SEQ ID NO: 1,

(iii) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 75% de identidad de secuencia, más particularmente al menos 77, 79, 80, 81, 83, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 93, 95, 97, 98 o 99% de identidad de secuencia, con una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 3,

(iv): una secuencia de nucleótidos que está degenerada con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 1 o 3;

(v): una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de (i) a (vi).

Alternativamente, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico, preferiblemente una molécula de ácido nucleico aislada, que codifica un polipéptido que tiene actividad de AK o que es el complemento de la misma que comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(i): una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido cuya secuencia de aminoácidos se expone en SEQ ID NO: 2 o 4;

(ii): una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia, preferiblemente una identidad de secuencia de 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98

: o 99% identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 2;

(iii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% identidad de secuencia, con una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO. 4;

(iv) una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de (i) a (iii).

La molécula de ácido nucleico codifica preferiblemente un polipéptido o proteína que es una AKI o una AKIII o una parte de la misma que tiene actividad AK.

Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico definida en las partes (i)-(iv) o (i) a (iii) anteriores codifica un polipéptido o proteína que tiene o retiene la función o actividad o propiedades de las enzimas AKI y AKIII como lo definen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2 y 4.

Los términos “polipéptido” y “proteína” se usan indistintamente en la presente memoria e incluyen cualquier longitud de cadena de aminoácidos (es decir, cualquier polímero u oligómero de aminoácidos).

Como se ha indicado anteriormente, en ciertos aspectos la invención abarca el uso de partes o fragmentos funcionales de las secuencias de nucleótidos definidas en la presente memoria, por lo que se entiende partes o fragmentos que codifican una proteína o polipéptido que tiene la misma o sustancialmente la misma actividad que la

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proteína de longitud completa como se ha definido anteriormente. Los ensayos para determinar si una proteína/polipéptido codificado por dicha parte o fragmento tiene la misma o sustancialmente la misma actividad (por ejemplo, actividad catalítica o enzimática) como el polipéptido/proteína de longitud completa como se ha definido anteriormente incluyen los tratados anteriormente. Normalmente, partes o fragmentos funcionales de moléculas de ácido nucleico sólo tendrán pequeñas eliminaciones relativas a la molécula de ácido nucleico de longitud completa, por ejemplo, las eliminaciones de menos de 50, 40, 30, 20 o 10 nucleótidos, por ejemplo en el extremo 5' que codifica el extremo N de la proteína, el extremo 3' codifica el extremo C-terminal de la proteína o internamente dentro de la región codificadora, aunque también pueden llevarse a cabo las eliminaciones más grandes, por ejemplo de al menos 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600 o 700 nucleótidos, o eliminaciones de menos de 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400 , 500, 600 o 700 nucleótidos, si el fragmento tiene la misma o sustancialmente la misma actividad (por ejemplo, actividad catalítica o enzimática) como la proteína de longitud completa como se ha definido anteriormente. La actividad del polipéptido o proteína codificados se puede probar fácilmente para determinar si comparte la misma actividad que el polipéptido o proteína de longitud completa, por ejemplo como se ha expuesto anteriormente.

Las partes o fragmentos representativos pueden comprender al menos un 50%, y preferiblemente al menos 60, 70, 75, 80, 85, 90 o 95% de nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 1 o

3. Por lo tanto, por ejemplo, en el caso de la secuencia yclM de SEQ ID NO: 3, la parte o fragmento puede tener al menos 684, 821, 957, 1026, 1094, 1163, 1231 o 1300 nucleótidos de longitud. En el caso de la secuencia dapG de SEQ ID NO: 1, la parte o fragmento puede tener al menos 621, 745, 869, 931, 994, 1056, 1118 o 1178 nucleótidos de longitud. Por lo tanto, los tamaños de parte o fragmento ejemplares incluyen al menos 620, 700, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250 y 1300 nucleótidos.

Pueden usarse fragmentos más cortos de la molécula de ácido nucleico de la invención como sondas, por ejemplo para PCR o protocolos de hibridación. Los fragmentos más cortos pueden ser por ejemplo 10-30, 20-25 nucleótidos de longitud. Tales sondas son útiles en protocolos para identificar moléculas de ácido nucleico adicionales que comparten homología con las moléculas de ácido nucleico de la invención.

El término "molécula de ácido nucleico" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un polímero de ARN o ADN que es de cadena sencilla o doble, incluyendo opcionalmente bases de nucleótidos sintéticas, no naturales o alteradas. Ejemplos de tales polinucleótidos incluyen ADNc, ADN genómico y ARNds, inter alia. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico es ADN.

Aunque las secuencias de ácido nucleico a las que se hace referencia en la presente memoria comprenden nucleótidos timidina ("t"), se entenderá que la invención también se refiere a secuencias correspondientes en las que la timidina se reemplaza por uridina ("u").

La invención incluye, por lo tanto, moléculas de ácido nucleico que son variantes de las moléculas de ácido nucleico de las SEQ ID NO 1 y 3, particularmente variantes funcionalmente equivalentes. Las moléculas de ácido nucleico "variantes" pueden tener así cambios de nucleótidos únicos o múltiples en comparación con las moléculas de ácido nucleico de las SEQ ID NOs. 1 y 3. Por ejemplo, las variantes pueden tener 1, 2, 3, 4, o 5 o más adiciones, sustituciones, inserciones o eliminaciones de nucleótidos.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una proteína (o polipéptido) que tiene actividad AK y que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(i): la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 2 o 4,

(ii): una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia, preferiblemente una identidad de secuencia de al menos 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% con una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 2 ; y

(iii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia, preferiblemente una identidad de secuencia de al menos 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% con una secuencia de aminoácidos como establece en la SEQ ID NO: 4.

La proteína o polipéptido preferiblemente es un AKI o AKIII o una parte del mismo que tiene actividad de AK. Más particularmente, la parte retiene la función o actividad de las propiedades del AKI o AKIII del que deriva (tal como se define por referencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS .2 y 4).

La proteína o polipéptido puede definirse alternativamente con referencia a las secuencias de ácido nucleico que codifican y, como tal, la proteína o polipéptido de la invención puede codificarse por cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de la invención, como se ha descrito anteriormente.

La invención se extiende a partes funcionales o fragmentos de las moléculas de proteína de longitud completa, por lo que se entiende partes o fragmentos que tienen la misma o sustancialmente la misma actividad que las proteínas

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de ácido nucleico que codifica AKIII de la invención. La una o más de las secuencias reguladoras opcionales pueden ser secuencias reguladoras no nativas.

En el contexto de esta invención, el término "unido operativamente" se refiere a la asociación de dos o más moléculas de ácido nucleico sobre un solo fragmento de ácido nucleico de manera que la función de uno es afectada por la otra. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente con una secuencia codificadora cuando es capaz de afectar a la expresión de esa secuencia codificadora (es decir, la secuencia codificadora está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias de codificación pueden estar operativamente ligadas a secuencias reguladoras en orientación sentido o antisentido.

El término “secuencias reguladoras” se refiere a secuencias de nucleótidos localizadas corriente arriba (secuencias no codificadoras 5'), dentro o corriente abajo (secuencias no codificadoras 3') de una secuencia codificadora, y que influyen en la transcripción, procesamiento o estabilidad del ARN o traducción de la secuencia de codificación asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, operadores, potenciadores y secuencias líderes de traducción. Como se usa en la presente memoria, el término “promotor” se refiere a una secuencia de nucleótidos capaz de controlar la expresión de una secuencia codificadora o ARN. En general, una secuencia codificadora se localiza 3' con respecto a una secuencia promotora. Los promotores pueden derivarse en su totalidad de un gen nativo, o estar compuestos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de nucleótidos sintéticos. Se reconoce además que, puesto que en la mayoría de los casos los límites exactos de las secuencias reguladoras no han sido completamente definidos, fragmentos de ácido nucleico de diferentes longitudes pueden tener actividad promotora idéntica.

Una realización adicional de la invención proporciona un vector que comprende una molécula o constructo de ácido nucleico como se definió anteriormente.

Más particularmente, pueden construirse vectores que comprenden la molécula de ácido nucleico que codifica AKIII de la invención (o constructo de la invención). La elección del vector puede depender del microorganismo, del método que se utilizará para transformar células huésped, del método que se usa para la expresión de proteínas o de otro uso previsto del vector. El experto en la materia conoce bien los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector con el fin de transformar, seleccionar y propagar con éxito células hospedadoras que contienen la molécula o construcción de ácido nucleico que codifica AKIII de la invención. El experto en la materia también reconocerá que diferentes sucesos de transformación independientes darán lugar a diferentes niveles y patrones de expresión y, por tanto, que se deben examinar múltiples eventos para obtener células que muestren el nivel y patrón de expresión deseados. Dicho tamizaje puede realizarse mediante análisis Southern de ADN, análisis Northern de expresión de ARNm, análisis Western de expresión de proteínas, inter alia.

La invención proporciona adicionalmente un B. methanolicus que contiene una o más de las moléculas de ácido nucleico, constructos o vectores de la invención, particularmente una molécula de ácido nucleico o un vector o construcción que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica AKIII que es por tanto capaz de sobreexpresando AKIII. El huésped B. methanolicus contiene endógenamente un ácido nucleico que codifica AKIII de la invención; se manipula genéticamente para alterar la expresión de AKIII. Esto se puede lograr por ejemplo mediante la introducción de una o más copias adicionales del ácido nucleico que codifica AKIII de la invención bajo el control de un promotor no nativo, preferiblemente fuerte. El material genético está presente en el organismo huésped que no está presente en el organismo natural (es decir, el material genético exógeno está presente).

En general, el material genético exógeno se introduce usando el proceso de transformación. La transformación implicará típicamente un plásmido u otro vector que contendrá también un marcador (por ejemplo, un gen) para permitir la identificación de microorganismos transformados con éxito, por ejemplo un gen para la resistencia a antibióticos (por ejemplo contra ampicilina). Otros métodos para seleccionar transformantes son conocidos por el experto en la materia e incluyen el uso de un vector sensible a la luz, un gen lux, que hace que las colonias positivas se iluminen en la oscuridad. Otros vehículos adecuados para la transformación de las bacterias incluyen cósmidos y moléculas de bacteriófagos.

Como se ha indicado anteriormente, los métodos de la invención encuentran utilidad particular en la producción comercial o industrial de L-lisina. En un aspecto preferido, por lo tanto, los métodos para producir L-lisina o para aumentar la expresión de L-lisina se refieren a procesos a escala de producción, es decir, se realizan a escala de producción o a escala industrial, en lugar de un experimento de laboratorio. Los procedimientos pueden ser preferidos en un biorreactor o fermentador, particularmente un biorreactor o fermentador a escala de producción.

La invención se describirá ahora con más detalle en los siguientes Ejemplos no limitativos, en los que:

La Figura 1 presenta una visión general de la ruta aspartato (Paulus (1993) Biosíntesis de la Familia de Aspartato de aminoácidos. En: Sonenshein (Ed) Bacillus subtilis y otras bacterias grampositivas: bioquímica, fisiología y genética molecular Sociedad Americana de Microbiología: Washington DC). Las principales funciones metabólicas de los productos finales se indican entre paréntesis. Se subrayan los genes de B. methanolicus secuenciados y presentados en este trabajo;

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La Figura 2 muestra la organización genética del operón de dap parcial e yclM de B. methanolicus MGA3 en comparación con los genes correspondientes de B. subtilis;

La Figura 3 muestra la actividad AK específica de extractos brutos de cultivos matraz de agitación de MGA3 de B. methanolicus y cepas recombinantes que sobreexpresan dapG, lysC e yclM. Todas las actividades enzimáticas específicas se miden in vitro y son relativas a la de la cepa de control MGA3(pHP13) (definida como 1). La actividad AK específica medida de MGA3 (pHP13) fue de 0.05 U/mg de proteína; y

La Figura 4 muestra el crecimiento y la producción de L-lisina en ensayos de fermentación de: A, MGA3 de tipo salvaje y la cepa de control MGA3(pHP13); B, cepas MGA3 recombinantes que sobreexpresan dapG, lysC o yclM. Símbolos rellenos, peso de células secas; símbolos vacíos, producción de L-lisina (valores corregidos de volumen). A lo largo de las fermentaciones, el nivel de metanol en el medio se mantuvo a 150 mM por alimentación automática de metanol.

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Materiales y métodos

Materiales biológicos, manipulación del ADN y condiciones de crecimiento

Las cepas y plásmidos bacterianos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 1. Se usó Escherichia coli DH5a como huésped de clonación estándar y se cultivaron cepas recombinantes a 37ºC en medio Luria-Bertani líquido o sólido suplementado con cloranfenicol (15 ug/ml) cuando sea apropiado. Los procedimientos recombinantes de E. coli se realizaron como se describe en otro lugar (Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York). La transformación de B. methanolicus se realizó por electroporación como se ha descrito previamente (Jakobsen et al., (2006) supra).

Para cultivos en matraces de agitación, las cepas de B. methanalicus se cultivaron a 50°C en 100 ml de medio MeOH200 que contenía metanol 200 mM (Jakobsen et al., (2006) supra), y el crecimiento bacteriano se monitorizó midiendo la densidad óptica a 600 nm (OD600).

Las fermentaciones se realizaron en fermentadores Applikon 3 1 con un volumen inicial de 0.91. El medio, definido como medio UMN1, contenía K2HPO4, 4.09 g/l; NaH2PO4, 1.30 g/l; (NH4)2SO4, 2.11 g/l; extracto de levadura (Difco),

0.25 g/l; d-Biotina, 6 mg/l; Vitamina B12, 0.01 mg/l; MgSO4, 1 mM; solución concentrada de metales (Lee et al., 1996), 1 ml/l; metanol, 150 mM. Se añadió cloranfenicol (5 µg/ml) cuando fue apropiado. Se usaron cultivos de matraz de agitación en medio MeOH200 como inóculo y se colectaron a OD600 = 1.1-1.3. Los fermentadores se inocularon con un volumen de cultivo igual a 75 ml dividido por la OD600 del inóculo en el momento de la cosecha (1.1-1.3). Las fermentaciones se realizaron a 50°C con agitación inicial de 400 rpm y aireación de 05 WM. La aireación se incrementó paso a paso hasta 1.0 VVM y el aire se enriqueció paso a paso hasta 60% de O2, a medida que aumentaba la demanda de oxígeno. En todo momento, el oxígeno disuelto se mantuvo al 30% de saturación por ajuste automático de la velocidad de agitación hasta 2.000 rpm. El pH se mantuvo a 6.5 mediante adición automática de NH3 al 12.5% (p/v) (típicamente 200-250 ml). Se añadió antiespumante (Sigma Antifoam 204) a una concentración inicial de 0.005% (v/v), y se añadió a demanda durante toda la fermentación (típicamente 3 ml). La concentración de metanol en el fermentador se monitorizó mediante análisis en línea del gas del espacio de cabeza mediante un espectrómetro de masas (Balzers Omnistar GSD 300 02). El gas del espacio de cabeza se llevó desde el fermentador al espectrómetro de masas en tubo de acero inoxidable aislado calentado a 60ºC, con un caudal de aproximadamente 30 ml/min. La concentración de metanol en el medio se mantuvo a 150 mM mediante adición automática de a demanda de metanol. La MeOH Feed Solution contiene 50 ml CKNFD Trace Metals por litro de metanol. LA CKNFD Trace Metals contiene MgCl2, 344 mM; FeCl2, 78.5 mM; MnCl2, 50.5 mM; CuCl2, 1.53 mM; CoCl2, 1.60 mM; Na2MoO2, 1.57 mM; ZnCl2, 3.23 mM; HCl, 100 ml/l. El peso de células secas se calculó basándose en un factor de conversión de 0.31 g/l de peso de células secas por OD600 (calculado como un valor medio basado en las mediciones de OD600 y el peso de células secas de los ensayos de fermentación informados). La tasa de crecimiento específico se calculó mediante regresión lineal de las parcelas semilogarítmicas de la concentración de biomasa en función del tiempo, basándose en los datos del período de crecimiento exponencial (concentración de biomasa inferior a 15 g/l). Las fermentaciones se llevaron a cabo hasta que el contenido de CO2 del gas agotado era cercano a cero (sin respiración celular).

Debido al aumento significativo del volumen de cultivo a lo largo de la fermentación, se han corregido todas las concentraciones de biomasa y aminoácidos para el aumento de volumen y la posterior dilución multiplicando la concentración medida con el volumen de cultivo al muestreo dividido por el volumen de cultivo original. Los factores de corrección utilizados para las muestras de punto final están entre 1.5 y 1.7 y, por consiguiente, las concentraciones reales de aminoácidos y de biomasa medidas en los biorreactores son menores.

Tabla 1. Cepas bacterianas y plásmidos

Cepa o plásmido: Descripcióna Referencia

B. methanolicus

MGA3: Cepa de tipo salvaje Schendel et al. 1990

E. coli

DH5α: Huésped de clonación general Bethesda Research Laboratories

Plásmidos

pTB1.9mdhL: Vector lanzadera E. coli -B. methanolicus pTB1.9 portador del gen mdh; Ampr Neor Brautaset et al. 2004

pHP13: Vector lanzadera E. coli -B. methanolicus; Clmr Haima y col. 1987; Jakobsen et al. 2006

pHP13mp-dapG: pHP13 que lleva la región de codificación dapG bajo control de promotor mdh Este estudio

pHP13mp-lysC: pHP13 que lleva la región de codificación lysC bajo control de promotor mdh Este estudio

pHP13mp-yclM: pHP13 que lleva la región de codificación yclM bajo control de promotor mdh Este estudio

a Ampr resistencia a ampicilina; Neor, resistencia a neomicina; Glmr, resistencia al cloranfenicol.

Medición de aminoácidos y amoniaco

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Los aminoácidos se cuantificaron según Skjerdal et al., 1996 (Appl. Micro. Biotechnol., 44(5): 635-642), utilizando un regulador que contenía acetato de Na 0.02 M y 2% de tetrahidrofurano, pH 5.9. La estimación de la concentración intracelular de aminoácidos se realizó como se ha descrito previamente (Brautaset et al., (2003) Appl. Environ. Microbiol., 69(7): 3986-3995), basándose en la determinación del contenido de aminoácidos en un cultivo de células 10 brevemente lavado y sometido a lisis, estimación teórica del volumen intracelular y un factor de conversión determinado experimentalmente de 2.2X108 células/ml por OD600. El amoníaco se midió con el kit de prueba de amoníaco Spectroquant (Merck), de acuerdo con las instrucciones del fabricante (las muestras se diluyeron 1:1000 y

1:10 000 antes del análisis).

15 Clonación asistida por PCR de genes de B. methanolicus asd, dapG, dapA y lysC

Los genes putativos que codifican AKI y AKIII se amplificaron por PCR a partir del ADN total de B. methanolicus MGA3 utilizando cebadores degenerados basados en secuencias de ADN de yclM, mlpA, asd, dapG e ymfA de B. licheniformls, B.halodurans, B. cereus, Listeria Innocua, L. monocytogenes y B. subtilis (números de acceso

20 GenBank AE017333, BA000004, NC_004722, AL592022, AL591824 y AL009126, respectivamente). Los fragmentos de ADN de MGA3 que cubrían asd, dapG y dapA se amplificaron por PCR como fragmentos solapantes usando pares de cebadores (Tabla 2) mlpA-PPS-1F junto con asd-PPS-1R (que daba un fragmento de 3.9 kb) y asd-PPS-1F juntos con ymfA-PPS-1R (produciendo un fragmento de 3.3 kb). Estos fragmentos se secuenciaron por desplazamiento de cebador.

25 Una región central de yclM fue amplificada por PCR y en parte secuenciada usando cebadores degenerados basados en regiones conservadas dentro de yclM. El ADN total de MGA3 se digirió con EcoRI, seguido de inactivación por calor de la enzima de restricción. El material se diluyó y se ligó durante 72 horas a 4ºC. Los cebadores yclM-PPS-1F y yclM-PPS-1R, ambos apuntando hacia fuera desde la región yclM previamente

30 amplificada por PCR se usaron para amplificar por PCR un fragmento de ADN de 3 kb usando la mezcla de ligación como molde. Este fragmento de ADN se secuenció por desplazamiento de cebador.

Construcción de vectores

35 El fragmento de ADN A que incluía la región codificadora de metanol deshidrogenasa (mdh) se amplificó por PCR a partir de pTB1.9mdhL utilizando los cebadores mdh-CDS-F1 y pTB1.9-R1. La región del promotor mdh putativo se amplificó por PCR a partir de la misma plantilla utilizando los cebadores mdh-prom-F1 y mdh-prom-R1, dando el

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fragmento de ADN B. El pTB1.9mdhL se digirió con PstI y BamHI y el fragmento de la cadena principal del vector se ligó con fragmento B de ADN digerido con BamHI/Pcil y fragmento de A de ADN digerido con Pcil /Pstl. Se retiraron dos sitios Pcil del vector resultante por amplificación por PCR del vector como dos fragmentos: Fragmento 1 usando los cebadores mp-mdh-P2-F1 y mp-mdh-P2-R2, y Fragmento 2 utilizando los cebadores mp-mdh-P2-F2 y mp-mdh-P2-R1. Los dos fragmentos se digieren con SphI y Kpnl y se ligaron para producir pTB1.9mp-mdh, que lleva un sitio Pci entre las regiones mdh corriente arriba y codificadoras para la fusión simplificada de regiones codificadoras al promotor mdh. La inserción del sitio Pcil cambió los cuatro nucleótidos corriente arriba del codón de inicio mdh del AAGA original a CATG.

Las regiones codificadoras de dapG, lysC e yclM se amplificaron por PCR a partir del ADN total de B. methanolicus MGA3 utilizando los cebadores dapG-CDS-F1 y dapG-CDS-R1, lysC-CDS-Fl y lysC-CDS-R1, yclM -CDS-F1 e yclMCDS-R1, respectivamente. Los fragmentos de PCR resultantes que llevaban todo un sitio Pcil que solapan parcialmente un codón de inicio GTG se digirieron en extremo con Pcil y Kpnl y se usaron para reemplazar la región de codificación mdh de pTB1.9mp-mdh, dando los vectores pTB1.9mp-dapG, pTB1.9mp-lysC y pTB1.9mp-yclM, respectivamente. En este proceso, los codones de inicio ATG originales de dapG y yclM se cambiaron a GTG. Se insertó un fragmento Pst1/EcoRI de pTB1.9mp-lysC que incluía el promotor mdh y la región codificadora de lysC en los sitios correspondientes de pHP13, produciendo pHP13mp-lysC (7.3 kb). La LysC de pHP13mp-lysC se intercambió con regiones codificadoras dapG y yclM insertando un fragmento Pstl/Kpnl de pTB1.9mp-dapG y un fragmento Spel/Kpnl de pTB1.9mp-yclM en los sitios correspondientes de pHP13mp-lysC, proporcionando pHP13mp-dapG (7.1 kb) y pHP13mp-yclM (7.2 kb), respectivamente.

Tabla 2. Cebadores de PCR utilizados en este estudio

Cebador Secuencia de cebador (5'-3')a

mlpA-PPS-1F TCTACCTTCGTTGAGGAAGA (SEQ ID NO: 10) asd-PPS-1R CACTCCTGAACGGTTAATCC (SEQ ID NO: 11) asd-PPS-1F TGAGCAGACAAGAGCGATTA (SEQ ID NO: 12) ymfA-PPS-1R ATAGATCGCTCCGATATGGT (SEQ ID NO: 13) yclM-PPS-1F CCTGTGATCGGAATTGCAAGTGATAAAGGATTCTG (SEQ ID NO: 14) yclM-PPS-1R ATCTTCGTTCCAGGAGCCGATGGATTATTGGTGTT (SEQ ID NO: 15) mdh-CDS-F1 TCGACATGTGACAACAAAGTTTTTC (SEQ ID NO: 16) pTB1.9-R1 ACGCATACCATTTTGAACGATGACC (SEQ ID NO: 17) mdh-prom-F1 GCCGGATCCTGCAGTTCATTAAAGAGCAGC (SEQ ID NO: 18) mdh-prom-R1 CGCGACATGTACTACCTCCTATTTATG (SEQ ID NO: 19) mp-mdh-P2-F1 CGCGGCATGCGTTTCAATGAAGATCC (SEQ ID NO: 20) mp-mdh-P2-R1 TTAAGCATGCAAAAGGCCAGGAACCG (SEQ ID NO: 21) mp-mdh-P2-F2 TTTTGGTACCCGCCATAGGTCTAGAG (SEQ ID NO: 22) mp-mdh-P2-R2 GGGCGGTACCTTATTCTTTAGTCTATC (SEQ ID NO: 23) lysC-CDS_F1 CCGAACATGTGGGATTAATTGTCC (SEQ ID NO: 24) lysC-CDS_R1 TTCCGGTACCCAGCAAATTGAACAGC (SEQ ID NO: 25) dapG-CDS-F1 GCGCACATGTGAAAATTATCGTTCAAAAATTCGG (SEQ ID NO: 26) dapG-CDS-R1 GCTAGGTACCGCTCCTCCTCATTCTATC (SEQ ID NO: 27) yclM-CDS-F1 GCGCACATGTGAAAGTAGCGAAGTTTGGAGGTTCTTC (SEQ ID NO: 28) yclM-CDS-R1 GCTAGGTACCAGTGTTTCACACCCAAATTCG (SEQ ID NO: 29)

a Los nucleótidos subrayados son sitios de restricción usados para la clonación simplificada de productos de PCR.

Preparaciones de extractos celulares crudos y ensayo ak

Los extractos crudos de células se prepararon basándose en el protocolo descrito por Brautaset et al., 2004 (supra). Las células de B. methanollcus se hicieron crecer en medio MeOH200 hasta la fase exponencial (OD600 = 1.9-2.1) y 20 ml de cultivo celular por centrifugación (3.200xg, 10 min, 10ºC). El sobrenadante se descartó y las células se resuspendieron en 20 ml de regulador de alta sal (el regulador de sal del medio MeOH200 a una concentración de IX, pH 7.2). Se centrifugaron 3 ml de la cultura resuspendida (3.200xg, 10 min, 10ºC), se descartó el sobrenadante y se congeló el gránulo y se almacenó a -20ºC. Las células se descongelaron sobre hielo, se resuspendieron en 3 ml de regulador de ensayo AK (fosfato de potasio 50 mM, MgSO4 10 mM, pH 75) y se sometieron a sonicación durante 3 min (Branson Sonifier 250, control de salida 3, 30% ciclo de trabajo). Se retiraron los restos celulares por centrifugación (3.200xg, 20 min, 4ºC), y el sobrenadante se recogió como extracto de células crudas y se almacenó en hielo para posterior actividad enzimática y análisis de proteínas celulares totales. La actividad de AK se determinó por formación de hidroxamato de aspartilo a partir de hidroxilamina (Black et al., (1955) supra). La mezcla de reacción contenía 400 µl de regulador de reacción (Tris-HCl 0.5 M, KCl 2M, pH 8.0), 200 µl de solución de hidroxilamina (2M hidroxilamina, pH 8.0), 100 µl de solución de AAM (0.1 M de ácido L-aspártico, ATP 0.1 M, MgCl2

0.1 M, Tris-HCl 0.2 M, pH 8.0) y una muestra de 300 µl diluida en regulador de ensayo AK. La mezcla de reacción se incubó a 50ºC durante 20 min antes de que la reacción se terminara por adición de 1 ml de solución de Fe (10% (p/v) de FeCl3, ácido tricloroacético al 3% (v/v) en HCl 0.7 M, esterilizada antes del uso). La formación de aspartil

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hidroxamato se midió inmediatamente a 540 nm usando un espectrofotómetro (Shimadzu, UV1700). Se realizaron ensayos en los que la muestra se reemplazó por patrones de aspartil hidroxamato para correlacionar la absorbancia con la concentración de hidroxamato de aspartilo. Una unidad de actividad AK se definió como la cantidad de enzima necesaria para producir 1 µmol de aspartil hidroxamato por minuto en las condiciones anteriores (Black et al., (1955) supra). Las concentraciones de proteína se determinaron mediante el método de Bradford (Bio-Rad), utilizando albúmina de suero bovino como patrón. Los ensayos de AK se realizaron por triplicado y se realizaron cuatro paralelos para cada medición de concentración de proteína. La incertidumbre de la actividad específica de AK se calculó utilizando General Formula for Error Propagation (Taylor (1997) An introduction to error analysis: the study of uncertainties in physical measurements. University Science Books: Sausalito, California. Section 3.11)) con base en valores medios y desviaciones estándar de las actividades de AK y concentraciones de proteínas medidas.

Resultados

yclM codifica un AKIII putativo en B. methanolicus

Basándose en alineaciones de secuencia de aminoácidos, se diseñó un conjunto de cebadores degenerados (véaseMATERIALES Y MÉTODOS) y se usó para amplificar por PCR un fragmento de ADN de 2 kb usando ADN total de MGA3 como molde. Un putativo gen yclM fue amplificado con éxito por PCR de MGA3 total de ADN utilizando esta estrategia. Se secuenció un fragmento de ADN de 2012 pb y se encontró que contenía la región codificadora esperada y 605 pb de la secuencia corriente arriba (Figura 2). La secuencia primaria deducida (455 aminoácidos) del producto del gen yclM exhibe la identidad más alta global al nivel de aminoácidos a B. licheniformis AKIII (74%) y es 71% idéntica a AKIII B. subtilis str. 168, para lo cual se verificó experimentalmente la actividad de AK (Kobashi et al., (2001) Biosci Biotechnol. Biochem., 65(6): 1391-1394). Tiene baja identidad de secuencia primaria tanto con AKI como con AKII de B. subtilis (23% y 25%, respectivamente). Juntos, estos datos sugieren que el gen B. metanolicus yclM codifica una supuesta isoenzima AKIII.

asd, dapG y dapA que codifican putativo aspartato semialdehído deshidrogenasa, AKI y dihidrodipicolinato sintasa, respectivamente, se organizan en un operón putativo dap en B. methanolicus

En B. subtilis, asd, dapG y dapA se localizan dentro del operón dap (Chen et al., (1993) J. Biol. Chem., 268 (13): 9448-9465). Al alinear las secuencias conocidas de varias especies relacionadas (ver MATERIALES Y MÉTODOS), se observó una organización conservada de los genes corriente arriba de, dentro y abajo del operón dap, y la hipótesis de que esta organización genética fue similar en B. methanolicus como en las especies relacionadas examinadas. Mediante el uso de cebadores degenerados basados en regiones conservadas dentro de mlpA, asd, dapG y ymfA (Figura 2), se amplificaron por PCR los fragmentos superpuestos de ADN que cubren un operón putativo MGA3 dap parcial. En total, se secuenció una región de ADN de 4465 pb que comprendía los genes putativos asd, dapG y dapA, además de partes de la supuesta putativa spoVFB y corriente abajo putativo ymfA (Figura 2). Los productos génicos deducidos de asd, dapG y dapA (351, 413 y 290 aminoácidos, respectivamente) muestran las identidades de secuencia primarias más altas a aspartato semialdehído deshidrogenasa, AKI y dihidrodipicolinato sintasa de Bacillus sp. NRRL B-14911 (76, 85 y 79%, respectivamente). El producto del gen dapG deducido es 68% idéntico al AKI de B.subtilis str. 168, para la cual se verificó experimentalmente la actividad de AK (Chen et al., (1993) supra), mientras que la identidad de secuencia primaria con AKII y AKIII de B. subtilis es baja (38% y 24%, respectivamente). Esto sugiere que el gen dapG de B. methanolicus codifica una isoenzima putativa de AKI.

La organización de asd, dapG y dapA con igual orientación y regiones intergénicas cortas (31 y 14 nucleótidos, respectivamente) es similar a la de B. subtilis (Figura 2), donde estos tres genes se transcriben como una unidad durante el crecimiento vegetativo (Chen et al., (1993) supra). Las regiones intergénicas cortas del operón putativo dap de MGA3 no permiten la formación de estructura secundaria de ARNm evidente. Esto parece estar en contraste con dos posibles estructuras secundarias del transcripto ASD-dapG de 91 nucleótidos de largo intergénico de B. subtilis. Se ha sugerido que estas estructuras secundarias difieren en la disponibilidad del sitio de unión al ribosoma dapG para la interacción con ARN ribosómico 16S y representan un posible mecanismo para regular negativamente la expresión de dapG-dapA en relación con asd (Chen et al., (1993) supra).

Construcción de un sistema de clonación y expresión de casete para B. methanolicus

Hemos construido un sistema de expresión de casete como una herramienta para la sobreexpresión genética simplificada en B. methanolicus basada en mdh y el vector lanzadera de E. coli -B. methanolicus pHP13 (Brautaset et al., (2004) supra, Jakobsen et al., (2006) supra). Mediante la introducción de un único sitio de restricción parcialmente solapando el codón de inicio mdh y sitios de restricción únicos corriente abajo de la región codificadora, este sistema de casete ofrece una estrategia de clonación simple para la fusión en marco de cualquier región codificadora a la región promotora mdh y al sitio de unión al ribosoma.

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La expresión recombinante de dapG y yclM confirma que codifican la actividad de AK

Para la sobreexpresión de genes AK en B. methanolicus, se establecieron los vectores de expresión pHP13mpdapG, pHP13mp-lysC y pHP13mp-yclM, en los que los genes dapG, lysC y yclM están bajo control del promotor mdh y del sitio de unión al ribosoma. Por lo tanto, en estas construcciones, los genes codificadores de AK se liberan de cualquier regulación de transcripción original por productos de la ruta aspartato. Estos vectores de expresión se introdujeron en el MGA3 de tipo salvaje, y se estableció MGA3 (pHP13) como una cepa de control. Se comparó la actividad de AK en extractos crudos preparados a partir de MGA3 y las cepas recombinantes cultivadas en matraces de agitación en medio de metanol definido. Los resultados (Figura 3) muestran que los extractos crudos de las cepas recombinantes que sobreexpresan AKI y AKIII putativos (codificados por dapG y yclM, respectivamente) y AKII (codificado por lysC) muestran actividades AK in vitro cuatro a cuarenta veces más específicas que la de la cepa de control. Estos resultados confirman la función bioquímica deducida de los productos génicos dapG y yclM. Como era de esperar, la cepa de tipo salvaje MGA3 y la cepa de control MGA3 (pHP13) expresan actividades similares de AK. Curiosamente, la sobreexpresión de lysC dio actividad AK in vitro 10 veces más alta en comparación con dapG y yclM. Se desconoce si esto se debe a un mayor nivel de expresión o a diferentes propiedades bioquímicas de las proteínas AK medidas in vitro. Para todas las muestras, se pudo medir una actividad específica in vitro similar a diferentes diluciones del extracto bruto (datos no mostrados), lo que indica que la regulación de retroalimentación no afectó a los resultados del ensayo enzimático.

La sobreexpresión de dapG, lysC y yclM conduce a un aumento de la producción de L-lisina en B. methanolicus MGA3

Con el fin de evaluar el efecto del aumento de la expresión de dapG, lysC y yclM en la producción de L-lisina en el tipo B. methanolicus salvajes, se realizaron ensayos de fermentación discontinua de alta densidad celular en medio de metanol definido con las cepas recombinantes establecidas. La producción de aminoácidos (definida como la cantidad de aminoácidos secretada en el medio de crecimiento) se monitorizó a lo largo de las fermentaciones. Para comparar diferentes ensayos de biorreactor, se han corregido todas las concentraciones de biomasa y la producción de aminoácidos aquí descritas para la dilución causada por la alimentación durante la fermentación (véase MATERIALES Y MÉTODOS).

En las condiciones ensayadas, el MGA3 de tipo salvaje alcanzó una concentración máxima de biomasa de 58 g/l en 23 horas con una tasa de crecimiento específico inicial de 0.49 h-1. La producción final de L-lisina de MGA3 fue de

0.18 g/l, de acuerdo con resultados anteriores (Schendel et al., (1990) supra; Brautaset et al., (2003) supra). La cepa de control MGA3 (pHP13) fue similar al tipo salvaje con respecto a la tasa de crecimiento específico, la densidad celular máxima y la producción de L-lisina, lo que indica que el pHP13 no produce efectos sobre estas propiedades (Figura 4 y Tabla 3). Curiosamente, todas las cepas recombinantes que sobreexpresan dapG, lysC o yclM produjeron más L-lisina que la cepa control, y mantuvieron una tasa de crecimiento específico similar (Tabla 3). El efecto más dramático sobre la producción de L-lisina se observó con la cepa MGA3 (pHP13mp-yclM), que produjo más de 60 veces más L-lisina (11 g/l) que la cepa control (Figura 4 y Tabla 3). Las cepas recombinantes que sobreexpresaban dapG y lysC mostraron un aumento de 2 veces y 10 veces en la producción de L-lisina, respectivamente. Todas las cepas fueron similares con respecto a la producción de L-glutamato (48-52 g/l), y la producción de los otros productos finales de la ruta aspartato, L-metionina (<0.5 g/l) y L-treonina (<0.1 G/l) se mantuvo bajo. Para verificar la reproducibilidad de los ensayos de fermentación, se realizaron MGA3(pHP13) y MGA3(pHP13mp-yclM) dos veces en ensayos de fermentación independientes. La densidad óptica y la concentración de aminoácidos variaron menos del 10% entre los ensayos de fermentación paralelos en cualquier punto de muestreo, y la tasa de crecimiento específico calculada no varió más de +/-0.02 h-1 .

Tabla 3 Tasa de crecimiento específica inicial, peso máximo de células secas y producción final de L-lisina de MGA3 de tipo salvaje de B. methanolicus y cepas recombinantes que sobreexpresan dapG, lysC y yclM.

Cepa: Tasa de crecimiento específica [h-1] Peso celular seco [g/l]1 Producción de Llisina [g/l]1 L-lisina en medio de crecimiento [g/l]2

MGA3: 0.49 58 0.18 0.12

MGA3(pHP13): 0.49 56 0.18 0.12

MGA3(pHP13mp-dapG): 0.50 62 0.38 0.23

MGA3(pHP13mp-lysC): 0.46 61 1.8 1.1

MGA3(pHP13mp-yclM): 0.50 54 11 7.0

1) La biomasa reportada y la producción de L-lisina se corrigen para la dilución causada por la alimentación durante la fermentación con el fin de comparar los resultados de diferentes ensayos de biorreactor (ver Materiales y Métodos). 2) Concentración de L-lisina medida en medio de crecimiento (sin corrección de volumen).

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Ejemplos 2 y 3 -materiales y métodos

Información adicional no descrita aun en los Materiales y Métodos del Ejemplo 1.

Manipulación del ADN y condiciones de crecimiento

Se realizó clonación general, PCR, secuenciación de ADN y fermentaciones como ya se describió en el Ejemplo 1. El crecimiento de B. metanolicus sobre manitol se hizo utilizando medio Mann20 que es igual a 2 x Mann10 como se describe en Jakobsen et al., (2006) J Bacteriol., 188 (8): 3063-3072.

Medición de L-lisina

Las mediciones de L-lisina se realizaron usando HPLC como se describe en el Ejemplo 1.

PCR en tiempo real

Se hicieron crecer cultivos de B. methanolicus hasta la fase logarítmica tardía (OD600=3), antes de la recolección. La lisis celular incluyendo la protección de ARN, el aislamiento del ARN total y la síntesis de ADNc concomitante se realizaron como se describe en otra parte (Jakobsen et al., 2006, supra). Las concentraciones totales de ARN se cuantificaron utilizando un espectrofotómetro NanoDrop® ND-1000 (NanoDrop Technologies). Los cebadores para los experimentos de PCR en tiempo real fueron diseñados mediante el software Primer ExpressR v 2.0 (Applied Biosystems). La detección de productos de PCR se realizó con el sistema ABI 7500 (Applied Biosystems) bajo los siguientes perfiles. Para el ensayo de eficiencia de cebador, las mezclas de reacción se incubaron a 95ºC durante 10 min para activar la polimerasa Taq de inicio en caliente seguido de un protocolo de PCR de dos etapas (desnaturalización durante 15 seg a 95ºC seguido por una etapa combinada de fusión-extensión (con adquisición de datos fluorescentes) durante 1 min a 60°C). Este paso se repitió en 40 ciclos. La determinación de la temperatura de disociación se realizó por un ciclo subsiguiente con 15 seg a 95°C, 1 min a 60°C y un paso final a 95°C durante 15 seg. Para los estudios comparativos de PCR cuantitativa en tiempo real, el perfil se redujo a los pasos utilizados para la prueba de eficiencia de cebador. La adquisición y el análisis de datos se realizaron con la versión de software de detección de secuencias v1.2.3 (Applied Biosystems Inc.) bajo reacción estandarizada con señal SYBR.

Construcción de vectores de expresión

pTH1mp-lysC:

El plásmido pHP13 (Jakobsen et al., 2006, supra) se digirió con PciI, y los extremos cohesivos resultantes se amortiguaron usando ADN Polimerasa T4, y los extremos religaron para dar el plásmido pTH1. Se digirió el plásmido pHP13mp-lysC (Ejemplo 1) con PstI/EcoRI y se aisló el fragmento de 2.6 kb y se ligó en los sitios correspondientes de pTH1, dando lugar a la clonación de casete con un vector de expresión pTH1mp-lysC. Este vector es análogo al plásmido HP13mp-lysC y tiene un único sitio PciI para la clonación en un solo paso de cualquier gen codificador corriente abajo del promotor mdh fuerte y en el marco con la región mdh rbs.

pTH1mp-asd, pTH1mp-dapA y pTH1mp-lysA

Los fragmentos de ADN con las regiones codificadoras de asd (1117 pb), dapA(904 pb) y lysA (1322 pb) se amplificaron por PCR a partir del ADN total de B. metanolicus usando los siguientes pares de cebadores: asd-F: 5’-

GCGCACATGTGGGTCAAGAAAATGGTCTTC-3’ ATGGTACCTGCCCCCGAATTTTTGAAC-3’(SEQ GCGCACATGTGGTTTCATTTGGTCGAATATC-3’(SEQ ATGGTACCGGCAGTAAAAACTCCATTGAT-3’(SEQ: (SEQ ID ID ID ID NO: NO: NO: NO: 30) 31) 32) 33) asd-R: dapA-F: dapA-R: lysA-F: 5’5’5’5’-

GCGCACATGTGTATTTTCATGGCACAACA-3’(SEQ: ID NO: 34) lysA-R: 5’-

ATGGTACCGCAGCTTAGTATCTTACTCT-3’(SEQ ID NO: 35) los sitios de restricción PciI y KpnI están subrayados en los cebadores directo e inverso, respectivamente. Los productos de PCR obtenidos se digirieron en extremo con PciI/KpnI y se ligaron en los sitios correspondientes de pTH1mp-lysC (sustituyendo el gen lysC), dando los vectores de expresión pTH1mp-asd, pTH1mpdapA y pTH1mp-lysA, respectivamente. Los insertos en todos los plásmidos se verificaron mediante secuenciación de ADN.

pHP13mp-yclM + lysA

El plásmido pTH1mp-lysA se digirió con SpeI/NcoI y el fragmento de 1.8 kb se ligó al vector pHP13mpyclM digerido con XbaI/NcoI, produciendo el plásmido pHP13mp-yclM+lysA.

pTH1mp-dapA + yclM

El plásmido pHP13mp-yclM se digirió con SpeI/NcoI y el fragmento de 1.9 kb se purificó y se ligó en sitios pTH1mpdapA XbaI/NcoI, dando lugar al vector de expresión pTHmp-dapA + yclM.

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Claims

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