ES2900273T3 - Procedimiento para la producción de L-ornitina bajo empleo de bacterias de sobreexpresión de lisis - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la producción de L-ornitina, caracterizado por que se realizan los siguientes pasos a) fermentación de una bacteria que excreta L-ornitina, seleccionada a partir del grupo Corynebacterium, Bacillus, Streptomyces, Arthrobacter y de Enterobacteriaceae, en la que se presenta sobreexpresado un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene la actividad de un exportador de L-ornitina y cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la SEQ ID NO: 2 o cuya secuencia de aminoácidos se puede obtener mediante un total como máximo de 25 deleciones, inserciones, sustituciones y/o adiciones N-, o bien C-terminales de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, en un medio b) acumulación de L-ornitina en el medio, obteniéndose un caldo de fermentación, y c) excluyéndose para la sobreexpresión el plásmido pEC7lysE depositado en DSM23239.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para la producción de L-ornitina bajo empleo de bacterias de sobreexpresión de lisis

Estado de la técnica

L-ornitina es conocida por su efecto estimulante para la función hepática y se utiliza frecuentemente como componente de medicamentos en la nutrición deportiva.

Actualmente se produce L-ornitina a través de diferentes procedimientos. Un método es la producción fermentativa con ayuda de microorganismos. Otro método es la hidrólisis alcalina de arginina, por ejemplo, con hidróxido de bario (CN 1594282 A). Otro método es la biotransformación de arginina mediante microorganismos inmovilizados que poseen una actividad de arginina (KR589121B1). En la literatura de patentes se describe además un método para la producción de L-ornitina a partir de L-citrulina (JP 42007767 B4).

En la bibliografía se describen microorganismos que se distinguen por que excretan L-ornitina en el medio de cultivo. En el caso de los microorganismos se trata, por ejemplo, de bacterias de la especie Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus (JP 43010996 B4, JP 57041912 B), Escherichia (US 3668072 A), Providencia (JP 03195494) o Arthrobacter (US 3574061).

Los microorganismos que producen L-ornitina se distinguen frecuentemente por que son auxótrofos para los aminoácidos L-arginina o L-citrulina (descritos para Brevibacterium, Bacillus, Corynebacterium in EP392708B1 und KR161147B1 y para Escherichia en US366072A). Además, se describen microorganismos que poseen una resistencia frente a 2-tiazol-alanina, sulfaguanidina o 2-fluor-piruvato (solicitud de patente japonesa sin examinar N° 61-119194). En el documento EP0393708B1 se describen productores de L-ornitina que se distinguen por una menor resistencia frente a ornitol y ácido micofenólico. Las citadas propiedades se pueden presentar también en combinación entre sí.

Los aminoácidos básicos como L-lisina, L-arginina y L-ornitina llegan muy deficientemente por difusión pasiva a partir de la célula (Bellmann et al. (Microbiology 2001; 147:1765-74)). Esto se describe convenientemente en el ejemplo de lisina. Vrlijc et al. (Journal of Bacteriology 1995; 177(14):4021 -7) analizaron varios mutantes de Corynebacterium glutamicum deficientes en exportación. En un mutante se midió una concentración intracelular de 174 mM de L-lisina, mientras que extracelularmente se pudieron medir solo 0,7 mM.

Vrlijc et al. (Molecular Microbiology 1996; 22(5):815-26 y Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology 1999; 1:327-336) y en el documento EP0868527B1 identificaron y describieron un nuevo exportador como exportador de L-lisina (LysE). Un mutante nulo de LysE definido ya no podía transportar L-lisina a partir de la célula. El polipéptido codificado por el gen lysE tiene una longitud de 233 aminoácidos, o bien restos aminoácido, y se refleja en SEQ ID NO:2. Tras sobreexpresión del gen lysE en un productor de lisina se registró una excreción elevada de L-lisina.

Bellmann et al. (Microbiology 2001; 147:1765-74) caracterizaron más detalladamente el exportador LysE respecto al transporte de diferentes aminoácidos básicos en C. glutamicum. Los autores mostraron que el transportador exporta específicamente los aminoácidos L-lisina y L-arginina a partir de la célula. Además, los autores analizaron si LysE también exporta L-ornitina a partir de la célula. A tal efecto se produjo en primer lugar una cepa auxótrofa de C. glutamicum de L-arginina denominada ATCC13032::argF.

La cepa se cultivó en 50 ml (cultivo por cargas) de un medio mínimo denominado CGXII, que contenía 40 g/l de glucosa. Tras un tiempo de incubación de 24 horas se midieron 60 mM de L-ornitina, correspondientes a 7,9 g/l. Intracelularmente se midió una concentración de L-ornitina de aproximadamente 200 mM en las células de la cepa durante un tiempo de incubación de aproximadamente 70 minutos. Para aclarar si LysE también transporta L-ornitina a partir de la célula se transformó la cepa 13032::argF con el plásmido replicativo pEC7lysE. Mediante esta medida, la cepa debía obtener una actividad de LysE elevada y de este modo transportar en el medio L-ornitina con una tasa de exportación elevada. No obstante, la tasa de exportación de L-ornitina no se elevaría mediante esta medida. Tanto en el caso de la cepa de control (13032::argF) como también en el transformante (13032::argF que contiene pEC7lysE) se determinó la misma tasa de exportación (0,6 nmol min-1 (mg de peso anhidro)-1). Los autores concluyen que L-ornitina no se exporta mediante el exportador LysE. Además, razonaron que debe haber otra función de exportación desconocida (proteína de exportación) para L-ornitina en Corynebacterium glutamicum (Bellmann et al., 2001, página 1771, Fig. 5b), o bien página 1772 línea 21 -28).

En C. glutamicum R se identificó una variante de LysE (veáse SEQ ID NO:4), que se diferencia de la secuencia de aminoácidos del exportador LysE de la cepa ATCC 13032 representado en la SEQ ID NO:2 por un término N prolongado en tres restos aminoácido. En el caso de los restos aminoácido se trata de la secuencia metionina, valina, isoleucina (MVI). Este polipéptido LysE de la cepa R se describió en el documento EP1266966B1 como variante que se diferencia de la proteína de tipo salvaje en la formación de una región de bucle, o bien ya no puede formar este bucle y, por lo tanto, puede ocasionar una exportación mejorada de L-lisina y L-arginina.

Se describió otra variante de LysE por Gunji und Yasueda (Journal of Biotechnology 127, 2006, 1 -13). Los autores estaban interesados en la formación de L-lisina de la bacteria metilotrofa obligada Methylophilus methylotrophus. Estos transformaron M. methylotrophus con un plásmido denominado pSE, que contenía el gen lysE de C. glutamicum ATCC13869 para mejorar el enlace de lisina de M. methylotrophus. Sin embargo, los autores descubrieron que se podía establecer solo una forma mutada del gen lysE (lysE24) estable en M. methylotrophus etablieren. El marco de lectura abierto del gen lysE está desplazado en el alelo lysE24 mediante la inserción de un resto timina, de modo que se produce una interrupción del marco de lectura después de 432 bp. El marco de lectura acortado codifica para una proteína LysE acortada en 92 restos AS en posición C-terminal frente a la proteína LysE de tipo salvaje de C. glutamicum ATCC13869. Esta tiene una longitud de 141 restos aminoácido. Los últimos 6 aminoácidos C-terminales de la proteína acortada (restos 135-141) se diferencian además de los aminoácidos de la secuencia de aminoácidos LysE de tipo salvaje. Se verificó el enlace de lisina en una cepa de M. methylotrophus que porta el alelo LysE modificado en un plásmido (pSE24). A tal efecto se analizó la cepa durante 50 horas en 0,3 1 de un medio mínimo denominado SEIIc en forma de cultivo por cargas de alimentación.

Los autores encontraron que el transformante, además de 0,55 mM de L-lisina y 0,19 mM de L-arginina, también formaba cantidades reducidas (0,07 mM correspondientes a 11,8 mg/l) de L-ornitina. Los autores explican esto con una especificidad de sustrato modificada del transportador mutado, o bien aducen el acervo de L-arginina intracelular modificado de la cepa como posible explicación para la formación de L-ornitina observada. En la patente EP1266966B1 (inventores Gunji y Yasueda) se describe el efecto positivo del transportador LysE24 sobre la excreción de L-lisina y L-arginina.

Tarea de la invención

Es tarea de la invención la puesta a disposición de un nuevo procedimiento para la producción fermentativa de L-ornitina.

Descripción de la invención

Es objeto de la invención un procedimiento para la producción de L-ornitina, caracterizado por que se realizan los siguientes pasos:

a) fermentación de una bacteria que excreta L-ornitina, seleccionada a partir del grupo Corynebacterium, Bacillus, Streptomyces, Arthrobacter y de Enterobacteriaceae, en la que se presenta sobreexpresado un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene la actividad de un exportador de L-ornitina y cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la SEQ ID NO: 2 o cuya secuencia de aminoácidos se puede obtener mediante un total como máximo de 25 deleciones, inserciones, sustituciones y/o adiciones N-, o bien C-terminales de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, en un medio

b) acumulación de L-ornitina en el medio, obteniéndose un caldo de fermentación,

c) excluyéndose para la sobreexpresión el plásmido pEC7lysE depositado en DSM23239.

Si en lo sucesivo se menciona L-ornitina, el concepto también comprende sus sales, como por ejemplo el monohidrocloruro de L-ornitina o sulfato de L-ornitina.

Para un procedimiento según la invención se emplean bacterias seleccionadas a partir del grupo especie Corynebacterium, especie

Bacillus, especie Streptomyces, especie Arthrobacter y de la familia Enterobacteriaceae.

Dentro de la especie Corynebacterium son preferentes cepas que se basan en los siguientes tipos:

Corynebacterium efficiens, como por ejemplo de la cepa tipo DSM44549,

Corynebacterium glutamicum, como por ejemplo de la cepa tipo ATCC13032 o de la cepa R, y

Corynebacterium ammoniagenes, como por ejemplo de la cepa ATCC6871,

siendo muy especialmente preferente el tipo Corynebacterium glutamicum.

Algunos representantes del tipo Corynebacterium glutamicum son conocidos en el estado de la técnica también bajo otras denominaciones. A estas pertenecen, a modo de ejemplo:

cepa ATCC13870, que se denominó Corynebacterium acetoacidophilum,

cepa DSM20137, que se denominó Corynebacterium lilium,

cepa ATCC17965, que se denominó Corynebacterium melassecola,

cepa ATCC14067, que se denominó Brevibacterium flavum,

cepa ATCC13869, que se denominó Brevibacterium lactofermentum, y

cepa ATCC14020, que se denominó Brevibacterium divaricatum.

El concepto "Micrococcus glutamicus" para Corynebacterium glutamicum era asimismo de uso común. Algunos representantes del tipo Corynebacterium efficiens se denominaron también Corynebacterium thermoaminogenes en el estado de la técnica, como por ejemplo la cepa FERM BP-1539.

Dentro de la especie Bacillus es preferente el tipo Bacillus subtilis.

Dentro de la especie Arthrobacter es preferente el tipo Arthrobacter citreus.

Dentro de la familia de Enterobacteriacae son preferentes las especies Escherichia, Erwinia, Providencia, Pantoea y Serratia. Son especialmente preferentes las especies Escherichia y Serratia. En la especie Escherichia es especialmente preferente el tipo Escherichia coli, en la especie Serratia el tipo Serratia marcescens y en la especie Providencia el tipo Providencia rettgeri.

Las bacterias, o bien cepas (cepas de partida) empleadas para las medidas de sobreexpresión del exportador de L-ornitina poseen ya preferentemente la capacidad de excretar L-ornitina en el medio nutriente que las rodea, o acumular esta en el mismo. A tal efecto, en lo sucesivo se emplea la expresión “producir”. Las cepas empleadas para las medidas de sobreexpresión poseen en especial la capacidad de concentrar, o bien acumular > 0,1 g/l, > 0,3 g/l, > 1 g/l, > 3 g/l, > 10 g/l de L-ornitina en el medio de cultivo. En el caso de las cepas de partida se trata preferentemente de cepas que se produjeron mediante mutagénesis y selección, mediante técnicas de ADN recombinantes o mediante una combinación de ambos métodos.

Es obvio y no requiere más explicaciones que se puede llegar a una bacteria apropiada para las medidas de la invención también sobreexpresándose en una cepa salvaje, como por ejemplo en la cepa de tipo Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 o en la cepa ATCC 14067, en primer lugar un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene la actividad de un exportador de L-ornitina y cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la SEQ ID NO: 2 o cuya secuencia de aminoácidos se puede obtener mediante un total como máximo de 25 deleciones, inserciones, sustituciones y/o adiciones N-, o bien C-terminales de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, y produciéndose L-ornitina a continuación mediante otra medida genética que induce a la bacteria, descrita en el estado de la técnica. La transformación de un tipo salvaje, como por ejemplo la cepa ATCC13032, ATCC14067, ATCC13869 o ATCC17965, únicamente con el citado polinucleótido no conduce a un procedimiento según la invención. Las cepas de tipo Corynebacterium glutamicum que excretan, o bien producen L-ornitina son, a modo de ejemplo:

Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 2344, y

Corynebacterium glutamicum FERM-BP 2345 descrita en el documento US5188947.

Una cepa de tipo Arthrobacter citreus que excreta, o bien produce L-ornitina es, a modo de ejemplo:

Arthrobacter citreus FERM-BP 2342 descrita en el documento US5188947.

Una cepa de tipo Bacillus subtilis que excreta, o bien produce L-ornitina es, a modo de ejemplo:

Bacillus subtilis BOR-32 (FERM-P 3647) descrita en el documento JP57041912.

Una cepa de tipo Providencia rettgeri que excreta, o bien produce L-ornitina es, a modo de ejemplo: Providencia rettgeri ARGA6 (FERM P-11147) descrita en el documento beschrieben JP03195494.

Una cepa de tipo Escherichia coli que excreta, o bien produce L-ornitina es, a modo de ejemplo:

Escherichia coli B-19-19 (ATCC 21104) descrita en el documento US3668072.

Las bacterias que producen L-ornitina son típicamente auxótrofas para los aminoácidos L-citrulina o L-arginina. Alternativamente, también son concebibles bacterias que producen L-ornitina, que son braditrofos para L-citrulina o L-arginina. Se encuentran definiciones de los conceptos auxótrofo y braditrofo, a modo de ejemplo, en la página 9 del documento WO 01/09286. En el mundo técnico, los braditrofos se denominan también mutantes débiles. En el caso de las bacterias braditrofas se emplean en especial aquellas en las que la actividad de los productos génicos ArgF (ornitina carbamoiltransferasa), ArgG (argininosuccinato sintasa) o ArgH (argininosuccinato liasa) es mayor (>) que cero, pero menor o igual (<) a 10 por ciento, preferentemente > cero y < 1 %, en comparación con la actividad en el tipo salvaje.

En el estado de la técnica son conocidos polinucleótidos denominados gen lysE, que codifican para proteínas, o bien polipéptidos que poseen la actividad de un exportador de L-lisina. Estos polipéptidos se abrevian también como LysE.

Un exportador es una proteína que se presenta en la membrana celular de una célula y transporta un metabolito, por ejemplo, L-lisina o L-ornitina, del citoplasma de la célula al medio circundante. Si la energía necesaria para ello se pone a disposición en forma de adenosintrifosfato (ATP) se habla de transporte, o bien exportación, activo primario. Si esta se pone a disposición en forma de un gradiente de iones, por ejemplo, de iones sodio, se habla de transporte, o bien exportación, activo secundario (Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko y L. Stryer; Biochemie, 5a edición, páginas 378-384, editorial Spektrum Akademischer, Heidelberg, Alemania, 2003). Se encuentran instrucciones para la determinación de la actividad de exportación de L-ornitina en Bellmann et al. (Microbiology 2001; 147:1765-74).

En los trabajos que llevan a la presente invención se descubrió que los exportadores de lisina de las especies Corynebacterium, preferentemente Corynebacterium glutamicum y Micrococcus, preferentemente Micrococcus luteus, poseen la actividad de un exportador de L-ornitina adicionalmente a la actividad del exportador de L-lisina.

Para las medidas de la invención se emplean genes que codifican para polipéptidos con actividad de exportación para L-ornitina, cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la SEQ ID NO: 2 o cuya secuencia de aminoácidos se puede obtener mediante un total como máximo de 25 deleciones, inserciones, sustituciones y/o adiciones N-, 0 bien C-terminales de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

Son exportadores de L-ornitina dados a conocer, a modo de ejemplo, los exportadores de lisina, o bien polipéptidos LysE de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (SEQ ID NO:2), Corynebacterium glutamicum R (SEQ ID NO:4), Corynebacterium glutamicum ATCC14067 (SEQ ID NO:5), Corynebacterium glutamicum ATCC13869 (SEQ ID NO:7), Corynebacterium efficiens YS-314 (SEQ ID NO:9), Corynebacterium diphteriae NCTC 13129 (SEQ ID NO:10), Corynebacterium striatum ATCC6940 (SeQ ID NO:11, Corynebacterium aurimucosum ATCC700975 (SEQ ID NO:12), Corynebacterium matruchotii ATCC33806 (SEQ ID NO:13), Corynebacterium pseudogenitalium ATCC33035 (SEQ iD NO:14), Corynebacterium accolens ATCC49725 (SEQ ID No :15), Corynebacterium glucuronalyticum ATCC 51867 (SEQ ID No :16), Micrococcus luteus NCTC2665 (SEQ ID NO:17), Corynebacterium tubuculostearicum SK141 (SEQ ID NO:18) y Corynebacterium matruchotii ATCC14266 (SEQ ID No :19). SEQ ID NO:18 y SEQ ID NO:19 se denominan también polipéptidos ArgO en el mundo técnico.

En este trabajo se determinó la secuencia de nucleótidos de los genes lysE de Corynebacterium glutamicum ATCC14067 y Corynebacterium glutamicum ATCC13869 (SEQ ID NO:6 y SEQ ID n O:8). Las secuencias de aminoácidos del polipéptido LysE de Corynebacterium glutamicum ATCC14067 y Corynebacterium glutamicum ATCC13869 se representan en SEQ ID NO:5 y 7. Estas son idénticas a la secuencia de aminoácidos de LysE de C. glutamicum ATCC13032 representadas en SEQ ID NO:2.

En la Tabla 1 se indican los números de acceso (accesion number) de polipéptidos LysE de diferentes representantes de la especie Corynebacterium y de Micrococcus luteus, que se extrajeron de los bancos de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, US). Además, en la Tabla 1 se remite a las secuencias de aminoácidos del polipéptido LysE reflejada en el protocolo de secuencia. Finalmente, en la Tabla 1 se indica la longitud (número de aminoácidos) del polipéptido LysE codificado.

Tabla 1

En la Figura 1 se representa una comparación múltiple (múltiple sequence alignment) de secuencias de aminoácidos de polipéptidos LysE de las bacterias indicadas en la Tabla 1. Las comparaciones de secuencias de aminoácidos representadas en la Figura 1 se elaboraron con el programa Clone Manager 9 Professional Edition (Scientific & Educational Software 600 Pinner Weald Way Ste 202 Cary NC 27513 USA). Como molécula de referencia para la comparación se empleó el polipéptido LysE (LysE) de ATCC13032. Para la matriz de encuentro (scoring matrix) se seleccionó el ajuste "Blosum 62" (véase: Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko y L. Stryer; Biochemie, 5a edición, páginas 194-197, editorial Spektrum Akademischer, Heidelberg, Alemania, 2003)).

En caso dado, también se pueden emplear los programas descritos en el estado de la técnica, como por ejemplo el programa ClustalX (Thompson, J.D., Gibson,T.J., Plewniak,F., Jeanmougin,F. and Higgins,D.G. (1997). The ClustalX Windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research, 25:4876-4882).

Los restos de aminoácido 4-236 del polipéptido LysE de Corynebacterium glutamicum R (véase SEQ ID NO:4) corresponden a la secuencia de aminoácidos de LysE de C. glutamicum ATCC13032 representada en la SEQ ID NO:2. En el término N, el polipéptido de C. glutamicum R posee adicionalmente una secuencia de tres restos de aminoácido (metionina-valina-isoleucina). Estos restos adicionales se producen si alternativamente al codón de iniciación del gen lysE en C. glutamicum ATCC13032 (véase SEQ ID NO:1) se emplea el codón de iniciación presente 9 pares de bases más adelante en línea de entrada del gen lysE.

La secuencia de aminoácidos del polipéptido LysE de C. efficiens YS-314 es un 71 % y la de C. diphteriae NCTC 13129 un 44 %, la de Corynebacterium striatum ATCC6940 es un 44 %, la de Corynebacterium aurimucosum ATCC700975 es un 42 %, la de Corynebacterium matruchotii ATCC33806 es un 43 %, la de Corynebacterium pseudogenitalium ATCC33035 es un 43 %, la de Corynebacterium accolens ATCC49725 es en un 43 %, la de Corynebacterium glucuronalyticum ATCC 51867 es en un 36 %, la de Micrococcus luteus NCTC2665 es en un 40 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de LysE de C. glutamicum ATCC13032 representada en SEQ ID NO:2. Además, la secuencia de aminoácidos del polipéptido ArgO de C. tubuculostearicum SK141 es en un 43 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2. Además, la secuencia de aminoácidos del polipéptido ArgO de C. matruchotii ATCC14266 es en un 44 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2. El porcentaje de identidad se elaboró mediante creación de un alineamiento de secuencia global con ayuda del programa Clone Manager 9 bajo empleo del ajuste Blosum 62 (véase Fig. 2).

Los genes lysE, es decir, los polinucleótidos que codifican para polipéptidos con la actividad de un exportador de L-ornitina, se pueden aislar a partir de los organismos por medio de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) bajo empleo de cebadores apropiados. Se encuentran instrucciones, entre otros, en el manual de laboratorio "PCR" de Newton y Graham (editorial Spektrum Akademischer, Heidelberg, Alemania, 1994) y en el documento WO 2006/100211 en las páginas 14 a 17.

Para un procedimiento según la invención se emplean de modo especialmente preferente genes que codifican para polipéptidos con actividad de exportación de L-ornitina, cuya secuencia de aminoácidos contiene una o varias de las características seleccionadas a partir del grupo

a) secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4,

b) secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:2 incluyendo una o varias, como máximo 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 deleción (deleciones) de aminoácidos,

c) secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:2 incluyendo una o varias, como máximo 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 inserción (inserciones) de aminoácidos, y

d) secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:2 incluyendo una o varias, como máximo 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, o 1, preferentemente como máximo 5, 4, 3, 2, o 1 intercambio(s) (sustitución (sustituciones)) de aminoácidos.

e) secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:2 incluyendo una o varias, como máximo 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2,

1, preferentemente como máximo 5, 4, 3, 2 o 1 adición (adiciones)

de aminoácidos en el término N y/o en el término C. En caso dado son preferentes intercambios de aminoácidos conservadores. En el caso de los aminoácidos aromáticos, se habla de intercambios conservadores si se intercambian fenilalanina, triptófano y tirosina entre sí. En el caso de los aminoácidos hidrófobos, se habla de intercambios conservadores si se intercambian leucina, isoleucina y valina entre sí. En el caso de aminoácidos polares, se habla de intercambios conservadores si se intercambian glutamina y asparagina entre sí. En el caso de los aminoácidos básicos, se habla de intercambios conservadores si se intercambian arginina, lisina e histidina entre sí. En el caso de los aminoácidos ácidos, se habla de intercambios conservadores si se intercambian ácido aspártico y ácido glutámico entre sí. En el caso de los aminoácidos que contienen grupos hidroxilo, se habla de intercambios conservadores si se intercambian serina y treonina entre sí.

Se dan a conocer polinucleótidos que hibridan con la secuencia de nucleótidos complementaria a SEQ ID NO:1, a modo de ejemplo la región codificante de SEQ ID NO:1, bajo condiciones estrictas, y codifican para un polipéptido con actividad de exportación de L-ornitina, siendo la secuencia de aminoácidos de la proteína modificada > en un 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, y encontrándose, en caso dado, la longitud del polipéptido codificado en los intervalos de longitud descritos anteriormente. El especialista encuentra instrucciones para la hibridación de ácidos nucleicos, o bien polinucleótidos, entre otros, en el manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" de la firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993) y en Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)). La hibridación tiene lugar bajo condiciones estrictas, es decir, se forman solo híbridos en los que la sonda, es decir, un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos complementaria a SEQ ID NO:1, a modo de ejemplo la región codificante de SEQ ID NO:1, y la secuencia objetivo, es decir, los polinucleótidos tratados con la sonda, o bien identificados, son idénticos al menos un 70 %. Es sabido que el rigor de hibridación, incluyendo los pasos de lavado, es influido, o bien se determina mediante variación de la composición del tampón, de la temperatura y de la concentración de sales. La reacción de hibridación se realiza en general con rigor relativamente reducido en comparación con los pasos de lavado (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).

Para la reacción de hibridación se puede emplear, a modo de ejemplo, un tampón correspondiente a tampón 5x SSC a una temperatura de aproximadamente 50°C - 68°C. En este caso, las sondas se pueden hibridar también con polinucleótidos que presentan menos del 70 % de identidad respecto a la secuencia de nucleótidos de la sonda empleada. Tales híbridos son menos estables y se eliminan mediante lavado bajo condiciones estrictas. Esto se puede conseguir, a modo de ejemplo, mediante reducción de la concentración de sales a 2x SSC o 1x SSC y en caso dado seguidamente 0,5x SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania, 1995), ajustándose una temperatura de aproximadamente 50°C - 68°C, aproximadamente 52°C - 68°C, aproximadamente 54°C - 68°C, aproximadamente 56°C - 68°C, aproximadamente 58°C - 68°C, aproximadamente 60°C - 68°C, aproximadamente 62°C - 68°C, aproximadamente 64°C - 68°C, aproximadamente 66°C - 68°C. Son preferentes intervalos de temperatura de aproximadamente 64°C - 68°C o aproximadamente 66°C - 68°C. En caso dado es posible reducir la concentración de sales hasta una concentración correspondiente a 0,2x SSC o 0,1x SSC. En caso dado, el tampón SSC contiene dodecilsulfato sódico (SDS) en una concentración de 0,1 %. Mediante aumento gradual de la temperatura de hibridación en pasos de aproximadamente 1-2°C de 50°C a 68°C se pueden aislar fragmentos de polinucleótido que poseen al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 92 %, al menos un 94 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 %, en caso dado un 100 % de identidad respecto a la secuencia, o bien secuencia complementaria de la sonda empleada y codifican para un polipéptido con actividad de exportación de L-ornitina. En el mercado se encuentran disponibles otras explicaciones para la hibridación en forma de los denominados kits (por ejemplo DIG Easy Hyb von der Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Catalog No.

1603558).

Para las medidas de la invención se sobreexpresa un polinucleótido en una bacteria, o bien cepa de partida o madre productora de L-ornitina, que codifica para una proteína que posee actividad de exportación de L-ornitina, siendo la secuencia de aminoácido idéntica a SEQ ID NO: 2 o pudiéndose obtener su secuencia de aminoácidos mediante un total como máximo de 25 deleciones, inserciones, sustituciones y/o adiciones N-, o bien C-terminales de aminoácidos a partir de SEQ ID NO: 2.

Generalmente se entiende por sobreexpresión un aumento de la concentración o actividad intracelular de un ácido ribonucleico, de una proteína (polipéptido) o de una enzima en comparación con la cepa de partida (cepa madre) o cepa de tipo salvaje, cuando esta esta la cepa de partida. Se entiende por una cepa de partida (cepa madre) la cepa en la que se realizó la medida que conduce a la sobreexpresión.

Los conceptos proteína y polipéptidos se consideran intercambiables.

En el caso de la sobreexpresión son preferentes los métodos de sobreexpresión recombinante. En estos se reúnen todos los métodos en los que se produce un microorganismo bajo empleo de una molécula de ADN dispuesta in-vitro. Tales moléculas de ADN comprenden, a modo de ejemplo, promotores, casetes de expresión, genes, alelos, regiones codificantes, etc. Estas se transforman en el microorganismo deseado mediante métodos de transformación, conjugación, transducción o métodos similares.

Mediante las medidas de sobreexpresión se aumenta la actividad o la concentración del correspondiente polipéptido generalmente en al menos 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 % o 500 %, bevorzugt maximal bis 1000 %, 2000 %, 4000 %, 10000 % o 20000 %, referido a la magnitud de la actividad o concentración del polipéptido en la cepa antes de la medida que conduce a la sobreexpresión.

En caso dado, en el empleo de cepas del tipo Corynebacterium glutamicum, la actividad de exportación de L-ornitina en la cepa ATCC13032 o ATCC14067 o ATCC13869 o ATCC17965 es un punto de referencia apropiado para la determinación de la sobreexpresión. En el caso de empleo de cepas que se basan, o bien tienen su origen en ATCC13032, la cepa ATCC13032 es un punto de referencia apropiado. Un ejemplo a tal efecto es la cepa ATCC 13032_Delta_argFRGH/pVWEx1_lysE, que se basa en la cepa ATCC13032, producida en los trabajos que conducen a la presente invención. En el caso de empleo de cepas que se basan, o bien tienen su origen en ATCC14067, la cepa ATCC14067 es un punto de partida apropiado. En el caso de empleo de cepas que se basan, o bien tienen su origen en ATCC13869, la cepa ATCC13869 es un punto de referencia apropiado. Otros puntos de referencia apropiados resultan de modo correspondiente.

En caso dado, en el caso de empleo de cepas de tipo Escherichia coli, preferentemente la cepa de Escherichia coli K12, la actividad de exportación de L-ornitina en la cepa MG1655 es un punto de referencia apropiado para la determinación de la sobreexpresión.

En el estado de la técnica se dispone de una variedad de métodos para la consecución de una sobreexpresión.

A estos pertenecen el aumento del número de copias y la modificación de las secuencias de nucleótidos que dirigen, o bien controlan la expresión del gen. La transcripción de un gen se controla, entre otras cosas, mediante el promotor, y en caso dado mediante proteínas que reprimen la transcripción (proteínas represoras) o la fomentan (proteínas activadoras). La traslación de ARN formado se controla, entre otras maneras, mediante el punto de enlace ribosómico y el codón de iniciación. Los polinucleótidos, o bien las moléculas de ADN que comprenden un promotor y un punto de enlace ribosómico, y en caso dado un codón de iniciación, también se denominan casete de expresión.

A estos también pertenece el empleo de variantes de polipéptidos, o bien enzimas, que presenten una actividad catalítica elevada.

El aumento del número de copias se puede efectuar mediante plásmidos que se replican en el citoplasma de la bacteria. A tal efecto, en el estado de la técnica se describe una variedad de plásmidos para los más diversos grupos de microorganismos, con los que se puede ajustar el aumento de número de copias deseado. Se describen plásmidos apropiados para la especie Escherichia, a modo de ejemplo, en Handbuch Molecular Biology, Labfax (Ed.: T. A. Brown, Bios Scientific, Oxford, UK, 1991). A modo de ejemplo, se describen plásmidos apropiados para la especie Corynebacterium en Tauch et al. (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 27-40, (2003)), o en Stansen et al. (Applied and Environmental Microbiology 71,5920-5928 (2005)).

El empleo del plásmido pEC7lysE depositado en DSM 23239 para el aumento del número de copias en cepas de Corynebacterium glutamicum se excluye por las medidas que conducen a la invención. La secuencia de nucleótidos del plásmido pEC7lysE se determinó y se representa en s Eq ID NO:29.

El aumento del número de copias en al menos una (1) copia se puede efectuar además mediante inserción de otras copias en el cromosoma de la bacteria. Se describen métodos apropiados para la especie Corynebacterium, preferentemente Corynebacterium glutamicum, a modo de ejemplo, en la solicitud de patente WO 03/014330, WO 03/040373 y WO 04/069996. En el documento WO 03/014330 se describen métodos para la duplicación tándem de genes en el lugar génico nativo. En el documento WO 03/040373 se describen métodos para incorporar una segunda o tercera copia de un gen en otros lugares génicos, no siendo esencial el respectivo lugar génico para el crecimiento o la producción del respectivo aminoácido, en el caso de la presente invención L-ornitina. Se describen lugares génicos apropiados para la incorporación de una segunda, o bien otra copia del gen lysE en un procedimiento según la invención, a modo de ejemplo los genes odh, sucA, dapA, dapB, ddh, lysA, argR, argF, argG y argH. En el documento WO 04/069996 (véase Tablas 12 y 13) se describen regiones intergénicas y genes que codifican para fagos, o bien componentes de fagos, de C. glutamicum, que son apropiados para la incorporación de otras copias del gen lysE.

Son métodos apropiados para la especie Escherichia, a modo de ejemplo, la incorporación de una copia génica en el sitio att del fago (Yu y Court, Gene 223, 77-81 (1998)), la amplificación cromosómica con ayuda del fago Mu, como se describe en el documento EP 0 332 448, o los métodos de intercambio génico con ayuda de plásmidos replicantes de manera condicional descritos por Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 174, 4617 - 4622 (1989)) o Link et al. (Journal of Bacteriology 179, 6228-6237 (1997)).

El aumento de la expresión génica se puede conseguir además mediante empleo de un promotor fuerte, que se enlaza funcionalmente al gen a expresar. Preferentemente se emplea un promotor que es más fuerte que el promotor natural, es decir, presente en el tipo salvaje o en la cepa madre. En el estado de la técnica se dispone de una variedad de métodos para ello.

Se encuentran promotores y sistemas de expresión apropiados para la especie Corynebacterium, entre otras, en las solicitudes de patente EP 0629 699 A2, US 2007/0259408 A1 (promotor gap), WO 2006/069711, EP 1881 076 A1, WO 2008/088158, WO 2009/025470 (promotor butA, promotor pyk), US 6,861,246 (variante MC20 y MA16 del promotor dapA) y EP 1 918 378 A1 (promotor sod) y en descripciones de síntesis, como el "Handbook of Corynebacterium glutamicum'' (Eds.: Lothar Eggeling y Michael Bott, CRC Press, Boca Raton, US (2005)) o el libro "Corynebacteria, Genomics and Molecular Biology" (Ed.:Andreas Burkovski, Caister Academic Press, Norfolk, UK (2008)). Se describen ejemplos de promotores que permiten una expresión controlada, es decir, inducible o reprimible, a modo de ejemplo en Tsuchiya y Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)) beschrieben.

Desde hace tiempo son conocidos promotores apropiados para la especie Escherichia. A estos pertenecen, entre otros, los promotores clásicos promotor lac, promotor trp, los promotores híbridos tac y trc, los promotores PL y PR del fago A. Del mismo modo se pueden emplear los promotores del fago T7, los promotores gear-box, el promotor nar o los promotores de los genes rrsG, rnpB, csrA, csrB, ompA, fusA, pepQ, rplX o rpsG. Permite una expresión controlada, a modo de ejemplo, el sistema cI857-PR o el sistema cI857-PL del fago A (Gotting et al., BioTechniques 24, 362-366 (1998)). Se encuentran descripciones de síntesis en Makrides (Microbiological Reviews 60(3), 512-538 (1996)) o el manual "Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology" (F. C. Neidhardt (Editor in Chief), ASM Press, Washington, US (1996)).

Tales promotores o casetes de expresión se emplean típicamente a una distancia de 1 a 1000, preferentemente 1 a 500 nucleótidos en línea de entrada del primer nucleótido del codón de iniciación de la región codificante del gen. A distancia de 1 significa que el promotor o el casete de expresión se posiciona directamente antes de la primera base del codón de iniciación de la región codificante.

Para el aumento de la expresión del gen lysE en C. glutamicum se insertarn promotores apropiados, como por ejemplo el promotor sod de von C. glutamicum (véase SEQ ID NO:1 del documento EP 1918 378 A1) o el promotor gap de C. glutamicum (véase SEQ NO:3 del documento US 2007/0259408) preferentemente entre la posición 930 y 990 de SEQ ID NO:1.

En el caso de empleo casetes de expresión que contienen un promotor y un punto de enlace ribosómico (RBS), como por ejemplo la unidad de expresión del gen sod de C. glutamicum (véase SEQ ID NO:2 del documento EP 1918378 A1) o la unidad de expresión del gen gap de C. glutamicum, descrito en el documento US 2007/0259408 y reflejado en SEQ ID NO:28 (y denominado PgapRBS en esta), en el caso de C. glutamicum estos se insertan preferentemente entre la posición 930 y 1001, de modo especialmente preferente entre la posición 1000 y 1001 de SEQ ID NO:1. Un punto de enlace ribosómico apropiado en tal casete de expresión es, a modo de ejemplo, la secuencia de nucleótidos 5'-agaaaggagg-3' indicada por Amador (Microbiology 145, 915-924 (1999)).

Es igualmente posible posicionar varios promotores, o bien enlazar funcionalmente estos al gen a expresar y llegar de este modo a una expresión acrecentada. Esto se describe, a modo de ejemplo, en el documento WO 2006/069711.

La estructura de promotores de Corynebacterium glutamicum y Escherichia coli es bastante conocida. Por lo tanto, es posible aumentar la fuerza de un promotor mediante modificación de su secuencia por medio de una o varias sustitución (sustituciones) y/o una o varias inserción (inserciones) y/o una o varias deleción (deleciones) de nucleótidos. Se encuentran ejemplos a tal efecto, entre otros, en "Herder Lexikon der Biologie" (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland (1994)).

Una medida apropiada para la sobreexpresión del gen lysE es correspondientemente la modificación, o bien mutación del promotor del gen lysE.

La estructura del punto de enlace ribosómico de Corynebacterium glutamicum y de Escherichia coli es asimismo bastante conocida y se describe, a modo de ejemplo, en Amador (Microbiology 145, 915-924 (1999)) y en manuales y libros de texto de genética, como por ejemplo "Gene und Klone" (Winnacker, editorial Chemie, Weinheim, Alemania (1990)) o "Molecular Genetics of Bacteria" (Dale y Park, Wiley and Sons Ltd., Chichester, UK (2004)). Los genes convenientemente expresados, es decir, los genes estructurales más importantes en un organismo, disponen de un buen punto de enlace ribosómico (Amador, Microbiology 145, 915-924 (1999)), es decir, este tiene una similitud elevada con la secuencia de consenso o corresponde a esta. En la literatura se mostró que los genes altamente expresados presentan un fuerte punto de enlace ribosómico (Karlin and Mrazek, Journal of Bacteriology 2000; 182(18):5238-50). Por lo tanto, la eficiencia de traslación de un gen, o bien del m-ARN, se puede conseguir mediante adaptación del punto de enlace ribosómico.

Otra posibilidad de aumento de la eficiencia de traslación es la adaptación del uso de codón en los genes a expresar (por ejemplo Najafabiad et al.; Nucleic Acids Research 2009, 37 (21) : 7014-7023).

Para la consecución de una sobreexpresión es igualmente posible aumentar la expresión de proteínas activadoras o reducir o desactivar la expresión de proteínas represoras.

La proteína activadora LysG para la expresión de lysE se describió por Bellmann et al. (Microbiology 2001; 147:1765-74). Esta se denomina aquí "regulador positivo". La secuencia de aminoácidos de LysG de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 se refleja en SEQ ID NO:30. En un alineamiento de secuencia global, la secuencia de aminoácidos del polipéptido LysG de Corynebacterium diphteriae NCTC13129 es en un 62%, la secuencia de aminoácidos del polipéptido LysG de Corynebacterium efficiens YS-314 es en un 81% y la secuencia de aminoácidos del polipéptido LysG de Corynebacterium glutamicum R es en un 94% idéntica a la de SEQ ID NO:30.

En el caso de las proteínas activadoras es preferente un polipéptido que es > (al menos) en un 55 %, preferentemente > en un 80 %, de modo especialmente preferente > en un 90 %, > en un 92 % o > en un 94 %, de modo muy especialmente preferente > en un 99 % y de modo extremadamente preferente en un 100 % idéntica a la secuencia de aminoacidos representada en SEQ ID NO:30.

Las citadas medidas para la sobreexpresión, preferentemente seleccionadas a partir del grupo aumento del número de copias, empleo de un promotor fuerte, mutación del promotor, empleo de un casete de expresión apropiado y sobreexpresión de una proteína activadora, se pueden combinar entre sí de modo apropiado. De este modo, por ejemplo se puede combinar el empleo de un promotor apropiado con el aumento del número de copias o la sobreexpresión de una proteína activadora con el empleo de un promotor apropiado o de un casete de expresión apropiado.

Adicionalmente a las medidas que afectan al polinucleótido que codifica para una proteína con actividad de exportación de L-ornitina, es asimismo posible debilitar genes de biosíntesis individuales.

De este modo, en caso dado, para la mejora de la producción de L-ornitina es conveniente debilitar adicionalmente uno o varios de los genes seleccionados a partir del grupo

a) gen odhA, que codifica para la subunidad E1 de alfa-cetoglutarato-dehidrogenasa (EC 1.2.4.2)

b) gen sucA, que codifica para la dihidrolipoamida succiniltransferasa (EC 2.3.1.61)

c) gen dapA, que codifica para una dihidrodipicolinato-sintasa (DapA, EC 4.2.1.52)

d) gen dapB, que codifica para una dihidrodipicolinato-sintasa (DapB, EC 1.3.1.26)

e) gen ddh, que codifica para una meso-diaminopimelato dehidrogenasa (Ddh, EC 1.4.1.16)

f) gen lysA, que codifica para una diaminopimelato-decarboxilasa (LysA, EC 4.1.1.20)

g) gen argR, que codifica para un/el represor (ArgR) de la biosíntesis de L-arginina

h) gen argF, que codifica para una ornitina carbamoil transferasa (ArgF, EC 2.1.3.3)

i) gen argG, que codifica para una argininosuccinato sintasa (ArgG, EC 6.3.4.5)

j) gen argH, que codifica para una argininosuccinato liasa (ASAL) (ArgH, EC 4.3.2.1)

k) gen lysC, que codifica para una aspartato quinasa (LysC, EC 2.7.2.4) y

l) gen asd, que codifica para una aspartato semialdehído-dehidrogenasa (Asd, EC 1.2.1.11).

Es preferente el debilitamiento de uno o varios de los genes seleccionados a partir del grupo lysA, odhA, argR argF, argG y argH. Es especialmente preferente el debilitamiento de uno o varios de los genes seleccionados a partir del grupo lysA, odhA y argF. Es muy especialmente preferente el debilitamiento de los genes lysA y/o argF.

En este contexto, el concepto “debilitamiento” describe la reducción o desactivación de la actividad de una o varias enzimas (proteínas) en una bacteria, que se codifican mediante el correspondiente ADN, empleándose, a modo de ejemplo, un promotor débil o empleándose un gel, o bien alelo, que codifica para una correspondiente enzima con una baja actividad, o bien desactiva el correspondiente gen o la enzima (proteína), y en caso dado combinándose estas medidas.

Se encuentra una visión de conjunto de promotores conocidos de diferente fortaleza en Corynebacterium glutamicum en Pátek et al. (Journal of Biotechnology 104, 311-323 (2003)). Se describen otros promotores débiles en la comunicación 512057 der la revista Research Disclosure de diciembre de 2006 (páginas 1616 a 1618).

Como mutaciones para la generación de un debilitamiento entran en consideración transiciones, transversiones, inserciones y deleciones de al menos un (1) par de bases, o bien nucleótido en la región codificante del gen respectivo. En función de la acción del intercambio de aminoácidos provocado por la mutación sobre la actividad de la proteína, o bien la enzima, se habla de mutaciones de sentido erróneo ("missense mutations'') o mutaciones sin sentido ("nonsense mutations").

La mutación de sentido erróneo conduce a un intercambio de un aminoácido dado en una proteína por otro, tratándose en especial de una sustitución de aminoácidos no conservadora. De este modo se merma la funcionalidad, o bien la actividad de la proteína, y se reduce esta a un valor de > 0 a 75 %, > 0 a 50 %, > 0 a 25 %, > 0 a 10 % o > 0 a 5 %.

La mutación sin sentido conduce a un codón de terminación en la región codificante del gen, y de este modo a una interrupción prematura de la traslación y, por lo tanto, a una desactivación. Inserciones y deleciones de al menos un par de bases en un gen conducen a mutaciones de desplazamiento de marco ("frame shift mutations"), que conducen a que se incorporen aminoácidos falsos o a que la traslación se interrumpa prematuramente. Si como consecuencia de la mutación se produce un codón de terminación en la región codificante, esto conduce asimismo a una interrupción prematura de la traslación. Las medidas para la generación de una mutación sin sentido se realizan preferentemente en la parte 5’-terminal de la región codificante, que codifica para el término N del polipéptido. Si la longitud total de un polipéptido (medida como número de L-aminoácidos enlazados químicamente) se caracteriza con 100 %, en el ámbito de la presente invención, la parte de la secuencia de aminoácidos que contiene 80 % de los siguientes L-aminoácidos, calculado a partir del aminoácido de iniciación L-formil-metionina, corresponde al término N del polipéptido.

Se describen métodos de mutagénesis, a modo de ejemplo, en el Manual of Methods for General Bacteriology (Gerhard et al. (Eds.), American Society for Microbiology, Washington, DC, USA, 1981) o en Tosaka et al. (Agricultural and Biological Chemistry 42(4), 745-752 (1978)) o en Konicek et al. (Folia Microbiologica 33, 337-343 (1988)).

Son métodos apropiados para la mutagénesis in-vitro, entre otros, el tratamiento con hidroxilamina según Miller (Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and OxyRated Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992), el empleo de oligonucleótidos mutagénicos (T. A. Brown: Gentechnologie für Einsteiger, editorial Spektrum Akademischer, Heidelberg, 1993 y R. M. Horton: PCR-Mediated Recombination and Mutagenesis, Molecular Biotechnology 3, 93-99 (1995)) y el empleo de una reacción en cadena de polimerasa bajo empleo de una ADN-polimerasa, que presenta una elevada cuota de errores. Tal ADN-polimerasa es, a modo de ejemplo, la mutazima ADN polimerasa (GeneMorph PCR Mutagenesis Kit, Nr.600550) de la firma Stratagene (LaJolla, CA, USA).

Se pueden extraer otras explicaciones y visiones de conjunto de mutaciones in-vivo o in-vitro del estado de la técnica y libros de texto conocidos de genética y biología molecular, como por ejemplo el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik", 6a edición, editorial Georg Thieme, Stuttgart, Alemania, 1995), el de Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) o el de Hagemann ("Allgemeine Genetik", editorial Gustav Fischer, Stuttgart, 1986).

Con ayuda del procedimiento conocido de intercambio de genes, o bien alelos, que se describen en sus rasgos básicos en Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), se puede transformar una mutación producida invitro, o bien un polinucleótido que contiene la mutación deseada, en el cromosoma. Este método se empleó por Schafer et al. (Gene 145, 69-73 (1994)) para incorporar una deleción en el operón hom-thrB de C. glutamicum. Este método se empleó por Nakagawa et al. (EP 1108790) y Ohnishi et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 58(2), 217-223 (2002)) para incorporar diversas mutaciones en el cromosoma de C. glutamicum partiendo de los alelos aislados.

Un método para la reducción selectiva de la expresión génica consiste en someter gen a debilitar al control de un promotor inducible mediante adición de cantidades dosificadas de IPTG (isopropil-B-D-tiogalactopiranósido), como por ejemplo del promotor trc o del promotor tac. A tal efecto son apropiados vectores, como por ejemplo el vector de expresión de Escherichia coli pXK99E (WO0226787; depositado según el Tratado de Budapest el 31 de julio de 2001 en DH5alpha/pXK99E como DSM14440 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemania)), pEKEx2 (n° de acceso NCBI AY585307) o pVWEx2 (Wendisch, Ph. D. thesis, Berichte des Forschungszentrums Jülich, Jül-3397, ISSN 0994-2952, Jülich, Alemania (1997)) , que posibilitan una expresión dependiente de IPTG del gen clonado en Corynebacterium glutamicum.

Este método se empleó, a modo de ejemplo, en la solicitud de patente WO0226787 para la expresión regulada del gen deaD mediante integración del vector pXK99EdeaD en el genoma de Corynebacterium glutamicum y por Simic et al. (Applied and Environmental Microbiology 68: 3321 -3327 (2002)) para la expresión regulada del gen glyA mediante integración del vector pK18mobglyA' en Corynebacterium glutamicum.

Otro método para la reducción específica de la expresión génica es la técnica antisentido, llevándose oligodesoxinucleótidos o vectores cortos a las células objetivo para la síntesis de ARN-antisentido más largo. El ARN antisentido se puede unir a secciones complementarias de mARN especifico y reducir su estabilidad o bloquear la capacidad de traslación. El especialista encuentra un ejemplo a tal efecto en Srivastava et al. (Applied Environmental Microbiology 2000 Oct; 66 (10): 4366 - 4371).

Mediante el empleo del codón se influye sobre la velocidad de elongación. Mediante el empleo del codón para t-ARN presente raramente en la cepa madre (parent strain) se puede debilitar la expresión génica. Esto se describe detalladamente en el documento WO2008049781 y en el documento WO2009133063. A modo de ejemplo, el intercambio del codón de iniciación ATG por el codón GTG o TTG más raramente presente puede empeorar la traslación, ya que el codón AUG es dos a tres veces más efectivo, por ejemplo, que el codón GUG o UUG (Khudyakov et al., FEBS Letters 232(2):369-71 (1988); Reddy et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 82(17):5656-60 (1985)).

Adicionalmente a las medidas que afectan al polinucleótido que codifica para una proteína con actividad de exportación de L-ornitina, es asimismo posible reforzar genes de biosíntesis individuales.

De este modo, en caso dado, para la mejora de la producción de L-ornitina es conveniente reforzar adicionalmente una o varias de las proteínas seleccionadas a partir del grupo

a) glutamato-dehidrogenasa (EC 1.4.1.3) codificada por el gen gdh,

b) glutamato N-acetiltransferasa (EC 2.3.1.35 y EC 2.3.1.1) codificada por el gen argJ,

c) acetylglutamato quinasa (EC 2.7.2.8) codificada por el gen argB,

d) N-acetyl-gamma-glutamil-fosfato-reductasa (EC 1.2.1.38) codificada por el gen argC,

e) acetyl-ornitina aminotransferasa (EC 2.6.1.11), codificada por el gen argD,

f) componente específico de glucosa EIIB (PtsG) (EC 2.7.1.69) del sistema de absorción de glucosa codificado por el gen ptsG,

g) componente específico de sacarosa EIIB (PtsS) (EC 2.7.1.69) del sistema de absorción de sacarosa cosificado por el gen ptsS,

h) glucosa-6-fosfato 1-dehidrogenasa (EC 1.1.1.49) codificada por el gen zwf,

i) glucosa-6-fosfato-isomerasa (EC 5.3.1.9) codificada por el gen pgi,

j) fosfofructoquinasa (EC 2.7.1.11) codificada por el gen pfkA,

k) fructosa-bisfosfato aldolasa (EC 4.1.2.13) codificada por el gen fda,

l) glicerilaldehído-3-fosfato dehidrogenasa (EC 1.2.1.59), codificada por el gen gap,

m) fosfoglicerato quinasa (EC 2.7.2.3) codificada por el gen pgk,

n) piruvato quinasa (EC 2.7.1.40) codificada por el gen pyk,

o) subunidad E1 de piruvato-dehidrogenasa (EC 1.2.4.1) codificada por el gen aceE,

p) fosfoenolpiruvato-carboxilasa (EC 4.1.1.31) codificada por el gen ppc,

q) piruvato-carboxilasa (EC 6.4.1.1), codificada por el gen pyc,

r) aconitasa (EC 4.2.1.3) codificada por el gen acn, y

s) isocitrato-dehidrogenasa (EC 1.1.1.42) codificada por el gen icd.

El concepto refuerzo comprende las medidas para la sobreexpresión y el empleo de variantes con actividad catalítica elevada en comparación con la proteína de tipo salvaje.

Es especialmente preferente el refuerzo de una o varias de las enzimas seleccionada a partir del grupo glutamatodehidrogenasa, glutamato-N-acetiltransferasa y de acetilglutamato quinasa.

Las medidas de debilitamiento adicionales indicadas se pueden combinar con las medidas de refuerzo adicionales.

Se encuentran instrucciones para el manejo de ADN, digestión y ligación de ADN, transformación y selección de transformantes, entre otros, en el conocido manual de Sambrook et al. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

El alcance de la expresión, o bien sobreexpresión, se puede determinar mediante medición de la cantidad, o bien de la concentración de mARN transcrito por el gen, mediante determinación de la cantidad, o bien de la concentración de polipéptido y mediante determinación de la magnitud de la actividad enzimática.

Para la determinación de la cantidad de mARN se pueden emplear, entre otros, el método de "Northern Blotting's" y la RT-PCR cuantitativa. En el caso de RT-PCR cuantitativa, a la reacción en cadena de polimerasa se antepone una transcripción inversa. A tal efecto se puede emplear el sistema LightCyclerTM de la firma Roche Diagnostics (Boehringer Mannheim GmbH, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania), como se describe, por ejemplo, en Jungwirth et al. (FEMS Microbiology Letters 281, 190-197 (2008)). La concentración de proteína se puede determinar a través de separación en gel de proteínas de 1 y 2 dimensiones y subsiguiente identificación óptica de la concentración de proteínas con correspondiente software de valoración en el gel. Un método habitual para la preparación de geles de proteínas con bacterias corineformes y para la identificación de proteínas es el procedimiento descrito por Hermann et al. (Electrophoresis, 22:1712-23 (2001)). La concentración de proteínas se puede determinar asimismo mediante una hibridación Western-Blot con un anticuerpo específico para la proteína a identificar (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) y subsiguiente valoración óptica con correspondiente software para la determinación de la concentración (Lohaus und Meyer (1998) Biospektrum 5:32-39; Lottspeich, Angewandte Chemie 321: 2630-2647 (1999)).

Las bacterias producidas se pueden cultivar continuamente - como se describe, a modo de ejemplo, en el documento WO 05/021772 - o discontinuamente en procedimiento por lotes (cultivo por cargas, o bien procedimiento por cargas) o en lote de alimentación (procedimiento de alimentación) o procedimiento de lotes de alimentación repetidos (procedimiento de alimentación repetitivo, a modo de ejemplo descrito en el documento US 6,562,601) para la producción de L-ornitina. En el manual de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (editorial Gustav Fischer, Stuttgart, 1991)) o en el manual de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (editorial Vieweg, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) se encuentra disponible un resumen de tipo general sobre métodos de cultivo conocidos.

El medio de cultivo, o bien el medio de fermentación a emplear, debe cumplir los requisitos de las respectivas cepas de manera apropiada. En el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) se incluyen descripciones de medios de cultivo de diferentes microorganismos. Los conceptos medio nutriente, medio de cultivo y medio de fermentación, o bien medio, son intercambiables entre sí.

Como fuente de carbono se pueden emplear azúcares e hidratos de carbono, como por ejemplo glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, disoluciones que contienen sacarosa de la elaboración de remolacha azucarera o caña de azúcar, almidón, hidrolizado de almidón y celulosa, aceites y grasas, como por ejemplo aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y grasa de coco, ácidos grasos, como por ejemplo ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes, como por ejemplo glicerina, metanol y etanol, y ácidos orgánicos, como por ejemplo ácido acético o ácido láctico.

En el caso de los azúcares son preferentes glucosa, fructosa, sacarosa, mezclas de glucosa y fructosa y mezclas de glucosa, fructosa y sacarosa. En caso dado, es especialmente preferente sacarosa.

En el caso de los alcoholes es preferente glicerina.

Como fuente de nitrógeno se pueden emplear compuestos orgánicos nitrogenados, como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, agua de remojo de maíz, harina de habas de soja y urea, o compuestos inorgánicos, como sulfato amónico, cloruro amónico, fosfato amónico, carbonato amónico y nitrato amónico. Las fuentes de nitrógeno se pueden emplear por separado o como mezcla.

Como fuente de fósforo se pueden emplear ácido fosfórico, dihidrogenofosfato potásico o hidrogenofosfato dipotásico, o las correspondientes sales que contienen sodio.

El medio de cultivo debe contener además sales de metales, como por ejemplo sodio, potasio, magnesio, calcio y hierro, a modo de ejemplo en forma de cloruros o sulfatos, como por ejemplo sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarios para el crecimiento. Finalmente se pueden emplear substancias de crecimiento esenciales como aminoácidos, a modo de ejemplo homoserina, y vitaminas, a modo de ejemplo tiamina, biotina o ácido pantoténico, adicionalmente a las sustancias citadas anteriormente.

Las citadas substancias de empleo se pueden añadir al cultivo en forma de una única carga, o alimentar de modo apropiado durante el cultivo.

Para el control de pH del cultivo se emplean compuestos básicos, como hidróxido sódico, hidróxido potásico, amoniaco, o bien agua amoniacal, o compuestos ácidos, como ácido fosfórico o ácido sulfúrico, de modo apropiado. El pH se ajusta en general a un valor de 6,0 a 8,5, preferentemente 6,5 a 8. Para el control del espumado se pueden emplear agentes antiespumantes, como por ejemplo poliglicolésteres de ácidos grasos. Para el mantenimiento de la estabilidad de plásmidos se pueden añadir al medio substancias de acción selectiva apropiadas, como por ejemplo antibióticos. La fermentación se realiza preferentemente bajo condiciones aerobias. Para mantener estas se introducen en el cultivo oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno, como por ejemplo aire. Es igualmente posible el empleo de líquidos que están enriquecidos con peróxido de hidrógeno. En caso dado, la fermentación se realiza con sobrepresión, a modo de ejemplo con una sobrepresión de 0,03 a 0,2 MPa. La temperatura del cultivo se sitúa normalmente en 20°C a 45°C y preferentemente a 25°C hasta 40°C, de modo especialmente preferente a 30°C hasta 37°C. En el caso de procedimientos por cargas, el cultivo se continúa hasta que se ha formado una cantidad suficiente para la medida de obtención de la L-ornitina deseada. Este objetivo se alcanza normalmente en el intervalo de 10 a 160 horas. En procedimientos continuos son posibles tiempos de cultivo más largos. Mediante la actividad de las bacterias se produce un enriquecimiento, o bien un aumento de la concentración (acumulación) de L-ornitina en el medio de fermentación.

Se encuentran ejemplos de medios de fermentación apropiados, entre otras, en las solicitudes de patente JP 43010996 B4 (para B. subtilis), US 3668072 A (para E. coli) y JP 57041912 B (para B. flavum).

En caso dado, el volumen del medio de fermentación en un procedimiento según la invención asciende a > 0,5 l, > 1 l, > 5 l, > 10 l, > 50 l, > 100 l, > 500 l, > 1000 l, preferentemente > 1 l, de modo especialmente preferente > 10 l, de modo muy especialmente preferente > 100 l y de modo extremadamente preferente > 1000 l.

El análisis de L-ornitina para la determinación de la concentración en uno o varios momento(s) en el transcurso de la fermentación se puede efectuar mediante separación de L-aminoácidos por medio de cromatografía de intercambio iónico, preferentemente cromatografía de intercambio catiónico con subsiguiente derivatización en columna posterior bajo empleo de ninhidrina, como se describe en Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190­ 1206 (1958)). En lugar de ninhidrina, también se puede emplear orto-ftadialdehído para la derivatización en columna posterior. En Pickering (LCGC (Magazine of Chromatographic Science) 7(6), 484-487 (1989)) se encuentra un artículo de revisión sobre cromatografía de intercambio iónico.

Es igualmente posible efectuar una derivatización en columna previa, a modo de ejemplo, bajo empleo de ortoftadialdehído o isotiocianato de fenilo y separar los derivados de aminoácido producidos mediante cromatografía en fase inversa (RP), preferentemente en forma de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Tal método se describe, a modo de ejemplo, en Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979)). La detección se efectúa mediante fotometría (Absorption, Fluoreszenz).

Entre otros en el libro de texto "Bioanalytik" de Lottspeich y Zorbas (editorial Spektrum Akademischer, Heidelberg, Alemania 1998) se encuentra una descripción detallada del análisis de aminoácidos.

El rendimiento de los procedimientos, o bien procesos de fermentación según la invención respecto a uno o varios de los parámetros seleccionados a partir del grupo de concentración de L-ornitina (L-ornitina formada por volumen), del rendimiento de L-ornitina (L-ornitina formada por fuente de carbono consumida), de la formación de L-ornitina (L-ornitina formada por volumen y tiempo) y de la formación de L-ornitina específica (L-ornitina formada por masa anhidra celular, o bien biomasa anhidra y tiempo o L-ornitina por proteína celular y tiempo), o también otros parámetros de proceso y combinaciones de estos, se aumenta en al menos 0,5 %, al menos 1 %, al menos 1,5 % o al menos 2 %, referido a procedimientos, o bien procesos de fermentación con bacterias, en los que se presenta una proteína con actividad de exportación de L-ornitina no sobreexpresada, o bien no se realizó ninguna medida de sobreexpresión.

Mediante las medidas de fermentación se obtiene un caldo de fermentación que contiene la L-ornitina deseada.

A continuación se efectúa la puesta a disposición, o bien producción u obtención de un producto que contiene L-ornitina en forma líquida o sólida.

Se entiende por un caldo de fermentación un medio de fermentación, o bien medio nutriente, en el que se cultivó un microorganismo durante un cierto tiempo y a una cierta temperatura. El medio de fermentación, o bien el medio empleado durante la fermentación, contiene/contienen todas las sustancias, o bien todos los componentes que aseguran una producción de L-ornitina y típicamente la propagación, o bien viabilidad.

Al concluir la fermentación, el caldo de fermentación producido contiene correspondientemente

a) la biomasa (masa celular) de la bacteria producida debido a la propagación de células de la bacteria, b) la L-ornitina formada en el transcurso de la fermentación,

c) los productos secundarios orgánicos formados en el transcurso de la fermentación, y

d) los componentes del medio de fermentación empleado no consumidos mediante la fermentación, o bien las sustancias de empleo, como por ejemplo vitaminas como biotina o sales como sulfato de magnesio.

A los productos secundarios orgánicos pertenecen sustancias que se generan, y en caso dado se excretan por las bacterias empleadas en la fermentación junto a la L-ornitina. A estos también pertenecen azúcares, como por ejemplo trehalosa.

El caldo de fermentación se extrae del recipiente de cultivo, o bien del depósito de fermentación, en caso dado se recoge y se emplea para poner a disposición un producto que contiene L-ornitina en forma líquida o sólida. A tal efecto también se emplea la expresión “obtención del producto que contiene L-ornitina”. En el más sencillo de los casos, el propio caldo de fermentación que contiene L-ornitina extraído del depósito de fermentación representa el producto obtenido.

Mediante una o varias de las medidas seleccionadas a partir del grupo

a) eliminación parcial (> 0% a < 80%) a completa (100%) o casi completa (> 80%, > 90%, > 95%, > 96%, > 97%, > 98% o > 99% a < 100%) de agua,

b) eliminación parcial (> 0% a < 80%) a completa (100%) o casi completa (> 80%, > 90%, > 95%, > 96%, > 97%, > 98% o > 99% a < 100%) de biomasa, desactivándose esta en caso dado antes de la eliminación,

c) eliminación parcial (> 0% a < 80%) a completa (100%) o casi completa (> 80%, > 90%, > 95%, > 96%, > 97%, > 98%, > 99%, > 99,3% o > 99,7% a < 100%) de productos secundarios orgánicos formados en el transcurso de la fermentación, y

d) eliminación parcial (> 0%) a completa (100%) o casi completa (> 80%, > 90%, > 95%, > 96%, > 97%, > 98%, > 99%, > 99,3% o > 99,7% a < 100%) de componentes del medio de fermentación empleado no consumidos mediante la fermentación, o bien de sustancias de empleo,

a partir del caldo de fermentación se obtiene una concentración, o bien purificación de L-ornitina. de este modo se aíslan productos que presentan un contenido deseado en L-ornitina.

La eliminación parcial (> 0% a < 80%) a completa (100%) o casi completa (> 80% bis < 100%) de agua (medida a)) se denomina también secado.

En una variante del procedimiento, mediante eliminación completa o casi completa de agua, de biomasa, de productos secundarios orgánicos y de componentes no consumidos del medio de fermentación empleado se llega a formas de producto de L-ornitina puras ((> 80 % en peso o > 90 % en peso) o altamente puras (> 95 % en peso, > 97 % en peso o > 99% % en peso). Para las medidas según a), b), c) o d), en el estado de la técnica se encuentran disponibles una variedad de instrucciones técnicas. En el caso del aminoácido L-ornitina, o bien sus sales, en el estado de la técnica se describen esencialmente tres productos diferentes.

Un grupo describe la L-ornitina HCL, en la que la L-ornitina se purifica a partir de la disolución de fermentación tras separación celular por medio de cambiador iónico y después se cristaliza a través de cristalización como monocloruro de L-ornitina y recristalización como monocloruro de L-ornitina (US 2988489). La L-ornitina-HCL obtenida tiene en este caso una pureza mayor que > 90 %, a modo de ejemplo mayor que 95 %, a modo de ejemplo mayor que 98,0 % y a modo de ejemplo mayor que 99 %. En la solicitud de patente EP 1995322 se describe otro procedimiento. A este respecto, la disolución de fermentación que contiene biomasa se añade desde arriba a un cambiador iónico ligeramente ácido con un diámetro de partícula > 300 gm y la L-ornitina se purifica a través de este paso. Mediante la selección de un correspondiente diámetro de partícula se impide una obturación de la resina mediante la biomasa. La eficiencia de separación celular se situaba en 99 %.

La L-ornitina purificada se puede emplear entonces para la producción de diversas sales de L-ornitina, como por ejemplo a-cetoglutarato de mono- o di-L-ornitina, L-aspartato de L-ornitina, etc.

Por ejemplo, en la patente EP 0477 991 se describe un procedimiento para la producción de L-aspartato de L-ornitina. En este caso se añade un disolvente hidrosoluble a una disolución acuosa de L-ornitina y L-aspartato para obtener una disolución saturada o sobresaturada al menos al 90 %. Esta se calienta bajo reflujo hasta que ha concluido la formación de cristales. Después se añade además un disolvente miscible con agua bajo reflujo hasta que se forman los cristales salinos. Los cristales se pueden separar, por ejemplo, mediante centrifugado, y se secan a continuación bajo vacío. La pureza de producto se sitúa típicamente por encima de 98,5 %.

En la patente JP46003194 se describe un proceso para la producción de L-cetoglutarato de L-ornitina. En este caso, por ejemplo, se transforma ornitina-HCL en la base libre mediante adsorción en un cambiador iónico ácido y elución con agua amoniacal, se añade a-cetoglutarato y se concentra la disolución por evaporación bajo vacío hasta que el producto cristaliza.

El plásmido pEC7lysE se depositó en forma de la cepa Escherichia coli DH5alpha/pEC7lysE(DM2204) el 15 de enero de 2010 en la Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemania) bajo el número de acceso DSM 23239 según el Contrato de Budapest.

Ejemplos

Ejemplo 1:

Clonación y secuenciación del gen lysE a partir de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

Se clonó el gen lysE de la cepa ATCC13032 en el vector de lanzadera y expresión de E. coli / C. glutamicum pVWEx1 (Peters-Wendisch et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol. (2001) 3(2) : 295-300).

La clonación se realizó en dos pasos. En primer lugar, mediante una reacción en cadena de polimerasa (PCR) se amplificó el gen a partir de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 por medio del siguiente cebador de oligonucleótido derivado de Seq ID NO:1. Los oligonucleótidos contenían puntos de corte de restricción adicionales en su extremo 5’ (subrayados: EcoRV para lysE_1.p y AvrlI, o bien SspI para lysE_2 .p).

lysE_1.p: 5'-[TCGATATCATGGAAATCTTCATTACAGG1-3' (véase SEQ ID NO:22)

lysE_2.p: 5'-[TGCCTAGGTCAATATTTGGGCGAAGGCCACCG1-3' (véase SEQ ID NO:23)

La reacción PCR se realizó en presencia de 200 gM de desoxinucleótido-trifosfatos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), respectivamente 0,5 gM del correspondiente oligonucleótido, 100 ng de ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum ATCC13032, 1/5 de volumen 5 veces de tampón de reacción HF y 0,02 U/gl de Phusion® Hot Start DNA Polymerase (Biozym Scientific GmbH, D-31840 Hess. Oldendorf) en un termociclador (Mastercycler, Eppendorf AG, Hamburgo) bajo las siguientes condiciones: 98°C durante 1 min; 30 ciclos x (98°C, 20 s; 63°C, 20s; 72°C, 40s); 72°C durante 6 min.

El fragmento lysE de PCR de 761 bp de tamaño (véase SEQ ID NO:3), como se describe a continuación, se clonó en pVWEx1: preparación del vector: se disoció 1 gg de ADN plásmido de pVWExl en el sistema tampón específico de la enzima con 10 unidades de la enzima PstI mediante incubación a 37°C durante 1 h. Directamente a continuación se trató la carga de disociación con el kit Quick Blunting Kit (New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main) según datos del fabricante y después se purificó mediante empleo del kit de purificación QiaExIl (Qiagen AG, Hilden) según datos del fabicante. El vector tratado previamente de este modo se disoció entonces con 10 unidades de Xbal en el sistema tampón específico de la enzima a 37°C durante 1 h y seguidamente se purificó de nuevo con el kit de purificación QiaExII.

Preparación del inserto: el fragmento de PCR lysE se disoció respectivamente con 10 unidades de enzima Avrll y EcoRV y a continuación se purificó mediante empleo del kit de purificación QiaExIl según datos del fabricante.

Ligación: vector e inserto se mezclaron en una proporción de 1:5 y se ligaron mediante empleo de T4-ADN-ligasa a 16°C durante 1 h. De la carga de ligación se transformaron 3 gl en células E. coli DH5alpha químicamente competentes (Subcloning efficieny, Invitrogen GmbH, Karlsruhe).

Se identificaron transformantes por medio de su resistencia a canamicina en placas de agar LB que contenían 50 gg/ml de sulfato de canamicina. A partir de 4 de los transformantes se aisló ADN plásmido y se analizaron los plásmidos mediante análisis de restricción para verificar la presencia del fragmento de 0,75 kb como inserto. El plásmido recombinante producido de este modo se denominó pVWEx1_lysE.

La secuencia de nucleótidos del fragmento de 0,75 kb en el plásmido pVWEx1 -lysE se determinó según el método de interrupción de cadenas dideoxi según Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1977) 74: 5463-5467). A tal efecto se secuenció el inserto completo del plásmido pVWEx1_lysE con ayuda del cebador de oligonucleótido pVW_1.p (5'-TGA GCG GAT AAC Aa T TTC Ac A C-3') y pVW_2.p(5'-CGA CGG CCA GTG AAT TCG AG-3') en la firma Eurofins MWG Operon GmbH (Ebersberg, Alemania).

La secuencia de nucleótidos obtenida se analizó con el programa Clone Manager 9 y se refleja como SEQ ID NO:20.

Ejemplo 2:

Construcción del vector pK18mobsacB_DargFRGH para la deleción de la región argFRGH en Corynebacterium glutamicum

A tal efecto se aisló en primer lugar ADN cromosómico a partir de C. glutamicum ATCC13032 según el método de Tauch et al. (1995, Plasmid 33:168-179). Sobre la base de los genes argFRGH de C. glutamicum se seleccionaron los oligonucleótidos indicados más abajo para la producción del constructo de deleción argFRGH. El constructo de deleción se generó con ayuda de la reacción en cadena de polimerasa (PCR), en especial mediante el método gene SOEing (Gene Splicing by Overlap Extension, Horton, Molecular Biotechnology 3: 93-98 (1995)).

argFRGH_d1:

5'-GGT GGT GCT AGC CCG GCG ATT TCT TTG CAC AT- 3' (véase SEQ ID NO:24)

argFRGH_d2:

5'-AAT GCT TAT CGA CGT ACC CCC CTG TGG TTG TGA AGT CAT A-3' (véase SEQ ID NO:25)

argFRGH_d3:

5' - GGG GTA CGT CGA TAA GCA TT-3'

(véase SEQ ID NO:26)

argFRGH_d4:

5'-GGT GGT ATG CAT GGT GAT GGT TCC GAA TGT TG-3'

(véase SEQ ID NO:27)

Se adquirió el cebador de oligonucleótido descrito de Eurofins MWG Operon GmbH (Ebersberg, Alemania). La reacción PCR se realizó bajo empleo de Phusion® Hot Start DNA Polymerase (Biozym Scientific GmbH, D-31840 Hess. Oldendorf) en un termociclador (Mastercycler, Eppendorf AG, Hamburgo).

El cebador argFRGH_d2 está compuesto por dos regiones. Una parte de la secuencia de nucleótidos es complementaria a la región de 1 bp en línea de entrada a 19 bp en línea de entrada del codón de iniciación del gen argF. La otra parte de la secuencia de nucleótidos es complementaria a la región del nucleótido 1419 del gen argH hasta 5 nucleótidos en línea de salida del gen argH.

Con ayuda de la reacción en cadena de polimerasa, los cebadores argFRGH_1 y argFRGH _2 posibilitan la amplificación de un fragmento de ADN de 543 bp de tamaño y los cebadores argFRGH _3 y argFRGH_4 posibilitan la amplificación de un fragmento de ADN de 513 bp de tamaño. Los amplificados se produjeron por PCR, se analizaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0,8 %, se aislaron a partir del gel de agarosa con el kit High Pure PCR Product Purification Kit (Product No. 1732676, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) y se emplearon conjuntamente como templados para otra reacción PCR con los cebadores argFRGH _1 y argFRGH _4. De este modo se generó el derivado de deleción DargFRGH de 1036 bp de tamaño (véase también SEQ ID NO: 21). Este contiene 477 bp del extremo 3' del gen argD, 19 bp del extremo 5' del gen argF, 15 bp del extremo 3' del gen argH, así como 420 bp del extremo 5' del marco de lectura cg1589. El producto amplificado de este modo se analizó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0,8 %.

El producto de PCR DargFRGH de 1,04 kb de tamaño (SEQ ID NO: 21) se disoció completamente con las enzimas NdeI y NsiI. A continuación se purificó el fragmento con el kit de purificación de PCR (Qiagen, Hilden). El derivado de deleción DargFRGH tratado previamente de este modo se empleó para la ligación con el vector de clonación movilizable pK18mobsacB (Schafer et al. (1994), Gene 14: 69-73). Este se había disociado previamente por completo con la endonucleasa de restricción Xbal y PstI. De este modo se crearon extremos de ADN compatibles respecto a los extremos del inserto generados con disociación de NdeI y NsiI. El vector preparado de este modo se mezcló con el fragmento DargFRGH en una proporción molar de 1:5 y se ligó mediante empleo de T4-DNA-ligasa (Amersham- Pharmacia, Freiburg, Alemania) a 16°C durante 1 hora. De la carga de ligación se transformaron 3 gl en células DH5alpha de E. coli químicamente competentes (Subcloning efficieny, Invitrogen GmbH, Karlsruhe). Los transformantes se identificaron por medio de su resistencia a canamicina en placas de agar LB que contenían 50 gg/ml de sulfato de canamicina. A partir de 4 de los transformantes se aisló ADN plásmido (kit QIAprep Spin Miniprep de la firma Qiagen (Hilden)) y los plásmidos se analizaron mediante análisis de restricción para verificar la presencia del fragmento de 1,04 kb como inserto. El plásmido recombinante se denominó pK18mobsacB_DargFRGH. La cepa se denominó E.coli_DH5alpha/pK18mobsacB_DargFRGH.

La secuencia de nucleótidos del fragmento de 1,04 kb de tamaño (SEQ ID NO:21) en el plásmido pK18mobsacB_DargFRGH se realizó según el método de interrupción de cadenas dideoxi según Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1977) 74: 5463-5467). A tal efecto se secuenció el inserto completo del plásmido pK18mobsacB_DargFRGH con ayuda del cebador de oligonucleótido M13 uni (-21) (5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3') y M13 rev (-49)(5'- GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG-3') en la firma Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Alemania) y se verificó su exactitud.

Ejemplo 3:

Producción de la cepa Corynebacterium glutamicum ATCC 13032_DargFRGH

El vector pK18mobsacB_DargFRGH citado en el Ejemplo 2 se transfirió por medio de conjugación según un protocolo de Schafer et al. (Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990)) en la cepa de Corynebacterium glutamicum ATCC13032. A tal efecto, el vector se transformó previamente en la cepa de E.coli S17-1 (Simon et al., Biotechnolgy 1:784-791). La identidad del vector en S17-1 se comprobó análogamente a la identificación en E.coli DH5alpha (véase Ejemplo 2).

El vector pK18mobsacB, o bien pK18mobsacB_DargFRGH, no se puede replicar independientemente en C. glutamicum ATCC13032 y permanece en la célula solo si este se ha integrado en el cromosoma como consecuencia de un resultado de recombinación. La selección de clones con pK18mobsacB_DargFRGH integrado se efectúa mediante siembra de la carga de conjugación en agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Habor, New York, 1989), que se ha suplementado con 15 mg/l de canamicina y 50 mg/ml de ácido nalidixínico. Los clones crecidos se extienden en placas de agar LB con 25 mg/l de canamicina y se incuban durante 16 horas a 33°C. Para la selección de mutantes en los que ha tenido lugar la escisión como consecuencia de un segundo resultado de recombinación se cultivan los clones 20 horas de manera no selectiva en medio líquido LB, a continuación se extienden sobre agar LB con 10 % de sacarosa y se incuban 24 horas.

El plásmido pK18mobsacB_DargFRGH contiene, al igual que el plásmido de partida pK18mobsacB, una copia del gen sacB que codifica para la levano sacarosa de Bacillus subtilis además del gen de resistencia de canamicina. La expresión inducible mediante sacarosa conduce a la formación de levano sacarosa, que cataliza la síntesis del producto tóxico para C. glutamicum. Por lo tanto, sobre agar LB con sacarosa crecen solo aquellos clones en los que se ha escindido a su vez el pK18mobsacB_DargFRGH integrado. En la escisión, junto con el plásmido se puede escindir la copia cromosómica completa de argFRGH o la copia incompleta con la deleción interna de argFRGH.

Se verificaron aproximadamente 40 a 50 colonias sobre el fenotipo “crecimiento en presencia de sacarosa” y “no crecimiento en presencia de canamicina”. Para identificar que el alelo argFRGH suprimido ha permanecido en el cromosoma se analizaron aproximadamente 20 colonias que presentaban el fenotipo “crecimiento en presencia de sacarosa” y “no crecimiento en presencia de canamicina” según el método de PCR estándar de Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) con ayuda de la reacción en cadena de polimerasa. A este respecto, a partir del ADN cromosómico de las colonias se amplificó un fragmento de ADN que portaba las regiones circundantes de la región argFRGH suprimida. Se seleccionaron los siguientes oligonucleótidos cebadores para la PCR.

argFRGH_d1 (SEQ ID NO:24):

5'-GGT GGT GCT AGC CCG GCG ATT TCT TTG CAC AT-3'

argFRGH_d4 (SEQ ID NO:27):

5'-GGT GGT ATG CAT GGT GAT GGT TCC GAA TGT TG-3'

En el caso de clones de control con locus de argFRGH completo, los cebadores posibilitan la amplificación de un fragmento de ADN de aproximadamente 5,35 kb de tamaño. En el caso de clones con un locus de argFRGH suprimido, los fragmentos de ADN se amplifican con un tamaño de aproximadamente 1,04 kb.

Los fragmentos de ADN amplificados se identificaron por medio de electroforesis en un gel de agarosa al 0,8 %. De este modo se pudo mostrar que la cepa porta un alelo de argFRGH suprimido en el cromosoma. La cepa se denominó Corynebacterium glutamicum Delta_argFRGH.

Ejemplo 4:

Expresión del gen lysE en Corynebacterium glutamicum ATCC 13032_Delta_argFRGH

Por medio de electroporación (Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334) se introdujo el plásmido pVWEx1_LysE y el plásmido vacío pVWEx1 en la cepa que forma L-ornitina ATCC 13032_Delta_argFGH. Los transformantes se identificaron por medio de su resistencia a canamicina en placas de Caso-agar que contenían 25 pg/ml de canamicina. A continuación se analizaron 5 clones aislados para verificar la exactitud del plásmido transformado. A tal efecto se aisló ADN de plásmido (kit de aislamiento de plásmido, Qiagen) y se verificó este ADN mediante análisis de restricción sobre el correcto patrón de disociación. De este modo se produjeron las cepas de C. glutamicum ATCC 13032_Delta_argFRGH/pVWEx1_lysE y ATCC 13032_Delta_argFRGH/pVWEx1.

Ejemplo 5:

Producción de L-ornitina con Corynebacterium glutamicum

Para la investigación de su capacidad de producción de L-ornitina se cultivaron previamente tres clones de la cepa ATCC 13032_Delta_argFRGH/pVWEx1_lysE y tres clones de la cepa ATCC 13032_Delta_argFRGH/pVWEx1 respectivamente en 10 ml de medio de ensayo durante 16 h a 33°C. Para el ensayo de producción, con el cultivo previo obtenido se inocularon en cada caso 10 ml de medio de ensayo, de modo que la OD600 inicial (densidad óptica a 600 nm) ascendía a 0,1. Se comprobó cada clon en tres matraces de agitación, de modo que cada cepa está representada por un total de nueve matraces de agitación en el respectivo momento de cosecha. El medio de ensayo era idéntico al medio CgXII descrito en Keilhauer et al. (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603), pero contenía adicionalmente 7,5 g/l de extracto de levadura (Difco), 25 pg/ml de canamicina, 1 mM de IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido) y 40 g/l de sacarosa en lugar de glucosa. Para una mayor simplicidad, la composición del medio de ensayo se reúne en la siguiente Tabla 2.

Tabla 2

El cultivo se efectuó a 33°C y 200 rpm en matraces de agitación de 100 ml. La desviación del agitador era 5 cm. Después de 24 y 48 horas se cosecharon tres cultivos de un clon. A tal efecto se extrajeron muestras de los cultivos y se determinó la densidad óptica, el contenido en sacarosa y el contenido en L-ornitina. Para la determinación del contenido en sacarosa y L-ornitina se centrifugaron brevemente las células (centrífuga de mesa tipo 5415D (Eppendorf) a 13000 rpm, 10 min, temperatura ambiente).

La determinación de la densidad óptica se efectuó a una longitud de onda de 660 nm con un fotómetro de placas de microtitratión GENios (Tecan, Reading UK). Antes de la medición se diluyeron las muestras 1 : 100 con agua desmineralizada.

La determinación de sacarosa se efectuó con un sistema de ensayo (n° cat. 10716251 035) de la firma R-Biopharm AG (Darmstadt, Alemania). En este caso se invirtió sacarosa y se identificó la glucosa formada con un ensayo enzimático acoplado (hexoquinasa/glucosa-6-fosfato dehidrogenasa) vía formación de NADH.

La determinación cuantitativa de la concentración de aminoácido extracelular a partir del sobrenadante de cultivo se efectuó por medio de HPLC en fase inversa (Lindroth et al., Analytical chemistry (1979) 51: 1167-1174). Se empleó un aparato de HPLC de la serie HP1100 (Hewlett-Packard, Waldbronn, Alemania) con detector de fluorescencia conectado (G1321A); el control del sistema y la evaluación de datos se efectuaron con una HP-Chem-Station (Hewlett-Packard). Se mezcló 1 pL de disolución de aminoácido a analizar en una derivatización de columna previa automática con 20 pL de reactivo acabado aldehido orto-ftálico/2-mercaptoetanol (Pierce Europe BV, Oud-Beijerland, Niederlande). Los isoindoles tiosustituidos fluorescentes producidos en este caso (Jones et al., Journal of Chromatography (1983) 266: 471-482) se separaron a través de una columna previa combinada (40x4 mm Hypersil ODS 5) y una columna principal (Hypersil ODS 5, ambas columnas de la firma CS-Chromatographie Service GmbH, Langerwehe, Alemania) con un gradiente de programa con fase crecientemente apolar (metanol). El eluato polar era acetato sódico (0,1 M; pH 7,2); la tasa de flujo ascendía a 0,8 mL por minuto. La detección de fluorescencia de los aminoácidos derivatizados se efectuó a una longitud de onda de excitación de 230 nm y una longitud de onda de emisión de 450 nm. Las concentraciones de L-ornitina, o bien hidrocloruro de L-ornitina, se calcularon mediante una comparación con un patrón externo y L-asparagina como patrón interno adicional.

El peso molecular de hidrocloruro de L-ornitina asciende a 168,6 g x mol-1 y el de L-ornitina asciende a 132,1 g x mol-1.

Para el cálculo del rendimiento se dividió la cantidad de L-ornitina formada (medida como hidrocloruro de L-ornitina) entre la cantidad de sacarosa consumida.

Los resultados se representan en la Tabla 3.

Tabla 3: formación de L-ornitina después de 24 horas (Tabla 3A) y 48 horas (Tabla 3B) de incubación. Abreviaturas: *: ATCC 13032 _Delta_argFRGH; Orn-HCl: hidrocloruro de L-ornitina.

Tabla 3A:

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1 Procedimiento para la producción de L-ornitina, caracterizado por que se realizan los siguientes pasos a) fermentación de una bacteria que excreta L-ornitina, seleccionada a partir del grupo Corynebacterium, Bacillus, Streptomyces, Arthrobacter y de Enterobacteriaceae, en la que se presenta sobreexpresado un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene la actividad de un exportador de L-ornitina y cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la SEQ ID NO: 2 o cuya secuencia de aminoácidos se puede obtener mediante un total como máximo de 25 deleciones, inserciones, sustituciones y/o adiciones N-, o bien C-terminales de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, en un medio

   b) acumulación de L-ornitina en el medio, obteniéndose un caldo de fermentación, y

   c) excluyéndose para la sobreexpresión el plásmido pEC7lysE depositado en DSM23239.
2. 2. - El procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que, en el caso de CoryneBacterium glutamicum, la magnitud de la actividad de exportación de L-ornitina se presenta aumentada al menos en 10 % debido a la sobreexpresión en comparación con ATCC13032 o ATCC14067 o ATCC13869.
3. 3. - El procedimiento según la reivindicación 1 a 2, caracterizado por que la sobreexpresión se obtiene mediante una o varias de las medidas seleccionadas a partir del grupo

   a) aumento del número de copias,

   b) empleo de un promotor fuerte, y

   c) mutación del promotor, y

   d) sobreexpresión de una proteína activadora.
4. 4. - El procedimiento según la reivindicación 1 a 3, caracterizado por que, en el caso de la bacteria, se trata de Corynebacterium, preferentemente Corynebacterium glutamicum.
5. 5. - El procedimiento según la reivindicación 1 a 4, caracterizado por que se debilita adicionalmente uno o varios de los genes seleccionados a partir del grupo

   a) gen odhA, que codifica para la subunidad E1 de alfa-cetoglutarato-dehidrogenasa (EC 1.2.4.2)

   b) gen sucA, que codifica para la dihidrolipoamida succiniltransferasa (EC 2.3.1.61)

   c) gen dapA, que codifica para una dihidrodipicolinato-sintasa (DapA, EC 4.2.1.52)

   d) gen dapB, que codifica para una dihidrodipicolinato-sintasa (DapB, EC 1.3.1.26)

   e) gen ddh, que codifica para una meso-diaminopimelato dehidrogenasa (Ddh, EC 1.4.1.16)

   f) gen lysA, que codifica para una diaminopimelato-decarboxilasa (LysA, EC 4.1.1.20)

   g) gen argR, que codifica para un/el represor (ArgR) de la biosíntesis de L-arginina

   h) gen argF, que codifica para una ornitina carbamoil transferasa (ArgF, EC 2.1.3.3)

   i) gen argG, que codifica para una argininosuccinato sintasa (ArgG, EC 6.3.4.5)

   j) gen argH, que codifica para una argininosuccinato liasa (ASAL) (ArgH, EC 4.3.2.1)

   k) gen lysC, que codifica para una aspartato quinasa (LysC, EC 2.7.2.4) y

   l) gen asd, que codifica para una aspartato semialdehído-dehidrogenasa (Asd, EC 1.2.1.11).
6. 6. - El procedimiento según la reivindicación 1 a 5, caracterizado por que adicionalmente se refuerza uno o varios de los genes seleccionados a partir del grupo

   a) glutamato-dehidrogenasa (EC 1.4.1.3) codificada por el gen gdh,

   b) glutamato N-acetiltransferasa (EC 2.3.1.35 y EC 2.3.1.1) codificada por el gen argJ,

   c) acetylglutamato quinasa (EC 2.7.2.8) codificada por el gen argB,

   d) N-acetyl-gamma-glutamil-fosfato-reductasa (EC 1.2.1.38) codificada por el gen argC,

   e) acetyl-ornitina aminotransferasa (EC 2.6.1.11), codificada por el gen argD,

   f) componente específico de glucosa EIIB (PtsG) (EC 2.7.1.69) del sistema de absorción de glucosa codificado por el gen ptsG,

   g) componente específico de sacarosa EIIB (PtsS) (EC 2.7.1.69) del sistema de absorción de sacarosa cosificado por el gen ptsS,

   h) glucosa-6-fosfato 1-dehidrogenasa (EC 1.1.1.49) codificada por el gen zwf,

   i) glucosa-6-fosfato-isomerasa (EC 5.3.1.9) codificada por el gen pgi,

   j) fosfofructoquinasa (EC 2.7.1.11) codificada por el gen pfkA,

   k) fructosa-bisfosfato aldolasa (EC 4.1.2.13) codificada por el gen fda,

   l) glicerilaldehído-3-fosfato dehidrogenasa (EC 1.2.1.59), codificada por el gen gap,

   m) fosfoglicerato quinasa (EC 2.7.2.3) codificada por el gen pgk,

   n) piruvato quinasa (EC 2.7.1.40) codificada por el gen pyk,

   o) subunidad E1de piruvato-dehidrogenasa (EC 1.2.4.1) codificada por el gen aceE,

   p) fosfoenolpiruvato-carboxilasa (EC 4.1.1.31) codificada por el gen ppc,

   q) piruvato-carboxilasa (EC 6.4.1.1), codificada por el gen pyc,

   r) aconitasa (EC 4.2.1.3) codificada por el gen acn, y

   s) isocitrato-dehidrogenasa (EC 1.1.1.42) codificada por el gen icd.
7. 7. - El procedimiento según la reivindicación 1 a 6, caracterizado por que se trata de un procedimiento selecionado a partir del grupo procedimiento por lotes, procedimiento de alimentación, procedimiento de alimentación repetitivo y procedimiento continuo.
8. 8. - El procedimiento según la reivindicación 1 a 7, caracterizado por que se obtiene L-ornitina o un producto líquido o sólido que contiene L-ornitina a partir del caldo de fermentación que contiene L-ornitina.