ES2249427T3 - Secuencias de nucleotidos codificadoras de proteinas que participan en la biosintesis de l-serina, rocedimiento mejorado para la produccion microbiana de l-serina y microorganismo modificado geneticamente adecuado para dicho procedimiento. - Google Patents
Secuencias de nucleotidos codificadoras de proteinas que participan en la biosintesis de l-serina, rocedimiento mejorado para la produccion microbiana de l-serina y microorganismo modificado geneticamente adecuado para dicho procedimiento.Info
- Publication number
- ES2249427T3 ES2249427T3 ES01929377T ES01929377T ES2249427T3 ES 2249427 T3 ES2249427 T3 ES 2249427T3 ES 01929377 T ES01929377 T ES 01929377T ES 01929377 T ES01929377 T ES 01929377T ES 2249427 T3 ES2249427 T3 ES 2249427T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- serine
- baselineskip
- seq
- genetically modified
- production
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
Procedimiento para la producción microbiana de L- serina, caracterizado porque a) un ácido nucleico que codifica una fosfoserina- fosfatasa (serB) según la ID SEC Nº 1 ó 5, un ácido nucleico que codifica una fosfoserina- aminotransferasa (serC) según la ID SEC Nº 3 ó 7 y un ácido nucleico que codifica un vehículo de exportación de L-treonina según la ID SEC Nº 9 u 11, aislados de una bacteria corineforme, se transfieren a un microorganismo homólogo y se expresan en éste, incrementándose la expresión y la actividad de los polipéptidos correspondientemente codificados con respecto al microorganismo respectivo no modificado genéticamente, b) este microorganismo modificado genéticamente del paso a) se utiliza para la producción fermentativa de L-serina, incrementándose la segregación de L-serina en el medio de cultivo, y c) la L-serina así producida se aísla del medio de cultivo.
Description
Secuencias de nucleótidos codificadoras de
proteínas que participan en la biosíntesis de
L-serina, procedimiento mejorado para la producción
microbiana de L-serina y microorganismo modificado
genéticamente adecuado para dicho procedimiento.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la producción microbiana de
L-serina y a un microorganismo modificado
genéticamente adecuado para dicho procedimiento. Además, la
presente invención incluye la utilización de
L-serina y/o de sus productos derivados en la
industria alimentaria, la industria de alimentos para animales y/o
la industria farmacéutica y/o en medicina humana.
En los últimos años, aminoácidos como por ejemplo
L-glutamato, L-lisina, o también
L-aminoácidos de cadena ramificada, han despertado
un creciente interés científico. Lo mismo es aplicable al
aminoácido L-serina, que no sólo sirve como
precursor para la síntesis de los aminoácidos alifáticos
L-glicina o L-cisteína, sino
también para la producción de L-triptófano a partir
de indol y L-serina. En este contexto se considera
que el aminoácido L-serina tiene un creciente
potencial económico en particular en la industria alimentaria, la
industria de alimentos para animales y la industria farmacéutica, y
también en amplios campos de la medicina humana.
En la literatura se han descrito numerosos
procedimientos para la producción microbiana de
L-serina. También se conocen fermentaciones de
bacterias corineformes para la producción de
L-serina. Por ejemplo, una cepa de
Corynebacterium glycinophilium puede producir
L-serina a partir de glicina e hidratos de carbono
(Kubota K., Kageyama K., Shiro T. y Okumura S. (1971) Journal of
General Applications in Microbiology, 17: 167-168;
Kubota K., Kageyama K., Maeyashiki I., Yamada K. y Okumura S.
(1972) Journal of General Applications in Microbiology 18: 365). En
este caso, la enzima
L-serina-hidroximetiltransferasa
participa en la transformación de glicina en
L-serina (Kubota K. y Yokozeki K. (1989) Journal of
Fermentation and Bioengeneering, 67(6):
387-390). Las cepas bacterianas utilizadas también
muestran una menor descomposición de serina, que se puede atribuir a
una disminución de la actividad de la enzima
L-serina-deshidratasa (Kubota K.,
Kageyama K., Shiro T. y Okumura S. (1971) Journal of General
Applications in Microbiology, 17: 167-168; Kubota
K. (1985) Agricultural Biological Chemistry, 49:
7-12).
Además, Izumi Y. Yoshida T., Miyazaki S.S.,
Mitsunaga T., Ohshiro T., Shiamo M., Miyata A. y Tanabe T. (1993)
Applies Microbiology and Biotechnology, 39:
427-432, han descrito la producción fermentativa de
L-serina a partir de metanol y glicina con ayuda de
bacterias, por ejemplo del género Hyphomicrobium.
Sin embargo, en los casos arriba mencionados es
necesario añadir el aminoácido glicina como precursor para formar
el aminoácido L-serina a partir de hidratos de
carbono.
En cambio, ya se conocen procedimientos para la
fermentación de bacterias corineformes que pueden producir
L-serina directamente a partir de hidratos de
carbono, sin añadir adicionalmente otros precursores. Por ejemplo,
Yoshida H. y Nakayama K. (1974)
Nihon-Nogei-Kagakukaishi 48:
201-208, describen cepas bacterianas del género
Corynebacterium, y en particular de la clase
Corynebacterium glutamicum, obtenidas mediante mutagénesis no
dirigida que se caracterizan, entre otras cosas, porque son
resistentes frente a análogos de L-serina:
hidroxamato de serina o \beta-cloroalanina. Entre
otras consecuencias, esto hace que el flujo metabólico pueda fluir
más en la dirección de la síntesis de L-serina,
dado que la actividad de las enzimas correspondientes está sometida
a una menor inhibición de producto final.
Además, el documento EP 0 931 833 da a conocer
cepas bacterianas de la especie Brevibacterium flavum que
también se obtienen mediante mutagénesis no dirigida y que debido a
ésta presentan defectos en la descomposición de la serina. Las
cepas descritas en dicho documento también presentan un gen serA
modificado que codifica una
3-fosfoglicerato-deshidrogenasa, no
sensible a la retroalimentación. Además, estas cepas contienen los
genes serB y serC procedentes del organismo
heterólogo Escherichia coli, que codifican las enzimas
fosfoserina-fosfatasa y
fosfoserina-aminotransferasa, respectivamente. Por
consiguiente, el sistema aquí descrito presenta una gran complejidad
en lo que respecta a las numerosas estructuras génicas incorporadas
adicionalmente, que son en parte heterólogas, junto con una
incertidumbre genética de las cepas bacterianas en lo que respecta
a la mutagénesis no dirigida mencionada en la introducción. Esto
entraña el riesgo de una inestabilidad relativamente alta para
dichas cepas bacterianas durante un procedimiento de producción a
escala industrial. Además, en dicho documento se indica que
mediante las cepas bacterianas descritas sólo se logra un aumento de
la producción de L-serina en un factor 2 hasta un
máximo de un factor 5. Esto se puede deber, entre otras razones, a
una expresión subóptima de genes
heterólogos.
heterólogos.
Otra desventaja de los sistemas heterólogos
radica en la escasa aceptación de los sistemas que contienen ADN
extraño, en particular para la producción de sustancias que tienen
relevancia médica, farmacológica y alimen-
taria.
taria.
En el documento WO 01/00843 se da a conocer el
aislamiento y la utilización general, para la producción de
productos químicos puros, de numerosos genes de Corynebacterium
glutamicum que codifican proteínas del metabolismo central. En
cambio, no se describe ningún procedimiento para la producción y
preparación mejorada del aminoácido L-serina.
Además de la biosíntesis de
L-aminoácidos económicamente interesantes, como por
ejemplo L-serina, la secreción de estos productos
metabólicos en el medio de cultivo tiene una importancia decisiva
en el rendimiento de L-serina en el producto final.
Esta secreción puede tener lugar de forma no específica por
difusión o, tal como se describe por ejemplo para los aminoácidos
L-isoleucina o L-lisina (Zittrich,
S. y col., 1994, Journal of Bacteriology, 176:
6892-6899 y Bröer, S. y col., 1991, European
Journal of Biochemistry, 202: 131-153), puede estar
mediada activamente por sistemas de transporte de membrana. Un
problema de estos sistemas de transporte activo consiste en que la
capacidad de estos "vehículos de exportación" se supera con
rapidez: tan pronto como el contenido de producto metabólico a
transportar en la célula supera un valor crítico de la
concentración presente de forma natural. Esto significa que, por
ejemplo, en caso de un aumento de la biosíntesis de
L-serina, su salida de la célula puede estar
limitada.
En consecuencia, sería deseable disponer de los
genes de bacterias corineformes que participan de forma decisiva en
la biosíntesis de L-serina para la expresión en un
sistema homólogo, y también mejorar la secreción de la
L-serina formada en el medio de cultivo.
Por consiguiente, un objetivo de la presente
invención consiste en poner a disposición un sistema que no presente
las desventajas arriba mencionadas y que posibilite una mejor
producción de L-serina y de productos metabólicos
derivados de ella y el aislamiento de los mismos.
Este objetivo se resuelve mediante un
procedimiento para la producción microbiana de
L-serina, en el que (a) un ácido nucleico que
codifica una fosfoserina-fosfatasa (serB) según la
ID SEC Nº 1 ó 5 y un ácido nucleico que codifica una
fosfoserina-aminotransferasa (serC) según la ID SEC
Nº 3 ó 7 y un ácido nucleico que codifica un vehículo de
exportación de L-treonina según la ID SEC Nº 9 u
11, aislados de una bacteria corineforme, se transfieren a un
microorganismo homólogo y se expresan en éste, incrementándose la
expresión y la actividad de los polipéptidos correspondientemente
codificados con respecto al microorganismo respectivo no modificado
genéticamente, (b) este microorganismo modificado genéticamente del
paso a) se utiliza para la producción fermentativa de
L-serina, incrementándose la segregación de
L-serina en el medio de cultivo, y (c) la
L-serina así producida se aísla del medio de
cultivo.
Además, el objetivo se resuelve mediante un
microorganismo modificado genéticamente para la producción de
L-serina que contiene un ácido nucleico que
codifica una fosfoserina-fosfatasa (serB) según la
ID SEC Nº 1 ó 5 de forma replicable, un ácido nucleico que codifica
una fosfoserina-aminotransferasa (serC) según la ID
SEC Nº 3 ó 7 y un ácido nucleico que codifica el vehículo de
exportación de L-treonina (thrE) según la ID SEC Nº
9 u 11 cuya expresión se ha incrementado y/o cuyo número de copias
se ha incrementado en comparación con el microorganismo
correspondiente no modificado genéticamente.
La invención también incluye la utilización de
los ácidos nucleicos que codifican un vehículo de exportación de
L-treonina según la ID SEC Nº 9 u 11 y las
secuencias de polipéptidos derivadas de éste según la ID SEC Nº 10 ó
12, y también su empleo en el procedimiento según la invención para
producir L-serina. La solicitud de patente alemana
199 41 478.5 da a conocer el aislamiento de estas secuencias de
bacterias corineformes.
Los ácidos nucleicos utilizados se caracterizan
porque se aíslan de bacterias corineformes, preferentemente del
género Corynebacterium o Brevibacterium, en especial
de la clase Corynebacterium glutamicum o Brevibacterium
flavum. Como ejemplos de bacterias corineformes de tipo salvaje
depositadas en cepas microbianas se mencionan: Corynebacterium
glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC
14752, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806,
Corynebacterium melassecola ATCC 17965, Corynebacterium
thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium
flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC
13869 y Brevibacterium divaricatum ATCC 14020. Como ejemplos
de mutantes o cepas de producción adecuados para la producción de
L-serina se mencionan: Corynebacterium
glutamicum ATCC 21586, Corynebacterium glutamicum KY
10150 y Brevibacterium ketoglutamicum ATCC 21222. La
invención se caracteriza más detalladamente mediante la indicación
de las cepas bacterianas arriba mencionadas, pero dicha indicación
no tiene efecto limitativo.
De acuerdo con la invención, como "ácido
nucleico aislado" o "fragmento de ácido nucleico aislado" se
ha de entender un polímero de ARN o ADN que puede ser de cadena
simple o doble y opcionalmente puede contener nucleótidos
naturales, sintetizados químicamente, modificados o artificiales. El
concepto "polímero de ADN" también incluye ADN genómico, ADNc
o mezclas de ellos.
De acuerdo con la invención, por el término
"alelos" se han de entender secuencias de nucleótidos
funcionalmente equivalentes, es decir secuencias de nucleótidos con
un efecto igual en esencia. Las secuencias funcionalmente
equivalentes son secuencias que todavía poseen las funciones
deseadas a pesar de presentar una secuencia de nucleótidos
diferente, por ejemplo debido a la degenerabilidad del código
genético. Por consiguiente, los equivalentes funcionales incluyen
variantes naturales de las secuencias aquí descritas y también
secuencias de nucleótidos obtenidas por síntesis química y en caso
dado adaptadas al uso de codones del organismo huésped. Además, las
secuencias funcionalmente equivalentes también incluyen aquellas
que presentan una secuencia de nucleótidos modificada que confiere
a la enzima una insensibilidad o resistencia a los inhibidores, por
ejemplo.
Por el concepto "funcional equivalente"
también se entienden, en particular, mutaciones naturales o
sintéticas de una secuencia originalmente aislada que siguen
mostrando la función deseada. Las mutaciones incluyen sustituciones,
adiciones, deleciones, intercambios o inserciones de uno o más
restos de nucleótido. También están incluidas las llamadas
mutaciones sentido (sense mutations), que a nivel proteínico
pueden conducir por ejemplo al intercambio de aminoácidos
conservados, pero que no producen ninguna modificación fundamental
de la actividad de la proteína y, en consecuencia, son
funcionalmente neutras. También se incluyen las modificaciones de la
secuencia de nucleótidos que a nivel proteínico afectan al terminal
N o C, pero sin influir esencialmente de forma negativa en la
función de la proteína. Estas modificaciones pueden tener incluso
una influencia estabilizadora en la estructura de la proteína.
La presente invención también incluye, por
ejemplo, las secuencias de nucleótidos obtenidas mediante
modificación de la secuencia de nucleótidos, con lo que se obtienen
sus derivados correspondientes. El objetivo de esta modificación
pueden consistir, por ejemplo, en una mayor delimitación de la
secuencia codificadora incluida o también en la incorporación de más
puntos de intersección de enzima de restricción. También son
equivalentes funcionales las variantes cuya función está debilitada
o reforzada en comparación con el gen o el fragmento de gen de
partida.
También forman parte del objeto de la presente
invención secuencias de ADN artificiales siempre que éstas confieran
las propiedades deseadas, tal como se describe más arriba. Estas
secuencias de ADN artificiales se pueden determinar, por ejemplo,
mediante retrotraducción de proteínas construidas mediante
programas asistidos por computador (molecular modelling), o
mediante selección in vitro. Son especialmente adecuadas las
secuencias de ADN codificadoras obtenidas mediante retrotraducción
de una secuencia de polipéptidos según el uso específico de codones
del organismo huésped. Un especialista familiarizado con los
métodos genéticos moleculares puede determinar fácilmente el uso
específico de codones mediante evaluación por computador de otros
genes ya conocidos del organismo a transformar.
De acuerdo con la invención, por el concepto
"secuencias homólogas" se han de entender aquellas secuencias
que son complementarias a las secuencias de nucleótidos de la
invención y/o que se hibridizan con éstas. De acuerdo con la
invención, el concepto "secuencias de hibridación" incluye
secuencias de nucleótido sustancialmente similares del grupo de ADN
o ARN que, bajo determinadas condiciones rigurosas conocidas,
experimentan una interacción específica (unión) con las secuencias
de nucleótidos anteriormente mencionadas. También están incluidas
secuencias de nucleótidos cortas, con una longitud de por ejemplo
10 a 30, preferentemente 12 a 15, nucleótidos. De acuerdo con la
invención, aquí también están incluidos, entre otros, los
denominados cebadores o sondas.
De acuerdo con la invención también están
incluidas las áreas de secuencia que preceden (en dirección 5' o
corriente arriba) y/o siguen (en dirección 3' o corriente abajo) a
las áreas codificadoras (genes estructurales). En este contexto
están incluidas, en particular, áreas de secuencia con función
reguladora. Éstas pueden influir en la transcripción, la estabilidad
de ARN o el procesamiento de ARN, y también en la traducción. Como
ejemplos de secuencias reguladoras se pueden mencionar, entre
otros: promotores, intensificadores, operadores, terminadores o
reforzadores de traducción.
Otro objeto de la presente invención consiste en
una estructura génica que contiene al menos una de las secuencias de
nucleótidos arriba descritas que codifican una
fosfoserina-fosfatasa, una
fosfoserina-aminotransferasa y/o un vehículo de
exportación de L-treonina, y también secuencias
reguladoras unidas operativamente con éstas y que controlan la
expresión de las secuencias codificadoras en la célula huésped.
Por el concepto "unión operativa" se
entiende la disposición secuencial de, por ejemplo, un promotor, una
secuencia codificadora, un terminador y dado el caso otros
elementos reguladores, de tal modo que cada uno de los elementos
reguladores pueda desempeñar correctamente su función durante la
expresión de la secuencia codificadora. Estas secuencias de
nucleótidos reguladoras pueden ser de origen natural o se pueden
obtener mediante síntesis química. En principio, como promotor es
adecuado cualquier promotor que pueda controlar la expresión génica
en el organismo huésped correspondiente. De acuerdo con la
invención, el promotor también puede consistir en un promotor
químicamente inducible a través del cual se puede controlar la
expresión del gen correspondiente en la célula huésped en un
momento determinado. Como ejemplo se puede mencionar un promotor
inducible por IPTG
(isopropil-\beta-tiogalactósido)
(Eikmanns, B.J. y col., 1991, Gene, 102: 93-98).
La producción de una estructura génica tiene
lugar mediante la fusión de un promotor adecuado con al menos una
secuencia de nucleótidos según la invención aplicando las técnicas
de recombinación y clonación habituales, tal como se describen por
ejemplo en T. Maniatis, E. F. Fritsch y J. Sambrook,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).
Para la unión de los fragmentos de ADN entre sí
se pueden añadir adaptadores o engarces a los fragmentos.
En el procedimiento según la invención se puede
utilizar además un vector que contenga como mínimo una secuencia de
nucleótidos del tipo arriba descrito que codifica una
fosfoserina-fosfatasa, una
fosfoserina-aminotransferasa y/o un vehículo de
exportación de L-treonina, secuencias de nucleótidos
reguladoras unidas operativamente con ésta y también secuencias de
nucleótido adicionales para la selección de las células huésped
transformadas, para la replicación dentro de la célula huésped o
para la integración en el genoma de célula huésped correspondiente.
El vector puede contener además una estructura génica del tipo
arriba mencionado.
Como vectores son adecuados los vectores que se
replican en bacterias corineformes (Process Biochem 33 (1998)
147-161). Numerosos plásmidos vector conocidos, como
por ejemplo pZ1 (Menkel y col., Applied and Environmental
Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKEx1 (Eikmanns y
col., Gene 102: 93-98 (1991)) o
pHS2-1 (Sonnen y col., Gene 107:
69-74 (1991)) se basan en los plásmidos crípticos
pHM1519, pBL1 o pGA1. También se pueden utilizar otros plásmidos
vector, como por ejemplo los basados en pCG4 (US-A
4,489,160), o pNG2 (Serwold-Davis y col., FEMS
Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), o pAG1
(US-A 5,158,891). No obstante, esta enumeración no
limita la presente invención.
Utilizando las secuencias de ácido nucleico según
las ID SEC Nº 1, 3, 5, 7, 9 u 11 se pueden sintetizar las sondas o
cebadores correspondientes y éstos se pueden utilizar, por ejemplo
con ayuda de la técnica PCR, para amplificar y aislar genes
análogos de otros microorganismos, preferentemente bacterias
corineformes.
Por consiguiente, otro objeto de la presente
invención consiste en una sonda para la identificación y/o el
aislamiento de genes que codifican proteínas que participan en la
biosíntesis de L-serina o en la exportación de
L-treonina y/o L-serina, sonda que
se prepara a partir de las secuencias de ácido nucleico del tipo
arriba descrito y que contiene un marcador adecuado para la
detección. La sonda puede consistir en una sección parcial de la
secuencia según la invención, por ejemplo de un área conservada,
que presenta por ejemplo una longitud de 10 a 30, o preferentemente
de 12 a 15 nucleótidos, y que bajo condiciones rigurosas se puede
hibridizar específicamente con secuencias de nucleótidos homólogas.
La literatura da a conocer numerosos marcadores adecuados.
Los especialistas pueden encontrar instrucciones
al respecto, por ejemplo en el manual de procedimiento:
Oligonukleotide synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford,
UK, 1984) y en Newton y Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag,
Heidelberg, Alemania, 1994), o por ejemplo en el manual "The DIG
System Users Guide for Filter Hybridization" de la firma Roche
Diagnostics (Mannheim, Alemania) y en Liebl y col. (International
Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41:
255-260).
Otro objeto de la presente invención consiste en
una fosfoserina-fosfatasa, o en una parte de ella,
codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre
las secuencias según la ID SEC Nº 1 ó 5, o sus variaciones del tipo
anteriormente descrito. La presente invención también incluye una
fosfoserina-fosfatasa con una secuencia de
aminoácidos seleccionada entre las secuencias según la ID SEC Nº 2
ó 6, o una forma modificada de estas secuencias de polipéptidos o
sus isoformas o mezclas de las mismas.
También está incluida una
fosfoserina-aminotransferasa, o una parte de ella,
codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre
las secuencias según la ID SEC Nº 3 ó 7 o sus variaciones del tipo
anteriormente descrito. La presente invención también incluye una
fosfoserina-fosfatasa con una secuencia de
aminoácidos seleccionada entre las secuencias según la ID SEC Nº 4 u
8 o una forma modificada de estas secuencias de polipéptidos o sus
isoformas o mezclas de las mismas.
La presente invención también incluye la
utilización del vehículo de exportación de
L-treonina con una secuencia de aminoácidos
seleccionada entre las secuencias según la ID SEC Nº 10 ó 12 o una
forma modificada de estas secuencias de polipéptidos o sus
isoformas o mezclas de las mismas, vehículo que también participa
en el transporte de L-serina y que es codificado por
una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre las secuencias
de acuerdo con la ID SEC Nº 9 u 11 o sus variaciones.
Los polipéptidos según la invención también se
caracterizan porque proceden de bacterias corineformes,
preferentemente del género Corynebacterium o
Brevibacterium, en especial de la clase Corynebacterium
glutamicum o Brevibacterium flavum.
Por el término "isoformas" se han de
entender enzimas con una especificidad de sustrato y especificidad
de efecto igual o comparable, pero que presentan una estructura
primaria diferente.
De acuerdo con la invención, por el concepto
"formas modificadas" se han de entender enzimas que presentan
modificaciones en la secuencia, por ejemplo en el terminal N y/o C
del polipéptido o en el área de aminoácidos conservados, sin que
ello influya negativamente en la función de la enzima. Estas
modificaciones se pueden llevar a cabo en forma de intercambios de
aminoácidos mediante métodos conocidos en sí.
Una variante de realización especial de la
presente invención abarca variantes de los polipéptidos según la
invención cuya actividad está debilitada o reforzada, por ejemplo
por intercambio de aminoácidos, en comparación con la proteína de
partida correspondiente. Lo mismo es aplicable a la estabilidad de
las enzimas según la invención, cuya susceptibilidad por ejemplo
frente a la descomposición por proteasas está reforzada o
debilitada.
Otro objeto de la presente invención consiste en
polipéptidos con la función de una
fosfoserina-fosfatasa o
fosfoserina-aminotransferasa de la presente
invención cuya secuencia de aminoácidos está modificada de tal modo
que son insensibles frente a compuestos de efecto regulador, por
ejemplo los productos finales del metabolismo que regulan su
actividad (feedback-desensitiv - insensibles
a la retroalimentación).
Otro objeto de la presente invención consiste en
la transferencia de como mínimo una de las secuencias de ácido
nucleico, o una parte de ellas, que codifica una
fosfoserina-fosfatasa o
fosfoserina-aminotransferasa, un alelo, homólogo o
un derivado de la misma de acuerdo con la ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7 y
también una secuencia de ácido nucleico que codifica un vehículo de
exportación de L-treonina, un alelo, homólogo o
derivado del mismo de acuerdo con la ID SEC Nº 9 u 11, a un sistema
huésped homólogo. Esto también incluye la transferencia de
constructos génicos o vectores anteriormente descrita a un sistema
huésped homólogo. Esta transferencia de ADN a una célula huésped
tiene lugar mediante métodos de ingeniería genética. Como
procedimiento preferente se menciona la transformación y en
especial la transferencia de ADN mediante electroporación.
Por el concepto "sistema huésped homólogo"
se han de entender microorganismos que pertenecen a una familia
común. De acuerdo con la invención, por este concepto se han de
entender bacterias corineformes en las que se incorporan los ácidos
nucleicos aislados según la invención a partir de bacterias
corineformes. Por consiguiente, un microorganismo transformado
resultante de una transferencia de ácido nucleico realizada con
éxito se diferencia del microorganismo no transformado
correspondiente en que contiene ácidos nucleicos adicionales del
tipo de la invención que puede expresar en consecuencia. Como
representante de un sistema huésped homólogo adecuado se puede
mencionar la bacteria Corynebacterium glutamicum, y
preferentemente la cepa ATCC 13032, que se puede cultivar bajo
condiciones estándar de la siguiente manera:
El cultivo se realiza en matraces de agitación de
500 ml a 120 revoluciones por minuto y a 30ºC, utilizando 50 ml de
medio de cultivo por matraz. La inoculación del medio de cultivo se
realiza mediante adición de un cultivo (previo) bacteriano de la
cepa Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, que previamente
ha sido cultivado bajo las mismas condiciones durante 12 - 16 horas,
ajustándose la densidad óptica del medio de cultivo inoculado entre
0,7 y 1,5.
Dependiendo de las necesidades, como medio de
cultivo puede ser adecuado un medio complejo, por ejemplo un medio
LB (T. Maniatis, E.F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, NY (1989)) o también un medio de sales minerales, por
ejemplo un medio CGXII (Keilhauer, C. y col., 1993, J. Bacteriol.,
175: 5593-5603). Después del cultivo
correspondiente, la suspensión bacteriana se puede recoger y
utilizar para su posterior investigación, por ejemplo para la
transformación o el aislamiento de ácidos nucleicos, de acuerdo con
métodos habituales. Este procedimiento se puede aplicar igualmente a
otras cepas bacterianas corineformes. En este contexto, como
sistemas huésped son preferentes bacterias del género
Corynebacterium o Brevibacterium. Dentro del género
Corynebacterium es especialmente preferente la clase
Corynebacterium glutamicum y dentro del género
Brevibacterium es especialmente preferente la clase
Brevibacterium flavum. Entre los representantes de estos
géneros se encuentran cepas que están caracterizadas como tipo
salvaje en sus propiedades. En este contexto se han de mencionar por
ejemplo: Corynebacterium glutamicum ATCC 13032,
Corynebacterium glutamicum ATCC 14752, Corynebacterium
acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium melassecola
ATCC 17965, Corynebacterium thermoaminogenes FERM
BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC 14067,
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 y Brevibacterium
divaricatum ATCC 14020.
Además, la presente invención también incluye
cepas bacterianas que se caracterizan como mutantes productoras de
L-serina o cepas de producción. Estas se pueden
producir, por ejemplo, partiendo de cepas de tipo salvaje mediante
métodos clásicos (químicos o físicos) o de ingeniería genética. Como
ejemplos de cepas adecuadas según la invención se pueden mencionar
entre otras: Corynebacterium glutamicum ATCC 21586,
Corynebacterium glutamicum KY 10150 y Brevibacterium
ketoglutamicum ATCC 21222. La presente invención se caracteriza
más detalladamente mediante los ejemplos de microorganismos
seleccionados, pero no está limitada por dichos ejemplos.
De acuerdo con la invención, además de las cepas
bacterianas anteriormente descritas que se caracterizan como
productoras de L-serina, también están incluidas
cepas de producción que presentan una mejor secreción de los
productos de metabolismo deseados, preferentemente de
L-aminoácidos, de las células en el medio de
cultivo. Esta secreción mejorada se logra, por ejemplo,
sobreexpresando uno o más genes que codifican proteínas de
transporte de membrana, por ejemplo proteínas de vehículo de
exportación, entre otras proteínas de vehículo de exportación de
L-aminoácidos específicas.
En una variante de realización especial de la
presente invención, la cepa bacteriana utilizada para la producción
de L-serina se caracteriza porque es un
microorganismo modificado que contiene un ácido nucleico replicable
que codifica una fosfoserina-fosfatasa (serB) y/o
un ácido nucleico que codifica una
fosfoserina-aminotransferasa (serC) según la ID SEC
Nº 1, 3, 5 ó 7 y un ácido nucleico que codifica el vehículo de
exportación de L-treonina (thrE) de acuerdo con la
ID SEC Nº 9 u 11, cuya expresión y/o número de copias es mayor que
en el caso del microorganismo correspondiente no modificado
genéticamente.
De acuerdo con la invención, también está
incluido un microorganismo modificado genéticamente que contiene
polipéptidos codificados por los genes serB y/o serC de acuerdo con
la ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8 y thrE de acuerdo con la ID SEC Nº 10 ó
12, que muestran una mayor actividad y/o vida y/o una menor
inhibición de producto final en comparación con el microorganismo
correspondiente no modificado genéticamente. Por consiguiente, otro
objeto de la invención consiste en un microorganismo modificado
genéticamente que presenta como mínimo un incremento del índice de
producción de L-serina y adicionalmente un
incremento del índice de secreción de L-serina y/o
L-treonina.
La invención incluye igualmente un microorganismo
modificado genéticamente que contiene una estructura génica
replicable o un vector del tipo anteriormente descrito. Un
microorganismo modificado genéticamente según la invención se
caracteriza, además, porque es una bacteria del tipo corineforme,
preferentemente del género Corynebacterium o
Brevibacterium, en especial de la especie Corynebacterium
glutamicum o Brevibacterium flavum.
En principio, los genes se pueden amplificar
mediante métodos conocidos en sí, por ejemplo mediante reacción en
cadena de polimerasa (PCR) con ayuda de secuencias de nucleótido
sintéticas cortas (cebadores), para, a continuación, aislarlos. La
preparación de los cebadores a utilizar tiene lugar, en general,
mediante secuencias génicas conocidas en base a homologías
existentes en áreas conservadas de los genes y/o teniendo en cuenta
el contenido de GC del ADN del microorganismo a analizar. Sin
embargo, este método presenta una serie de desventajas debidas a,
por ejemplo, el propio método PCR o a que las secuencias génicas a
identificar presenten una homología menor de la esperada con
respecto a las secuencias ya conocidas. Esto puede conducir a una
hibridación no específica o incluso a una falta de hibridación de
los cebadores utilizados en la secuencia de ácido nucleico a
analizar.
Otro método para aislar secuencias de nucleótidos
codificadoras consiste en la complementación de los llamados
mutantes auxótrofos del organismo a analizar, que presentan, al
menos en fenotipo, una pérdida de función en la actividad del gen a
analizar o de la proteína correspondiente. Por el término
"complementación" se ha de entender la supresión del defecto
génico del mutante y un amplio restablecimiento del fenotipo
original antes de la mutagénesis, lo que se logra mediante la
incorporación de genes o fragmentos de gen funcionales del
microrganismo a analizar.
Un procedimiento de mutagénesis clásico para la
producción de mutantes auxótrofos consiste, por ejemplo, en tratar
las células bacterianas con sustancias químicas como
N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina
o con radiación UV. Procedimientos de este tipo para provocar
mutaciones son bien conocidos y se pueden consultar, entre otros,
en Miller (A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory
Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria
(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992)) o en "Manual of
Methods for General Bacteriology" de la American Society for
Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981). En este contexto resultan
poco ventajosos el tiempo y el gasto necesarios para la selección de
los mutantes con el fenotipo deseado y también el hecho de que los
mutantes aislados no estén definidos genéticamente, ya que la
mutagénesis tiene lugar de forma no dirigida. Con frecuencia esto
último conduce a problemas inesperados, por ejemplo en relación con
la estabilidad de estos mutantes, en el marco de un proceso de
producción a escala industrial.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en poner a disposición un procedimiento para aislar secuencias de
ácido nucleico codificador de bacterias corineformes que no
presente las desventajas mencionadas. La solución según la
invención se explica más detalladamente mediante la siguiente
descripción.
La invención se refiere a un procedimiento para
aislar los ácidos nucleicos según la invención, en el que se produce
una bacteria corineforme que presenta defectos en los genes
serB y serC producidos por mutagénesis por
transposón.
En el método de la mutagénesis por transposón se
aprovecha la propiedad de un transposón que puede "saltar" en
secuencias de ADN y perturbar o incluso eliminar la función del gen
correspondiente.
Más abajo se indican ejemplos de transposones de
bacterias corineformes. Por ejemplo, a partir de la cepa M82B de
Corynebacterium xerosis se aisló el transposón de
resistencia a la eritromicina Tn5432 (Tauch y col., Plasmid (1995)
33: 168-179) y el transposón de resistencia al
cloramfenicol Tn5546. Tauch y col. (Plasmid (1995) 34:
119-131 y Plasmid (1998) 40:
126-139) demostraron que es posible una mutagénesis
con estos transposones. También se ha aislado la secuencia de
intersección IS31831 de Corynebacterium glutamicum ATCC
31831 (Vertes y col., Molecular Microbiology (1994) 11:
739-746). El transposón sintético Tn31831 se
construyó mediante combinación de IS31831 con el gen de resistencia
a la canamicina aphA (Vertes y col., Molecular and General Genetics
(1994) 245: 397-405). Vertes y col. (Molecular and
General Genetics (1994) 245: 397-405) y Jaeger y
col. (FEMS Microbiology Letters (1995) 126: 1-6)
demostraron la utilización de este transposón en cepas de
Brevibacterium flavum MJ233C y Corynebacterium
glutamicum ATCC 13058.
Otro transposón es el transposón Tn5531, que se
describe en Ankri y col. (Journal of Bacteriology (1996) 178:
4412-4419) y se utiliza a modo de ejemplo en la
presente invención. Para ello, en una variante de realización
especial de la presente invención, la cepa Corynebacterium
glutamicum ATCC 14752 se somete a una mutagénesis
correspondiente. Opcionalmente también es adecuada la cepa
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. El transposón Tn5531
contiene el gen de resistencia a la canamicina aph3 y se puede
administrar en forma del plásmido vector pCGL0040 (Figura 1). La
secuencia de nucleótidos del transposón Tn5531 es de libre
disposición bajo el número de acceso (accession number)
U53587 en el National Center for Biotechnology Information (NCBI,
Bethesda, MD, USA). La especificación del transposón arriba
mencionado caracteriza más detalladamente la presente invención,
pero no la limita.
A continuación de la mutagénesis por transposón
se selecciona un mutante con defectos en el gen o los genes
deseados. Un mutante con defectos en el gen serB y/o el gen
serC se reconoce según la invención porque muestra un buen
crecimiento en un medio mínimo con L-serina pero un
mal crecimiento en un medio mínimo sin
L-serina.
Los mutantes auxótrofos de cepas bacterianas
corineformes correspondientemente seleccionados se utilizan a
continuación para la clonación y secuenciación del gen serB
y serC.
La clonación de los genes puede realizarse, por
ejemplo, mediante complementación de los mutantes auxótrofos. Para
ello se emplea un banco de genes del ADN de la bacteria corineforme
a investigar. El empleo de bancos de genes está descrito en
tratados y manuales bien conocidos. Como ejemplos se mencionan el
tratado de Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die
Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Alemania, 1990) o el manual
de Sambrook y col.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Bathe y col. (Molecular and
General Genetics, 252: 255-265, 1996) describen un
banco de genes de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
utilizado con ayuda del cósmido vector SuperCos I (Wahl y col.,
1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84:
2160-2164) en E. coli K-12
cepa NM554 (Raleigh y col., 1988, Nucleic Acids Research 16:
1563-1575). De acuerdo con la invención, son
adecuados los vectores que se replican en bacterias corineformes,
preferentemente Corynebacterium glutamicum. En el estado
actual de la técnica se conocen vectores de este tipo. Como ejemplo
se menciona el plásmido vector pZ1, descrito por Menkel y col.
(Applied and Environmental Microbiology (1989) 64:
549-554).
A continuación, el banco de genes se transfiere
mediante transformación, de acuerdo con la invención preferentemente
mediante electroporación, a la cepa bacteriana con defectos en el
gen serB o serC anteriormente descrita. Mediante
métodos conocidos en sí se seleccionan aquellas bacterias
transformadas que poseen la propiedad de crecer en un medio mínimo
en ausencia de L-serina. A continuación, los
fragmentos de ADN del banco de genes originalmente utilizado
aislados de estas bacterias transformadas se pueden someter a un
análisis de secuencia.
En otra variante de realización de la presente
invención, gracias al mutante auxótrofo generado mediante
mutagénesis con el transposón Tn5531 de una bacteria corineforme,
como por ejemplo las cepas ATCC 14752serB::Tn5531 y ATCC
14752serC::Tn5531, se pueden clonar directamente los alelos
serB::Tn5531 y serC::Tn5531, respectivamente,
aprovechando el gen de resistencia a la canamicina aph3 contenido
en el transposón. Para ello se utilizan vectores de clonación
conocidos, por ejemplo pUC18 (Norrander y col., Gene (1983) 26:
101-106 y Yanish-Perron y col., Gene
(1985) 33: 103-119) o pGEM-T (Zhou
M-Y, Clark SE y Gomez-Sanchez CE
(1995) BioTechniques 19:34; Kobs G (1995) Promega Notes 55:28;
Promega Cooperation, Madison, USA). Como sistemas huésped para la
clonación son especialmente adecuadas las cepas de Escherichia
coli con defectos de restricción y recombinación. Un ejemplo es
la cepa DH5\alphamcr, descrita por Grant y col. (Proceedings of
the National Academy of Sciences USA, 87 (1990)
4645-4649). La selección de los transformantes tiene
lugar en presencia de canamicina.
A continuación se secuencia el ADN aislado de los
transformantes obtenidos, que contiene el gen que interesa. Para
ello se puede aplicar el método de interrupción de cadena didesoxi
descrito por Sanger y col. (Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America USA (1977) 74:
5463-5467). Después se obtiene el gen contenido
corriente arriba y corriente abajo del sitio de inserción de
Tn5531. Las secuencias de nucleótidos obtenidas se analizan y
reúnen con programas de análisis de secuencia comerciales, por
ejemplo el paquete de programas Lasergene (Biocomputing Software for
Windows, DNASTAR, Madison, USA) o el paquete de programas HUSAR
(Release 4.0, EMBL, Heidelberg, Alemania). De este modo se aislaron
los ácidos nucleicos según la invención de las bacterias
corineformes del gen serB y serC y se determinó su
secuencia.
Sorprendentemente, las comparaciones de homología
con secuencias conocidas han mostrado que el polipéptido codificado
por serB presenta una similitud moderada con la
fosfoserina-fosfatasa de Escherichia coli,
mientras que el polipéptido derivado de serC sólo muestran
una similitud reducida, pero significativa, con la
fosfoserina-aminotransferasa de Escherichia
coli. Los genes corinebacterianos descubiertos también
presentan sólo una similitud entre reducida y moderada con
fosfoserina-fosfatasas o
fosfoserina-aminotransferasas de otros organismos
(por ejemplo levaduras). Únicamente las secuencias de polipéptidos
derivadas de los genes serB y serC probables de
Mycobacterium tuberculosis presentan una alta similitud con
las proteínas corinebacterianas. La Tabla 2 muestra el resultado de
una comparación de homología de este tipo. Además, la secuencia de
nucleótidos de los genes corineformes demuestra que el cebador PCR
utilizado en el documento EP 0 931 833, si bien es adecuado para la
amplificación de los genes de Escherichia coli, no lo es
para el aislamiento de los genes serC y serC
corineformes debido a dicha escasa similitud de secuencia.
Esto ilustra una vez más la ventaja del
procedimiento según la invención de mutagénesis por transposón para
la clonación de los genes serB y serC de bacterias
corineformes.
El procedimiento según la invención sirve para la
producción microbiana de L-serina, en la que como
mínimo uno de los ácidos nucleicos según la invención, aislado de
una bacteria corineforme, se transfiere a un microorganismo homólogo
y se expresa en éste, siendo la expresión génica y/o la actividad
del polipéptido correspondientemente codificado mayor que en el
caso del microorganismo correspondiente no modificado
genéticamente, este microorganismo modificado genéticamente se
utiliza para la producción fermentativa de L-serina
y la L-serina así formada se aísla del medio de
cultivo.
La presente invención también comprende alelos y
derivados de las ID SEC Nº 1, 3, 5, 7, 9 y 11.
Para lograr una mayor expresión génica
(sobreexpresión) en un organismo producido por ingeniería genética
se puede incrementar la cantidad de copias de los genes
correspondientes. También se pueden modificar correspondientemente
la región de promotor y/o la región de regulación y/o el sitio de
unión de ribosomas que se encuentra corriente arriba del gen
estructural de tal modo que la expresión tenga lugar en mayor
proporción. El mismo efecto tienen cassettes de expresión
incorporados corriente arriba del gen estructural. Además, mediante
promotores inducibles se puede aumentar la expresión durante la
producción fermentativa de L-serina. La expresión
también se mejora mediante medidas que prolonguen la vida del ARNm.
Los genes o constructos genéticos se pueden encontrar en plásmidos
con diferentes números de copias o pueden estar integrados y
amplificados en el cromosoma. También se puede aumentar la
actividad de la propia enzima o ésta se puede reforzar impidiendo la
descomposición de la proteína enzimática. Como alternativa, se
puede lograr una sobreexpresión de los genes correspondientes
modificando la composición de los medios y el procedimiento de
cultivo.
Los especialistas pueden encontrar instrucciones
al respecto en, entre otros, las referencias de Martin y col.
(Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), Guerrero y col.
(Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya y Morinaga
(Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), Eikmanns y col.
(Gene 102, 93-98 (1991)), en el documento de patente
europea EPS 0 472 869, en la patente US 4,601,893, en Schwarzer y
Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), Reinscheid
y col. (Applied and Environmental Microbiology 60,
126-132 (1994)), LaBarre y col. (Journal of
Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en la
solicitud de patente WO 96/15246, en Malumbres y col. (Gene 134, 15
- 24 (1993)), en la publicación de patente japonesa abierta a
consulta pública
JP-A-10-229891, en
Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58,
191-195 (1998)), Makrides (Microbiological Reviews
60: 512-538 (1996)) y en manuales de genética y
biología molecular conocidos.
Los microorganismos modificados genéticamente
producidos según la invención se pueden cultivar de forma continua o
discontinua en un procedimiento por lotes (batch) o un
procedimiento por lotes de alimentación (fed batch) o un
procedimiento por lotes de alimentación reiterada (repeated fed
batch) para producir L-serina. En el manual de
Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik
(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el manual de Storhas
(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag,
Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) se describen resúmenes de métodos de
cultivo conocidos.
El medio de cultivo a utilizar ha de satisfacer
adecuadamente las necesidades de las cepas correspondientes. El
"Manual of Methods for General Bacteriology" de la American
Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) incluye
descripciones de medios de cultivo de diferentes microorganismos.
Como fuente de carbono se pueden utilizar azúcares e hidratos de
carbono, por ejemplo glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa,
melaza, almidón y celulosa; aceites y grasas, por ejemplo aceite de
soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y manteca de coco;
ácidos grasos, por ejemplo ácido palmítico, ácido esteárico y ácido
linólico; alcoholes, por ejemplo glicerina y etanol; y ácidos
orgánicos, por ejemplo ácido acético. Estas sustancias se pueden
utilizar individualmente o mezcladas. Como fuente de nitrógeno se
pueden utilizar compuestos orgánicos que contienen nitrógeno como
peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de
malta, agua de remojo de maíz, harina de soja y urea; y compuestos
inorgánicos como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de
amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de
nitrógeno se pueden utilizar individualmente o mezcladas. Como
fuente de fósforo se puede utilizar ácido fosfórico,
dihidrogenofosfato de potasio o hidrogenofosfato de dipotasio, o sus
correspondientes sales de sodio. El medio de cultivo también ha de
contener sales de metales, como por ejemplo sulfato de magnesio o
sulfato de hierro, necesarias para el crecimiento. Por último,
además de las sustancias arriba mencionadas también se pueden
utilizar sustancias de crecimiento esenciales, como aminoácidos y
vitaminas. También se pueden añadir precursores adecuados al medio
de cultivo. Las sustancias mencionadas se pueden añadir en forma de
una carga única para el cultivo o se pueden ir añadiendo
adecuadamente durante el mismo.
Para controlar el pH del cultivo se utilizan
adecuadamente compuestos básicos como hidróxido de sodio, hidróxido
de potasio, amoníaco o agua amoniacal; o compuestos ácidos como
ácido fosfórico o ácido sulfúrico. También se pueden utilizar
antiespumantes, por ejemplo poliglicol éster de ácidos grasos, para
controlar la formación de espuma. Para mantener la estabilidad de
los plásmidos se pueden añadir al medio sustancias con un efecto
selectivo adecuado, por ejemplo antibióticos. En el cultivo se
incorpora oxígeno o mezclas gaseosas que contienen oxígeno, por
ejemplo aire, para mantener condiciones aeróbicas. La temperatura
del cultivo oscila normalmente entre 20ºC y 45ºC, preferentemente
entre 25ºC y 40ºC. El cultivo se mantiene hasta que se ha formado
la cantidad máxima de L-serina. Este punto se
alcanza normalmente en un plazo de 10 horas a 160 horas.
El análisis de la formación de
L-serina también puede realizarse mediante
cromatografía de intercambio aniónico con derivación subsiguiente de
ninhidrina, de acuerdo con la descripción de Spackman y col.
(Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190), o se puede llevar a cabo
mediante HPLC en fase inversa, de acuerdo con la descripción de
Lindroth y col. (Analytical Chemistry (1979) 51:
1167-1174).
Los microorganismos objeto de la presente
invención pueden producir L-serina a partir de
glucosa, sacarosa, lactosa, manosa, almidón, celulosa o a partir de
glicerina y etanol. Pueden consistir en los representantes de las
bacterias corineformes arriba descritos de forma detallada.
La Tabla 3 muestra una selección de resultados de
la fermentación. Los microorganismos modificados genéticamente según
la invención se caracterizan por una producción de
L-serina considerablemente mejor que en el caso de
los microorganismos correspondientes no transformados (tipo
salvaje) o los microorganismos que sólo contienen el vector sin
inserción de gen.
Una variante de realización especial de la
presente invención muestra que la sobreexpresión del gen serB
homólogo en C. glutamicum ATCC 13032
(13032(pVWEx1serB)) aumenta como mínimo al cuádruple
la acumulación de L-serina en el medio en
comparación con las cepas de control. Mediante la expresión del gen
serC homólogo (13032(pVWEx2serC)), la acumulación de
L-serina se puede multiplicar como mínimo por 20.
Es de esperar que la sobreexpresión conjunta de ambos genes,
serC y serC, en un sistema homólogo provoque un
aumento aun mayor de la producción de L-serina.
Lo más notable es que el aumento de la
acumulación de L-serina se logra ya en el tipo
salvaje Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. Por
consiguiente, mediante la utilización según la invención de una
cepa de producción de aminoácidos homóloga se puede lograr un
aumento aun mayor de la producción de L-serina.
En el sentido de la presente invención, por la
expresión "cepas de producción de aminoácidos" se han de
entender cepas de Corynebacterium glutamicum, o
microorganismos homólogos, que están modificadas mediante métodos
clásicos y/o de genética molecular de tal modo que su flujo
metabólico se desarrolla de forma reforzada hacia la biosíntesis de
aminoácidos o sus derivados (ingeniería metabólica). Por ejemplo,
en estas cepas de producción de aminoácidos, uno o más genes y/o
las enzimas correspondientes, que se encuentran en posiciones
decisivas y regulados de forma correspondientemente compleja de la
vía metabólica (cuello de botella), están modificados en su
regulación o incluso no están regulados. En este contexto, la
presente invención abarca todas las cepas de producción de
aminoácidos conocidas, preferentemente del género
Corynebacterium u organismos homólogos. La invención también
incluye aquellas cepas de producción que los especialistas puedan
obtener de forma análoga a cuando se trata de otros
microorganismos, por ejemplo enterobacterias, bacillaceae o tipos
de levadura mediante métodos habituales.
La invención también incluye aquellas cepas de
producción de aminoácidos en las que la descomposición de
L-serina está modificada, preferentemente
debilitada. Esto se puede conseguir, por ejemplo, mediante
modificaciones selectivas de ingeniería genética en enzimas que
degradan la L-serina o en los genes
correspondientes.
De acuerdo con la invención, el rendimiento de
L-serina en el producto final mejora adicionalmente
gracias a la mejora considerable de la secreción de
L-serina desde las células al medio que las rodea.
Esto se logra de acuerdo con la invención mediante la expresión
reforzada del vehículo de exportación de
L-treonina, a través del cual sorprendentemente
también se transporta activamente a través de la membrana celular
la L-serina formada, entre otras sustancias. De
este modo se aumenta aun más el contenido de
L-serina en el medio de cultivo, con lo que se
obtiene un producto final con una calidad considerablemente
mejorada con respecto a los productos conocidos hasta ahora.
La invención también incluye cepas bacterianas
que, además de las propiedades ventajosas referentes a la producción
de L-serina, también disponen de una mayor
capacidad para la secreción de L-serina desde las
células al medio de cultivo. En este contexto son preferentes
bacterias con un contenido elevado de proteínas de transporte de
membrana, por ejemplo un vehículo de exportación específico para
L-aminoácidos, en particular el vehículo de
exportación de L-treonina.
Otro objeto de la presente invención consiste en
la utilización de un microorganismo modificado genéticamente del
tipo anteriormente descrito para la producción de
L-serina y/o sus productos derivados de acuerdo con
un procedimiento del tipo mencionado en la introducción.
La presente invención también se refiere a la
utilización de los L-aminoácidos producidos del modo
anteriormente descrito para la industria alimentaria, la industria
de alimentos para animales y/o la industria farmacéutica o en
medicina humana. Además, los aminoácidos L-serina
producidos según la invención se pueden utilizar como precursores
para la síntesis de L-glicina,
L-cisteína y/o L-triptófano y/o
productos metabólicos derivados de éstos.
La presente invención se explica más
detalladamente a continuación mediante ejemplos no limitativos.
El aislamiento de ADN plásmido de Escherichia
coli y todas las técnicas de restricción, tratamiento Klenow y
tratamiento con fosfatasa alcalina se llevaron a cabo de acuerdo
con Sambrook y col. (Molecular cloning. A laboratory manual (1989),
Cold Spring Harbour Laboratory Press). Siempre que no se describa de
otro modo, la transformación de Escherichia coli se llevó a
cabo de acuerdo con Chung y col. (Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America USA (1989) 86:
2172-2175).
La cepa Corynebacterium glutamicum ATCC
14752 se sometió a una mutagénesis con el transposón Tn5531, cuya
secuencia está depositada bajo el número de acceso U53587 en el
banco de datos de nucleótidos del National Center for Biotechnology
Information (Bethesda, USA). El plásmido pCGL0040, que contiene el
transposón unido Tn5531 (Ankri y col., Journal of Bacteriology
(1996) 178: 4412-4419), se aisló de la cepa de
Escherichia coli con defecto de metilasa GM2929pCGL0040
(Escherichia coli GM2929: Palmer y col., Gene (1994) 143:
1-12). La cepa Corynebacterium glutamicum
ATCC 14752 se transformó mediante electroporación (Haynes y col.,
FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334) con el
plásmido pCGL0040. Los clones en los que el transposón Tn5531 estaba
integrado en el genoma se identificaron de acuerdo con su
resistencia a la canamicina sobre placas de
agar-LBHIS que contenían 15 \mug/ml de canamicina
(Liebl y col., FEMS Microbiology Letters (1989) 65:
229-304). De este modo se obtuvieron 1.800 clones,
que se estudiaron en cuanto al retardo en su crecimiento en
presencia de serilalanina. Para ello, todos los clones se
transfirieron individualmente a placas de
agar-CGXII-medio mínimo con y sin 2
mM serilalanina. El medio era idéntico al medio CGXII descrito por
Keilhauer y col. (Journal of Bacteriology (1993) 175:
5593-5603), pero contenía además 25 \mug/ml de
canamicina y 15 g/l de agar. La Tabla 1 muestra la composición del
medio descrito por Keilhauer y col.
Las placas de agar se incubaron a 30ºC y el
crecimiento se analizó después de 12, 18 y 24 horas. Se obtuvieron
dos mutantes de transposón que, en presencia de serilalanina,
presentaban un crecimiento comparable al de la cepa de partida
Corynebacterium glutamicum ATCC 14752, pero que en ausencia
de serilalanina no mostraban ningún crecimiento. Los mutantes
también crecían sólo con serina, lo que demostraba que se trataba
de mutantes auxótrofos de serina que han de presentar un defecto en
el metabolismo de serina. Estos mutantes se designaron ATCC
14752ser1::Tn5531 y ATCC 14752ser2::Tn5531.
Para clonar los sitios de inserción dispuestos
corriente arriba del transposón Tn5531 en el mutante descrito, en
primer lugar se aisló el ADN cromosómico de estas cepas mutantes de
acuerdo con la descripción de Schwarzer y col. (Bio/Technology
(1990) 9: 84-87) y 400 ng de éste se cortaron con la
endonucleasa de restricción XbaI. Toda la carga de restricción se
ligó en el vector pUC18 también linealizado con XbaI (Norander y
col., Gene (1983) 26: 101-106) de la firma Roche
Diagnostics (Mannheim, Alemania). La cepa de Escherichia coli
DH5\alphamcr (Grant y col., Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of America USA (1990) 87:
4645-4649) se transformó mediante electroporación
con toda la carga de ligación (Dower y col., Nucleic Acid Research
(1988) 16: 6127-6145). Los transformantes que
presentaban los sitios de inserción del transposón Tn5531 clonados
en el vector pUC18 se identificaron según su resistencia a la
carbenicilina y a la canamicina sobre placas de agar LB que
contenían 50 \mug/ml de carbenicilina y 25 \mug/ml de
canamicina. Después se prepararon plásmidos a partir de tres de los
transformantes en cada caso y la magnitud de la inserción clonada se
determinó mediante análisis de restricción. Las secuencias de
nucleótidos de los sitios de inserción en los plásmidos con una
inserción de aproximadamente 10 kb en el caso de ser1::Tn5531, o de
una inserción de 4,5 kb en el caso de ser2::Tn5531, se determinó de
acuerdo con el método de interrupción de cadena didesoxi de Sanger
y col. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America USA (1977) 74: 5463-5467).
Para ello, en primer lugar se secuenciaron aproximadamente 600 pb
de cada una de las dos inserciones a partir del siguiente cebador
oligonucleótido: 5'-CGG GTC TAC ACC GCT AGC CCA
GG-3'. Después se llevaron a cabo prolongaciones de
secuencia mediante desplazamiento del cebador, de modo que se
pudieron secuenciar en total aproximadamente 1,4 kb de la inserción
de ser1::Tn5531 y 1,2 kb de la inserción de ser2:Tn5531. El análisis
con el paquete de programas Lasergene (Biocomputing Software for
Windows, DNASTAR, Madison, USA) mostró que, en ambos casos, el
transposón estaba insertado al comienzo de un marco de lectura
abierta.
Para identificar los sitios de inserción
dispuestos corriente arriba del transposón, el ADN cromosómico de
los mutantes se cortó con la endonucleasa de restricción
EcoRI y se ligó en el vector pUC18 linealizado con
EcoRI. La clonación posterior se llevó a cabo tal como se
describe más arriba. Las secuencias de nucleótidos de los sitios de
inserción en uno de los plásmidos partiendo de ser1::Tn5531 con una
inserción de aproximadamente 6,5 kb, o en uno de los plásmidos
partiendo de ser2::Tn5531 con una inserción de aproximadamente 5,0
kb, se determinaron mediante el método de interrupción de cadena
didesoxi de Sanger y col. (Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America USA (1977) 74:
5463-5467). Para ello se secuenciaron
aproximadamente 400 pb de la inserción de ser1::Tn5531, o
aproximadamente 220 pb de la inserción de ser2::Tn5531, a partir
del siguiente cebador oligonucleótido: 5'-CGG TGC
CTT ATC CAT TCA GG-3'.
Las secuencias de nucleótidos obtenidas se
analizaron y reunieron con el paquete de programas Lasergene
(Biocomputing Software for Windows, DNASTAR, Madison, USA). Las
secuencias de nucleótidos están reproducidas como ID SEC Nº 1 e ID
SEC Nº 3. El análisis dio como resultado la identificación de un
marco de lectura abierta de 1.209 pb en el caso de ser1:Tn5531, y el
gen correspondiente se designó como serB, y de 1.128 pb en
el caso de ser2:Tn5531, y el gen correspondiente se designó como
serC. Los productos génicos correspondientes comprenden 403
y 376 aminoácidos y están reproducidos como ID SEC Nº 2 e ID SEC Nº
4.
Los genes serB y serC se clonaron
en el vector de clonación de Escherichia coli
pGEM-T (Zhou M-Y, Clark SE y
Gomez-Sanchez CE (1995) BioTechniques 19:34; Kobs G
(1995) Promega Notes 55:28; Promega Cooperation, Madison, USA). La
clonación se llevó a cabo en dos pasos. En primer lugar, los genes
de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 se amplificaron, en
cada caso, mediante una reacción en cadena de polimerasa (PCR) con
los siguientes cebadores oligonucleótido derivados de ID SEC Nº 1 o
ID SEC Nº 3.
| serB-forward: | |
| 5'-GCAGAGGCACACACTGGCA-3' | |
| serB-reverse: | |
| 5'-CTTGAGGAGGAGGTGGGC-3' | |
| serC-forward: | |
| 5'-CATCGTTTGGGAGACTGCG-3' |
| serC-reverse: | |
| 5'-CGTACTGGTGTAACTGTACGGG-3' |
La reacción PCR se llevó a cabo en 30 ciclos en
presencia de 200 \muM de desoxinucleótidotrifosfato (dATP, dCTP,
dGTP, dTTP), en cada caso 1 \muM del oligonucleótido
correspondiente, 100 ng de ADN cromosómico de Corynebacterium
glutamicum ATCC 13032, 1/10 volumen de tampón de reacción
décuplo y 2,6 unidades de la mezcla termoestable
Taq/Pwo-ADN-polimerasa (Expand High
Fidelity PCR System de la firma Roche Diagnostics, Mannheim,
Alemania), en un Thermocycler (PTC-100, MJ
Research, Inc., Watertown, USA) bajo las siguientes condiciones:
94ºC durante 60 segundos, 56ºC durante 90 segundos y 72ºC durante 2
minutos.
El fragmento de serB amplificado con un
tamaño de aproximadamente 1,7 kb y el fragmento de serC
amplificado con un tamaño de aproximadamente 1,3 kb se ligaron a
continuación con el vector pGEM-T con ayuda del
Promega PCR Cloning Kit de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. La cepa de Escherichia coli DH5\alphamcr
(Grant y col., Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America USA (1990) 87:
4645-4649) se transformó con las dos cargas de
ligación. Los transformantes se identificaron según su resistencia
a la ampicilina sobre placas de agar-LB que
contenían 50 \mug/ml de ampicilina. Los plásmidos se prepararon a
partir de 10 de los transformantes en cada caso y se comprobó la
presencia de los fragmentos de PCR, de 1,7 kb y 1,3 kb,
respectivamente, mediante análisis de restricción. Los plásmidos
recombinantes así formados de designan en lo sucesivo como
pGEM-TserB y
pGEM-TserC.
La determinación de las secuencias de nucleótidos
de los fragmentos de PCR de 1,7 kb y 1,3 kb en el plásmido
pGEM-TserBexp y el plásmido
pGEM-TserCexp, respectivamente, se llevó a
cabo mediante el método de interrupción de cadena didesoxi de
Sanger y col. (Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America USA (1977) 74:
5463-5467). Para ello se secuenciaron las
inserciones completas de pGEM-TserB y
pGEM-TserC con ayuda de los siguientes
cebadores de la firma Roche Diagnostics (Mannheim, Alemania).
| Cebador universal: | |
| 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3' | |
| Cebador inverso: | |
| 5'-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3' |
La secuencia de nucleótidos de la inserción en el
plásmido pGEM-TserB está reproducida como ID
SEC Nº 5 y la secuencia de nucleótidos de la inserción en el
plásmido pGEM-TserC está reproducida como ID
SEC Nº 7. La secuencia de nucleótidos obtenida se analizó con el
paquete de programas Lasergene (Biocomputing Software for Windows,
DNASTAR, Madison, USA). El análisis dio como resultado la
identificación de un marco de lectura abierta con una longitud de
1.209 pb y 1.128 pb, respectivamente. Los genes correspondientes se
designaron como serB y serC. Los productos génicos
correspondientes codifican polipéptidos con una longitud de 403 y
376 aminoácidos, respectivamente, que están reproducidos como ID
SEC Nº 6 e ID SEC Nº 8.
Para investigar el efecto de la sobreexpresión de
los genes para la fosfoserina-fosfatasa serB
y la fosfoserina-aminotransferasa serC en la
producción de serina se utilizaron los vectores de expresión pVWEX1
(Wendisch. V., Dissertation Heinrich-Heine
Universität, Düsseldorf, 1997; confiere resistencia a la
canamicina) y pVWEX2 (Wendisch. V., Dissertation
Heinrich-Heine Universität, Düsseldorf, 1997;
confiere resistencia a la tetraciclina), que permiten una expresión
inducible por IPTG (Molecular Cloning, A laboratory manual (1989),
Cold Spring Harbour Laboratory Press). El gen serB se clonó
sin promotor en el vector pVWEX1 y el serC se clonó sin
promotor en el vector pVWEX2. Para ello se sintetizaron los
siguientes promotores:
| serB-exp-for: | |
| 5'-ATCTAGAATGATCACAGTGAGCCGTAAAG-3' | |
| serB-exp-rev: | |
| 5'-AGGATCCTTAGGCATTTGTCAATGGAACGC-3' | |
| serC-exp-for: | |
| 5'-AGCATGCATGCCCGAAGACATGACCG-3' | |
| serC-exp-rev: | |
| 5'-ATCTAGATTACTTCCTTGCAAAACCGC-3' |
\newpage
Mediante PCR se amplificó el gen serB sin
promotor en forma de un fragmento con un tamaño de 1.226 pb (ID SEC
Nº 5, bases 382 a 1.594) y el gen serC sin promotor en forma
de un fragmento de 1.157 pb (ID SEC Nº 7, bases 132 a 1.261) a
partir de ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum ATCC
13032. Los cebadores se eligieron de tal modo que el cebador
serB-exp-for proporcionaba un sitio de corte
XbaI, el cebador serB-exp-rev
proporcionaba un sitio de corte BamHI, el cebador
serC-exp-for proporcionaba un sitio de corte
SphI y el cebador serC-exp-rev
proporcionaba un sitio de corte XbaI. Los productos de PCR
aislados se clonaron en primer lugar en el vector
pGEM-T tal como se describe más arriba, y se
obtuvieron los plásmidos pGEM-TserB-exp y
pGEM-TserC-exp. A continuación se cortó el
gen serB sin promotor del vector
pGEM-TserBexp mediante restricción de
XbaI-BamHI, y se ligó en el vector pVWEX1 linealizado
correspondientemente con XbaI-BamHI. El gen
serC sin promotor se cortó del vector
pGEM-TserBexp después de una restricción de
SpeI-XbaI, y se ligó en el vector pVWEX2 linealizado
con XbaI. Los constructos obtenidos pVWEX1serB (Figura 2) y
pVWEX2serC (Figura 3) se ensayaron mediante restricción.
Los plásmidos pVWEX1-serB y
pVWEX2-serC se incorporaron individualmente, en cada caso,
mediante electroporación en la cepa de Corynebacterium
glutamicum ATCC 13032 de tipo salvaje, con lo que se obtuvieron
las cepas C. glutamicum 13032 (pVWEX1serB) y C.
glutamicum 13032 (pVWEX2serC). Como control negativo se
cultivó el tipo salvaje Corynebacterium glutamicum ATCC
13032 y la cepa C. glutamicum ATCC que contiene los vectores
pVWEX1 sin inserción. A continuación se determinó la segregación de
L-serina de todas las cepas anteriormente
mencionadas, que se resume de forma comparativa en la Tabla 3.
Para ello, las cepas se cultivaron en medio
complejo (2xTY; Molecular Cloning, A laboratory manual (1989) Cold
Spring Harbour Laboratory Press; con 50 \mug/l de canamicina, 25
\mug/l de tetraciclina o 50 \mug/l de canamicina y 25 \mug/l
de tetraciclina), y se inoculó por separado el medio de fermentación
CGXII (J Bacteriol (1993) 175: 5595-5603) en cada
caso de los cultivos previos. El medio contenía adicionalmente el o
los antibióticos correspondientes y también 200 \mug/ml de IPTG.
Después de 24 horas de cultivo a 30ºC en un agitador rotativo a 120
revoluciones por minuto se determinó la cantidad de
L-serina acumulada en el medio. La determinación de
la concentración de aminoácidos se realizó mediante cromatografía
líquida a alta concentración (J Chromat (1983) 266:
471-482).
Representación de las secuencias de ácido
nucleico que contienen los genes serB (ID SEC Nº 1),
serC (ID SEC Nº 3) y thrE (ID SEC Nº 9), y secuencias
de aminoácido derivadas de éstas SerB (ID SEC Nº 2), SerC (ID SEC Nº
4) y ThrE (ID SEC Nº 10) de Corynebacterium glutamicum ATCC
14752 y Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
(correspondientes a las ID SEC Nº 5, 7, 6, 8, 11 y 12).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
1
Las abreviaturas utilizadas tienen el siguiente
significado:
- Amp = Gen de \beta-lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina
- Kan = Gen de fosfotransferasa que confiere resistencia a la canamicina
También se indican puntos de intersección para
endonucleasas de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
2
Las abreviaturas utilizadas tienen el siguiente
significado:
- Kan = Gen de fosfotransferasa que confiere resistencia a la canamicina
- lacl^{q} = Represor del operón lactosa de E. coli expresado cuantitativamente
- P^{tac} = Promotor artificial inducible por IPTG compuesto por el promotor trp y el promotor lac de E. coli
También se indican puntos de intersección para
endonucleasas de restricción.
\newpage
Figura
3
Las abreviaturas utilizadas tienen el siguiente
significado:
- Kan = Gen de fosfotransferasa que confiere resistencia a la canamicina
- Tet = Gen tet\alpha1 del plásmido pHY163PLK (Ishiwa & Shibahara, 1985, Jpn. J. Genet., 60: 485-498), que {}\hskip0,8cm confiere resistencia a la tetraciclina
- lacl^{q} = Represor del operón lactosa de E. coli expresado cuantitativamente
- P^{tac} = Promotor artificial inducible por IPTG compuesto por el promotor trp y el promotor lac de E. coli
También se indican puntos de intersección para
endonucleasas de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
- Tabla 1:
- Composición del medio de sal mineral CGXII para el cultivo de bacterias corineformes
- Tabla 2:
- Comparación de las similitudes de la fosfoserina-aminotransferasa (PSAT; serC) y de la fosfoserina-fosfatasa (PSP; serB) de Corynebacterium glutamicum con fosfoserina- aminotransferasas y fosfoserina-fosfatasas conocidas de otros organismos
- Tabla 3:
- Sinopsis comparativa de la acumulación de L-serina en el sobrenadante de cultivo del Corynebacterium glutamicum de tipo salvaje ATCC 13032 y también de las cepas de Corynebacterium glutamicum transformadas con los plásmidos correspondientes ATCC 13032(pVWEX1), ATCC 13032(pVWEX1serB) y ATCC 13032(pVWEX2serC)
<110> Forschungszentrum Jülich GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Secuencias de nucleótido que
codifican proteínas que participan en la biosíntesis de
L-serina, procedimiento mejorado para la producción
microbiana de L-serina y también un Mikr modificado
genéticamente adecuado para ello.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
FZJ-9912-PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1765
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> C. glutamicum ATCC 14 752
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (414) .. (1613)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ser B
(fosfoserina-fosfatasa)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 400
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> C. glutamicum ATCC 14 752
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1469
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> C. glutamicum ATCC 14 752
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (246) .. (1373)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ser C (fosfoserina fosfatasa)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 376
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> C. glutamicum ATCC 14 752
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1627
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> C. glutamicum ATCC 13 032
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (382) .. (1590)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ser B
(fosfoserina-fosfatasa)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 403
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> C. glutamicum ATCC 13 032
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1304
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> C. glutamicum ATCC 13032
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (131) .. (1258)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ser C
(fosfoserina-fosfatasa)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 376
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> C. glutamicum ATCC 13 032
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2817
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> C. glutamicum ATCC 14 752
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> thr E (vehículo de exportación de
treonina)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 489
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> C. glutamicum ATCC 14 752
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1909
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> C. glutamicum ATCC 13 032
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (280) .. (1746)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> thr E (vehículo de exportación de
treonina)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 489
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> C. glutamicum ATCC 13 032
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>12
Claims (9)
1. Procedimiento para la producción microbiana de
L-serina, caracterizado porque
- a)
- un ácido nucleico que codifica una fosfoserina-fosfatasa (serB) según la ID SEC Nº 1 ó 5, un ácido nucleico que codifica una fosfoserina-aminotransferasa (serC) según la ID SEC Nº 3 ó 7 y un ácido nucleico que codifica un vehículo de exportación de L-treonina según la ID SEC Nº 9 u 11, aislados de una bacteria corineforme, se transfieren a un microorganismo homólogo y se expresan en éste, incrementándose la expresión y la actividad de los polipéptidos correspondientemente codificados con respecto al microorganismo respectivo no modificado genéticamente,
- b)
- este microorganismo modificado genéticamente del paso a) se utiliza para la producción fermentativa de L-serina, incrementándose la segregación de L-serina en el medio de cultivo, y
- c)
- la L-serina así producida se aísla del medio de cultivo.
2. Microorganismo modificado genéticamente para
la producción de L-serina que contiene un ácido
nucleico replicable que codifica una
fosfoserina-fosfatasa (serB) según la ID SEC Nº 1 ó
5, un ácido nucleico que codifica una
fosfoserina-aminotransferasa (serC) según la ID SEC
Nº 3 ó 7 y un ácido nucleico que codifica el vehículo de exportación
de L-treonina (thrE) según la ID SEC Nº 9 u 11 cuya
expresión se ha incrementado y/o cuyo número de copias se ha
incrementado en comparación con el microorganismo correspondiente no
modificado genéticamente.
3. Microorganismo modificado genéticamente según
la reivindicación 2, que contiene polipéptidos codificados por los
genes serB, serC y thrE, que presentan una actividad aumentada en
comparación con el microorganismo correspondiente no modificado
genéticamente.
4. Microorganismo modificado genéticamente según
una de las reivindicaciones 2 ó 3, caracterizado porque
presenta como mínimo un índice de producción se
L-serina aumentado y un índice de secreción de
L-serina y/o
L-treonina aumentado.
L-treonina aumentado.
5. Microorganismo modificado genéticamente según
una de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque
consiste en una bacteria corineforme, preferentemente del género
Corynebacterium o Brevibacterium.
6. Microorganismo modificado genéticamente según
una de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado porque
consiste en una bacteria de la especie Corynebacterium
glutamicum o Brevibacterium flavum.
7. Utilización de los ácidos nucleicos según la
ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7 y la ID SEC Nº 9 u 11 para la producción de
un microorganismo modificado genéticamente según una de las
reivindicaciones 2-6.
8. Utilización de las secuencias según ID SEC Nº
9-12 para mejorar la exportación de
L-serina de un microorganismo modificado
genéticamente según una de las reivindicaciones
2-6.
9. Utilización del microorganismo modificado
genéticamente según una de las reivindicaciones 2 a 6 para la
producción de L-serina y/o sus productos
derivados.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10009799A DE10009799A1 (de) | 2000-03-01 | 2000-03-01 | Nukleotidsequenzen kodierend für Proteine beteiligt an der Biosynthese von L-Serin und Verfahren zu dessen Herstellung |
| DE10009799 | 2000-03-01 | ||
| DE10044831A DE10044831A1 (de) | 2000-03-01 | 2000-09-11 | Verbessertes Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Serin sowie ein dazu geeigneter genetisch veränderter Mikroorganismus |
| DE10044831 | 2000-09-11 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2249427T3 true ES2249427T3 (es) | 2006-04-01 |
Family
ID=26004608
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES01929377T Expired - Lifetime ES2249427T3 (es) | 2000-03-01 | 2001-03-01 | Secuencias de nucleotidos codificadoras de proteinas que participan en la biosintesis de l-serina, rocedimiento mejorado para la produccion microbiana de l-serina y microorganismo modificado geneticamente adecuado para dicho procedimiento. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7083952B2 (es) |
| EP (1) | EP1259622B1 (es) |
| JP (1) | JP2003525046A (es) |
| AT (1) | ATE305515T1 (es) |
| DE (2) | DE10044831A1 (es) |
| DK (1) | DK1259622T3 (es) |
| ES (1) | ES2249427T3 (es) |
| WO (1) | WO2001064899A2 (es) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4655374B2 (ja) * | 2000-01-27 | 2011-03-23 | 味の素株式会社 | コリネ型細菌のホスホセリンホスファターゼ遺伝子 |
| US6395528B1 (en) | 2000-01-27 | 2002-05-28 | Ajinomoto Co., Inc. | Phosphoserine phosphatase gene of coryneform bacteria |
| DE10331291A1 (de) | 2003-07-10 | 2005-02-17 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Varianten der 3-Phosphoglyceratdehydrogenase mit reduzierter Hemmung durch L-Serin und dafür codierende Gene |
| KR101381048B1 (ko) * | 2010-10-20 | 2014-04-14 | 씨제이제일제당 (주) | Ｏ-포스포세린 생산 균주 및 이로부터 생산된 ｏ-포스포세린으로부터 ｌ-시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법 |
| AU2019243241B2 (en) * | 2018-03-27 | 2022-12-01 | Cj Cheiljedang Corporation | A Novel Promoter And A Method For Producing L-Amino Acid Using The Same |
| CN114134185A (zh) * | 2021-10-30 | 2022-03-04 | 新泰市佳禾生物科技有限公司 | 一种发酵生产l-丝氨酸的方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1412288A1 (ru) * | 1986-07-18 | 1991-12-07 | Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Штамм бактерий ВRеVIвастеRIUм FLаVUм продуцент L - серина |
| DE4208785A1 (de) * | 1992-03-19 | 1993-09-23 | Degussa | Verfahren zum auffinden von insertionselementen (is-elemente) oder transposonen |
| JPH06181776A (ja) * | 1992-10-23 | 1994-07-05 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードするｄｎａ |
| JP4066543B2 (ja) * | 1998-01-12 | 2008-03-26 | 味の素株式会社 | 発酵法によるｌ−セリンの製造法 |
| EP1257649B1 (en) * | 1999-06-25 | 2010-01-20 | Paik Kwang Industrial Co., Ltd. | Corynebacterium glutamicum genes encoding metabolic pathway proteins |
| DE19941478A1 (de) * | 1999-09-01 | 2001-03-08 | Degussa | Neue für das thrE-Gen codierende Nukleotidsequenzen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin mit coryneformen Bakterien |
| JP4623825B2 (ja) * | 1999-12-16 | 2011-02-02 | 協和発酵バイオ株式会社 | 新規ポリヌクレオチド |
-
2000
- 2000-09-11 DE DE10044831A patent/DE10044831A1/de not_active Withdrawn
-
2001
- 2001-03-01 AT AT01929377T patent/ATE305515T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-03-01 DE DE50107566T patent/DE50107566D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-03-01 EP EP01929377A patent/EP1259622B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-03-01 WO PCT/EP2001/002283 patent/WO2001064899A2/de active IP Right Grant
- 2001-03-01 JP JP2001563588A patent/JP2003525046A/ja not_active Withdrawn
- 2001-03-01 ES ES01929377T patent/ES2249427T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-03-01 DK DK01929377T patent/DK1259622T3/da active
-
2002
- 2002-08-21 US US10/224,574 patent/US7083952B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2003525046A (ja) | 2003-08-26 |
| DE50107566D1 (de) | 2006-02-09 |
| DK1259622T3 (da) | 2006-01-09 |
| WO2001064899A2 (de) | 2001-09-07 |
| EP1259622B1 (de) | 2005-09-28 |
| DE10044831A1 (de) | 2002-04-04 |
| WO2001064899A3 (de) | 2002-08-15 |
| ATE305515T1 (de) | 2005-10-15 |
| US7083952B2 (en) | 2006-08-01 |
| WO2001064899A9 (de) | 2003-06-05 |
| US20040101837A1 (en) | 2004-05-27 |
| EP1259622A2 (de) | 2002-11-27 |
| WO2001064899A8 (de) | 2003-01-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2900273T3 (es) | Procedimiento para la producción de L-ornitina bajo empleo de bacterias de sobreexpresión de lisis | |
| ES2529107T3 (es) | Procedimiento para la producción por fermentación de L-aminoácidos mediando utilización de bacterias corineformes | |
| ES2382226T3 (es) | Procedimiento para la producción de L-metionina usando bacterias corineformes | |
| ES2376035T3 (es) | Unidades de expresión de p-ef-ts en corynebacterium glutamicum. | |
| ES2439946T3 (es) | Unidades de expresión de PEF-TU | |
| ES2197076T5 (es) | Procedimiento para la produccion microbiana de l-valina. | |
| ES2856755T3 (es) | Promotores de Corynebacterium glutamicum | |
| ES2203384T3 (es) | Secuencias de nucleotidos que codifican el gen thre y procedimiento para la preparacion fermentativa de l-treonina con bacterias corineformes. | |
| US7135313B2 (en) | Method for producing L-lysine or L-lysine containing feed additives with a cornebacteria containing a mutated lysC | |
| ES2352183T3 (es) | Secuencias de nucleótidos que codifican la exportación de aminoácidos ramificados, un procedimiento para su aislamiento y su utilización. | |
| EP3456834B1 (en) | Method for the fermentative production of l-amino acids | |
| ES2254459T3 (es) | Secuencias de nucleotidos que codifican para el gen mdha a partir de corynebacterium glutamicum. | |
| ES2383888T3 (es) | Procedimiento para la producción por fermentación de productos químicos finos que contienen azufre | |
| ES2231089T3 (es) | Secuencias de nucleotidos que codifican el gen dapf. | |
| ES2518995T3 (es) | Alelos del gen prpD1 procedente de bacterias corineformes | |
| ES2344248T3 (es) | Secuencias de nucleotidos que codifican el gen dapc, y procedimiento para la preparacion de l-lisina. | |
| US7524657B2 (en) | Alleles of the sigA gene from coryneform bacteria | |
| ES2374837T3 (es) | Alelos del gen opca de bacterias corineformes. | |
| ES2249427T3 (es) | Secuencias de nucleotidos codificadoras de proteinas que participan en la biosintesis de l-serina, rocedimiento mejorado para la produccion microbiana de l-serina y microorganismo modificado geneticamente adecuado para dicho procedimiento. | |
| ES2320247T3 (es) | Procedimiento para la produccion de l-valina por fermentacion mediando utilizacion de bacterias corineformes con una actividad aumentada de transaminasa. | |
| EP3498853A1 (en) | Method for the fermentative production of l-lysine | |
| ES2329227T3 (es) | Alelos de gen de la glucoquinasa de la bacteria corineforme. | |
| US20160244490A1 (en) | Microorganism and Method for the Fermentative Production of an Organic-Chemical Compound | |
| ES2208178T3 (es) | Procedimiento para la preparacion fermentativa de l-aminoacidos y secuencias de nucleotidos que codifican el gen accda. | |
| ES2500365T3 (es) | Alelos del gen mqo procedente de bacterias corineformes |