ES2249427T3 - Secuencias de nucleotidos codificadoras de proteinas que participan en la biosintesis de l-serina, rocedimiento mejorado para la produccion microbiana de l-serina y microorganismo modificado geneticamente adecuado para dicho procedimiento. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la producción microbiana de L- serina, caracterizado porque a) un ácido nucleico que codifica una fosfoserina- fosfatasa (serB) según la ID SEC Nº 1 ó 5, un ácido nucleico que codifica una fosfoserina- aminotransferasa (serC) según la ID SEC Nº 3 ó 7 y un ácido nucleico que codifica un vehículo de exportación de L-treonina según la ID SEC Nº 9 u 11, aislados de una bacteria corineforme, se transfieren a un microorganismo homólogo y se expresan en éste, incrementándose la expresión y la actividad de los polipéptidos correspondientemente codificados con respecto al microorganismo respectivo no modificado genéticamente, b) este microorganismo modificado genéticamente del paso a) se utiliza para la producción fermentativa de L-serina, incrementándose la segregación de L-serina en el medio de cultivo, y c) la L-serina así producida se aísla del medio de cultivo.

Description

Secuencias de nucleótidos codificadoras de proteínas que participan en la biosíntesis de L-serina, procedimiento mejorado para la producción microbiana de L-serina y microorganismo modificado genéticamente adecuado para dicho procedimiento.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción microbiana de L-serina y a un microorganismo modificado genéticamente adecuado para dicho procedimiento. Además, la presente invención incluye la utilización de L-serina y/o de sus productos derivados en la industria alimentaria, la industria de alimentos para animales y/o la industria farmacéutica y/o en medicina humana.

En los últimos años, aminoácidos como por ejemplo L-glutamato, L-lisina, o también L-aminoácidos de cadena ramificada, han despertado un creciente interés científico. Lo mismo es aplicable al aminoácido L-serina, que no sólo sirve como precursor para la síntesis de los aminoácidos alifáticos L-glicina o L-cisteína, sino también para la producción de L-triptófano a partir de indol y L-serina. En este contexto se considera que el aminoácido L-serina tiene un creciente potencial económico en particular en la industria alimentaria, la industria de alimentos para animales y la industria farmacéutica, y también en amplios campos de la medicina humana.

En la literatura se han descrito numerosos procedimientos para la producción microbiana de L-serina. También se conocen fermentaciones de bacterias corineformes para la producción de L-serina. Por ejemplo, una cepa de Corynebacterium glycinophilium puede producir L-serina a partir de glicina e hidratos de carbono (Kubota K., Kageyama K., Shiro T. y Okumura S. (1971) Journal of General Applications in Microbiology, 17: 167-168; Kubota K., Kageyama K., Maeyashiki I., Yamada K. y Okumura S. (1972) Journal of General Applications in Microbiology 18: 365). En este caso, la enzima L-serina-hidroximetiltransferasa participa en la transformación de glicina en L-serina (Kubota K. y Yokozeki K. (1989) Journal of Fermentation and Bioengeneering, 67(6): 387-390). Las cepas bacterianas utilizadas también muestran una menor descomposición de serina, que se puede atribuir a una disminución de la actividad de la enzima L-serina-deshidratasa (Kubota K., Kageyama K., Shiro T. y Okumura S. (1971) Journal of General Applications in Microbiology, 17: 167-168; Kubota K. (1985) Agricultural Biological Chemistry, 49: 7-12).

Además, Izumi Y. Yoshida T., Miyazaki S.S., Mitsunaga T., Ohshiro T., Shiamo M., Miyata A. y Tanabe T. (1993) Applies Microbiology and Biotechnology, 39: 427-432, han descrito la producción fermentativa de L-serina a partir de metanol y glicina con ayuda de bacterias, por ejemplo del género Hyphomicrobium.

Sin embargo, en los casos arriba mencionados es necesario añadir el aminoácido glicina como precursor para formar el aminoácido L-serina a partir de hidratos de carbono.

En cambio, ya se conocen procedimientos para la fermentación de bacterias corineformes que pueden producir L-serina directamente a partir de hidratos de carbono, sin añadir adicionalmente otros precursores. Por ejemplo, Yoshida H. y Nakayama K. (1974) Nihon-Nogei-Kagakukaishi 48: 201-208, describen cepas bacterianas del género Corynebacterium, y en particular de la clase Corynebacterium glutamicum, obtenidas mediante mutagénesis no dirigida que se caracterizan, entre otras cosas, porque son resistentes frente a análogos de L-serina: hidroxamato de serina o \beta-cloroalanina. Entre otras consecuencias, esto hace que el flujo metabólico pueda fluir más en la dirección de la síntesis de L-serina, dado que la actividad de las enzimas correspondientes está sometida a una menor inhibición de producto final.

Además, el documento EP 0 931 833 da a conocer cepas bacterianas de la especie Brevibacterium flavum que también se obtienen mediante mutagénesis no dirigida y que debido a ésta presentan defectos en la descomposición de la serina. Las cepas descritas en dicho documento también presentan un gen serA modificado que codifica una 3-fosfoglicerato-deshidrogenasa, no sensible a la retroalimentación. Además, estas cepas contienen los genes serB y serC procedentes del organismo heterólogo Escherichia coli, que codifican las enzimas fosfoserina-fosfatasa y fosfoserina-aminotransferasa, respectivamente. Por consiguiente, el sistema aquí descrito presenta una gran complejidad en lo que respecta a las numerosas estructuras génicas incorporadas adicionalmente, que son en parte heterólogas, junto con una incertidumbre genética de las cepas bacterianas en lo que respecta a la mutagénesis no dirigida mencionada en la introducción. Esto entraña el riesgo de una inestabilidad relativamente alta para dichas cepas bacterianas durante un procedimiento de producción a escala industrial. Además, en dicho documento se indica que mediante las cepas bacterianas descritas sólo se logra un aumento de la producción de L-serina en un factor 2 hasta un máximo de un factor 5. Esto se puede deber, entre otras razones, a una expresión subóptima de genes
heterólogos.

Otra desventaja de los sistemas heterólogos radica en la escasa aceptación de los sistemas que contienen ADN extraño, en particular para la producción de sustancias que tienen relevancia médica, farmacológica y alimen-
taria.

En el documento WO 01/00843 se da a conocer el aislamiento y la utilización general, para la producción de productos químicos puros, de numerosos genes de Corynebacterium glutamicum que codifican proteínas del metabolismo central. En cambio, no se describe ningún procedimiento para la producción y preparación mejorada del aminoácido L-serina.

Además de la biosíntesis de L-aminoácidos económicamente interesantes, como por ejemplo L-serina, la secreción de estos productos metabólicos en el medio de cultivo tiene una importancia decisiva en el rendimiento de L-serina en el producto final. Esta secreción puede tener lugar de forma no específica por difusión o, tal como se describe por ejemplo para los aminoácidos L-isoleucina o L-lisina (Zittrich, S. y col., 1994, Journal of Bacteriology, 176: 6892-6899 y Bröer, S. y col., 1991, European Journal of Biochemistry, 202: 131-153), puede estar mediada activamente por sistemas de transporte de membrana. Un problema de estos sistemas de transporte activo consiste en que la capacidad de estos "vehículos de exportación" se supera con rapidez: tan pronto como el contenido de producto metabólico a transportar en la célula supera un valor crítico de la concentración presente de forma natural. Esto significa que, por ejemplo, en caso de un aumento de la biosíntesis de L-serina, su salida de la célula puede estar limitada.

En consecuencia, sería deseable disponer de los genes de bacterias corineformes que participan de forma decisiva en la biosíntesis de L-serina para la expresión en un sistema homólogo, y también mejorar la secreción de la L-serina formada en el medio de cultivo.

Por consiguiente, un objetivo de la presente invención consiste en poner a disposición un sistema que no presente las desventajas arriba mencionadas y que posibilite una mejor producción de L-serina y de productos metabólicos derivados de ella y el aislamiento de los mismos.

Este objetivo se resuelve mediante un procedimiento para la producción microbiana de L-serina, en el que (a) un ácido nucleico que codifica una fosfoserina-fosfatasa (serB) según la ID SEC Nº 1 ó 5 y un ácido nucleico que codifica una fosfoserina-aminotransferasa (serC) según la ID SEC Nº 3 ó 7 y un ácido nucleico que codifica un vehículo de exportación de L-treonina según la ID SEC Nº 9 u 11, aislados de una bacteria corineforme, se transfieren a un microorganismo homólogo y se expresan en éste, incrementándose la expresión y la actividad de los polipéptidos correspondientemente codificados con respecto al microorganismo respectivo no modificado genéticamente, (b) este microorganismo modificado genéticamente del paso a) se utiliza para la producción fermentativa de L-serina, incrementándose la segregación de L-serina en el medio de cultivo, y (c) la L-serina así producida se aísla del medio de cultivo.

Además, el objetivo se resuelve mediante un microorganismo modificado genéticamente para la producción de L-serina que contiene un ácido nucleico que codifica una fosfoserina-fosfatasa (serB) según la ID SEC Nº 1 ó 5 de forma replicable, un ácido nucleico que codifica una fosfoserina-aminotransferasa (serC) según la ID SEC Nº 3 ó 7 y un ácido nucleico que codifica el vehículo de exportación de L-treonina (thrE) según la ID SEC Nº 9 u 11 cuya expresión se ha incrementado y/o cuyo número de copias se ha incrementado en comparación con el microorganismo correspondiente no modificado genéticamente.

La invención también incluye la utilización de los ácidos nucleicos que codifican un vehículo de exportación de L-treonina según la ID SEC Nº 9 u 11 y las secuencias de polipéptidos derivadas de éste según la ID SEC Nº 10 ó 12, y también su empleo en el procedimiento según la invención para producir L-serina. La solicitud de patente alemana 199 41 478.5 da a conocer el aislamiento de estas secuencias de bacterias corineformes.

Los ácidos nucleicos utilizados se caracterizan porque se aíslan de bacterias corineformes, preferentemente del género Corynebacterium o Brevibacterium, en especial de la clase Corynebacterium glutamicum o Brevibacterium flavum. Como ejemplos de bacterias corineformes de tipo salvaje depositadas en cepas microbianas se mencionan: Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 14752, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium melassecola ATCC 17965, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 y Brevibacterium divaricatum ATCC 14020. Como ejemplos de mutantes o cepas de producción adecuados para la producción de L-serina se mencionan: Corynebacterium glutamicum ATCC 21586, Corynebacterium glutamicum KY 10150 y Brevibacterium ketoglutamicum ATCC 21222. La invención se caracteriza más detalladamente mediante la indicación de las cepas bacterianas arriba mencionadas, pero dicha indicación no tiene efecto limitativo.

De acuerdo con la invención, como "ácido nucleico aislado" o "fragmento de ácido nucleico aislado" se ha de entender un polímero de ARN o ADN que puede ser de cadena simple o doble y opcionalmente puede contener nucleótidos naturales, sintetizados químicamente, modificados o artificiales. El concepto "polímero de ADN" también incluye ADN genómico, ADNc o mezclas de ellos.

De acuerdo con la invención, por el término "alelos" se han de entender secuencias de nucleótidos funcionalmente equivalentes, es decir secuencias de nucleótidos con un efecto igual en esencia. Las secuencias funcionalmente equivalentes son secuencias que todavía poseen las funciones deseadas a pesar de presentar una secuencia de nucleótidos diferente, por ejemplo debido a la degenerabilidad del código genético. Por consiguiente, los equivalentes funcionales incluyen variantes naturales de las secuencias aquí descritas y también secuencias de nucleótidos obtenidas por síntesis química y en caso dado adaptadas al uso de codones del organismo huésped. Además, las secuencias funcionalmente equivalentes también incluyen aquellas que presentan una secuencia de nucleótidos modificada que confiere a la enzima una insensibilidad o resistencia a los inhibidores, por ejemplo.

Por el concepto "funcional equivalente" también se entienden, en particular, mutaciones naturales o sintéticas de una secuencia originalmente aislada que siguen mostrando la función deseada. Las mutaciones incluyen sustituciones, adiciones, deleciones, intercambios o inserciones de uno o más restos de nucleótido. También están incluidas las llamadas mutaciones sentido (sense mutations), que a nivel proteínico pueden conducir por ejemplo al intercambio de aminoácidos conservados, pero que no producen ninguna modificación fundamental de la actividad de la proteína y, en consecuencia, son funcionalmente neutras. También se incluyen las modificaciones de la secuencia de nucleótidos que a nivel proteínico afectan al terminal N o C, pero sin influir esencialmente de forma negativa en la función de la proteína. Estas modificaciones pueden tener incluso una influencia estabilizadora en la estructura de la proteína.

La presente invención también incluye, por ejemplo, las secuencias de nucleótidos obtenidas mediante modificación de la secuencia de nucleótidos, con lo que se obtienen sus derivados correspondientes. El objetivo de esta modificación pueden consistir, por ejemplo, en una mayor delimitación de la secuencia codificadora incluida o también en la incorporación de más puntos de intersección de enzima de restricción. También son equivalentes funcionales las variantes cuya función está debilitada o reforzada en comparación con el gen o el fragmento de gen de partida.

También forman parte del objeto de la presente invención secuencias de ADN artificiales siempre que éstas confieran las propiedades deseadas, tal como se describe más arriba. Estas secuencias de ADN artificiales se pueden determinar, por ejemplo, mediante retrotraducción de proteínas construidas mediante programas asistidos por computador (molecular modelling), o mediante selección in vitro. Son especialmente adecuadas las secuencias de ADN codificadoras obtenidas mediante retrotraducción de una secuencia de polipéptidos según el uso específico de codones del organismo huésped. Un especialista familiarizado con los métodos genéticos moleculares puede determinar fácilmente el uso específico de codones mediante evaluación por computador de otros genes ya conocidos del organismo a transformar.

De acuerdo con la invención, por el concepto "secuencias homólogas" se han de entender aquellas secuencias que son complementarias a las secuencias de nucleótidos de la invención y/o que se hibridizan con éstas. De acuerdo con la invención, el concepto "secuencias de hibridación" incluye secuencias de nucleótido sustancialmente similares del grupo de ADN o ARN que, bajo determinadas condiciones rigurosas conocidas, experimentan una interacción específica (unión) con las secuencias de nucleótidos anteriormente mencionadas. También están incluidas secuencias de nucleótidos cortas, con una longitud de por ejemplo 10 a 30, preferentemente 12 a 15, nucleótidos. De acuerdo con la invención, aquí también están incluidos, entre otros, los denominados cebadores o sondas.

De acuerdo con la invención también están incluidas las áreas de secuencia que preceden (en dirección 5' o corriente arriba) y/o siguen (en dirección 3' o corriente abajo) a las áreas codificadoras (genes estructurales). En este contexto están incluidas, en particular, áreas de secuencia con función reguladora. Éstas pueden influir en la transcripción, la estabilidad de ARN o el procesamiento de ARN, y también en la traducción. Como ejemplos de secuencias reguladoras se pueden mencionar, entre otros: promotores, intensificadores, operadores, terminadores o reforzadores de traducción.

Otro objeto de la presente invención consiste en una estructura génica que contiene al menos una de las secuencias de nucleótidos arriba descritas que codifican una fosfoserina-fosfatasa, una fosfoserina-aminotransferasa y/o un vehículo de exportación de L-treonina, y también secuencias reguladoras unidas operativamente con éstas y que controlan la expresión de las secuencias codificadoras en la célula huésped.

Por el concepto "unión operativa" se entiende la disposición secuencial de, por ejemplo, un promotor, una secuencia codificadora, un terminador y dado el caso otros elementos reguladores, de tal modo que cada uno de los elementos reguladores pueda desempeñar correctamente su función durante la expresión de la secuencia codificadora. Estas secuencias de nucleótidos reguladoras pueden ser de origen natural o se pueden obtener mediante síntesis química. En principio, como promotor es adecuado cualquier promotor que pueda controlar la expresión génica en el organismo huésped correspondiente. De acuerdo con la invención, el promotor también puede consistir en un promotor químicamente inducible a través del cual se puede controlar la expresión del gen correspondiente en la célula huésped en un momento determinado. Como ejemplo se puede mencionar un promotor inducible por IPTG (isopropil-\beta-tiogalactósido) (Eikmanns, B.J. y col., 1991, Gene, 102: 93-98).

La producción de una estructura génica tiene lugar mediante la fusión de un promotor adecuado con al menos una secuencia de nucleótidos según la invención aplicando las técnicas de recombinación y clonación habituales, tal como se describen por ejemplo en T. Maniatis, E. F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).

Para la unión de los fragmentos de ADN entre sí se pueden añadir adaptadores o engarces a los fragmentos.

En el procedimiento según la invención se puede utilizar además un vector que contenga como mínimo una secuencia de nucleótidos del tipo arriba descrito que codifica una fosfoserina-fosfatasa, una fosfoserina-aminotransferasa y/o un vehículo de exportación de L-treonina, secuencias de nucleótidos reguladoras unidas operativamente con ésta y también secuencias de nucleótido adicionales para la selección de las células huésped transformadas, para la replicación dentro de la célula huésped o para la integración en el genoma de célula huésped correspondiente. El vector puede contener además una estructura génica del tipo arriba mencionado.

Como vectores son adecuados los vectores que se replican en bacterias corineformes (Process Biochem 33 (1998) 147-161). Numerosos plásmidos vector conocidos, como por ejemplo pZ1 (Menkel y col., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKEx1 (Eikmanns y col., Gene 102: 93-98 (1991)) o pHS2-1 (Sonnen y col., Gene 107: 69-74 (1991)) se basan en los plásmidos crípticos pHM1519, pBL1 o pGA1. También se pueden utilizar otros plásmidos vector, como por ejemplo los basados en pCG4 (US-A 4,489,160), o pNG2 (Serwold-Davis y col., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), o pAG1 (US-A 5,158,891). No obstante, esta enumeración no limita la presente invención.

Utilizando las secuencias de ácido nucleico según las ID SEC Nº 1, 3, 5, 7, 9 u 11 se pueden sintetizar las sondas o cebadores correspondientes y éstos se pueden utilizar, por ejemplo con ayuda de la técnica PCR, para amplificar y aislar genes análogos de otros microorganismos, preferentemente bacterias corineformes.

Por consiguiente, otro objeto de la presente invención consiste en una sonda para la identificación y/o el aislamiento de genes que codifican proteínas que participan en la biosíntesis de L-serina o en la exportación de L-treonina y/o L-serina, sonda que se prepara a partir de las secuencias de ácido nucleico del tipo arriba descrito y que contiene un marcador adecuado para la detección. La sonda puede consistir en una sección parcial de la secuencia según la invención, por ejemplo de un área conservada, que presenta por ejemplo una longitud de 10 a 30, o preferentemente de 12 a 15 nucleótidos, y que bajo condiciones rigurosas se puede hibridizar específicamente con secuencias de nucleótidos homólogas. La literatura da a conocer numerosos marcadores adecuados.

Los especialistas pueden encontrar instrucciones al respecto, por ejemplo en el manual de procedimiento: Oligonukleotide synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) y en Newton y Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania, 1994), o por ejemplo en el manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" de la firma Roche Diagnostics (Mannheim, Alemania) y en Liebl y col. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260).

Otro objeto de la presente invención consiste en una fosfoserina-fosfatasa, o en una parte de ella, codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre las secuencias según la ID SEC Nº 1 ó 5, o sus variaciones del tipo anteriormente descrito. La presente invención también incluye una fosfoserina-fosfatasa con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las secuencias según la ID SEC Nº 2 ó 6, o una forma modificada de estas secuencias de polipéptidos o sus isoformas o mezclas de las mismas.

También está incluida una fosfoserina-aminotransferasa, o una parte de ella, codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre las secuencias según la ID SEC Nº 3 ó 7 o sus variaciones del tipo anteriormente descrito. La presente invención también incluye una fosfoserina-fosfatasa con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las secuencias según la ID SEC Nº 4 u 8 o una forma modificada de estas secuencias de polipéptidos o sus isoformas o mezclas de las mismas.

La presente invención también incluye la utilización del vehículo de exportación de L-treonina con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las secuencias según la ID SEC Nº 10 ó 12 o una forma modificada de estas secuencias de polipéptidos o sus isoformas o mezclas de las mismas, vehículo que también participa en el transporte de L-serina y que es codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre las secuencias de acuerdo con la ID SEC Nº 9 u 11 o sus variaciones.

Los polipéptidos según la invención también se caracterizan porque proceden de bacterias corineformes, preferentemente del género Corynebacterium o Brevibacterium, en especial de la clase Corynebacterium glutamicum o Brevibacterium flavum.

Por el término "isoformas" se han de entender enzimas con una especificidad de sustrato y especificidad de efecto igual o comparable, pero que presentan una estructura primaria diferente.

De acuerdo con la invención, por el concepto "formas modificadas" se han de entender enzimas que presentan modificaciones en la secuencia, por ejemplo en el terminal N y/o C del polipéptido o en el área de aminoácidos conservados, sin que ello influya negativamente en la función de la enzima. Estas modificaciones se pueden llevar a cabo en forma de intercambios de aminoácidos mediante métodos conocidos en sí.

Una variante de realización especial de la presente invención abarca variantes de los polipéptidos según la invención cuya actividad está debilitada o reforzada, por ejemplo por intercambio de aminoácidos, en comparación con la proteína de partida correspondiente. Lo mismo es aplicable a la estabilidad de las enzimas según la invención, cuya susceptibilidad por ejemplo frente a la descomposición por proteasas está reforzada o debilitada.

Otro objeto de la presente invención consiste en polipéptidos con la función de una fosfoserina-fosfatasa o fosfoserina-aminotransferasa de la presente invención cuya secuencia de aminoácidos está modificada de tal modo que son insensibles frente a compuestos de efecto regulador, por ejemplo los productos finales del metabolismo que regulan su actividad (feedback-desensitiv - insensibles a la retroalimentación).

Otro objeto de la presente invención consiste en la transferencia de como mínimo una de las secuencias de ácido nucleico, o una parte de ellas, que codifica una fosfoserina-fosfatasa o fosfoserina-aminotransferasa, un alelo, homólogo o un derivado de la misma de acuerdo con la ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7 y también una secuencia de ácido nucleico que codifica un vehículo de exportación de L-treonina, un alelo, homólogo o derivado del mismo de acuerdo con la ID SEC Nº 9 u 11, a un sistema huésped homólogo. Esto también incluye la transferencia de constructos génicos o vectores anteriormente descrita a un sistema huésped homólogo. Esta transferencia de ADN a una célula huésped tiene lugar mediante métodos de ingeniería genética. Como procedimiento preferente se menciona la transformación y en especial la transferencia de ADN mediante electroporación.

Por el concepto "sistema huésped homólogo" se han de entender microorganismos que pertenecen a una familia común. De acuerdo con la invención, por este concepto se han de entender bacterias corineformes en las que se incorporan los ácidos nucleicos aislados según la invención a partir de bacterias corineformes. Por consiguiente, un microorganismo transformado resultante de una transferencia de ácido nucleico realizada con éxito se diferencia del microorganismo no transformado correspondiente en que contiene ácidos nucleicos adicionales del tipo de la invención que puede expresar en consecuencia. Como representante de un sistema huésped homólogo adecuado se puede mencionar la bacteria Corynebacterium glutamicum, y preferentemente la cepa ATCC 13032, que se puede cultivar bajo condiciones estándar de la siguiente manera:

El cultivo se realiza en matraces de agitación de 500 ml a 120 revoluciones por minuto y a 30ºC, utilizando 50 ml de medio de cultivo por matraz. La inoculación del medio de cultivo se realiza mediante adición de un cultivo (previo) bacteriano de la cepa Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, que previamente ha sido cultivado bajo las mismas condiciones durante 12 - 16 horas, ajustándose la densidad óptica del medio de cultivo inoculado entre 0,7 y 1,5.

Dependiendo de las necesidades, como medio de cultivo puede ser adecuado un medio complejo, por ejemplo un medio LB (T. Maniatis, E.F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)) o también un medio de sales minerales, por ejemplo un medio CGXII (Keilhauer, C. y col., 1993, J. Bacteriol., 175: 5593-5603). Después del cultivo correspondiente, la suspensión bacteriana se puede recoger y utilizar para su posterior investigación, por ejemplo para la transformación o el aislamiento de ácidos nucleicos, de acuerdo con métodos habituales. Este procedimiento se puede aplicar igualmente a otras cepas bacterianas corineformes. En este contexto, como sistemas huésped son preferentes bacterias del género Corynebacterium o Brevibacterium. Dentro del género Corynebacterium es especialmente preferente la clase Corynebacterium glutamicum y dentro del género Brevibacterium es especialmente preferente la clase Brevibacterium flavum. Entre los representantes de estos géneros se encuentran cepas que están caracterizadas como tipo salvaje en sus propiedades. En este contexto se han de mencionar por ejemplo: Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 14752, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium melassecola ATCC 17965, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 y Brevibacterium divaricatum ATCC 14020.

Además, la presente invención también incluye cepas bacterianas que se caracterizan como mutantes productoras de L-serina o cepas de producción. Estas se pueden producir, por ejemplo, partiendo de cepas de tipo salvaje mediante métodos clásicos (químicos o físicos) o de ingeniería genética. Como ejemplos de cepas adecuadas según la invención se pueden mencionar entre otras: Corynebacterium glutamicum ATCC 21586, Corynebacterium glutamicum KY 10150 y Brevibacterium ketoglutamicum ATCC 21222. La presente invención se caracteriza más detalladamente mediante los ejemplos de microorganismos seleccionados, pero no está limitada por dichos ejemplos.

De acuerdo con la invención, además de las cepas bacterianas anteriormente descritas que se caracterizan como productoras de L-serina, también están incluidas cepas de producción que presentan una mejor secreción de los productos de metabolismo deseados, preferentemente de L-aminoácidos, de las células en el medio de cultivo. Esta secreción mejorada se logra, por ejemplo, sobreexpresando uno o más genes que codifican proteínas de transporte de membrana, por ejemplo proteínas de vehículo de exportación, entre otras proteínas de vehículo de exportación de L-aminoácidos específicas.

En una variante de realización especial de la presente invención, la cepa bacteriana utilizada para la producción de L-serina se caracteriza porque es un microorganismo modificado que contiene un ácido nucleico replicable que codifica una fosfoserina-fosfatasa (serB) y/o un ácido nucleico que codifica una fosfoserina-aminotransferasa (serC) según la ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7 y un ácido nucleico que codifica el vehículo de exportación de L-treonina (thrE) de acuerdo con la ID SEC Nº 9 u 11, cuya expresión y/o número de copias es mayor que en el caso del microorganismo correspondiente no modificado genéticamente.

De acuerdo con la invención, también está incluido un microorganismo modificado genéticamente que contiene polipéptidos codificados por los genes serB y/o serC de acuerdo con la ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8 y thrE de acuerdo con la ID SEC Nº 10 ó 12, que muestran una mayor actividad y/o vida y/o una menor inhibición de producto final en comparación con el microorganismo correspondiente no modificado genéticamente. Por consiguiente, otro objeto de la invención consiste en un microorganismo modificado genéticamente que presenta como mínimo un incremento del índice de producción de L-serina y adicionalmente un incremento del índice de secreción de L-serina y/o L-treonina.

La invención incluye igualmente un microorganismo modificado genéticamente que contiene una estructura génica replicable o un vector del tipo anteriormente descrito. Un microorganismo modificado genéticamente según la invención se caracteriza, además, porque es una bacteria del tipo corineforme, preferentemente del género Corynebacterium o Brevibacterium, en especial de la especie Corynebacterium glutamicum o Brevibacterium flavum.

En principio, los genes se pueden amplificar mediante métodos conocidos en sí, por ejemplo mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) con ayuda de secuencias de nucleótido sintéticas cortas (cebadores), para, a continuación, aislarlos. La preparación de los cebadores a utilizar tiene lugar, en general, mediante secuencias génicas conocidas en base a homologías existentes en áreas conservadas de los genes y/o teniendo en cuenta el contenido de GC del ADN del microorganismo a analizar. Sin embargo, este método presenta una serie de desventajas debidas a, por ejemplo, el propio método PCR o a que las secuencias génicas a identificar presenten una homología menor de la esperada con respecto a las secuencias ya conocidas. Esto puede conducir a una hibridación no específica o incluso a una falta de hibridación de los cebadores utilizados en la secuencia de ácido nucleico a analizar.

Otro método para aislar secuencias de nucleótidos codificadoras consiste en la complementación de los llamados mutantes auxótrofos del organismo a analizar, que presentan, al menos en fenotipo, una pérdida de función en la actividad del gen a analizar o de la proteína correspondiente. Por el término "complementación" se ha de entender la supresión del defecto génico del mutante y un amplio restablecimiento del fenotipo original antes de la mutagénesis, lo que se logra mediante la incorporación de genes o fragmentos de gen funcionales del microrganismo a analizar.

Un procedimiento de mutagénesis clásico para la producción de mutantes auxótrofos consiste, por ejemplo, en tratar las células bacterianas con sustancias químicas como N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina o con radiación UV. Procedimientos de este tipo para provocar mutaciones son bien conocidos y se pueden consultar, entre otros, en Miller (A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992)) o en "Manual of Methods for General Bacteriology" de la American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981). En este contexto resultan poco ventajosos el tiempo y el gasto necesarios para la selección de los mutantes con el fenotipo deseado y también el hecho de que los mutantes aislados no estén definidos genéticamente, ya que la mutagénesis tiene lugar de forma no dirigida. Con frecuencia esto último conduce a problemas inesperados, por ejemplo en relación con la estabilidad de estos mutantes, en el marco de un proceso de producción a escala industrial.

Otro objetivo de la presente invención consiste en poner a disposición un procedimiento para aislar secuencias de ácido nucleico codificador de bacterias corineformes que no presente las desventajas mencionadas. La solución según la invención se explica más detalladamente mediante la siguiente descripción.

La invención se refiere a un procedimiento para aislar los ácidos nucleicos según la invención, en el que se produce una bacteria corineforme que presenta defectos en los genes serB y serC producidos por mutagénesis por transposón.

En el método de la mutagénesis por transposón se aprovecha la propiedad de un transposón que puede "saltar" en secuencias de ADN y perturbar o incluso eliminar la función del gen correspondiente.

Más abajo se indican ejemplos de transposones de bacterias corineformes. Por ejemplo, a partir de la cepa M82B de Corynebacterium xerosis se aisló el transposón de resistencia a la eritromicina Tn5432 (Tauch y col., Plasmid (1995) 33: 168-179) y el transposón de resistencia al cloramfenicol Tn5546. Tauch y col. (Plasmid (1995) 34: 119-131 y Plasmid (1998) 40: 126-139) demostraron que es posible una mutagénesis con estos transposones. También se ha aislado la secuencia de intersección IS31831 de Corynebacterium glutamicum ATCC 31831 (Vertes y col., Molecular Microbiology (1994) 11: 739-746). El transposón sintético Tn31831 se construyó mediante combinación de IS31831 con el gen de resistencia a la canamicina aphA (Vertes y col., Molecular and General Genetics (1994) 245: 397-405). Vertes y col. (Molecular and General Genetics (1994) 245: 397-405) y Jaeger y col. (FEMS Microbiology Letters (1995) 126: 1-6) demostraron la utilización de este transposón en cepas de Brevibacterium flavum MJ233C y Corynebacterium glutamicum ATCC 13058.

Otro transposón es el transposón Tn5531, que se describe en Ankri y col. (Journal of Bacteriology (1996) 178: 4412-4419) y se utiliza a modo de ejemplo en la presente invención. Para ello, en una variante de realización especial de la presente invención, la cepa Corynebacterium glutamicum ATCC 14752 se somete a una mutagénesis correspondiente. Opcionalmente también es adecuada la cepa Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. El transposón Tn5531 contiene el gen de resistencia a la canamicina aph3 y se puede administrar en forma del plásmido vector pCGL0040 (Figura 1). La secuencia de nucleótidos del transposón Tn5531 es de libre disposición bajo el número de acceso (accession number) U53587 en el National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA). La especificación del transposón arriba mencionado caracteriza más detalladamente la presente invención, pero no la limita.

A continuación de la mutagénesis por transposón se selecciona un mutante con defectos en el gen o los genes deseados. Un mutante con defectos en el gen serB y/o el gen serC se reconoce según la invención porque muestra un buen crecimiento en un medio mínimo con L-serina pero un mal crecimiento en un medio mínimo sin L-serina.

Los mutantes auxótrofos de cepas bacterianas corineformes correspondientemente seleccionados se utilizan a continuación para la clonación y secuenciación del gen serB y serC.

La clonación de los genes puede realizarse, por ejemplo, mediante complementación de los mutantes auxótrofos. Para ello se emplea un banco de genes del ADN de la bacteria corineforme a investigar. El empleo de bancos de genes está descrito en tratados y manuales bien conocidos. Como ejemplos se mencionan el tratado de Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Alemania, 1990) o el manual de Sambrook y col.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Bathe y col. (Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996) describen un banco de genes de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 utilizado con ayuda del cósmido vector SuperCos I (Wahl y col., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164) en E. coli K-12 cepa NM554 (Raleigh y col., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575). De acuerdo con la invención, son adecuados los vectores que se replican en bacterias corineformes, preferentemente Corynebacterium glutamicum. En el estado actual de la técnica se conocen vectores de este tipo. Como ejemplo se menciona el plásmido vector pZ1, descrito por Menkel y col. (Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554).

A continuación, el banco de genes se transfiere mediante transformación, de acuerdo con la invención preferentemente mediante electroporación, a la cepa bacteriana con defectos en el gen serB o serC anteriormente descrita. Mediante métodos conocidos en sí se seleccionan aquellas bacterias transformadas que poseen la propiedad de crecer en un medio mínimo en ausencia de L-serina. A continuación, los fragmentos de ADN del banco de genes originalmente utilizado aislados de estas bacterias transformadas se pueden someter a un análisis de secuencia.

En otra variante de realización de la presente invención, gracias al mutante auxótrofo generado mediante mutagénesis con el transposón Tn5531 de una bacteria corineforme, como por ejemplo las cepas ATCC 14752serB::Tn5531 y ATCC 14752serC::Tn5531, se pueden clonar directamente los alelos serB::Tn5531 y serC::Tn5531, respectivamente, aprovechando el gen de resistencia a la canamicina aph3 contenido en el transposón. Para ello se utilizan vectores de clonación conocidos, por ejemplo pUC18 (Norrander y col., Gene (1983) 26: 101-106 y Yanish-Perron y col., Gene (1985) 33: 103-119) o pGEM-T (Zhou M-Y, Clark SE y Gomez-Sanchez CE (1995) BioTechniques 19:34; Kobs G (1995) Promega Notes 55:28; Promega Cooperation, Madison, USA). Como sistemas huésped para la clonación son especialmente adecuadas las cepas de Escherichia coli con defectos de restricción y recombinación. Un ejemplo es la cepa DH5\alphamcr, descrita por Grant y col. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649). La selección de los transformantes tiene lugar en presencia de canamicina.

A continuación se secuencia el ADN aislado de los transformantes obtenidos, que contiene el gen que interesa. Para ello se puede aplicar el método de interrupción de cadena didesoxi descrito por Sanger y col. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467). Después se obtiene el gen contenido corriente arriba y corriente abajo del sitio de inserción de Tn5531. Las secuencias de nucleótidos obtenidas se analizan y reúnen con programas de análisis de secuencia comerciales, por ejemplo el paquete de programas Lasergene (Biocomputing Software for Windows, DNASTAR, Madison, USA) o el paquete de programas HUSAR (Release 4.0, EMBL, Heidelberg, Alemania). De este modo se aislaron los ácidos nucleicos según la invención de las bacterias corineformes del gen serB y serC y se determinó su secuencia.

Sorprendentemente, las comparaciones de homología con secuencias conocidas han mostrado que el polipéptido codificado por serB presenta una similitud moderada con la fosfoserina-fosfatasa de Escherichia coli, mientras que el polipéptido derivado de serC sólo muestran una similitud reducida, pero significativa, con la fosfoserina-aminotransferasa de Escherichia coli. Los genes corinebacterianos descubiertos también presentan sólo una similitud entre reducida y moderada con fosfoserina-fosfatasas o fosfoserina-aminotransferasas de otros organismos (por ejemplo levaduras). Únicamente las secuencias de polipéptidos derivadas de los genes serB y serC probables de Mycobacterium tuberculosis presentan una alta similitud con las proteínas corinebacterianas. La Tabla 2 muestra el resultado de una comparación de homología de este tipo. Además, la secuencia de nucleótidos de los genes corineformes demuestra que el cebador PCR utilizado en el documento EP 0 931 833, si bien es adecuado para la amplificación de los genes de Escherichia coli, no lo es para el aislamiento de los genes serC y serC corineformes debido a dicha escasa similitud de secuencia.

Esto ilustra una vez más la ventaja del procedimiento según la invención de mutagénesis por transposón para la clonación de los genes serB y serC de bacterias corineformes.

El procedimiento según la invención sirve para la producción microbiana de L-serina, en la que como mínimo uno de los ácidos nucleicos según la invención, aislado de una bacteria corineforme, se transfiere a un microorganismo homólogo y se expresa en éste, siendo la expresión génica y/o la actividad del polipéptido correspondientemente codificado mayor que en el caso del microorganismo correspondiente no modificado genéticamente, este microorganismo modificado genéticamente se utiliza para la producción fermentativa de L-serina y la L-serina así formada se aísla del medio de cultivo.

La presente invención también comprende alelos y derivados de las ID SEC Nº 1, 3, 5, 7, 9 y 11.

Para lograr una mayor expresión génica (sobreexpresión) en un organismo producido por ingeniería genética se puede incrementar la cantidad de copias de los genes correspondientes. También se pueden modificar correspondientemente la región de promotor y/o la región de regulación y/o el sitio de unión de ribosomas que se encuentra corriente arriba del gen estructural de tal modo que la expresión tenga lugar en mayor proporción. El mismo efecto tienen cassettes de expresión incorporados corriente arriba del gen estructural. Además, mediante promotores inducibles se puede aumentar la expresión durante la producción fermentativa de L-serina. La expresión también se mejora mediante medidas que prolonguen la vida del ARNm. Los genes o constructos genéticos se pueden encontrar en plásmidos con diferentes números de copias o pueden estar integrados y amplificados en el cromosoma. También se puede aumentar la actividad de la propia enzima o ésta se puede reforzar impidiendo la descomposición de la proteína enzimática. Como alternativa, se puede lograr una sobreexpresión de los genes correspondientes modificando la composición de los medios y el procedimiento de cultivo.

Los especialistas pueden encontrar instrucciones al respecto en, entre otros, las referencias de Martin y col. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), Guerrero y col. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya y Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), Eikmanns y col. (Gene 102, 93-98 (1991)), en el documento de patente europea EPS 0 472 869, en la patente US 4,601,893, en Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), Reinscheid y col. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), LaBarre y col. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en la solicitud de patente WO 96/15246, en Malumbres y col. (Gene 134, 15 - 24 (1993)), en la publicación de patente japonesa abierta a consulta pública JP-A-10-229891, en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), Makrides (Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)) y en manuales de genética y biología molecular conocidos.

Los microorganismos modificados genéticamente producidos según la invención se pueden cultivar de forma continua o discontinua en un procedimiento por lotes (batch) o un procedimiento por lotes de alimentación (fed batch) o un procedimiento por lotes de alimentación reiterada (repeated fed batch) para producir L-serina. En el manual de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el manual de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) se describen resúmenes de métodos de cultivo conocidos.

El medio de cultivo a utilizar ha de satisfacer adecuadamente las necesidades de las cepas correspondientes. El "Manual of Methods for General Bacteriology" de la American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) incluye descripciones de medios de cultivo de diferentes microorganismos. Como fuente de carbono se pueden utilizar azúcares e hidratos de carbono, por ejemplo glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, almidón y celulosa; aceites y grasas, por ejemplo aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y manteca de coco; ácidos grasos, por ejemplo ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linólico; alcoholes, por ejemplo glicerina y etanol; y ácidos orgánicos, por ejemplo ácido acético. Estas sustancias se pueden utilizar individualmente o mezcladas. Como fuente de nitrógeno se pueden utilizar compuestos orgánicos que contienen nitrógeno como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, agua de remojo de maíz, harina de soja y urea; y compuestos inorgánicos como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno se pueden utilizar individualmente o mezcladas. Como fuente de fósforo se puede utilizar ácido fosfórico, dihidrogenofosfato de potasio o hidrogenofosfato de dipotasio, o sus correspondientes sales de sodio. El medio de cultivo también ha de contener sales de metales, como por ejemplo sulfato de magnesio o sulfato de hierro, necesarias para el crecimiento. Por último, además de las sustancias arriba mencionadas también se pueden utilizar sustancias de crecimiento esenciales, como aminoácidos y vitaminas. También se pueden añadir precursores adecuados al medio de cultivo. Las sustancias mencionadas se pueden añadir en forma de una carga única para el cultivo o se pueden ir añadiendo adecuadamente durante el mismo.

Para controlar el pH del cultivo se utilizan adecuadamente compuestos básicos como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o agua amoniacal; o compuestos ácidos como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. También se pueden utilizar antiespumantes, por ejemplo poliglicol éster de ácidos grasos, para controlar la formación de espuma. Para mantener la estabilidad de los plásmidos se pueden añadir al medio sustancias con un efecto selectivo adecuado, por ejemplo antibióticos. En el cultivo se incorpora oxígeno o mezclas gaseosas que contienen oxígeno, por ejemplo aire, para mantener condiciones aeróbicas. La temperatura del cultivo oscila normalmente entre 20ºC y 45ºC, preferentemente entre 25ºC y 40ºC. El cultivo se mantiene hasta que se ha formado la cantidad máxima de L-serina. Este punto se alcanza normalmente en un plazo de 10 horas a 160 horas.

El análisis de la formación de L-serina también puede realizarse mediante cromatografía de intercambio aniónico con derivación subsiguiente de ninhidrina, de acuerdo con la descripción de Spackman y col. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190), o se puede llevar a cabo mediante HPLC en fase inversa, de acuerdo con la descripción de Lindroth y col. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174).

Los microorganismos objeto de la presente invención pueden producir L-serina a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, manosa, almidón, celulosa o a partir de glicerina y etanol. Pueden consistir en los representantes de las bacterias corineformes arriba descritos de forma detallada.

La Tabla 3 muestra una selección de resultados de la fermentación. Los microorganismos modificados genéticamente según la invención se caracterizan por una producción de L-serina considerablemente mejor que en el caso de los microorganismos correspondientes no transformados (tipo salvaje) o los microorganismos que sólo contienen el vector sin inserción de gen.

Una variante de realización especial de la presente invención muestra que la sobreexpresión del gen serB homólogo en C. glutamicum ATCC 13032 (13032(pVWEx1serB)) aumenta como mínimo al cuádruple la acumulación de L-serina en el medio en comparación con las cepas de control. Mediante la expresión del gen serC homólogo (13032(pVWEx2serC)), la acumulación de L-serina se puede multiplicar como mínimo por 20. Es de esperar que la sobreexpresión conjunta de ambos genes, serC y serC, en un sistema homólogo provoque un aumento aun mayor de la producción de L-serina.

Lo más notable es que el aumento de la acumulación de L-serina se logra ya en el tipo salvaje Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. Por consiguiente, mediante la utilización según la invención de una cepa de producción de aminoácidos homóloga se puede lograr un aumento aun mayor de la producción de L-serina.

En el sentido de la presente invención, por la expresión "cepas de producción de aminoácidos" se han de entender cepas de Corynebacterium glutamicum, o microorganismos homólogos, que están modificadas mediante métodos clásicos y/o de genética molecular de tal modo que su flujo metabólico se desarrolla de forma reforzada hacia la biosíntesis de aminoácidos o sus derivados (ingeniería metabólica). Por ejemplo, en estas cepas de producción de aminoácidos, uno o más genes y/o las enzimas correspondientes, que se encuentran en posiciones decisivas y regulados de forma correspondientemente compleja de la vía metabólica (cuello de botella), están modificados en su regulación o incluso no están regulados. En este contexto, la presente invención abarca todas las cepas de producción de aminoácidos conocidas, preferentemente del género Corynebacterium u organismos homólogos. La invención también incluye aquellas cepas de producción que los especialistas puedan obtener de forma análoga a cuando se trata de otros microorganismos, por ejemplo enterobacterias, bacillaceae o tipos de levadura mediante métodos habituales.

La invención también incluye aquellas cepas de producción de aminoácidos en las que la descomposición de L-serina está modificada, preferentemente debilitada. Esto se puede conseguir, por ejemplo, mediante modificaciones selectivas de ingeniería genética en enzimas que degradan la L-serina o en los genes correspondientes.

De acuerdo con la invención, el rendimiento de L-serina en el producto final mejora adicionalmente gracias a la mejora considerable de la secreción de L-serina desde las células al medio que las rodea. Esto se logra de acuerdo con la invención mediante la expresión reforzada del vehículo de exportación de L-treonina, a través del cual sorprendentemente también se transporta activamente a través de la membrana celular la L-serina formada, entre otras sustancias. De este modo se aumenta aun más el contenido de L-serina en el medio de cultivo, con lo que se obtiene un producto final con una calidad considerablemente mejorada con respecto a los productos conocidos hasta ahora.

La invención también incluye cepas bacterianas que, además de las propiedades ventajosas referentes a la producción de L-serina, también disponen de una mayor capacidad para la secreción de L-serina desde las células al medio de cultivo. En este contexto son preferentes bacterias con un contenido elevado de proteínas de transporte de membrana, por ejemplo un vehículo de exportación específico para L-aminoácidos, en particular el vehículo de exportación de L-treonina.

Otro objeto de la presente invención consiste en la utilización de un microorganismo modificado genéticamente del tipo anteriormente descrito para la producción de L-serina y/o sus productos derivados de acuerdo con un procedimiento del tipo mencionado en la introducción.

La presente invención también se refiere a la utilización de los L-aminoácidos producidos del modo anteriormente descrito para la industria alimentaria, la industria de alimentos para animales y/o la industria farmacéutica o en medicina humana. Además, los aminoácidos L-serina producidos según la invención se pueden utilizar como precursores para la síntesis de L-glicina, L-cisteína y/o L-triptófano y/o productos metabólicos derivados de éstos.

La presente invención se explica más detalladamente a continuación mediante ejemplos no limitativos.

Técnicas generales

El aislamiento de ADN plásmido de Escherichia coli y todas las técnicas de restricción, tratamiento Klenow y tratamiento con fosfatasa alcalina se llevaron a cabo de acuerdo con Sambrook y col. (Molecular cloning. A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbour Laboratory Press). Siempre que no se describa de otro modo, la transformación de Escherichia coli se llevó a cabo de acuerdo con Chung y col. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1989) 86: 2172-2175).

Clonación y secuenciación de los genes serB y serC de Corynebacterium glutamicum ATCC 14752 1. Mutagénesis por transposón

La cepa Corynebacterium glutamicum ATCC 14752 se sometió a una mutagénesis con el transposón Tn5531, cuya secuencia está depositada bajo el número de acceso U53587 en el banco de datos de nucleótidos del National Center for Biotechnology Information (Bethesda, USA). El plásmido pCGL0040, que contiene el transposón unido Tn5531 (Ankri y col., Journal of Bacteriology (1996) 178: 4412-4419), se aisló de la cepa de Escherichia coli con defecto de metilasa GM2929pCGL0040 (Escherichia coli GM2929: Palmer y col., Gene (1994) 143: 1-12). La cepa Corynebacterium glutamicum ATCC 14752 se transformó mediante electroporación (Haynes y col., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334) con el plásmido pCGL0040. Los clones en los que el transposón Tn5531 estaba integrado en el genoma se identificaron de acuerdo con su resistencia a la canamicina sobre placas de agar-LBHIS que contenían 15 \mug/ml de canamicina (Liebl y col., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 229-304). De este modo se obtuvieron 1.800 clones, que se estudiaron en cuanto al retardo en su crecimiento en presencia de serilalanina. Para ello, todos los clones se transfirieron individualmente a placas de agar-CGXII-medio mínimo con y sin 2 mM serilalanina. El medio era idéntico al medio CGXII descrito por Keilhauer y col. (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603), pero contenía además 25 \mug/ml de canamicina y 15 g/l de agar. La Tabla 1 muestra la composición del medio descrito por Keilhauer y col.

Las placas de agar se incubaron a 30ºC y el crecimiento se analizó después de 12, 18 y 24 horas. Se obtuvieron dos mutantes de transposón que, en presencia de serilalanina, presentaban un crecimiento comparable al de la cepa de partida Corynebacterium glutamicum ATCC 14752, pero que en ausencia de serilalanina no mostraban ningún crecimiento. Los mutantes también crecían sólo con serina, lo que demostraba que se trataba de mutantes auxótrofos de serina que han de presentar un defecto en el metabolismo de serina. Estos mutantes se designaron ATCC 14752ser1::Tn5531 y ATCC 14752ser2::Tn5531.

2. Clonación y secuenciación de los sitios de inserción de Tn5531 en ATCC 14752ser1::Tn5531 y ATCC 14752ser2::Tn5531

Para clonar los sitios de inserción dispuestos corriente arriba del transposón Tn5531 en el mutante descrito, en primer lugar se aisló el ADN cromosómico de estas cepas mutantes de acuerdo con la descripción de Schwarzer y col. (Bio/Technology (1990) 9: 84-87) y 400 ng de éste se cortaron con la endonucleasa de restricción XbaI. Toda la carga de restricción se ligó en el vector pUC18 también linealizado con XbaI (Norander y col., Gene (1983) 26: 101-106) de la firma Roche Diagnostics (Mannheim, Alemania). La cepa de Escherichia coli DH5\alphamcr (Grant y col., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) se transformó mediante electroporación con toda la carga de ligación (Dower y col., Nucleic Acid Research (1988) 16: 6127-6145). Los transformantes que presentaban los sitios de inserción del transposón Tn5531 clonados en el vector pUC18 se identificaron según su resistencia a la carbenicilina y a la canamicina sobre placas de agar LB que contenían 50 \mug/ml de carbenicilina y 25 \mug/ml de canamicina. Después se prepararon plásmidos a partir de tres de los transformantes en cada caso y la magnitud de la inserción clonada se determinó mediante análisis de restricción. Las secuencias de nucleótidos de los sitios de inserción en los plásmidos con una inserción de aproximadamente 10 kb en el caso de ser1::Tn5531, o de una inserción de 4,5 kb en el caso de ser2::Tn5531, se determinó de acuerdo con el método de interrupción de cadena didesoxi de Sanger y col. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467). Para ello, en primer lugar se secuenciaron aproximadamente 600 pb de cada una de las dos inserciones a partir del siguiente cebador oligonucleótido: 5'-CGG GTC TAC ACC GCT AGC CCA GG-3'. Después se llevaron a cabo prolongaciones de secuencia mediante desplazamiento del cebador, de modo que se pudieron secuenciar en total aproximadamente 1,4 kb de la inserción de ser1::Tn5531 y 1,2 kb de la inserción de ser2:Tn5531. El análisis con el paquete de programas Lasergene (Biocomputing Software for Windows, DNASTAR, Madison, USA) mostró que, en ambos casos, el transposón estaba insertado al comienzo de un marco de lectura abierta.

Para identificar los sitios de inserción dispuestos corriente arriba del transposón, el ADN cromosómico de los mutantes se cortó con la endonucleasa de restricción EcoRI y se ligó en el vector pUC18 linealizado con EcoRI. La clonación posterior se llevó a cabo tal como se describe más arriba. Las secuencias de nucleótidos de los sitios de inserción en uno de los plásmidos partiendo de ser1::Tn5531 con una inserción de aproximadamente 6,5 kb, o en uno de los plásmidos partiendo de ser2::Tn5531 con una inserción de aproximadamente 5,0 kb, se determinaron mediante el método de interrupción de cadena didesoxi de Sanger y col. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467). Para ello se secuenciaron aproximadamente 400 pb de la inserción de ser1::Tn5531, o aproximadamente 220 pb de la inserción de ser2::Tn5531, a partir del siguiente cebador oligonucleótido: 5'-CGG TGC CTT ATC CAT TCA GG-3'.

Las secuencias de nucleótidos obtenidas se analizaron y reunieron con el paquete de programas Lasergene (Biocomputing Software for Windows, DNASTAR, Madison, USA). Las secuencias de nucleótidos están reproducidas como ID SEC Nº 1 e ID SEC Nº 3. El análisis dio como resultado la identificación de un marco de lectura abierta de 1.209 pb en el caso de ser1:Tn5531, y el gen correspondiente se designó como serB, y de 1.128 pb en el caso de ser2:Tn5531, y el gen correspondiente se designó como serC. Los productos génicos correspondientes comprenden 403 y 376 aminoácidos y están reproducidos como ID SEC Nº 2 e ID SEC Nº 4.

Clonación y secuenciación de los genes serB y serC de Corynebacterium glutamicum ATVV 13032

Los genes serB y serC se clonaron en el vector de clonación de Escherichia coli pGEM-T (Zhou M-Y, Clark SE y Gomez-Sanchez CE (1995) BioTechniques 19:34; Kobs G (1995) Promega Notes 55:28; Promega Cooperation, Madison, USA). La clonación se llevó a cabo en dos pasos. En primer lugar, los genes de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 se amplificaron, en cada caso, mediante una reacción en cadena de polimerasa (PCR) con los siguientes cebadores oligonucleótido derivados de ID SEC Nº 1 o ID SEC Nº 3.

serB-forward:
	5'-GCAGAGGCACACACTGGCA-3'
serB-reverse:
	5'-CTTGAGGAGGAGGTGGGC-3'
serC-forward:
	5'-CATCGTTTGGGAGACTGCG-3'

serC-reverse:
	5'-CGTACTGGTGTAACTGTACGGG-3'

La reacción PCR se llevó a cabo en 30 ciclos en presencia de 200 \muM de desoxinucleótidotrifosfato (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), en cada caso 1 \muM del oligonucleótido correspondiente, 100 ng de ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, 1/10 volumen de tampón de reacción décuplo y 2,6 unidades de la mezcla termoestable Taq/Pwo-ADN-polimerasa (Expand High Fidelity PCR System de la firma Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), en un Thermocycler (PTC-100, MJ Research, Inc., Watertown, USA) bajo las siguientes condiciones: 94ºC durante 60 segundos, 56ºC durante 90 segundos y 72ºC durante 2 minutos.

El fragmento de serB amplificado con un tamaño de aproximadamente 1,7 kb y el fragmento de serC amplificado con un tamaño de aproximadamente 1,3 kb se ligaron a continuación con el vector pGEM-T con ayuda del Promega PCR Cloning Kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La cepa de Escherichia coli DH5\alphamcr (Grant y col., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) se transformó con las dos cargas de ligación. Los transformantes se identificaron según su resistencia a la ampicilina sobre placas de agar-LB que contenían 50 \mug/ml de ampicilina. Los plásmidos se prepararon a partir de 10 de los transformantes en cada caso y se comprobó la presencia de los fragmentos de PCR, de 1,7 kb y 1,3 kb, respectivamente, mediante análisis de restricción. Los plásmidos recombinantes así formados de designan en lo sucesivo como pGEM-TserB y pGEM-TserC.

La determinación de las secuencias de nucleótidos de los fragmentos de PCR de 1,7 kb y 1,3 kb en el plásmido pGEM-TserBexp y el plásmido pGEM-TserCexp, respectivamente, se llevó a cabo mediante el método de interrupción de cadena didesoxi de Sanger y col. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467). Para ello se secuenciaron las inserciones completas de pGEM-TserB y pGEM-TserC con ayuda de los siguientes cebadores de la firma Roche Diagnostics (Mannheim, Alemania).

Cebador universal:
	5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3'
Cebador inverso:
	5'-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3'

La secuencia de nucleótidos de la inserción en el plásmido pGEM-TserB está reproducida como ID SEC Nº 5 y la secuencia de nucleótidos de la inserción en el plásmido pGEM-TserC está reproducida como ID SEC Nº 7. La secuencia de nucleótidos obtenida se analizó con el paquete de programas Lasergene (Biocomputing Software for Windows, DNASTAR, Madison, USA). El análisis dio como resultado la identificación de un marco de lectura abierta con una longitud de 1.209 pb y 1.128 pb, respectivamente. Los genes correspondientes se designaron como serB y serC. Los productos génicos correspondientes codifican polipéptidos con una longitud de 403 y 376 aminoácidos, respectivamente, que están reproducidos como ID SEC Nº 6 e ID SEC Nº 8.

Sobreexpresión de los genes para la fosfoserina-fosfatasa serB y la fosfoserina-aminotransferasa serC

Para investigar el efecto de la sobreexpresión de los genes para la fosfoserina-fosfatasa serB y la fosfoserina-aminotransferasa serC en la producción de serina se utilizaron los vectores de expresión pVWEX1 (Wendisch. V., Dissertation Heinrich-Heine Universität, Düsseldorf, 1997; confiere resistencia a la canamicina) y pVWEX2 (Wendisch. V., Dissertation Heinrich-Heine Universität, Düsseldorf, 1997; confiere resistencia a la tetraciclina), que permiten una expresión inducible por IPTG (Molecular Cloning, A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbour Laboratory Press). El gen serB se clonó sin promotor en el vector pVWEX1 y el serC se clonó sin promotor en el vector pVWEX2. Para ello se sintetizaron los siguientes promotores:

serB-exp-for:
	5'-ATCTAGAATGATCACAGTGAGCCGTAAAG-3'
serB-exp-rev:
	5'-AGGATCCTTAGGCATTTGTCAATGGAACGC-3'
serC-exp-for:
	5'-AGCATGCATGCCCGAAGACATGACCG-3'
serC-exp-rev:
	5'-ATCTAGATTACTTCCTTGCAAAACCGC-3'

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Mediante PCR se amplificó el gen serB sin promotor en forma de un fragmento con un tamaño de 1.226 pb (ID SEC Nº 5, bases 382 a 1.594) y el gen serC sin promotor en forma de un fragmento de 1.157 pb (ID SEC Nº 7, bases 132 a 1.261) a partir de ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. Los cebadores se eligieron de tal modo que el cebador serB-exp-for proporcionaba un sitio de corte XbaI, el cebador serB-exp-rev proporcionaba un sitio de corte BamHI, el cebador serC-exp-for proporcionaba un sitio de corte SphI y el cebador serC-exp-rev proporcionaba un sitio de corte XbaI. Los productos de PCR aislados se clonaron en primer lugar en el vector pGEM-T tal como se describe más arriba, y se obtuvieron los plásmidos pGEM-TserB-exp y pGEM-TserC-exp. A continuación se cortó el gen serB sin promotor del vector pGEM-TserBexp mediante restricción de XbaI-BamHI, y se ligó en el vector pVWEX1 linealizado correspondientemente con XbaI-BamHI. El gen serC sin promotor se cortó del vector pGEM-TserBexp después de una restricción de SpeI-XbaI, y se ligó en el vector pVWEX2 linealizado con XbaI. Los constructos obtenidos pVWEX1serB (Figura 2) y pVWEX2serC (Figura 3) se ensayaron mediante restricción.

Aumento de la acumulación de L-serina mediante sobreexpresión de los genes para la fosfoserina-fosfatasa serB y la fosfoserina-aminotransferasa serC

Los plásmidos pVWEX1-serB y pVWEX2-serC se incorporaron individualmente, en cada caso, mediante electroporación en la cepa de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 de tipo salvaje, con lo que se obtuvieron las cepas C. glutamicum 13032 (pVWEX1serB) y C. glutamicum 13032 (pVWEX2serC). Como control negativo se cultivó el tipo salvaje Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 y la cepa C. glutamicum ATCC que contiene los vectores pVWEX1 sin inserción. A continuación se determinó la segregación de L-serina de todas las cepas anteriormente mencionadas, que se resume de forma comparativa en la Tabla 3.

Para ello, las cepas se cultivaron en medio complejo (2xTY; Molecular Cloning, A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press; con 50 \mug/l de canamicina, 25 \mug/l de tetraciclina o 50 \mug/l de canamicina y 25 \mug/l de tetraciclina), y se inoculó por separado el medio de fermentación CGXII (J Bacteriol (1993) 175: 5595-5603) en cada caso de los cultivos previos. El medio contenía adicionalmente el o los antibióticos correspondientes y también 200 \mug/ml de IPTG. Después de 24 horas de cultivo a 30ºC en un agitador rotativo a 120 revoluciones por minuto se determinó la cantidad de L-serina acumulada en el medio. La determinación de la concentración de aminoácidos se realizó mediante cromatografía líquida a alta concentración (J Chromat (1983) 266: 471-482).

Leyendas referentes a los protocolos de secuencia, figuras y tablas Protocolo de secuencia

Representación de las secuencias de ácido nucleico que contienen los genes serB (ID SEC Nº 1), serC (ID SEC Nº 3) y thrE (ID SEC Nº 9), y secuencias de aminoácido derivadas de éstas SerB (ID SEC Nº 2), SerC (ID SEC Nº 4) y ThrE (ID SEC Nº 10) de Corynebacterium glutamicum ATCC 14752 y Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (correspondientes a las ID SEC Nº 5, 7, 6, 8, 11 y 12).

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Figura 1

Representación esquemática del vector pCGL0040

Las abreviaturas utilizadas tienen el siguiente significado:

Amp = Gen de \beta-lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina

Kan = Gen de fosfotransferasa que confiere resistencia a la canamicina

También se indican puntos de intersección para endonucleasas de restricción.

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Figura 2

Representación esquemática del vector pVWEx1serB

Las abreviaturas utilizadas tienen el siguiente significado:

Kan = Gen de fosfotransferasa que confiere resistencia a la canamicina

lacl^{q} = Represor del operón lactosa de E. coli expresado cuantitativamente

P^{tac} = Promotor artificial inducible por IPTG compuesto por el promotor trp y el promotor lac de E. coli

También se indican puntos de intersección para endonucleasas de restricción.

\newpage

Figura 3

Representación esquemática del vector pVWEx1serC-1

Las abreviaturas utilizadas tienen el siguiente significado:

Kan = Gen de fosfotransferasa que confiere resistencia a la canamicina

Tet = Gen tet\alpha1 del plásmido pHY163PLK (Ishiwa & Shibahara, 1985, Jpn. J. Genet., 60: 485-498), que {}\hskip0,8cm confiere resistencia a la tetraciclina

lacl^{q} = Represor del operón lactosa de E. coli expresado cuantitativamente

P^{tac} = Promotor artificial inducible por IPTG compuesto por el promotor trp y el promotor lac de E. coli

También se indican puntos de intersección para endonucleasas de restricción.

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Tabla 1:

Composición del medio de sal mineral CGXII para el cultivo de bacterias corineformes

Tabla 2:

Comparación de las similitudes de la fosfoserina-aminotransferasa (PSAT; serC) y de la fosfoserina-fosfatasa (PSP; serB) de Corynebacterium glutamicum con fosfoserina- aminotransferasas y fosfoserina-fosfatasas conocidas de otros organismos

Tabla 3:

Sinopsis comparativa de la acumulación de L-serina en el sobrenadante de cultivo del Corynebacterium glutamicum de tipo salvaje ATCC 13032 y también de las cepas de Corynebacterium glutamicum transformadas con los plásmidos correspondientes ATCC 13032(pVWEX1), ATCC 13032(pVWEX1serB) y ATCC 13032(pVWEX2serC)

<110> Forschungszentrum Jülich GmbH

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<120> Secuencias de nucleótido que codifican proteínas que participan en la biosíntesis de L-serina, procedimiento mejorado para la producción microbiana de L-serina y también un Mikr modificado genéticamente adecuado para ello.

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<130> FZJ-9912-PCT

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<140>

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<141>

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 12

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

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<211> 1765

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<212> ADN

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<213> C. glutamicum ATCC 14 752

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> CDS

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<222> (414) .. (1613)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ser B (fosfoserina-fosfatasa)

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<400> 1

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1

2

3

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 400

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<212> PRT

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<213> C. glutamicum ATCC 14 752

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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4

5

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

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<211> 1469

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<212> ADN

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<213> C. glutamicum ATCC 14 752

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> CDS

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<222> (246) .. (1373)

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<223> ser C (fosfoserina fosfatasa)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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6

7

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<210> 4

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<211> 376

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<212> PRT

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<213> C. glutamicum ATCC 14 752

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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8

9

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 1627

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> C. glutamicum ATCC 13 032

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (382) .. (1590)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ser B (fosfoserina-fosfatasa)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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10

11

12

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<210> 6

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<211> 403

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> C. glutamicum ATCC 13 032

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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13

14

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

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<211> 1304

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> C. glutamicum ATCC 13032

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (131) .. (1258)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ser C (fosfoserina-fosfatasa)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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15

16

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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<211> 376

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> C. glutamicum ATCC 13 032

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 2817

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> C. glutamicum ATCC 14 752

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> thr E (vehículo de exportación de treonina)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 489

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> C. glutamicum ATCC 14 752

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

24

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

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<211> 1909

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> C. glutamicum ATCC 13 032

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (280) .. (1746)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> thr E (vehículo de exportación de treonina)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

26

27

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 489

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> C. glutamicum ATCC 13 032

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400>12

29

30

31

Claims (9)

1. Procedimiento para la producción microbiana de L-serina, caracterizado porque

a)

un ácido nucleico que codifica una fosfoserina-fosfatasa (serB) según la ID SEC Nº 1 ó 5, un ácido nucleico que codifica una fosfoserina-aminotransferasa (serC) según la ID SEC Nº 3 ó 7 y un ácido nucleico que codifica un vehículo de exportación de L-treonina según la ID SEC Nº 9 u 11, aislados de una bacteria corineforme, se transfieren a un microorganismo homólogo y se expresan en éste, incrementándose la expresión y la actividad de los polipéptidos correspondientemente codificados con respecto al microorganismo respectivo no modificado genéticamente,

b)

este microorganismo modificado genéticamente del paso a) se utiliza para la producción fermentativa de L-serina, incrementándose la segregación de L-serina en el medio de cultivo, y

c)

la L-serina así producida se aísla del medio de cultivo.

2. Microorganismo modificado genéticamente para la producción de L-serina que contiene un ácido nucleico replicable que codifica una fosfoserina-fosfatasa (serB) según la ID SEC Nº 1 ó 5, un ácido nucleico que codifica una fosfoserina-aminotransferasa (serC) según la ID SEC Nº 3 ó 7 y un ácido nucleico que codifica el vehículo de exportación de L-treonina (thrE) según la ID SEC Nº 9 u 11 cuya expresión se ha incrementado y/o cuyo número de copias se ha incrementado en comparación con el microorganismo correspondiente no modificado genéticamente.

3. Microorganismo modificado genéticamente según la reivindicación 2, que contiene polipéptidos codificados por los genes serB, serC y thrE, que presentan una actividad aumentada en comparación con el microorganismo correspondiente no modificado genéticamente.

4. Microorganismo modificado genéticamente según una de las reivindicaciones 2 ó 3, caracterizado porque presenta como mínimo un índice de producción se L-serina aumentado y un índice de secreción de L-serina y/o
L-treonina aumentado.

5. Microorganismo modificado genéticamente según una de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque consiste en una bacteria corineforme, preferentemente del género Corynebacterium o Brevibacterium.

6. Microorganismo modificado genéticamente según una de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado porque consiste en una bacteria de la especie Corynebacterium glutamicum o Brevibacterium flavum.

7. Utilización de los ácidos nucleicos según la ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7 y la ID SEC Nº 9 u 11 para la producción de un microorganismo modificado genéticamente según una de las reivindicaciones 2-6.

8. Utilización de las secuencias según ID SEC Nº 9-12 para mejorar la exportación de L-serina de un microorganismo modificado genéticamente según una de las reivindicaciones 2-6.

9. Utilización del microorganismo modificado genéticamente según una de las reivindicaciones 2 a 6 para la producción de L-serina y/o sus productos derivados.