ES2344248T3 - Secuencias de nucleotidos que codifican el gen dapc, y procedimiento para la preparacion de l-lisina. - Google Patents
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- C12N9/10—Transferases (2.)
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Abstract
Un polinucleótido aislado, que codifica un polipéptido con actividad de N-succinil-aminocetopimelato transaminasa, que comprende una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en por lo menos un 90% a la secuencia de SEQ ID NO.
Description
Secuencias de nucleótidos que codifican el gen
dapC, y procedimiento para la preparación de
L-lisina.
\global\parskip0.930000\baselineskip
Son objeto del invento unas secuencias de
nucleótidos que codifican el gen dapC y procedimientos para la
preparación por fermentación de L-lisina mediando
utilización de bacterias corineformes, en las que es sobreexpresado
el gen dapC (gen de
N-succinil-aminocetopimelato
transaminasa).
Ciertos aminoácidos, en particular la
L-lisina, encuentran utilización en la medicina
humana y en la industria farmacéutica, pero especialmente en la
nutrición de animales.
Es conocido que se preparan aminoácidos mediante
fermentación de cepas de bacterias corineformes, en particular
Corynebacterium glutamicum. A causa de la gran importancia,
se trabaja constantemente en el mejoramiento de los procedimientos
de preparación. Unas mejoras en los procedimientos pueden referirse
a medidas técnicas de fermentación tales como p.ej. agitación y
abastecimiento con oxígeno, o a la composición de los medios
nutritivos tal como p.ej. a la concentración de azúcares durante la
fermentación, o al tratamiento para dar la forma del producto
mediante p.ej. una cromatografía de intercambio de iones, o las
propiedades intrínsecas de rendimiento del propio
microorganismo.
Con el fin de mejorar las propiedades de
rendimiento de estos microorganismos se utilizan métodos de la
mutagénesis, la selección y la elección de mutantes. De esta manera
se obtienen unas cepas, que son resistentes contra
anti-metabolitos, tales como p.ej. el compuesto
análogo a lisina
S-(2-amino-etil)cisteína, o
son auxótrofas para metabolitos importantes en cuanto a regulación
y producen unos L-aminoácidos tales como p.ej.
L-lisina.
Desde hace algunos años, se emplean asimismo
métodos de la tecnología del ADN recombinante para el mejoramiento
de las cepas de Corynebacterium que producen aminoácidos,
amplificando unos genes individuales de la biosíntesis de
aminoácidos e investigando la repercusión sobre la producción de los
aminoácidos. Unos artículos recopilatorios acerca de esto se
encuentran, entre otras, en las citas de Kinoshita ("Glutamic Acid
Bacteria" [Bacterias de ácido glutámico], en: Biology of
Industrial Microorganisms, de Demain y Solomon (coordinadores de
edición), Benjamin Cummings, Londres, Reino Unido, 1985,
115-142), de Hilliger (BioTec 2,
40-44 (1991)), de Eggeling (Amino Acids 6:
261-272 (1994)), de Jetten y Sinskey (Critical
Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995)) y de
Sahm y colaboradores (Annuals of the New York Academy of Science
782, 25-39 (1996)).
Los autores del invento se han establecido como
misión la de poner a disposición unas nuevas medidas para la
preparación por fermentación mejorada de
L-lisina.
La L-lisina encuentra
utilización en la medicina humana, en la industria farmacéutica y en
particular en la nutrición de animales. Existe por lo tanto un
interés general en poner a disposición nuevos procedimientos
mejorados para la preparación de L-lisina.
Cuando en lo sucesivo se mencionan la
L-lisina o la lisina, se entienden por estos
nombres no solamente la base, sino también las sales tales como
p.ej. el monohidrocloruro de lisina o el sulfato de lisina.
Es objeto del invento un polinucleótido aislado
a partir de bacterias corineformes, que contiene por lo menos una
secuencia de polinucleótido, seleccionado entre el conjunto formado
por
- a)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido con actividad de N-succinil-aminocetopimelato transaminasa, que contiene una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en por lo menos un 90% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2, o
- b)
- un polinucleótido que es complementario con respecto a los polinucleótidos de a).
Es objeto del invento asimismo el polinucleótido
de acuerdo con la reivindicación 1, tratándose de manera preferente
de un ADN replicable, que contiene:
- (i)
- la secuencia de nucleótidos, que se muestra en SEQ ID No. 1, o
- (ii)
- por lo menos una secuencia, que corresponde a la secuencia (i) dentro de la zona de la degeneración del código genético, o
- (iii)
- por lo menos una secuencia, que se hibrida con la secuencia complementaria con la secuencia (i) o (ii), y eventualmente
- (iv)
- unas mutaciones de sentido funcionalmente neutras en (i).
Otros objetos del invento son
- \quad
- un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 5, que contiene la secuencia de nucleótidos que se representa en SEQ ID No. 1,
- \quad
- un polinucleótido, que codifica un polipéptido, que contiene la secuencia de aminoácidos, como se representa en SEQ ID No. 2,
- \quad
- un vector, que contiene el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en particular el vector de lanzadera o el vector plasmídico pXT-dapCexp, que se representa en la Figura 2 y se ha depositado bajo en nombre de DSM 13254 en DSM 5715,
- \quad
- y bacterias corineformes que sirven como células anfitrionas, que contienen el vector.
Son objeto del invento asimismo unos
polinucleótidos, que se componen en lo esencial de una secuencia de
polinucleótido, los cuales son obtenibles por escrutinio mediante
hibridación de un correspondiente banco de genes, que contienen el
gen completo con la secuencia de polinucleótido que corresponde a
SEQ ID No. 1, con una sonda, que contiene la secuencia de
polinucleótido que se menciona según SEQ ID No. 1 o un fragmento de
la misma, y por aislamiento de la mencionada secuencia de ADN.
Las secuencias de polinucleótidos de acuerdo con
el invento son apropiadas como sondas de hibridación para ARN, ADNc
y ADN, con el fin de aislar un ADNc (ácido desoxirribonucleico
complementario) de plena longitud, que codifican la
N-succinil-aminocetopimelato
transaminasa y aislar tales ADNc o unos genes, que presentan una
alta similaridad de su secuencia con la del gen
N-succinil-aminocetopimelato
transaminasa.
Las secuencias de polinucleótidos de acuerdo con
el invento son apropiadas además como cebadores para la producción
de los ADN de genes que codifican la
N-succinil-aminocetopimelato
transaminasa, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR,
acrónimo de Polymerase Chain Reaction).
Tales oligonucleótidos, que sirven como sondas o
cebadores, contienen por lo menos 30, de manera preferida por lo
menos 20, de manera muy especialmente preferida por lo menos 15
nucleótidos consecutivos. Son apropiados asimismo unos
oligonucleótidos que tienen una longitud de por lo menos 40 ó 50
nucleótidos.
El concepto de "aislado" significa separado
desde su entorno natural.
El concepto de "polinucleótido" se refiere
en general a poli(ribonucleótidos) y
poli-(desoxirribonucleótidos), pudiéndose tratar de un ARN o ADN no
modificado o de un ARN o ADN modificado.
Por el concepto de "polipéptidos" se
entienden unos péptidos o unas proteínas que contienen dos o más
aminoácidos unidos a través de enlaces peptídicos.
Los polipéptidos de acuerdo con el invento
incluyen un polipéptido de acuerdo con SEQ ID No. 2, en particular
los que tienen la actividad biológica de la
N-succinil-aminocetopimelato
transaminasa y también los que presentan una identidad desde por lo
menos un 90% hasta un 95% con el polipéptido de acuerdo con SEQ ID
No. 2, y la actividad mencionada.
El invento se refiere además a un procedimiento
para la preparación por fermentación de L-lisina,
mediando utilización de bacterias corineformes, que en particular
ya producían un aminoácido, y en las cuales se refuerzan, en
particular se sobreexpresan las secuencias de nucleótidos que
codifican el gen dapC.
El concepto de "refuerzo" describe en este
contexto la elevación de la actividad intracelular de una o varias
enzimas en un microorganismo, que son codificadas por el
correspondiente ADN, aumentando por ejemplo el número de copias del
gen o respectivamente de los genes, utilizando un promotor fuerte o
utilizando un gen o alelo, que codifica una correspondiente enzima
con una alta actividad, y eventualmente se combinan estas
medidas.
Los microorganismos, que son objeto del presente
invento, pueden producir L-aminoácidos, en
particular L-lisina, a partir de glucosa, sacarosa,
lactosa, fructosa, maltosa, melazas, un almidón, una celulosa, o a
partir de glicerol y etanol. Puede tratarse de representantes de
bacterias corineformes, en particular del género Corynebacterium.
En el caso del género Corynebacterium hay que mencionar en
particular la especie Corynebacterium glutamicum, que es
conocida en el mundo especializado por su capacidad de producir
L-aminoácidos.
Cepas apropiadas del género Corynebacterium, en
particular de la especie Corynebacterium glutamicum, son por
ejemplo las conocidas cepas de tipo salvaje
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum
ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum
ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM
BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869
y
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
\vskip1.000000\baselineskip
y mutantes o respectivamente cepas que producen
L-lisina, preparadas a partir de ellas, tales como
por ejemplo
\vskip1.000000\baselineskip
Corynebacterium glutamicum
FERM-P 1709
Brevibacterium flavum
FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum
FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum
FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum
FERM-P 6464
Corynebacterium glutamicum DSM5715
Corynebacterium glutamicum DSM12866 y
Corynebacterium glutamicum
DM58-1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se hizo posible para los autores del invento
aislar el nuevo gen dapC de C. glutamicum, que codifica la
enzima N-succinil-aminocetopimelato
transaminasa (EC 2.6.1.17).
Para el aislamiento del gen dapC o también de
otros genes de C. glutamicum, se establece en primer lugar
un banco de genes de este microorganismo en el seno de E.
coli. El establecimiento de bancos de genes ha sido descrito y
redactado en libros de texto y manuales generalmente conocidos. Como
ejemplo se han de mencionar el libro de texto de Winnacker: Gene
und Klone. Eine Einführung in die Gentechnologie [Genes y clones.
Una introducción en la tecnología génica] (editorial Verlag Chemie,
Weinheim, Alemania, 1990) o el manual de Sambrook y colaboradores:
Molecular Cloning, A Laboratory Manual Clonación molecular, un
manual de laboratorio] (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Un banco de genes muy conocido es el de la cepa W3110 de E.
coli K-12, que fue establecido por Kohara y
colaboradores (Cell 50, 495-508 (1987)) en el seno
de vectores \lambda. Bathe y colaboradores (Molecular and General
Genetics, 252:255-265, 1996) describen un banco de
genes de C. glutamicum ATCC13032, que fue establecido con ayuda del
vector cosmídico SuperCos I (Wahl y colaboradores 1987,
Proceedings of the National Academy of Sciences USA,
84:2160-2164) en el seno de la cepa NM554 de E.
coli K-12 (Raleigh y colaboradores, 1988,
Nucleic Acids Research 16:1563-1575). Börmann y
colaboradores (Molecular Microbiology 6(3),
317-326 (1992)) a su vez describen un banco de genes
de C. glutamicum ATCC13032 mediando utilización del cósmido
pHC79 (Hohn y Collins, Gene 11, 291-298 (1980)).
Para la producción de un banco de genes de C.
glutamicum en el seno de E. coli se pueden utilizar
también unos plásmidos tales como el pBR322 (Bolivar, Life
Sciences, 25, 807-818 (1979)) o el pUC9 (Vieira y
colaboradores, 1982, Gene, 19:259-268). Como
anfitrionas son adecuadas en especial aquellas cepas de E.
coli que son defectuosas en cuanto a restricción y
recombinación. Un ejemplo de esto es la cepa DH5\alphamcr, que fue
descrita por Grant y colaboradores (Proceedings of the National
Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649). Los
fragmentos de ADN largos, clonados con ayuda de cósmidos, pueden
ser subclonados a continuación a su vez en unos vectores
corrientes, que son apropiados para la secuenciación, y a
continuación pueden ser secuenciados, tal como se ha descrito p.ej.
en la cita de Sanger y colaboradores (Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America,
74:5463-5467, 1977).
De este modo se obtuvo la nueva secuencia de ADN
de C. glutamicum que codifica el gen dapC, que en la forma
de SEQ ID NO 1 es una parte componente del presente invento. Además,
a partir de la presente secuencia de ADN se puede deducir, con los
métodos arriba descritos, la secuencia de aminoácidos de la
correspondiente proteína. En SEQ ID NO 2 se representa la secuencia
de aminoácidos que se establece, del producto génico de dapC.
Una secuencias de ADN codificadoras, que se
establecen a partir de SEQ ID NO 1 mediante la degenerabilidad del
código genético, son asimismo una parte componente del invento. De
igual modo, son parte componente del invento unas secuencias de
ADN, que se hibridan con SEQ ID NO 1 o con partes de SEQ ID NO 1. En
el mundo especializado se conocen además unos intercambios
conservativos de aminoácidos, tales como p.ej. un intercambio de
glicina por alanina o de ácido aspártico por ácido glutámico en
proteínas como "mutaciones de sentido" (en inglés sense
mutations), que no conducen a ninguna modificación fundamental de la
actividad de la proteína, es decir son funcionalmente neutras.
Además, es conocido que unas modificaciones en el extremo terminal
de N y/o de C de una proteína, cuya función no perjudican
esencialmente o incluso pueden estabilizar. Datos acerca de esto
los encuentra un especialista en la materia, entre otras citas, en
las de Ben-Bassat y colaboradores (Journal of
Bacteriology 169:751-757 (1987)), de O'Regan y
colaboradores (Gene 77:237-251 (1989)), de
Sahin-Toth y colaboradores (Protein Sciences
3:240-247 (1994)), y de Hochuli y colaboradores
(Bio/Technology 6:1321-1325 (1988)) y en libros de
texto conocidos acerca de la genética y la biología molecular. Unas
secuencias de aminoácidos, que se establecen de una manera
correspondiente a partir de SEQ ID NO 2, son asimismo una parte
componente del invento.
De igual manera, son una parte componente del
invento unas secuencias de ADN, que se hibridan con la SEQ ID NO 1
o con partes de la SEQ ID NO 1. Finalmente, son una parte componente
del invento unas secuencias de ADN, que se producen mediante la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con utilización de unos
cebadores, que se establecen a partir de SEQ ID NO 1. Tales
oligonucleótidos tienen típicamente una longitud de por lo menos 15
nucleótidos.
Unas instrucciones para la identificación de
secuencias de ADN mediante hibridación, las encuentra un
especialista en la materia, entre otras citas, en el manual "The
DIG System Users Guide for Filter Hybridization" [La guía para
los usuarios del sistema DIG] de la entidad Roche Diagnostics GmbH
(Mannheim, Alemania, 1993) y en la cita de Liebl y colaboradores
(International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41:
255-260). Unas instrucciones para la amplificación
de secuencias de ADN con ayuda de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) las encuentra un especialista en la materia, entre
otras citas, en el manual de Gait: Oligonucleotide Synthesis: A
Practical Approach [Síntesis de oligonucleótidos: Un enfoque
práctico] (IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1984) y en la cita de
Newton y Graham: PCR (editorial Spektrum Akademischer Verlag,
Heidelberg, Alemania, 1994).
Los autores del invento descubrieron que unas
bacterias corineformes, después de una sobreexpresión del gen dapC,
producen L-lisina de una manera mejorada.
Para la consecución de una sobreexpresión, se
puede aumentar el número de copias de los correspondientes genes, o
se puede mutar la región de promotor y de regulación o el sitio de
fijación a ribosomas, que se encuentra secuencia arriba del gen
estructural. De igual manera, actúan unas casetes de expresión, que
son incorporadas secuencia arriba del gen estructural. Mediante
unos promotores inducibles es posible adicionalmente aumentar la
expresión en el transcurso de la producción por fermentación de
L-lisina. Mediante unas medidas técnicas para la
prolongación de la duración de vida del ARNm (ácido ribonucleico
mensajero) se mejora asimismo la expresión. Además, mediante
evitación de la degradación de la proteína enzimática, se refuerza
asimismo la actividad enzimática. Los genes o las construcciones
artificiales de genes, o bien pueden presentarse en plásmidos con
un diverso número de copias o pueden ser integrados y amplificados
en el cromosoma. Alternativamente, además se puede conseguir una
sobreexpresión de los correspondientes genes mediante una
modificación de la composición del medio y de la realización del
cultivo.
Unas instrucciones acerca de esto las encuentra
el especialista en la materia, entre otras citas, en las de Martin
y colaboradores (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)),
de Guerrero y colaboradores (Gene 138, 35-41
(1994)), de Tsuchiya y Morinaga (Bio/Technology 6,
428-430 (1988)), de Eikmanns y colaboradores (Gene
102, 93-98 (1991)), del documento de patente
europea EP 0 472 869, del documento de patente de los EE.UU. US
4.601.893, de Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9,
84-87 (1991), de Reinscheid y colaboradores (Applied
and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)),
de LaBarre y colaboradores (Journal of Bacteriology 175,
1001-1007 (1993)), del documento de solicitud de
patente internacional WO 96/15246, de Malumbres y colaboradores
(Gene 134, 15-24 (1993)), del documento de
solicitud de patente japonesa
JP-A-10-229891, de
Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58,
191-195 (1998)), de Makrides (Microbiological
Reviews 60:512-538 (1996)) y en libros de texto
conocidos acerca de la genética y la biología molecular.
A modo de ejemplo, el gen dapC conforme al
invento fue sobreexpresado con ayuda de plásmidos.
Como plásmidos son apropiados los que se
replican en bacterias corineformes. Numerosos vectores plasmídicos
conocidos, tales como p.ej. el pZ1 (Menkel y colaboradores, Applied
and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554),
el pEKEx1 (Eikmanns y colaboradores, Gene 102:93-98
(1991)) o el pHS2-1 (Sonnen y colaboradores, Gene
107:69-74 (1991)) se basan en los plásmidos
crípticos pHM1519, pBL1 o pGA1. Otros vectores plasmídicos tales
como p.ej. los que se basan en el pCG4 (documento
US-A 4.489.160), o el pNG2
(Serwold-Davis y colaboradores, FEMS Microbiology
Letters 66, 119-124 (1990)), o el pAG1 (documento
US-A 5.158.891) se pueden utilizar de igual
manera.
Un ejemplo de un plásmido, con cuya ayuda se
puede sobreexpresar el gen dapC, es el vector de lanzadera (en
inglés shuttle vector) de E. coli - C. glutamicum
pXT-dapCexp. El contiene la región de replicación
rep del plásmido pGA1, incluyendo el efector de replicación per
(documento US-A-5.175.108; Nesvera y
colaboradores, Journal of Bacteriology 179,
1525-1532 (1997)), el gen tetA(Z) del
plásmido pAG1 que media en la resistencia a tetraciclina (documento
US-A-5.158.891; inscripción en el
banco de genes en el National Center for Biotechnology Information
(NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.) con el número de acceso AF121000), así
como el origen de replicación, el promotor trc, las regiones de
terminación T1 y T2 y el gen lacl^{q} (represor del operón lac de
E. coli) del plásmido pTRC99A (Amann y colaboradores (1988),
Gene 69: 301-315).
El vector de lanzadera
pXT-dapCexp se representa en la Figura 2.
Además son apropiados aquellos vectores
plasmídicos, con cuya ayuda se puede aplicar el procedimiento de la
amplificación de genes por integración en el cromosoma, tal como fue
descrito por ejemplo por Reinscheid y colaboradores (Applied and
Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) para
la duplicación o respectivamente amplificación del operón
hom-thrB. En el caso de este método, el gen completo
es clonado en un vector plasmídico, que puede replicar en un
anfitrión (típicamente E. coli), pero no en C.
glutamicum. Como vectores entran en consideración por ejemplo
el pSUP301 (Simon y colaboradores, Bio/Technology 1,
784-791 (1983)), el pK18mob o pK19mob (Schäfer y
colaboradores, Gene 145, 69-73 (1994)), el
pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, EE.UU.),
el pCR2.1-TOPO (Shuman (11994). Journal of
Biological Chemistry 269:32678-84; documento
US-A 5,487,993), el pCR®Blunt (Firma Invitrogen,
Groningen, Holanda; Bernard y colaboradores, Journal of Molecular
Biology, 234: 534-541 (1993)) o el pEM1 (Schrumpf y
colaboradores, 1991, Journal of Bacteriology
173:4510-4516). El vector plasmídico que contiene
el gen que se ha de amplificar, es transformado a continuación por
conjugación o transformación en el seno de la respectiva cepa de
C. glutamicum. El método de la conjugación ha sido descrito
por ejemplo en la cita de Schäfer y colaboradores (Applied and
Environmental Microbiology 60, 756-759 (1999)).
Unos métodos para la transformación se han descrito por ejemplo en
las citas de Thierbach y colaboradores (Applied Microbiology and
Biotechnology 29, 356-362 (1988)), de Dunican y
Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) y de
Tauch y colaboradores (FEMS Microbiological Letters 123,
343-347 (1994)). Después de una recombinación
homóloga mediante un suceso de cruce [en inglés "cross over"],
la cepa resultante contiene por lo menos dos copias del
correspondiente gen.
Además, se encontró que mediante intercambio del
aminoácido L-prolina en la posición 209 de la
proteína enzimática
N-succinil-aminocetopimelato
transaminasa (véase SEQ ID No. 2) por cualquier otro aminoácido
proteinógeno, en particular L-leucina (véase SEQ ID
No. 4), con excepción de la L-prolina, se inicia un
refuerzo, y unas bacterias corineformes, que llevan el
correspondiente intercambio de aminoácidos, producen
L-lisina de una manera mejorada. El intercambio de
L-prolina por L-leucina en la
posición 209 de la secuencia de aminoácidos puede efectuarse
preferiblemente mediante el intercambio de la nucleobase citosina
situada en la posición 716 por timina, tal como se representa en la
secuencia de nucleótidos según SEQ ID No. 3.
Para la mutagénesis se pueden utilizar unos
procedimientos clásicos de mutagénesis mediando utilización de
sustancias mutágenas tales como, por ejemplo, la
N-metil-N'-nitro-N-nitroso-guanidina
o una luz ultravioleta. Además, para la mutagénesis se pueden
utilizar unos métodos in vitro, tales como por ejemplo un
tratamiento con hidroxilamina (Molecular and General Genetics 145,
101 pp (1978)) o bien el uso der oligonucleótidos mutágenos (T. A.
Brown: Gentechnologie für Einsteiger [Tecnología genética para
novatos], Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993) o la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tal como se ha descrito
en el manual de Newton y Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag,
Heidelberg, 1994).
Son objeto del invento de una manera
correspondiente, además, unas bacterias corineformes que contienen
la proteína enzimática
N-succinil-aminocetopimelato
transaminasa, en las cuales la secuencia de aminoácidos mostrada
dentro de SEQ ID No. 2 ha sido intercambiada en la posición 209 por
otro aminoácido distinto, exceptuando la L-prolina.
Un aspecto adicional de este invento son unas bacterias
corineformes, que contienen una correspondiente proteína
enzimática, en la que el aminoácido L-prolina ha
sido intercambiado en la posición 209 de la proteína enzimática
(véase SEQ ID No. 2) por L-leucina (véase SEQ ID No.
4).
Un objeto adicional del invento son, de una
manera correspondiente, unas secuencias de polinucleótidos que
proceden de bacterias corineformes, las cuales contienen unos genes
que codifican las mencionadas proteínas enzimáticas
N-succinil-aminocetopimelato
transaminasas.
Todavía un objeto de este invento son unas
bacterias corineformes, que contienen un ADN que codifica una
proteína enzimática
N-succinil-aminocetopimelato
transaminasa, que está caracterizada por el intercambio de
L-prolina por L-leucina en la
posición 209, cuyo ADN, en lugar de la nucleobase citosina en la
posición 716 (véase SEQ ID No. 1) contiene timina, tal como se
representa en SEQ ID No. 3.
Adicionalmente, puede ser ventajoso para la
producción de L-lisina reforzar o sobreexpresar,
junto al gen dapC, una o varias enzimas de la correspondiente ruta
de biosíntesis, de la glicolisis, de la anaplerótica o de la
exportación de aminoácidos.
Así, por ejemplo, adicionalmente al gen dapC, se
puede(n) sobreexpresar o amplificar al mismo tiempo uno o
varios de los genes seleccionados entre el conjunto formado por
- \bullet
- el gen lysC que codifica una aspartato cinasa resistente a la retroalimentación (feed back) (Kalinowski y colaboradores (1990), Molecular and General Genetics 224: 317-324),
- \bullet
- el gen asd que codifica la aspartato-semialdehído deshidrogenasa (documento EP-A 0 219 027; Kalinowski y colaboradores (1991), Molecular Microbiology 5:1197-1204, y Kalinowski y colaboradores (1991), Molecular and General Genetics 224: 317-324),
\global\parskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- el gen dapA que codifica la dihidrodipicolinato sintasa (documento EP-B 0 197 335),
- \bullet
- el gen dapB que codifica la dihidrodipicolinato reductasa (inscripción en el banco de genes número de acceso X67737; Pisabarro y colaboradores (1993), Journal of Bacteriology, 175(9): 2743-2749),
- \bullet
- el gen dapD que codifica la tetrahidro-picolinato succinilasa (inscripción en el banco de genes número de acceso AJ004934; Wehrmann y colaboradores (1998), Journal of Bacteriology 180: 3159-3163),
- \bullet
- el gen dapE que codifica la N-succinil-diaminopimelato dessuccinilasa (inscripción en el banco de genes número de acceso X81379; Wehrmann y colaboradores (1994), Microbiology 140: 3349-3356),
- \bullet
- el gen dapF que codifica la diaminopimelato epimerasa (documento DE: 199 43 587.1, DSM12968),
- \bullet
- el gen lysA que codifica la diaminopimelato descarboxilasa (inscripción en el banco de genes número de acceso X07563; Yeh y colaboradores (1988), Molecular and General Genetics 212: 112-119),
- \bullet
- el gen ddh que codifica la diaminopimelato deshidrogenasa (Ishino y colaboradores (1988), Agricultural and Biological Chemistry 52(11): 2903-2909),
- \bullet
- el gen lysE que codifica la exportación de lisina (documento DE-A-195 48 222),
- \bullet
- el gen pyc que codifica la piruvato carboxilasa (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
\bullet el gen mqo que codifica la
malato-quinona oxidorreductasa (Molenaar y
colaboradores (1998), European Journal of Biochemistry 254:
395-403),
\bullet el gen zwa1 (documento DE:
19959328.0, DSM 13115)
\bullet el gen gdh que codifica la glutamato
deshidrogenasa (Börmann y colaboradores (1992), Molecular
Microbiology 6, 317-326). Se prefiere el refuerzo
simultáneo de uno o varios genes, seleccionados entre el conjunto
formado por dapD, dapE y dapF.
Además, para la producción de
L-lisina puede ser ventajoso, de modo adicional al
refuerzo del gen dapC, eventualmente en combinación con uno o varios
genes seleccionados entre el conjunto formado por dapD, dapE y dapF,
debilitar al mismo tiempo
- \bullet
- al gen pck que codifica la fosfoenolpiruvato carboxicinasa (documento DE 199 50 409.1, DSM 13047), o
- \bullet
- al gen pgi que codifica la glucosa-6-fosfato isomerasa (documento US 09/396,478, DSM 12969), o
- \bullet
- al gen poxB que codifica la piruvato oxidasa (documento DE: 19951975.7, DSM 13114), o
- \bullet
- al gen zwa2(documento DE: 19959327.2, DSM 13113), o
- \bullet
- al gen sucC o sucD que codifica la succinil-CoA sintetasa (documento DE: 19956686.0)
Además, para la producción de
L-lisina puede ser ventajoso, de modo adicional al
refuerzo del gen dapC, eventualmente en combinación con uno o
varios genes seleccionados entre el conjunto formado por dapD, dapE
y dapF, excluir reacciones secundarias indeseadas (Nakayama:
"Breeding of Amino Acid Producing
Micro-organisms" [Cría de microorganismos
productores de aminoácidos], in: Overproduction of Microbial
Products [Sobreproducción de productos microbianos], Krumphanzl,
Sikyta, Vanek (coordinadores de edición), Academic Press, Londres,
Reino Unido, 1982).
Los microorganismos producidos conforme al
invento pueden ser cultivados de un modo continuo o discontinuo
según el procedimiento batch (cultivación por tandas) o según el
procedimiento fed batch (procedimiento de afluencia) o según el
procedimiento fed batch repeated (procedimiento repetitivo de
afluencia) con la finalidad de efectuar la producción de
L-lisina. Una recopilación acerca de conocidos
métodos de cultivación se describe en el libro de texto de Chmiel
(Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Técnica
de los bioprocesos 1. Introducción en la técnica de los
procedimientos biológicos] (editorial Gustav Fischer, Stuttgart,
1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere
Einrichtungen [Biorreactores y disposiciones periféricas]
(editorial Vieweg, Braunschweig/Wiesbaden, 1999)).
El medio de cultivo que se ha de utilizar debe
de satisfacer de una manera apropiada las exigencias de las
respectivas cepas. Unas descripciones de medios de cultivo de
diferentes microorganismos están contenidas en el manual "Manual
of Methods for General Bacteriology" [Manual de métodos para la
bacteriología general] de la American Society for Bacteriology
(Washington D.C., EE.UU., 1981).
Como fuente de carbono se pueden utilizar
azúcares e hidratos de carbono tales como p.ej. glucosa, sacarosa,
lactosa, fructosa, melazas, almidones y celulosas, aceites y grasas
tales como p.ej. aceite de soja, aceite de girasol, aceite de
cacahuete y grasa de coco, ácidos grasos tales como p.ej. ácido
palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes tales como
p.ej. glicerol y etanol, y ácidos orgánicos tales como p.ej. ácido
acético. Estas sustancias se pueden utilizar individualmente o como
una mezcla.
Como fuente de nitrógeno se pueden utilizar
compuestos orgánicos que contienen nitrógeno, tales como peptonas,
un extracto de levadura, un extracto de carne, un extracto de malta,
un líquido de maceración de maíz, harina de soja y urea, o
compuestos inorgánicos, tales como sulfato de amonio, cloruro de
amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio.
Las fuentes de nitrógeno se pueden utilizar individualmente o en
forma de una mezcla.
Como fuente de fósforo se pueden utilizar ácido
fosfórico, dihidrógeno-fosfato de potasio o
hidrógeno-fosfato de dipotasio o las
correspondientes sales que contienen sodio. El medio de cultivo debe
de contener además ciertas sales de metales tales como p.ej.
sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el
crecimiento. Finalmente, de una manera adicional a las sustancias
arriba mencionadas, se pueden emplear hormonas esenciales tales
como aminoácidos y vitaminas. Al medio de cultivo se le pueden
añadir, además de esto, unos compuestos precursores apropiados. Las
mencionadas sustancias empleadas se pueden añadir al cultivo en
forma de una tanda única o se pueden aportar como alimentación de
una manera apropiada durante la cultivación.
Para el control del pH del cultivo, se emplean
de manera apropiada ciertos compuestos de carácter básico, tales
como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o
respectivamente agua amoniacal, o ciertos compuestos de carácter
ácido, tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Para la
represión del desarrollo de espuma se pueden emplear agentes
antiespumantes tales como p.ej. ésteres poliglicólicos de ácidos
grasos. Para la conservación de la estabilidad de los plásmidos, se
pueden añadir al medio unas apropiadas sustancias que actúan
selectivamente, tales como p.ej. antibióticos. Con el fin de
mantener unas condiciones aerobias, se incorporan en el cultivo
oxígeno o mezclas gaseosas que contienen oxígeno, tales como p.ej.
aire. La temperatura del cultivo está situada normalmente en 20ºC
hasta 45ºC y de manera preferida en 25ºC hasta 40ºC. El proceso de
cultivo se prosigue durante tanto tiempo hasta que se haya formado
un máximo de lisina. Esta meta se alcanza normalmente en el
transcurso de 10 horas hasta 160 horas.
El análisis de L-lisina se puede
efectuar mediante una cromatografía de intercambio de aniones con
una subsiguiente derivatización con ninhidrina, tal como se describe
en la cita de Spackman y colaboradores (Analytical Chemistry, 30,
(1958), 1190).
El siguiente microorganismo fue depositado en la
Deutsche Sammlung für Mikrorganismen und Zellkulturen (DSMZ =
Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares],
Braunschweig, Alemania) conforme al Convenio de Budapest:
- \bullet
- Corynebacterium glutamicum cepa DSM5715/pXT-dapCexp como DSM 13254;
- \bullet
- Corynebacterium glutamicum cepa DSM5715/pJC1dapF como DSM 13382;
- \bullet
- Corynebacterium glutamicum cepa DSM5715/pJC1dapDE como DSM 13383;
- \bullet
- Corynebacterium glutamicum cepa DSM5715/pJC1dapDEF como DSM 13384.
El procedimiento conforme al invento sirve para
la preparación de L-lisina por fermentación.
El presente invento es explicado con mayor
detalle a continuación con ayuda de Ejemplos de realización.
\vskip1.000000\baselineskip
Un ADN cromosomal procedente de
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 fue aislado tal como se
describe en la cita de Tauch y colaboradores (1995, Plasmid
33:168-179) y disociado parcialmente con la enzima
de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania,
Descripción del producto Sau3AI, Nº de código
27-0913-02). Los fragmentos de ADN
fueron desfosforilados con una fosfatasa alcalina de camarón (Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, Descripción del producto SAP,
Nº de código 1758250). El ADN del vector cosmídico SuperCos1 (Wahl
y colaboradores (1987) Proceedings of the National Academy of
Sciences EE.UU. 84:2160-2164) adquirido de la
entidad Stratagene (La Jolla, EE.UU., Descripción del producto
SuperCos1 Cosmid Vektor Kit, Nº de código 251301), fue disociado
con la enzima de restricción XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Alemania, Descripción del producto XbaI, Nº de código
27-0948-02) y asimismo
desfosforilado con una fosfatasa alcalina de camarón. A
continuación, el ADN de cósmido se disoció con la enzima de
restricción BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania,
Descripción del producto BamHI, Nº de código
27-0868-04). El ADN de cósmido,
tratado de esta manera, se mezcló con el ADN de ATCC 13032 tratado,
y la tanda se trató con la ligasa de ADN de T4 (Amersham Pharmacia,
Freiburg, Alemania, Descripción del producto
T4-DNA-Ligase, Nº de código
27-0870-04). La mezcla de ligacion
fue a continuación empaquetada en fagos con ayuda del Extracto de
Empaquetamiento Gigapack II XL (Stratagene, La Jolla, EE.UU.,
Descripción del producto Gigapack II XL Packing Extract, Nº de
código 200217). Para la infección de la cepa NM554 de E.
coli (Raleigh y colaboradores 1988, Nucleic Acid Research
16:1563-1575) las células se recogieron en
MgSO_{4} 10 mM y se mezclaron con una parte alícuota de la
suspensión de fagos. La infección y la titulación del banco de
cósmidos se llevaron a cabo tal como se describe en la cita de
Sambrook y colaboradores (1989, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor), habiendo sido sembradas en placas las
células sobre un agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) con 100
mg/l de ampicilina. Después de una incubación durante una noche a
37ºC se seleccionaron clones individuales recombinantes.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN de cósmido de una colonia individual fue
aislado con el estuche Qiaprep Spin Miniprep Kit (Nº de producto
27106, Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con los datos del
fabricante, y disociado parcialmente con la enzima de restricción
Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del
producto Sau3AI, Nº de producto
27-0913-02). Los fragmentos de ADN
fueron desfosforilados con una fosfatasa alcalina de camarón (Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, Descripción del producto SAP,
Nº de producto 1758250). Después de una separación por
electroforesis en gel se efectuó el aislamiento de los fragmentos de
cósmidos en el intervalo de tamaños de 1.500 a 2.000 pb (pares de
bases = bps) con el estuche de extracción en gel QiaExII Gel
Extraction Kit (Nº de producto 20021, Qiagen, Hilden, Alemania). El
ADN del vector de secuenciación pZero-1, adquirido
de la entidad Invitrogen (Groningen, Holanda, Descripción del
producto Zero Background Cloning Kit, Nº de producto
K2500-01) fue disociado con la enzima de restricción
BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del
producto BamHI, Nº de producto
27-0868-04). La ligación de los
fragmentos de cósmidos en el vector de secuenciación
pZero-1 fue llevada a cabo tal como se describe por
Sambrook y colaboradores (1989, Molecular Cloning: A laboratory
Manual, Cold Spring Harbor) siendo incubada la mezcla de ADN durante
una noche con la ligasa de T4 (Pharmacia Biotech, Freiburg,
Alemania). Esta mezcla de ligación fue a continuación electroporada
en la cepa de E. coli DH5\alphaMCR (Grant, 1990, Proceedings of
the National Academy of Sciences EE.UU.,
87:4645-4649) (Tauch y colaboradores 1994, FEMS
Microbiol Letters, 123:343-7) y sembrada en placas
sobre un agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) con 50 mg/l de
zeocina. La preparación de los plásmidos de los clones
recombinantes se efectuó con el Biorobot 9600 (Nº de producto
900200, Qiagen, Hilden, Alemania). La secuenciación se efectuó de
acuerdo con el método de rotura de cadenas didesoxi de Sanger y
colaboradores (1977, Proceedings of the National Academies of
Sciences EE.UU., 74:5463-5467) con unas
modificaciones de acuerdo con Zimmermann y colaboradores (1990,
Nucleic Acids Research, 18:1067). Se utilizó el estuche de
secuenciación "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit"
von PE Applied Biosystems (Nº de producto 403044, Weiterstadt,
Alemania). La separación por electroforesis en gel y el análisis de
la reacción de secuenciación se efectuaron en un gel de
"Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid" (29:1) (Nº de producto
A124.1, Roth, Karlsruhe, Alemania) con el aparato secuenciador
"ABI Prism 377" de PE Applied Biosystems (Weiterstadt,
Alemania).
Los datos de secuencias en bruto que se
obtuvieron fueron a continuación procesados mediando uso del paquete
de programas de Staden ((1986, Nucleic Acids Research,
14:217-231) versión 97-0. Las
secuencias individuales de los derivados de pZerol fueron
ensambladas para formar un desfragmentador Contig coherente. El
análisis de la zona de codificación, apoyado por ordenador, fue
realizado con el programa XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids
Research, 14:217-231). Otros análisis adicionales
fueron llevados a cabo con los programas "BLAST search
programs" (Altschul y colaboradores, 1997, Nucleic Acids
Research, 25:3389-3402), frente al banco de datos
no redundante del "National Center for Biotechnology
Information" (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.).
La secuencia de nucleótidos del gen dapC, que se
obtuvo, se representa en SEQ ID No. 1. El análisis de la secuencia
de nucleótidos proporcionó un cuadro de lectura abierto de 1.101
pares de bases, que fue designado como gen dapC. El gen dapC
codifica un polipéptido de 367 aminoácidos, que está representado en
SEQ ID No. 2.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de la cepa ATCC 13032 de acuerdo con el
método de Eikmanns y colaboradores (Microbiology 140:
1817-1828 (1994)) se aisló un ADN cromosomal. En
virtud de la secuencia del gen dapC, conocida a partir del Ejemplo
2 para C. glutamicum, se seleccionaron los siguientes
oligonucleótidos para la reacción en cadena de la polimerasa (véanse
también SEQ ID No. 5 y 6):
DapC (dCex1):
- 5' GAT CTA (GAA TTC) GCC TCA GGC ATA ATC TAA CG 3'
DapC (dCexna2):
- 5' GAT CTA (TCT AGA) CAG AGG ACA AGG CAA TCG GA 3'
Los cebadores representados fueron sintetizados
por la entidad ARK Scientific GmbH Biosystems (Darmstadt, Alemania)
y la reacción de PCR se llevó a cabo de acuerdo con el método de PCR
patrón de Innis y colaboradores (PCR Protocols. A Guide to Methods
and Applications, 1990, Academic Press) con la polimerasa Pwo de la
entidad Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Alemania). Con ayuda de
la reacción en cadena de la polimerasa, los cebadores hacen posible
la amplificación de un fragmento de ADN con un tamaño de
aproximadamente 1,6 kb (kilobases), que lleva el gen dapC.
Además, el cebador DapC (dCex1) contiene la secuencia para el sitio
de corte con la endonucleasa de restricción EcoRI, y el cebador
DapC (dCexna2) contiene el sitio de corte con la endonucleasa de
restricción XbaI, los cuales sitios están marcados mediante unos
paréntesis en la secuencia de nucleótidos arriba representada.
El fragmento de ADN amplificado, de
aproximadamente 1,6 kb, que lleva el gen dapC, fue ligado con el
estuche Zero Blunt® de la entidad Invitrogen Corporation (Carlsbad,
CA, EE.UU.; número de catálogo K2700-20) en el
vector pCR®Blunt II (Bernard y colaboradores, Journal of Molecular
Biology, 234: 534-541 (1993)). A continuación la
cepa Top10 de E. coli fue transformada con la tanda de
ligación de acuerdo con los datos del fabricante del estuche
(entidad Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EE.UU.). La selección
de células portadoras de plásmidos se efectuó por siembra en placas
de la tanda de transformación sobre un agar LB (Sambrook y
colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,
1989), que había sido suplementada con 25 mg/l de kanamicina. El ADN
de plásmido fue aislado a partir de un transformante con ayuda del
estuche QIAprep Spin Miniprep Kit de la entidad Qiagen (Hilden,
Alemania) y comprobado por tratamiento con las enzimas de
restricción XbaI y EcoRI con una subsiguiente electroforesis en
gel de agarosa (al 0,8%). La secuencia de ADN del fragmento de ADN
amplificado fue comprobada por secuenciación. El plásmido fue
denominado pCRdapC. La cepa fue designada como E. coli
Top10/pCRdapC.
Como vector de partida para la construcción del
vector de expresión de lanzadera de E. coli - C. glutamicum
pEC-XT99A se utilizó el vector de expresión en E.
coli pTRC99A (Amann y colaboradores 1988, Gene
69:301-315). Después de una disociación por
restricción con BspHI (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania,
Descripción del producto BspHI, Nº de producto 1467123)
Produktbeschreibung BspHIy del subsiguiente tratamiento según
Klenow (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania, Descripción
del producto Klenow Fragment of DNA Polymerase I, Nº de producto
27-0928-01; método según Sambrook y
colaboradores, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor), se intercambió el gen de resistencia a ampicilina
(bla) por el gen de resistencia a tetraciclina del plásmido de
C. glutamicum pAG1 (Nº de acceso al banco de genes AF121000).
Para esto, la región portadora del gen de resistencia se clonó como
fragmento AluI (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania,
Descripción del producto AluI, Nº de producto
27-0884-01) en el vector linealizado
de expresión en E. Coli pTRC99A. La ligación se llevó a cabo
tal como se ha descrito por Sambrook y colaboradores (1989,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) siendo
incubada la mezcla de ADN durante una noche con la ligasa de T4
(Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania). Esta mezcla de ligación fue
electroporada (Tauch y colaboradores FEMS Microbiology Letters,
123:343-7) a continuación en la cepa de E.
coli DH5\alphamcr (Grant, 1990, Proceedings of the National
Academy of Sciences EE.UU., 87:4645-4649). El vector
de expresión en E. coli construido fue designado por
pXT99A.
Como base para la clonación de un replicón
mínimo procedente de Corynebacterium glutamicum, se utilizó
el plásmido pGA1 (Sonnen y colaboradores 1991, Gene,
107:69-74). Mediante disociación por restricción con
BalI/PstI (Promega GmbH, Mannheim, Alemania, Descripción del
producto BalI, Nº de producto R6691; Amersham Pharmacia Biotech,
Freiburg, Alemania, Descripción del producto PstI, Nº de producto
27-0976-01) del vector pGA1 se
pudo clonar un fragmento con un tamaño de 3.484 pb en el vector
pK18mob2 fragmentado con SmaI y PstI (Amersham Pharmacia Biotech,
Freiburg, Alemania, Descripción del producto SmaI, Nº de producto
27-0942-02, Descripción del
producto PstI, Nº de producto
27-0976-01) (Tauch y colaboradores,
1998, Archives of Microbiology 169:303-312).
Mediante disociación por restricción con
BamHI/XhoI (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania,
Descripción del producto BamHI, Nº de producto
27-086803, Descripción del producto XhoI, Nº de
producto 27-0950-01) y por
subsiguiente tratamiento según Klenow (Amersham Pharmacia Biotech,
Freiburg, Alemania, Descripción del producto Klenow Fragment of DNA
Polymerase I, Nº de producto
27-0928-01; método según Sambrook y
colaboradores, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor) se delecionó (suprimió) un fragmento con un tamaño
de 839 pb. A partir de la construcción artificial vuelta a ligar con
la ligasa de T4 (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania,
Descripción del producto
T4-DNA-Ligase, Nº de producto
27-0870-04) se pudo clonar el
replicón mínimo de C. glutamicum como un fragmento con un
tamaño de 2.645 pb en el vector de expresión en E. coli
pXT99A. Para esto el ADN de la construcción artificial portadora del
replicón mínimo fue disociado con las enzimas de restricción KpnI
(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania, Descripción del
producto KpnI, Nº de producto
27-0908-01) y PstI (Amersham
Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania, Descripción del producto
PstI, Nº de producto 27-0886-03) y a
continuación mediante la polimerasa de Klenow (Amersham Pharmacia
Biotech, Freiburg, Alemania, Descripción del producto Klenow
Fragment of DNA Polymerase I, Nº de producto
27-0928-01) se llevó a cabo un
tratamiento con una
3'-5'-exonucleasa (Sambrook y
colaboradores, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor).
En una tanda paralela, el vector de expresión en
E. coli pXT99A se disoció con la enzima de restricción RsrII
(Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania, Descripción del producto
RsrII, Nº de producto 1292587) y se preparó para la ligación con la
polimerasa de Klenow (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg,
Alemania, Klenow Fragment of DNA Polymerase I, Nº de producto
27-0928-01). La ligación del
replicón mínimo con la construcción artificial de vector pXT99A se
llevó a cabo tal como se ha descrito por Sambrook y colaboradores
(1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor)
siendo la mezcla de ADN incubada durante una noche con la ligasa de
T4 (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania, Descripción del
producto T4-DNA-Ligase, Nº de
producto 27-0870-04).
El vector de expresión de lanzadera de E.
coli - C. glutamicum pEC-XT99A, construido de
esta manera, se transfirió mediante electroporación (Liebl y
colaboradores, 1989, FEMS Microbiology Letters,
53:299-303) in C. glutamicum DSM5715. La
selección de los transformantes se efectuó sobre un agar LBHIS, que
se componía de 18,5 g/l de Brain-Heart Infusion
Boullion (caldo de infusión de corazón-cerebro), 0,5
M de sorbitol, 5 g/l de Bacto-triptona, 2,5 g/l de
extracto de Bacto-levadura, 5 g/l de NaCl y 18 g/l
de Bacto-agar, que había sido suplementado con 5
mg/l de tetraciclina. La incubación se efectuó durante 2 días a
33ºC.
El ADN de plásmido fue aislado a partir de un
transformante de acuerdo con los métodos usuales
(Peters-Wendisch y colaboradores, 1998,
Microbiology, 144, 915-927), fue cortado con la
endonucleasa de restricción HindIII y el plásmido fue comprobado
por subsiguiente electroforesis en un gel de agarosa.
La construcción plasmídica así obtenida fue
designada como pEC-XT99A y se representa en la
Figura 1. La cepa obtenida por electroporación del plásmido
pEC-XT99A en la cepa DSM5715 de Corynebacterium
glutamicum fue denominada DSM5715/pEC-XT99A y
depositada como DSM12967 en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen
und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemania) según el Convenio
de Budapest.
Como vector se utilizó el vector de lanzadera de
E. coli - C. glutamicum pEC-XT99A, que se ha
descrito en el Ejemplo 3.2. El ADN de este plásmido fue disociado
completamente con las enzimas de restricción EcoRI y XbaI y a
continuación desfosforilado con una fosfatasa alcalina de camarón
(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, Descripción del
producto SAP, Nº de producto 1758250).
A partir del plásmido pCRdapC que se ha descrito
en el Ejemplo 3.1., se aisló el gen dapC por disociación completa
con las enzimas EcoRI y XbaI. El fragmento de dapC con un tamaño de
aproximadamente 1.600 pb fue aislado a partir del gel de agarosa
con el estuche QiaExII Gel Extraction Kit (Nº de producto 20021,
Qiagen, Hilden, Alemania).
El fragmento de dapC obtenido de este modo se
mezcló con el vector pEC-XT99A previamente preparado
y la tanda se trató con la ligasa de T4 (Amersham Pharmacia,
Freiburg, Alemania, Descripción del producto
T4-DNA-Ligase, Nº de código
27-0870-04). La tanda de ligación
fue transformada en el seno de la cepa de E. coli DH5\alpha
(Hanahan, In: DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. I,
IRL-Press, Oxford, Washington DC, EE.UU.). La
selección de células portadoras del plásmido se efectuó mediante
siembra en placas de la tanda de transformación sobre un agar de LB
(Lennox, 1955, Virology, 1:190) con 5 mg/l de tetraciclina. Después
de una incubación durante una noche a 37ºC se seleccionaron unos
clones individuales recombinantes. El ADN de plásmido fue aislado a
partir de un transformante con el estuche Qiaprep Spin Miniprep Kit
(Nº de producto 27106, Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con los
datos del fabricante, y fue disociado con las enzimas de restricción
EcoRI y XbaI, con el fin de comprobar el plásmido mediante una
subsiguiente electroforesis en gel de agarosa. El plásmido obtenido
fue denominado pXT-dapCexp. Está representado en la
Figura 2.
La cepa DSM5715 se transformó con el plásmido
pXT-dapCexp mediante aplicación del método de
electroporación que ha sido descrito por Liebl y colaboradores,
(FEMS Microbiology Letters, 53:299-303 (1989)). La
selección de los transformantes se efectuó sobre un agar LBHIS que
se componía de 18,5 g/l del Brain-Heart Infusion
Boullion, 0,5 M de sorbitol, 5 g/l de
Bacto-triptona, 2,5 g/l de
Bacto-extracto de levadura, 5 g/l de NaCl y 18 g/l
de Bacto-agar, que había sido suplementado con 5
mg/l de tetraciclina. La incubación se efectuó durante 2 días a
33ºC.
El ADN del plásmido se aisló a partir de un
transformante de acuerdo con métodos usuales
(Peters-Wendisch y colaboradores, 1998,
Microbiology, 144, 915-927), se cortó con las
endonucleasas de restricción EcoRI y XbaI, y el plásmido se
comprobó por subsiguiente electroforesis en un gel de agarosa. La
cepa obtenida fue denominada DSM5715/pXT-dapCexp y
depositada como DSM 13254 en la Deutsche Sammlung für
Mikrorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemania)
según el Convenio de Budapest.
La cepa DSM5715/pXT-dapCexp de
C. glutamicum, obtenida en el Ejemplo 4, fue cultivada en un
medio nutritivo que es apropiado para la producción de lisina, y se
determinó el contenido de lisina en el material sobrenadante del
cultivo.
Para esto la cepa se incubó primeramente durante
24 horas a 33ºC sobre una placa de agar con el correspondiente
antibiótico (agar de Hirn-Herz (de
cerebro-corazón) con tetraciclina (5 mg/l)).
Partiendo de este cultivo en placas de agar, se inoculó un cultivo
preliminar (10 ml del medio en un matraz Erlenmeyer de 100 ml de
capacidad). Como medio para el cultivo preliminar se utilizó el
medio completo CgIII.
\vskip1.000000\baselineskip
El valor del pH se ajustó a un pH de 7,4
A éste se le añadió tetraciclina (5 mg/l). El
cultivo preliminar fue incubado sobre el aparato sacudidor a 240
rpm (revoluciones por minuto) durante 16 horas a 33ºC. De este
cultivo preliminar se inoculó un cultivo principal, de manera tal
que la densidad óptica (DO) inicial (a 660 nm) del cultivo principal
fue de 0,1. Para el cultivo principal se utilizó el medio MM.
\vskip1.000000\baselineskip
Medio
MM
El CSL (líquido de maceración de maíz), el MOPS
y la solución de sal se ajustaron a un pH de 7 con agua amoniacal y
se autoclavaron. A continuación se añadieron las soluciones
estériles del substrato y de vitaminas, así como el CaCO_{3}
autoclavado en seco.
La cultivación se efectúa en un volumen de 10 ml
en un matraz Erlenmeyer con una capacidad de 100 ml provisto de
obstáculos. Se añadió tetraciclina (5 mg/l). La cultivación se
efectuó a 33ºC y con una humedad del aire de 80%.
Después de 72 horas se determinó la DO a una
longitud de onda de medición de 660 nm con el aparato Biomek 1000
(de Beckmann Instruments GmbH, München). La cantidad formada de
lisina se determinó con un aparato analizador de aminoácidos de la
entidad Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Alemania)
mediante una cromatografía con intercambio de iones y mediante
derivatización posterior en columna con detección por
ninhidrina.
En la Tabla 1 se representa el resultado del
ensayo
Se adjuntan las siguientes Figuras:
Figura 1: mapa del plásmido
pEC-XT99A
Figura 2: mapa del plásmido
pXT-dapCexp
\vskip1.000000\baselineskip
Las abreviaturas y denominaciones que se
utilizan tienen los siguientes significados.
- per:
- gen para el control de número de copias, procedente de pGA1
- oriE:
- origen de replicación de E. coli codificado por un plásmido
- rep:
- origen de replicación codificado por un plásmido, procedente del plásmido pGA1 de C. glutamicum
- Ptrc:
- promotor trc procedente de pTRC99A
- T1, T2:
- regiones de terminadores 1 y 2 procedentes de pTRC99A
- lacIq:
- gen de represor del operón Lac
- Tet:
- gen de resistencia para tetraciclina
- dapC:
- gen dapC de C. glutamicum
- EcoRI:
- sitio de corte con la enzima de restricción EcoRI
- EcoRV:
- sitio de corte con la enzima de restricción EcoRV
- HindIII:
- sitio de corte con la enzima de restricción HindIII
- KpnI:
- sitio de corte con la enzima de restricción KpnI
- SalI:
- sitio de corte con la enzima de restricción SalI
- SmaI:
- sitio de corte con la enzima de restricción SmaI
- NdeI:
- sitio de corte con la enzima de restricción NdeI
- BamHI:
- sitio de corte con la enzima de restricción BamHI
- NcoI:
- sitio de corte con la enzima de restricción NcoI
- XbaI:
- sitio de corte con la enzima de restricción XbaI
- SacI:
- sitio de corte con la enzima de restricción SacI
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Degussa-Huels AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Secuencias de nucleótidos que
codifican el gen dapC y procedimiento para la preparación de
L-lisina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 990217 BT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1300
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (91)..(1191)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gen dapC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 367
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1300
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (91)..(1191)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> alelo dapC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 367
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador DapC (dCex1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatctagaat tcgcctcagg cataatctaa cg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador DapC (dCexna2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgactatcta gacagaggac aaggcaatcg ga
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Degussa-Huels AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Secuencias de nucleótidos que
codifican el gen dapC y procedimiento para la preparación de
L-lisina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 990217 BT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1300
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (91)..(1191)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gen dapC
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<400> 1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 367
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<212> PRT
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<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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<211> 1300
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<212> ADN
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<213> Corynebacterium
glutamicum
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (91)..(1191)
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<223> Alelo de dapC
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 367
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<212> PRT
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<213> Corynebacterium
glutamicum
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<400> 4
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> Cebador DapC (dCex1)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskipgatctagaat tcgcctcagg cataatctaa cg
\hfill32
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<210> 6
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<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\newpage
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<220>
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<223> Cebador DapC (dCexna2)
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<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatctatcta gacagaggac aaggcaatcg ga
\hfill32
Claims (36)
1. Un polinucleótido aislado, que codifica un
polipéptido con actividad de
N-succinil-aminocetopimelato
transaminasa, que comprende una secuencia de aminoácidos, que es
idéntica en por lo menos un 90% a la secuencia de SEQ ID NO. 2.
2. Un polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 1,
caracterizado porque la secuencia de
aminoácidos es idéntica en por lo menos un 95% a la secuencia de SEQ
ID NO. 2.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque la secuencia de
aminoácidos es idéntica a la secuencia de SEQ ID NO. 2.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Un polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 3,
caracterizado porque la secuencia de
nucleótidos comprende la secuencia de las posiciones desde 91 hasta
1.191 de SEQ ID NO. 1.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Un polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 4,
caracterizado porque la secuencia de
nucleótidos comprende la secuencia de SEQ ID NO. 1.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Un polinucleótido aislado, que es
complementario con respecto a los polinucleótidos de acuerdo con una
o varias de las reivindicaciones 1 hasta 5.
7. Un vector que contiene el polinucleótido de
acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 hasta 6.
8. Un vector de acuerdo con la reivindicación
7,
caracterizado porque se trata del
pXT-dapCexp, depositado bajo la denominación DSM
13254.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Una bacteria corineforme o una bacteria de
la especie Escherichia coli, en la que el vector de acuerdo
con la reivindicación 7 u 8 ha sido transformado por conjugación o
transformación.
10. Una bacteria corineforme recombinante, en
la que se presenta aumentada la actividad intracelular de la
N-succinil-aminocetopimelato
transaminasa, consiguiéndose el aumento mencionado mediante
sobreexpresión de un polinucleótido, que codifica un polipéptido,
cuya secuencia de aminoácidos es idéntica en por lo menos un 90% a
la de SEQ ID NO. 2, y consiguiéndose la sobreexpresión mediante
aumento del número de copias o mediante utilización de un promotor
fuerte.
11. Una bacteria corineforme de acuerdo con la
reivindicación 10,
caracterizada porque la secuencia de
aminoácidos del péptido es idéntica en por lo menos un 95% a la de
SEQ ID NO. 2.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Una bacteria corineforme de acuerdo con la
reivindicación 11,
caracterizada porque la secuencia de
aminoácidos del polipéptido es idéntica a la de SEQ ID NO. 2.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Una bacteria corineforme de acuerdo con una
de las reivindicaciones 9 hasta 12,
caracterizada porque se trata del género
Corynebacterium.
\vskip1.000000\baselineskip
14. Una bacteria corineforme de acuerdo con la
reivindicación 13,
caracterizada porque se trata de la
especie Corynebacterium glutamicum.
15. Una bacteria corineforme de acuerdo con una
o varias de las reivindicaciones 9 hasta 14,
caracterizada porque se trata de una
mutante productora de L-lisina.
\vskip1.000000\baselineskip
16. Un procedimiento para la preparación de
L-lisina,
caracterizado porque se llevan a cabo las
siguientes etapas:
- a)
- fermentación de una bacteria corineforme de acuerdo con las reivindicaciones 9 hasta 15;
- b)
- enriquecimiento de la L-lisina en el medio o en las células de las bacterias, y
- c)
- aislamiento de la L-lisina.
17. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 16,
caracterizado porque se fermentan unas
bacterias, en las que se sobreexpresa(n) uno o varios de los
genes, seleccionados entre el conjunto formado por
- 17.1 el gen lysC que codifica una aspartato cinasa resistente a la retroalimentación,
- 17.2 el gen asd que codifica la aspartato-semialdehído deshidrogenasa,
- 17.3 el gen dapA que codifica la dihidrodipicolinato sintasa,
- 17.4 el gen dapB que codifica la dihidrodipicolinato reductasa,
- 17.5 el gen dapD que codifica la tetrahidrodipicolinato succinilasa,
- 17.6 el gen dapE que codifica la N-succinil-diaminopimelato dessuccinilasa,
- 17.7 el gen dapF que codifica la diaminopimelato epimerasa
- 17.8 el gen lysA que codifica la diaminopimelato descarboxilasa,
- 17.9 el gen ddh que codifica la diaminopimelato deshidrogenasa,
- 17.10 el gen lysE que codifica la exportación de lisina,
- 17.11 el gen pyc que codifica la piruvato carboxilasa,
- 17.12 el gen mqo que codifica la malato-quinona oxidorreductasa,
- 17.13 el gen zwa1,
- 17.14 el gen gdh que codifica la glutamato deshidrogenasa.
18. Un ADN que procede de bacterias
corineformes, que codifica una proteína enzimática
N-succinil-aminocetopimelato
transaminasa, cuya secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO. 2) contiene
en la posición 209 cualquier otro aminoácido distinto, estando
excluida la L-prolina.
19. Un ADN de acuerdo con la reivindicación 18,
caracterizado porque éste codifica una proteína enzimática
N-succinil-aminocetopimelato
transaminasa, cuya secuencia de aminoácidos contiene en la posición
209 L-leucina, que se representa en SEQ ID NO.
4.
20. Un ADN de acuerdo con la reivindicación 19,
caracterizado porque éste contiene en la posición 716 la
nucleobase timina, que se representa en SEQ ID NO. 3.
21. Bacterias corineformes recombinantes que
contienen un ADN de acuerdo con las reivindicaciones 18, 19 ó
20.
22. Un procedimiento para la preparación de
L-lisina de acuerdo con la reivindicación 16,
caracterizado porque en la etapa a) se
emplean las bacterias de acuerdo con la reivindicación 21.
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