SK3382001A3 - Nucleotide sequences coding for the dapc gene and process for the preparation of l-lysine - Google Patents

Nucleotide sequences coding for the dapc gene and process for the preparation of l-lysine Download PDF

Info

Publication number
SK3382001A3
SK3382001A3 SK338-2001A SK3382001A SK3382001A3 SK 3382001 A3 SK3382001 A3 SK 3382001A3 SK 3382001 A SK3382001 A SK 3382001A SK 3382001 A3 SK3382001 A3 SK 3382001A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
gene
polynucleotide
ala
leu
gene encoding
Prior art date
Application number
SK338-2001A
Other languages
English (en)
Inventor
Bettina Mockel
Anke Weissenborn
Walter Pfefferle
Michael Hartmann
Jorn Kalinowski
Alfred Puhler
Original Assignee
Degussa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Degussa filed Critical Degussa
Publication of SK3382001A3 publication Critical patent/SK3382001A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Nukleotidové sekvencie kódujúce gén dapC a spôsob výroby
L-lyzínu
Oblasť techniky
Predmetom vynálezu sú nukleotidové sekvencie kódujúce gén dapC a spôsob fermentačnej výroby L-lyzínu použitím koryneformných baktérií, v ktorých sa zosilňuje, najmä nadmerne exprimuje gén dapC (gén pre N-sukcinylaminoketopimeláttransaminázu).
Doterajší stav techniky
Aminokyseliny, najmä L-lyzín, sa používajú v humánnej medicíne a vo farmaceutickom priemysle, ale najmä vo výžive zvierat.
Je známe, že aminokyseliny sa vyrábajú fermentáciou kmeňov koryneformných baktérií, najmä Corynebacterium glutamicum. Kvôli ich veľkému významu sa stále pracuje na zlepšení spôsobov výroby. Zlepšenia spôsobov sa môžu týkať fermentačno-technologických opatrení, ako napríklad miešania a zásobovania kyslíkom, alebo zloženia živných médií, ako napríklad koncentrácie cukru počas fermentácie, alebo spracovania na produktovú formu, napríklad ionexovou chromatografiou, alebo vlastných úžitkových vlastností samotného mikroorganizmu.
Na zlepšenie úžitkových vlastností týchto mikroorganizmov sa používajú metódy mutagenézy, selekcie a voľby mutan·· ·· ·· • · · · · · · • · ·· t · • · · ·· ··· · • · ··· tov. Týmto spôsobom sa získavajú kmene, ktoré sú rezistentné voči antimetabolitom, ako je napríklad analóg lyzínu S-(2-aminoetyl)cysteín, alebo sú auxotrofné vzhľadom na regulačné významné metabolity a produkujú L-aminokyseliny, ako napríklad L-lyzín.
Už niekoľko rokov sa taktiež používajú metódy technológie rekombinantných DNA na kmeňové zlepšenie kmeňov Corynebacterium produkujúcich aminokyseliny tak, že jednotlivé gény pre biosyntézu aminokyselín sa amplifikujú a skúma sa účinok na produkciu aminokyseliny. Prehľadný článok k tomu sa nachádza medzi iným v Kinoshita („Glutamic Acid Bacteria, in: Biology of Industrial Microorganisms, Demain and Solomon (Eds.), Benjamín Cummings, Londýn, Velká Británia, 1985, 115-142), Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), Eggeling (Amino Acids 6:261-272 (1994)), Jetten a Sinskey (Critical Reviews in Biotechnol'ogy 15, 73-103 (1995)) a Sahm et al. (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)).
Vynálezcovia si stanovili za úlohu poskytnúť nové opatrenia na zlepšenú fermentačnú výrobu L-lyzínu.
L-Lyzín sa používa v humánnej medicíne, vo farmaceutic; kom priemysle a najmä vo výžive zvierat. Existuje preto všeobecný záujem o poskytnutie nových, zlepšených spôsobov výroby L-lyzínu.
Keď sa v nasledovnom texte uvedie L-lyzín alebo lyzín, >
mieni sa tým nielen zásada, ale aj soli, ako napríklad lyzín-monohydrochlorid alebo lyzín-sulfát.
·· ·· ·· • · · · · · · • · ·· · · • · ·· ··· · • · · · · · · ··· · · · · · η .·· · • · ····
Podstata vynálezu
Predmetom vynálezu je izolovaný polynukleotid z koryneformných baktérii, obsahujúci aspoň jednu polynukleotidovú sekvenciu vybranú zo skupiny zahŕňajúcej
a) polynukleotid, ktorý je aspoň na 70 % identický s polynukleotidom, ktorý kóduje polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu' SEQ ID No. 2,
b) polynukleotid, ktorý kóduje polypeptid, ktorý obsahuje t
aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň na 70 % identická *
s aminokyselinovou sekvenciou SEQ ID No. 2,
c) polynukleotid, ktorý je komplementárny k polynukleotidom a) alebo b), alebo
d) polynukleotid obsahujúci aspoň 15 za sebou nasledujúcich nukleotidov polynukleotidových sekvencií a), b) alebo c).
Predmetom vynálezu je aj polynukleotid podía nároku 1, pričom sa prednostne jedná o replikovateľnú DNA obsahujúcu:
(i) nukleotidovú sekvenciu znázornenú v SEQ ID No. 1 alebo (ii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá zodpovedá sekvencií (i) v oblasti degenerácie genetického kódu, alebo v
(iii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá hybridizuje so sekvenciou komplementárnou k sekvencií (i) alebo (ii), a poprípade
···· · · • · ·· ·· • · · · • e ·· • · · · • · · · ·· ·· (iv) funkčne neutrálne mutácie so zmyslom v (i).
Ďalším predmetom je polynukleotid podľa nároku 4 obsahujúci nukleotidovú sekvenciu znázornenú v SEQ ID No. 1, polynukleotid, ktorý kóduje polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu znázornenú v SEQ ID No. 2, vektor obsahujúci polynukleotid podľa nároku 1, najmä kyvadlový vektor alebo plazmidový vektor pXT-dapCexp, ktorý je znázornený na obrázku 2 a uložený pod označením DSM 13254 v DSM 5715 t
a koryneformné baktérie slúžiace ako hostiteľské bunky, ktoré obsahujú tento vektor.
Predmetom vynálezu sú aj polynukleotidy, ktoré sa skladajú v podstate z polynukleotidovej sekvencie, ktoré možno získať skríningom prostredníctvom hybridizácie príslušnej génovej banky, ktorá obsahuje úplný gén s polynukleotidovou sekvenciou zodpovedajúcou SEQ ID No. 1, pomocou sondy, ktorá obsahuje sekvenciu uvedeného polynukleotidu podía SEQ ID No.
; 1 alebo jej fragment, a izoláciou uvedenej sekvencie DNA.
Polynukleotidové sekvencie podía vynálezu sú vhodné ako hybridizačné sondy pre RNA, cDNA a DNA, aby sa izolovali cDNA s celou dĺžkou, ktoré kódujú N-sukcinylaminoketopimeláttransaminázu, a aby sa izolovali také cDNA alebo gény, ktoré vykazujú veľkú podobnosť sekvencie so sekvenciou génu pre N-sukcinylaminoketopimeláttransaminázu.
• · ·· ·· ·· ··· ···· · · · • · · ···· · · • ···· ·· ·· · · · · • · ······ ····«···· ·· ·
Polynukleotidové sekvencie podľa vynálezu sú ďalej vhodné ako priméry na prípravu DNA génov, ktoré kódujú N-sukcinylaminoketopimeláttransaminázu, polymerázovou reťazovou reakciou (PCR).
Také oligonukleotidy slúžiace ako sondy alebo priméry obsahujú aspoň 30, prednostne aspoň 20, celkom obzvlášť prednostne aspoň 15 za sebou nasledujúcich nukleotidov. Vhodné sú taktiež oligonukleotidy s dĺžkou aspoň 40 alebo 50 nukleotidov.
„Izolovaný znamená oddelený zo svojhc prirodzeného prostredia.
„Polynukleotid sa vzťahuje všeobecne na polyribonukleotidy a polydeoxyribonukleotidy, pričom sa môže jednať o nemodifikované RNA alebo DNA alebo modifikované RNA alebo DNA.
Pod pojmom „polypeptidy sa rozumejú peptidy alebo proteíny, ktoré obsahujú dve alebo viac aminokyselín viazaných peptidovými väzbami.
Polypeptidy podľa vynálezu zahŕňajú polypeptid podlá ' SEQ ID No. 2, najmä polypeptidy s biologickou aktivitou
N-sukcinylaminoketopimeláttransaminázy a aj také, ktoré sú aspoň na 70 % identické s polypeptidom podlá SEQ ID No. 2, * prednostne aspoň na 80 % a obzvlášť také, ktoré vykazujú identitu s polypeptidom podľa SEQ ID No. 2 aspoň nä 90 % až 95 % a uvedenú aktivitu.
Vynález sa ďalej týka spôsobu fermentačnej výroby aminokyselín, najmä' L-lyzínu, použitím koryneformných baktérií, ·· e • · · • ···· ·· ·· ·· • · · · · · · • · ·· · · • · · · ··· · • · ······ ··· · ·· ·· ·· · ktoré najmä už produkujú aminokyseliny a v ktorých sa zosilňujú, najmä nadmerne exprimujú nukleotidové sekvencie kódujúce gén dapC.
Pojem „zosilnenie opisuje v tejto* súvislosti zvýšenie intracelulárnej aktivity jedného alebo viacerých enzýmov v mikroorganizme, ktoré sú kódované príslušnou DNA, tým, že sa napríklad zvýši počet kópií génu, poprípade génov, použije sa silný promótor alebo sa použije gén alebo alela, ktorá kóduje príslušný enzým s vysokou aktivitou a tieto opatrenia sa poprípade kombinujú.
Mikroorganizmy, ktoré sú predmetom predloženého vynálezu, môžu produkovať L-aminokyseliny, najmä L-lyzín, z glukózy, sacharózy, laktózy, fruktózy, maltózy, melasy, škrobu, celulózy alebo z glycerolu a etanolu.. Môže sa jednať o zástupcov koryneformných baktérií, najmä rodu Corynebacterium. Pri rode Corynebacterium treba uviesť najmä druh Corynebačterium glutamicum, ktorý je v odbornom svete známy pre svoju schopnosť produkovať L-aminokyseliny.
Vhodnými kmeňmi rodu Corynebacterium, najmä druhu Corynebacterium glutamicum, sú napríklad známe kmene divého typu glutamicum ATCC13032, acetoglutamicum ATCC15806, acetoacidophilum ATCC13870, thermoaminogenes FERM BP-1539, melassecola ATCC17965, flavum ATCC14067, lactofermentum ATCC13869 a divaričatum ATCC14020
Corynebacterium Corynebactéri um Coryn eba c t eri um Corynebacterium Corynebacterium Brevibacterium Brevibacterium Brevibacterium
Ί • · ·· ·· ·· ··· ···· ··· ··· ···· · · • ···· ·· · · ··· · • · ······ ··· · ·· ·· ·· · a z nich vytvorené mutanty, poprípade kmene, produkujúce L-lyzín, ako napríklad
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709,
Brevibacterium flavum FERM-P 1708,
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712,
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463,
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464,
Corynebacterium glutamicum DSM5715,
Corynebacterium glutamicum DSM12866 a
Corynebacterium glutamicum DM58-1.
Vynálezcom sa podarilo izolovať nový gén dapC z C. glutamicum, kódujúci enzým N-sukcinylaminoketopimeláttransaminázu (EC 2.6.1.17).
Na izoláciu génu dapč alebo aj iných génov z C. glutamicum sa najskôr založí génová banka tohto mikroorganizmu v E. coli. Založenie génových bánk je opísané vo všeobecne známych učebniciach a príručkách. Ako príklad možno uviesť učebnicu Winnacker: Gene und Klone, Eine Einfíihrung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Nemecko, 1990) alebo príručku Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989). Velmi známou génovou bankou je génová banka kmeňa W3110 E. coli K-12, ktorú založili Kohara et al. (Celí 50, 495 - 508 (1987)) v λ-vektoroch. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252:255-265, 1996) opisujú génovú banku C. glutamicum ATCC13032, ktorá bola založená pomocou kozmidového vektora SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of « the National Academy of Sciences USA, 84:2160-2164) v kmeni NM554 E. coli K-12 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575). Bôrmann et al. (Molecular Microbio8 ·· ·· ···· · · • · • · • · · · · • · ·· · • · · · · · • · · · · ·· ·· ·· logy 6(3), 317-326)) zasa opisujú génovú banku C. glutamicum ATCC13032 s použitím kozmidu pHC79 (Hohn a Collins, Gene 11, 291-298 (1980)). Na vytvorenie génovej banky C. glutamicum v E. coli sa môžu použiť aj plazmidy, ako napríklad pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979) alebo pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19:259-268). Ako hostitelia sú vhodné najmä také kmene E. coli, ktoré sú reštrikčné a rekombinačne defektné. Príkladom toho je kmeň DH5amcr, ktorý opísal Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649). Dlhé fragmenty DNA klonované pomocou kozmidov sa potom zasa môžu subklonovať do bežných vektorov vhodných na sekvenovanie a potom sekvenovat, ako sa opisuje napríklad v Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 74:5463-5467 (1977)).
Týmto spôsobom sa získala nová sekvencia DNA z C. glutamicum, kódujúca gén dapC, ktorá je ako SEQ ID NO 1 súčasťou predloženého vynálezu. Ďalej sa z tejto sekvencie DNA odvodila aminokyselinová sekvencia príslušného proteínu pomocou vyššie opísaných metód. V SEQ ID NO 2 je znázornená vyplývajúca aminokyselinová sekvencia génového produktu dapC.
Kódujúce sekvencie DNA, ktoré vyplývajú z SEQ ID NO 1 v dôsledku degenerovateľnosti genetického kódu, sú taktiež súčasťou tohto vynálezu. Rovnako sú súčasťou tohto vynálezu sekvencie DNA, ktoré hybridizujú s SEQ ID NO 1 alebo časťami SEQ ID NO 1. V odbornom svete sú ďalej konzervatívne zámeny aminokyselín, ako napríklad zámena glycínu za alanín alebo kyseliny asparágovej za kyselinu glutámovú v proteínoch, známe ako „mutácie so zmyslom (sense mutations), ktoré nevedú k žiadnej zásadnej zmene aktivity proteínu, t. zn. sú ·· • · · · • · • · ·· · • · • ··· • · ··· · ·· ·· • · · • · ·· ·· · funkčne neutrálne. Ďalej je známe, že zmeny na N-konci a/alebo C-konci proteínu nemôžu jeho funkciu podstatne , obmedzovať alebo ju môžu dokonca stabilizovať. Údaje k tomu nájde odborník medzi iným v Ben-Bassat et al.. (Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987)), v O'Regan et al. (Gene 77:237-251 (1989)), v Sahin-Toth et al. (Proteín Sciences 3:240-247 (1994)), v Hochuli et al. (Bio/Technology 6:13211325 (1988)) a v známych učebniciach genetiky a molekulovej biológie. Aminokyselinové sekvencie, ktoré vyplývajú príslušným spôsobom z SEQ ID NO 2, sú taktiež súčasťou vynálezu.
Súčasťou vynálezu sú rovnako aj sekvencie DNA, ktoré hybridizujú s SEQ ID NO 1 alebo časťami SEQ ID NO 1. Napokon sú súčasťou vynálezu sekvencie DNA, ktoré sa pripravujú polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) použitím primérov, ktoré vyplývajú z SEQ ID NO 1. Také oligonukleotidy majú typickým spôsobom dĺžku aspoň 15 nukleotidov.
Návody na identifikáciu sekvencii DNA pomocou hybridizácie nájde odborník medzi iným v príručke „The DIG System Users Guide for Filter Hybridization od firmy Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Nemecko, 1993) a v Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260). Návody na amplifikáciu sekvencii DNA pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) nájde odborník medzi iným v príručke Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, Velká Británia, 1984) a v Newton a Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Nemecko, 1994).
Vynálezcovia zistili, že koryneformné baktérie po nadmernej expresii génu dapC produkujú zlepšeným spôsobom
L-lyzín.
Na dosiahnutie nadmernej expresie sa môže zvýšiť počet kópií príslušných génov alebo sa môže mutovať promótorová a regulačná oblasť alebo miesto pre naviazanie ribozómov, ktoré sa nachádza proti smeru štruktúrneho génu. Rovnakým spôsobom pôsobia expresívne kazety, ktoré sa vkladajú proti smeru štruktúrneho génu. Pomocou indukovatelných promótorov možno dodatočne zvýšiť expresiu v priebehu fermentačnej produkcie L-lyzínu. Opatreniami na predĺženie trvanlivosti mRNA sa expresia taktiež zlepšuje. Ďalej sa enzýmová aktivita taktiež zosilňuje zabránením odbúravania enzýmového proteínu. Gény alebo génové konštrukty môžu buď existovať v plazmidoch s rozdielnym počtom kópií, alebo môžu byť v chromozóme integrované a amplifikované. Ďalej' sa môže alternatívne dosiahnuť nadmerná expresia príslušných génov zmenou' zloženia médií a zmenou uskutočnenia kultivácie.
Návody na to nájde odborník medzi iným v Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), v Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya a Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), v Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), v EP 0 472 869, v US patente 4,601,893, vo Schwarzer a ·
I
Puhler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), v Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), v LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), vo WO 96/15246, v Malumbres et al. (Gene 134, 15 24 (1993)), v JP-A-10-229891, v Jensen a Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), v Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996)) a v známych učebniciach genetiky a molekulovej biológie.
·· • · · · · • · ·· · • · · β · · • · · · ·
Gén dapC podlá vynálezu sa napríklad nadmerne exprimoval pomocou plazmidov. '
Ako plazmidy sú vhodné také, ktoré sa replikujú v koryneformných baktériách. Početné známe plazmidové vektory, ako napríklad pZl (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKExl (Eikmanns et al., Gene 102, 93-98 (1991)) alebo pHS2-l (Sonnen et al., Gene 107:69-74 (1991)) sa zakladajú na kryptických plazmidoch pHM1519, pBLl alebo pGAl. Rovnako sa môžu použiť iné plazmidové vektory, ako napríklad tie, ktoré sú založené na pCG4 (US-A 4,489,160) alebo pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)) alebo pAGl (US-A 5,158,891).
Príkladom plazmidu, pomocou ktorého sa môže nadmerne exprimovať gén dapC, je kyvadlový vektor (shuttle vector) pXT-dapCexp E. coli -.C.glutamicum. Obsahuje replikačnú oblasť rep plazmidu pGAl zahŕňajúc replikačný efektor per (US-A- 5,175,108; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179, 1525-1532 (1997)), gén tetA(Z) plazmidu pAGl sprostredkovávajúci rezistenciu na tetracyklín (US-A- 5,158,891; zápis do génovej banky v National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) s prírastkovým číslom AF121000) a počiatok replikácie, promótor trc, terminačné oblasti Tl a T2 a gén laclq (represor operónu lac z E. coli) plazmidu pTRC99A (Amann et al. (1988), Gene 69: 301-315).
Kyvadlový vektor pXT-dapCexp je znázornený na obrázku
Ďalej sú vhodné také plazmidové vektory, pomocou ktorých sa môže použiť spôsob génovej amplifikácie integráciou • · ·· · • « · • ···· • · ··· · ·· ·· ·· • · · · · · · • t ·· · · • · · · · · · • · · · · · ·· ·· ·· · do chromozómu, ako opísal napríklad Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), na duplikáciu, poprípade amplifikáciu operónu hom-thrB. Pri tejto metóde sa úplný gén klonuje do plazmidového vektora, ktorý sa môže replikovať v hostiteľovi (typicky E. coli), avšak nie v C. glutamicum. Ako vektory prichádzajú do úvahy napríklad pSUP301 (Šimon et al., Bio/Technolcgy 1, 784-791 (1983)), pK18mob alebo pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biologicai Chemistry 269:32678-84; US-A 5,487,993), pCR®Blunt (firma Invitrogen, Groningen, Holandsko; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) alebo pEMl (Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacteriology 173:45104516). Plazmidový vektor obsahujúci gén, ktorý sa má amplifikovať, sa potom prenesie konjugáciou alebo transformáciou do žiadaného kmeňa C. glutamicum. Metóda konjugácie je opísaná napríklad v Schäfer et al., (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)). Metódy transformácie sa opisujú napríklad v Thierbach et al., (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican a Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) a Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)). Po homológnej rekombinácii pomocou „cross over udalosti obsahuje výsledný kmeň aspoň dve kópie uvedeného génu.
Ďalej sa zistilo, že zámenou aminokyseliny L-prolínu v polohe 209 enzýmového proteínu N-sukcinylaminoketopimeláttransaminázy (viď SEQ ID No. 2) za akúkoľvek inú proteinogénnu aminokyselinu, najmä L-leucín (viď SEQ ID No. 4), s výnimkou L-prolínu, nastane zosilnenie a koryneformné • · · ···· · · ·· ·· ·· • · · · · · • ·· · · • · · · · · • · ···· ·· ··· · ·· ·· ·· · baktérie, ktoré nesú príslušnú aminokyselinovú zámenu, produkujú L-lyzín zlepšeným spôsobom. Zámena L-prolínu za L-leucín v polohe 209 aminokyselinovej sekvencie sa môže uskutočniť predovšetkým zámenou nukleovej bázy cytozínu v polohe 716 za tymín, ako sa znázorňuje v nukleotidovej sekvencií SEQ ID No. 3.
Na mutagenézu sa môžu použiť klasické spôsoby mutagenézy použitím mutagénnych látok, ako napríklad N-metyl-N'-nitro-N-nitrózoguanidín, alebo ultrafialového svetla. Ďalej sa môžu na mutagenézu použiť metódy in vitro, ako napríklad spracovanie hydroxylamínom (Molecular and General Genetics 145, str. 101 a ďalšie, (1978)) alebo mutagénne oligonukleotidy (T. A. Brown: Gentechnologie fúr Einsteiger,
Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993) alebo polymerázová reťazová reakcia (PCR), ako sa opisuje v príručke Newton a Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1994).
Predmetom vynálezu sú preto ďalej koryneformné baktérie, ktoré obsahujú N-sukcinylaminoketopimeláttransaminázové enzýmové proteíny, v ktorých je aminokyselinová sekvencia v'polohe 209, znázornená v SEQ ID No. 2, zamenená za inú aminokyselinu s výnimkou L-prolínu. Ďalším aspektom tohto vynálezu sú koryneformné baktérie, ktoré obsahujú príslušný enzýmový proteín, v ktorom je aminokyselina L-prolín v polohe 209 enzýmového proteínu (viď SEQ ID No. 2) zamenená za L-leucín (viď SEQ ID No. 4).
Ďalším predmetom tohto vynálezu sú preto polynukleotidové sekvencie pochádzajúce z koryneformných baktérií, ktoré obsahujú gény, ktoré kódujú uvedené N-sukcinylaminoketopi* meláttransaminázové enzýmové proteíny.
• · ···· ·· ·· ·· • · · · · · • · ·· · · ·· ·· ··· · • · · · · · · ··· · ·· ·· ··
Ešte ďalším predmetom tohto vynálezu sú koryneformné baktérie, ktoré obsahujú DNA kódujúcu enzýmový proteín N-sukcinylaminoketopimeláttransaminázu, ktorý sa vyznačuje zámenou L-prolínu za L-leucín v polohe 209, ktorá obsahuje namiesto nukleovej bázy cytozínu v polohe 716 (viď SEQ ID No. 1) tymín, ako sa znázorňuje v SEQ ID No. 3.
Prídavné môže byť pre produkciu L-lyzínu výhodné okrem génu dapC zosilniť alebo nadmerne exprimovať jeden alebo viac enzýmov danej biosyntetickej dráhy, glykolýzy, anaplerotiky alebo exportu aminokyselín.
Takto sa napríklad môže na produkciu L-lyzínu prídavné ku génu dapC súčasne zosilniť, najmä nadmerne exprimovať alebo amplifikovať jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej • gén lysC kódujúci aspartátkinázu rezistentnú na spätnú väzbu (feed back) (Kalinowski et al. (1990), Molecular and General Genetics 224: 317-324), • gén asd kódujúci aspartátsemialdehyddehydrogenázu (EP-A 0 219 027; Kalinowski et al. (1991), Molecular Microbiology 5:1197-1204, a (Kalinowski et al. (1991), Molecular and General Genetics 224:' 317-324), ♦
• gén dapA kódujúci dihydrodipikolinátsyntázu (EP-B 0 197 335), • gén dapB kódujúci dihydrodipikolinátreduktázu • · ···· ·· ·· ·· • · · · · · · • · ·· · · ·· ·· · · · · • · ······ ··· · ·· ·· ·· · t » (zápis do génovej banky pod prírastkovým číslom X67737; Pisabarro et al. (1993), Journal of Bacteriology 175(9): 2743-2749), • gén dapD kódujúci tetrahydrodipikolinátsukcinylázu (zápis do génovej banky pod prírastkovým číslom AJ004934; Wehrmann et al. (1998), Journal of Bacteriology 180: 3159-3163), ý
• gén dapE kódujúci N-sukcinyl*aminopimelátdesukcinylázu (zápis do génovej banky pod prírastkovým číslom X81379;
Wehrmann et al. (1994), Microbiology 140: 3349-3356), • gén dapF'kódujúci diaminopimelátepimerázu (DE: 199 43 587.1, DSM12968), a
• gén lysA kódujúci diaminopimelátdekarboxylázu (zápis do génovej banky pod prírastkovým číslom X07563; Yeh et al. (1988), Molecular and General Genetics 212: 112-119), • gén ddh kódujúci diaminopimelátdehydrogenázu (Ishino et al. (1988), Agricultural and Biological
Chemistry 52 (11): 2903-2909), • gén lysE kódujúci export lyzínu (DE-A-195 48 222), • gén pyc kódujúci pyruvátkarboxylázu (Eikmanns (1992),
Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), • gén mqo kódujúci malátchinónoxidoreduktázu (Molenaar et al. (1998), European Journal of Biochemistry 254: 395403), • · ·· · • I · • ··· • · • · ·· ·· ·· ·· • gén zwal (DE: 19959328.0, DSM 13115), • gén gdh kódujúci glutamátdehydrogenázu (Bôrmann et al. (1992), Molecular Microbiology 6, 317-326).
Prednostné je súčasné zosilnenie jedného alebo viacerých génov zvolených zo súboru zahŕňajúceho dapD, dapE a dapF.
Ďalej môže byť pre produkciu aminokyselín L-lyzínu výhodné prídavné k zosilneniu génu dapC, poprípade v kombinácii s jedným alebo viacerými génmi zvolenými zo súboru zahŕňajúceho dapD, dapE a dapF, súčasne zoslabiť • gén pck kódujúci fosfoenolpyruvátkarboxykinázu (DE 199 50 409.1, DSM 13047) alebo • gén pgi kódujúci glukóza-6-fosfátizomerázu (US
09/396,478, DSM 12969) alebo • gén poxB kódujúci pyruvátoxidázu (DE 19951975.7, DSM 13114) alebo • gén zwa2 (DE: 19959327.2, DSM 13113) alebo • gén sucC alebo sucD kódujúci sukcinyl-CoA-syntetázu (DE: 19956686.0).
Ďalej môže byť pre produkciu L-lyzínu výhodné prídavné k zosilneniu génu dapC, poprípade v kombinácii s jedným alebo viacerými génmi zvolenými zo súboru zahŕňajúceho dapD, dapE a dapF, vylúčiť nežiaduce vedľajšie reakcie (Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms, in:
·· ·· • · · · • ·' ·· ·· · · · · · · · · · • ·· ·· ·· ·
Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (vyd.), Academic Press, Londýn, Veľká Británia, 1982).
Mikroorganizmy vytvorené podľa vynálezu sa môžu .na účely produkcie L-lyzínu kultivovať kontinuálne alebo diskontinuálne spôsobom „batch (vsádzková kultivácia) alebo spôsobom „fed batch (prítokový systém) alebo spôsobom „repeated fed batch (opakovaný prítokový systém). Zhrnutie známych kultivačných metód je opísané v učebnici Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustáv Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) alebo v učebnici Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994):
Použité kultivačné médium musí vhodným spôsobom vyhovovať nárokom daných kmeňov. Opisy kultivačných médií rozličných mikroorganizmov sa nachádzajú v príručke „Manual of Methods for General Bactériology od American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981).
Ako zdroje uhlíka sa môžu používať cukry a sacharidy, ako je napríklad glukóza, sacharóza, laktóza, fruktóza, maltóza, melasa, škrob a celulóza; oleje a tuky, ako napríklad sójový olej, slnečnicový olej, podzemnicový olej a kokosový olej; mastné kyseliny, ako je kyselina palmitová, kyselina stearová, kyselina linolová; alkoholy, ako je napríklad glycerol a etanol; a organické kyseliny, ako je napríklad kyselina octová. Tieto látky sa môžu používať ako jednotlivé zložky alebo ako zmes.
Ako zdroje dusíka sa môžu používať organické zlúčeniny obsahujúce dusík, napríklad peptóny, kvasnicový extrakt, mäsový extrakt, sladový extrakt, kukuričný extrakt, sójová ·· ·· · • · · • ··· • · ··· · ·· • · · · • · ·· • · · · · • · · · ·· ·· ·· • · · • · • · · • · ·· · múka a močovina, alebo anorganické zlúčeniny, ako je napríklad síran amónny, chlorid amónny, fosforečnan amónny, uhličitan amónny a dusičnan amónny. Zdroje dusíka sa môžu používať jednotlivo alebo ako zmes.
Ako zdroje fosforu sa môže používať kyselina fosforečná, dihydrogenfosforečnan draselný alebo hydrogenfosforečnan draselný alebo príslušné sodné soli. Kultivačné médium musí ďalej obsahovať soli kovov, ako napríklad síran horečnatý alebo síran železa, ktoré'sú potrebné na rast. Napokon sa môžu prídavné k vyššie uvedeným látkam používať esenciálne rastové.látky, ako sú aminokyseliny a vitamíny.
Ku kultivačnému médiu sa môžu okrem toho pridávať vhodné prekurzory. Uvedené vsádzkové suroviny sa môžu ku kultúre pridávať vo forme jednorazovej vsádzky alebo sa môžu vhodným spôsobom pridávať počas kultivácie.
Na kontrolu pH kultúry sa vhodne používajú zásadité zlúčeniny, ako je hydroxid sodný, .hydroxid draselný, amoniak, poprípade amoniaková voda, alebo kyslé zlúčeniny, ako je kyselina fosforečná alebo kyselina sírová. Na kontrolu tvorby peny sa môžu používať odpeňovadlá, ako napríklad polyglykolestery mastných kyselín. Na udržiavanie stability plazmidov sa môžu k médiu pridávať vhodné selektívne pôsobiace látky, napríklad antibiotiká. Aby sa udržiavali aeróbne podmienky, zavádza sa do kultúry kyslík alebo zmesi plynov obsahujúce kyslík, napríklad vzduch. Teplota kultúry je zvyčajne približne 20 °C až 45 °C a najmä približne 25 °C až 40 °C. Kultivácia prebieha tak dlho, kým sa nevytvorí maximum lyzínu. Tento ciel sa zvyčajne dosiahne za 10 hodín až 160 hodín.
• · · • · • · · · • · · ·· ·· ·· ·· ·· • · · • · • · · • · ·· ·
Analýza L-lyzínu sa môže uskutočňovať anexovou chromatografiou s následnou ninhydrínovou derivatizáciou tak, ako sa opisuje v Spackman et al. (Analýtical Chemistry, 30, (1958) 1190).
K
Nasledovný mikroorganizmus sa uložil v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr (DSMZ, Braunschweig, Nemecko) podľa Budapeštianskej zmluvy:
• Corynebacterium glutamicum kmeň DSM5715/pXT-dapCexp ako DSM 13254.
Spôsob podľa vynálezu slúži na fermentačnú výrobu L-lyzínu.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Predložený vynález sa v nasledovnom texte bližšie vysvetľuje na základe príkladov uskutočnenia.
Príklad 1
Vytvorenie genomickej génovej banky kozmidu z Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Chromozómová DNA z Corynebacterium glutamicum ATCC « 13032 sa izolovala tak, ako sa opisuje v Tauch et al. (1995,
Plasmid 33: 168-179), a čiastočne rozštiepila reštrikčným enzýmom Sau3AI (Amersham Pharmacia,%Freiburg, Nemecko, opis produktu Sau3AI, kód č. 27-0913-02). Fragmenty DNA sa defosforylovali pomocou alkalickej fosfatázy z garnátov (shrimp) (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nemecko, opis produktu SAP, kód č. 1758250). DNA kozmidového vektora • · ·· ·· ·· ·· · ···· ··· ··· ···· ·· • ···· ·· ·· ··· · • · ······ ··· · ·· ·· ·· ·
SuperCosl (Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84:2160-2164), získaná od firmy Stratagene (La Jolla, USA, opis produktu SuperCosl Cosmid Vektor Kit, kód č. 251301), sa štiepila reštrikčným enzýmom Xbal (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu Xbal, kód č. 27-0948-02) a taktiež defosforylovala alkalickou fosfatázou z garnátov. Následne sa kozmidová DNA štiepila reštrikčným enzýmom BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu BamHI, kód č. 27-0868-04). Týmto spôsobom spracovaná kozmidová DNA sa zmiešala so spracovanou DNA ATCC 13032 a zmes sa spracovala T4-DNA-1Ígázou (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu T4-DNA-ligáza, kód č. 27-0870-04). Ligačná zmes sa potom pomocou Gigapack II XL Packing Extract (Stratagene, La Jolla, USA, opis produktu Gigapack II XL Packing Extract, kód č. 200217) vbalila do fágov. Na infekciu kmeňa E. coli NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Research 16:15631575) sa bunky extrahovali v lOmM MgSO4 a zmiešali s alikvotom suspenzie fágov. Infekcia a titrácia kozmidovej banky sa uskutočnila tak, ako sa opisuje v Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), pričom sa bunky naniesli na platne s agarom LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) so 100 mg/1 ampicilínu. Po inkubácii cez noc pri 37 °C sa selektovali jednotlivé ;rekombinantné klony.
Príklad 2
Izolácia a sekvenovanie génu dapC
Kozmidová DNA jednej jednotlivej kolónie sa izolovala pomocou Qiaprep Spin Miniprep Kit (produkt č. 27106, Qiagen, Hilden, Nemecko) podľa návodov výrobcu a čiastočne rozštiepila reštrikčným enzýmom Sau3AI (Amersham Pharmacia, • · ·· ·· ·· ··· · · · · · · · • · I · ·· · · • ···· · · ·· ··· · • · ······ ··· · ·· ·· ·· ·
Freibur.g, Nemecko, opis produktu Sau3AI, produkt č. 27-091302). Fragmenty DNA sa defosforylovali pomocou alkalickej fosfatázy z garnátov (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nemecko, opis produktu SAP, produkt č. 1758250). Po separácii gólovou elektroforézou sa uskutočnila izolácia kozmidových fragmentov s rozsahom veľkostí 1 500 až 2 000 bp pomocou QiaExlI Gel Extraction Kit (produkt č. 20021,
Qiagen, Hilden, Nemecko). DNA sekvenačného vektora pZero-1, získaná od firmy Invitrogen (Groningen, Holandsko, opis produktu Zero Background Cloning Kit, produkt č. K2500-01), sa štiepila reštrikčným enzýmom BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu BamHI, produkt č. 27-086804). Ligácia kozmidových fragmentov do sekvenačného vektora pZero-1 sa uskutočnila tak, ako sa opisuje v Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring· Harbor), pričom zmes DNA s T4-ligázou (Pharmacia Biotech, Freiburg, Nemecko) sa inkubovala cez noc. Táto ligačná zmes sa následne elektroporovala (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123:343-7) do kmeňa E. coli DH5aMCR (Grant,
1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645-4649) a naniesla na platňu s agarom LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) s 50 mg/1 zeocínu. Plazmidcvá preparácia rekombinantných klonov sa uskutočňovala . pomocou Biorobot 9600 (produkt č. 900200, Qiagen, Hilden, -'Nemecko). Sekvenovanie sa uskutočňovalo dideoxymetódou ukončenia reťazca od Sangera et al. (1997, Proceedings of the National of Sciences U.S.A.,74:5463-5467) s modifikácia- , mi podľa Zimmermanna et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18:1067). Použil sa „RR dRhodamin Terminátor Cycle Sequencing Kit od PE Applied Biosystems (produkt č. 403044, Weiterstadt, Nemecko). Separácia gélovou elektroforézou a analýza sekvenačnej reakcie sa uskutočňovala v géle „Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid (29:1) (produkt č.
·· • · · e • · ·· ·· • · · · • · ·· • · · · • · · · ·· ·· ···· · · • · • ·
A124.1, Roth, Karslruhe, Nemecko) pomocou prístroja na sekvenovanie „ABI prism 377 od PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Nemecko).
Získané nespracované údaje o sekvenciách sa následne spracovali procesorom použitím Stadenovho programového balíka (1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231) Version 97-0. Jednotlivé sekvencie derivátov pZerol sa zostavili do jedného súvislého celku. Počítačová analýza kódujúcich oblastí sa uskutočnila pomocou programu XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231). Ďalšie analýzy sa uskutočnili pomocou „BLAST search programs (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25:3389-3402) proti neredundantnej databanke od „National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA).
Získaná nukleotidová sekvencia je znázornená v SEQ ID No. 1. Analýza nukleotidovej sekvencie poskytla otvorený čítací raster s 1101 pármi báz, ktorý sa označil ako gén dapC. Gén dapC kóduje polypeptid s 367 aminokyselinami, ktorý je znázornený v SEQ ID No. 2.
Príklad 3
Príprava kyvadlového vektora pXT-dapCexp na zosilnenie génu dapC v C. glutamicum
3.1 Klonovanie génu dapC
Chromozómová DNA sa izolovala z kmeňa ATCC 13032 podlá metódy od Eikmannsa et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)). Na základe sekvencie génu dapC známej z príkladu 2 pre C. glutamicum sa selektovali -nasledovné .oligonukleotidy ·· ···· · · • · · · · • · ·· · • · · · · · • · · · · ·· ·· ·· · pre polymerázovú reťazovú reakciu (viď tiež SEQ ID No. 5 a 6) :
DapC (dCexl):
5' GAT CTA (GAA TTC) GCC TCA GGC ATA ATC TAA CG 3'
DapC (dCexna2):
5' GAT CTA (TCT AGA) CAG AGG ACA AGG CAA TCG GA 3'
Znázornené priméry syntetizovala firma ARK Scientific
GmbH Biosystems (Darmstadt, Nemecko) a podľa štandardnej metódy PCR od Innisa et al. (PCR protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) sa uskutočnila PCR reakcia s polymerázou Pwo od firmy Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Nemecko). Pomocou tejto polymerázovej reťazovej reakcie umožnili priméry amplifikáciu fragmentu DNA s veľkosťou približne 1,6 kb, ktorý nesie gén dapC. Okrem toho primér DapC (dCexl) obsahuje sekvenciu pre štiepne miesto reštrikčnej endonukleázy EcoRI a primér DapC (dCexna2) obsahuje sekvenciu pre štiepne miesto reštrikčnej endonukleázy Xbal, ktoré sú vo vyššie znázornenom poradí nukleotidov označené zátvorkami·.
Amplifikovaný fragment DNA s veľkosťou približne 1,6 kb, ktorý nesie gén dapC, sa ligoval pomocou Zero Blunt™ ; Kit od firmy Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; katalógové číslo K2700-20) do vektora pCR®Blunt II (Bernard et al., Journal of -Molecular Biology 234:534-541 (1993)). Kmeň E. coli ToplO sa potom transformoval s ligačnou zmesou podlá údajov výrobcu kitu (firma Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA). Selekcia buniek nesúcich plazmid sa uskutočnila nanesením transformačnej zmesi na platne s agarom LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold • · ·· ·· ·· ·· · ···· ··· • · · · · ·· a · • ···· · · ·· ··· · • a a··· · · • a· · ·· ·· ·· ·
Spring Harbor, N.Y.), ktorý bol doplnený 25 mg/1 kanamycínu. Plazmidová DNA sa izolovala z jedného transformantu použitím QIAprep Spin Miniprep Kit od firmy Qiagen (Hilden, Nemecko) a analyzovala reštrikciou reštrikčnými enzýmami Xbal a EcoRI s následnou elektroforézou v agarózovom géle (0,8%). Sekvencia DNA amplifikovaného fragmentu DNA sa analyzovala sekvenovaním. Plazmid sa nazval pCRdapC. Kmeň sa označil ako E. coli Top10/pCRdapC.
3.2 Príprava kyvadlového vektora pEC-XT99A z E. coli - C. glutamicum
Ako východiskový vektor na konštrukciu kyvadlového expresívneho vektora pEC-XT99A z E. coli - C. glutamicum sa použil expresívny vektor pTRC99A z E. coli (Amann et al.
1988, Gene 69:301-315). Po reštrikčnom štiepení pomocou BspHI (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nemecko, opis produktu BspHI, produkt č. 1467123) a po následnom Klenowovom spracovaní (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Nemecko, opis produktu Klenow Fragment of DNA Polymerase I, produkt č. 27-0928-01); metóda podľa Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) sa vymenil gén pre rezistenciu na ampicilín (bla) za gén pre rezistenciu na tetracyklín plazmidu pGAl z C. glutamicum (prírastkové číslo v génovej banke AF121000). Na tento účel sa klonovala oblasť nesúca gén pre túto rezistenciu ako fragment Alul (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Nemecko, ·opis produktu Alul, produkt č. 27-0884-01) do linearizovaného expresívneho vektora pTRC99A z E.coli. Ligácia sa uskutočnila tak, ako sa opisuje v Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), pričom zmes DNA s T4-ligázou (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Nemecko, opis produktu T4-DNA-Ligase, produkt č.
··
·· · · • · • · · · · • · ·· · • · · · B · • · · · · ·· ··
27-0870-04) sa inkubovala cez noc. Táto ligačná zmes sa potom elektroporovala (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiology Letters, 123:343-7) do kmeňa E. coli DH5amcr (Grant et al., 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645-4649). Skonštruovaný expresívny vektor E. coli sa označil pXT99A.
Ako základ na klonovanie minimálneho replikónu z Corynebacterium glutamicum sa použil plazmid pGAl (Sonnen et al. 1991, Gene, 107:69-74). Reštrikčným štiepením vektora pGAl pomocou Ball/Pstl (Promega GmbH,· Mannheim, Nemecko, opis produktu Balí, produkt č. R6691; Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Nemecko, opis produktu PstI, produkt č. 27-0976-01) sa mohol klonovať fragment s veľkosťou 3484 bp do vektora pK18mob2 (Tauch et al., 1998, Archives of Microbiology 169:303-312)., fragmentovaného pomocou Smal a PstI (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Nemecko, opis produktu Smal, produkt č. 27-0942-02, opis produktu PstI, produkt č. 27-0976-01). Pomocou reštrikčného štiepenia s BamHI/XhoI (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Nemecko, opis produktu BamHI, produkt č. 27-086803, opis produktu Xhol, produkt č. 27-0950-01) a následným Klenowovým spracovaním (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Nemecko, opis produktu Klenow Fragment of DNA Polymerase I, produkt č. 27-0928-01); metóda podía Sambrook et al., 1989,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) sa deleoval fragment s veľkosťou 839 bp. Z konštruktu religovaného pomocou T4-ligázy (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Nemecko, opis produktu T4-Ligase, produkt č. 270870-04) sa mohol minimálny replikón z C. glutamicum ako fragment s veľkosťou 2645 bp klonovať do expresívneho vektora pXT99A z E. coli. Na tento účel sa DNA konštruktu nesúceho minimálny replikón štiepila reštrikčným enzýmom • · • · · · • · • · · · • · · ·· · ··· • · ···· ·· ·· • · · • e ·· • · · ·· ··
KpnI (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Nemecko, opis produktu KpnI, produkt č. 27-0908-01) a PstI (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Nemecko, opis produktu PstI, produkt č. 27-0886-0) a potom sa pomocou Klenowovej polymerázy (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Nemecko, opis produktu Klenow Fragment of DNA Polymerase I, produkt č. 27-0928-01) uskutočnilo spracovanie 3'-5'-exonukleázou (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor).
V súbežnej vsádzke sa expresívny vektor pXT99A z E. coli štiepil reštrikčným enzýmom RsrII (Roche Diagnostics, Mannheim, Nemecko, opis produktu RsrII, produkt č. 1292587) a pomocou Klenowovej polymerázy (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Nemecko, opis produktu Klenow Fragment of DNA Polymerase I, produkt č. 27-0928-01) pripravil na ligáciu. Ligácia minimálneho replikónu s vektorovým konštruktom pXT99A sa uskutočnila tak, ako sa opisuje v Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), pričom zmes DNA s T4-ligázou (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Nemecko, opis produktu T4-DNA-Ligase, produkt č. 27-0870-04) sa inkubovala cez noc.
Takto skonštruovaný kyvadlový -expresívny vektor pEC;XT99A z E. coli - C. glutamicum sa elektroporáciou (Liebl ét al., 1989, FEMS Microbiology Letters, 53:299-303) transferoval do C. glutamicum DSM5715. Selekcia transformantov sa uskutočňovala na agare LBHIS zloženom z 18,5 g/1 mozgovo-srdcového infúzneho bujónu, 0,5 M sorbitolu, 5 g/1 Bacto-tryptónu, 2,5 g/1 Bacto-yeast-extract, 5 g/1 NaCl a 18 g/1 Bacto-agaru, ktorý bol doplnený 5 mg/1 tetracyklínu. Inkubácia sa uskutočňovala 2 dni pri 33 °C.
·· . 27
9
9
9 9 ···· • · ··· · ·· 99
9 9 9
9 99 • · · · · · • · · · ·· ·· • · • · • · • ·
Plazmidová DNA sa izolovala z jedného transformantu obvyklou metódou (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927), štiepila reštrikčnou endonukleázou
HindlII a plazmid sa analyzoval následnou elektroforézou v agarózovom géle.
Takto získaný plazmidový konštrukt sa označil ako pECXT99A a je znázornený na obrázku 1. Kmeň získaný elektroporáciou plazmidu pEC-XT99A do kmeňa Corynebacterium glutamicum DSM5715 sa nazval DSM5715/pEC-XT99A a uložil v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr (DSMZ, Braunschweig, Nemecko) podlá Budapeštianskej zmluvy ako DSM 12967.
3.3 Klonovanie dapC v kyvadlovom vektore pEC-XT99A z E. coli - C. glutamicum
Ako vektor sa použil kyvadlový vektor pEC-XT99A z E. coli - C. glutamicum, opísaný v príklade 3.2. DNA tohto plazmidu sa úplne rozštiepila reštrikčnými enzýmami EcoRI a Xbal a potom defosforylovala alkalickou fosfatázou z garnátov (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nemecko, opis produktu SAP, produkt č. 1758250).
: Z plazmidu pCRdapC, opísaného v príklade 3.1., sa izoloval gén dapC úplným štiepením enzýmami EcoRI a Xbal. Fragment dapC s velkosťou približne 1600 bp sa izoloval z agarózového gélu pomocou QiaExII Gel Extraction Kit (produkt č. 20021, Qiagen, Hilden, Nemecko).
Týmto spôsobom získaný fragment dapC sa zmiešal s pripraveným vektorom pEC-XT99A a zmes sa spracovala s T4DNA-ligázou (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis ··
• · · ·· ·· produktu T4-DNA-Ligase, kód č. 27-0870-04). Ligačná zmes sa transformovala do kmeňa E. coli DH5a (Hanahan, In: DNA Cloning. A Practical Approach. zv. I., IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA). Bunky nesúce plazmid sa selektovali nanesením transformačnej zmesi na platne s agarom LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) s 5 mg/1 tetracyklínu. Po inkubácii cez noc pri 37 °C sa selektovali jednotlivé rekombinantné klony. Plazmidová DNA sa izolovala z jedného transformantu použitím QIAprep Spin Miniprep Kit (produkt č. 27106, Qiagen, Hilden, Nemecko) podľa návodov výrobcu a štiepila reštrikčnými enzýmami EcoRI a Xbal, aby sa plazmid analyzoval následnou elektroforézou v agarózovom géle. Získaný plazmid sa nazval pXT-dapCexp a je znázornený na obrázku 2.
Príklad 4
Transformácia kmeňa DSM5715 plazmidom pXT-dapCexp
Kmeň DSM5715 sa transformoval plazmidom pXT-dapCexp použitím eletroporačnej metódy opísanej v Liebl et al., (FEMS Microbiology Letters, 53:299-303 (1989)). Transformanty sa selektovali na agare LBHIS zloženom z 18,5 g/1 mozgovo-srdcového infúzneho bujónu, 0,5 M sorbitolu, 5 g/1 -Bacto-tryptónu, 2,5 g/1 Bacto-yeast-extract, 5 g/1 NaCl a 18 g/1 Bacto-agaru, ktorý bol doplnený 5 mg/1 tetracyklínu. Inkubácia sa uskutočňovala 2 dni pri 33 ’C.
Plazmidová DNA sa izolovala z jedného transformantu obvyklou metódou (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927), štiepila reštrikčnými endonukleázami EcoRI a Xbal a plazmid sa analyzoval následnou elektroforézou v agarózovom géle. Získaný kmeň sa nazval DSM5715/pXT29 • ·· ·· ·· • ···· ··· ···· ·· ·· · · · · • · · · · · · • ·· ·· ·· dapCexp a uložil v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr (DSMZ, Braunschweig, Nemecko) podľa
Budapeštianskej zmluvy ako DSM 13254.
Príklad 5
Príprava lyzínu
Kmeň C. glutamicum DSM5715/pXT-dapCexp získaný v príklade 4 sa kultivoval v živnom médiu vhodnom na produkciu lyzínu a obsah lyzínu sa stanovoval v kultivačnom supernatante.
Na tento účel sa kmeň najskôr inkuboval 24 hodín pri 33 °C na agarovej platni s vhodným antibiotikom (mozgovosrdcový agar s tetracyklínom (5 mg/1)). Vychádzajúc z kultúk ry z tejto agarovej platne sa naočkovala predkultúra (10 ml média v 100 ml Erlenmeyerovej banke). Médiom.použitým pre predkultúru bolo úplné médium CglII.
Médium Cg III
NaCI 2,5 g/1
Bacto-peptón 10 g/1
Bacto-yeast-extract 10 g/1
Glukóza (oddelene autoklávovaná) 2 % (hmotnosť/objem) Hodnota pH sa nastavila na 7,4.
K tomu sa pridal tetracyklín (5 mg/1). Predkultúra sa inkubovala 16 hodín pri 33 °C pri 240 ot./min v pretrepávačke. Hlavná kultúra sa naočkovala touto predkultúrou tak, aby začiatočná optická hustota (660 nm) hlavnej kultúry bola 0,1. Pre hlavnú kultúru sa použilo médium MM.
···· ·· ·· ·· • · · · · · β • · ·· · · • · ·· ··· · • · · · · · · ··· · ·· ·· ·· ·
Médium MM:
CSL (Corn Steep Liquor) 5 g/1
MOPS (kyselina morfolinopropán- 20 g/1
sulfónová)
Glukóza (oddelene autoklávovaná) 50 g/1
ính4)2so4 25 g/1
KH2PO4 0,1 g/1
MgSO4.7H2O 1,0 g/1
CaCl2.2H2O 10 mg/1
EeSO4.7H2O 10 mg/1
MnSO4.H2O 5,0 mg/1
Biotín (sterilizovaný filtráciou) 0,3 mg/1
Tiamín.HCl (sterilizovaný filtráciou) 0,2 mg/1
L-Leucín (sterilizovaný filtráciou) 0,1 g/1
CaCO3 25 g/1
CSL, MOPS a roztok solí sa roztokom amoniaku nastavili na pH 7 a autoklávovali. Potom sa pridal sterilný roztok substrátu a roztok vitamínov, ako aj za sucha autoklávovaný CaCO3.
Kultivácia sa uskutočňovala v 10 ml objemoch v 100 ml Erlenmeyerovej banke s priehradkami. Pridal sa tetracyklín (5 mg/1). Kultivácia sa uskutočňovala pri 33 °C a 80% vlhkosti vzduchu.
Po 72 hodinách sa určila optická hustota (OD) pri meracej vlnovej dĺžke 660 nm pomocou zariadenia Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Mníchov). Vytvorené množstvo lyzínu sa stanovilo pomocou analyzátora aminokyselín od • · ·· ·· ·· • · · ···· ··· • · · ···· · t • ···· ·· ·· ··· · • ···· ·· ·· · ·· ·· ·· · firmy Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Nemecko) ionexovou chromatografiou a derivatizáciou na prídavnom stĺpci s ninhydrínovou detekciou.
Výsledok pokusu je uvedený v tabuľke 1.
Tabulka 1
Kmeň Optická hustota (660 nm) Lyzín-HCl g/1 ’
DSM5715 7,0 13,7
DSM5715/pXT-dapCexp 7,1 14,7
Prehľad obrázkov na výkresoch
Priložené sú nasledovné obrázky:
Obrázok‘1: Mapa plazmidu pEC-XT99A
Obrázok 2: Mapa plazmidu pXT-dapCexp
Použité skratky a značky majú nasledovný význam:
per: gén na kontrolu počtu kópií z pGAl oriE: plazmidom kódovaný počiatok replikácie E.coli rep: plazmidom kódovaný počiatok replikácie z plazmidu pGAl C. glutamicum Ptrc: promótor trc z pTRC99A
TI, T2: terminačné oblasti 1 a 2 z pTRC99A laclq: represorový gén operónu Lac
Tet: gén pre rezistenciu na tetracyklín dapC: gén dapC z C. glutamicum
EcoRI: štiepne miesto pre reštrikčný enzým EcoRI ·· ··
EcoRV: štiepne miesto pre reštrikčný enzým EcoRV
HindlII: štiepne miesto pre reštrikčný enzým HindlII
KpnI : štiepne miesto pre reštrikčný enzým KpnI
Sali: štiepne miesto pre reštrikčný enzým Sali
Smal: štiepne miesto pre reštrikčný enzým Smal
Ndel: štiepne miesto pre reštrikčný enzým Ndel
BamHI: štiepne miesto pre reštrikčný enzým BamHII
Ncol: štiepne miesto pre reštrikčný enzým Ncol
Xbal: štiepne miesto pre reštrikčný enzým Xbal
Sací: štiepne miesto pre reštrikčný enzým Sací
·· • · ···· ·· ·· • · · · · · • · ·· · · ·· · · · · · · • · · · · · ·· ·· ·· ·· ···
PROTOKOL SEKVENCIÍ <110> Degussa-Huels AG <120> Nu)-:-eotidové sekvencie kódujúce gén dapC a spôsob výroby L-lyzínu <130> 990217 BT <140>
<141>
<160> 6 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1300 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220>
<221> CDS <222> (91)..(1191) <223> Gén dapc <400> 1 gggctcccca ggtggtgcgg ctaagcttgg accacaagat tttgatcacc caatgatcgc 60 tgcgctgccg cctcaggcat aatctaacgc atg acc tct cgc acc ccg ctt gtt 114 Met Thr Ser Arg Thr Pro Leu Val
5
tct gtt ctt cct gat ttt ccg Pro 15 tgg gat tcg ctc get tcc gca aaa gcc 162
Ser Val 10 Leu Pro Asp Phe Trp Asp Ser Leu Ala 20 Ser Ala Lys Ala
aaa get gcg tct cac ccg gat ggg atc gtg aat ctt tct gtt ggc act 210
Lys Ala Ala Ser His Pro Asp Gly íle Val Asn Leu Ser Val Gly Thr
25 30 35 40
ccg gtt gat ccg gtc gcg ccc age att cag atc gcg ttg gca gaa gca 258
Pro Val Asp Pro Val Ala Pro Ser íle Gin íle Ala Leu Ala Glu Ala
45 50 55
gcg ggg ttt tcg ggt tac cct caa acc atc ggc acc ccg gaa ctc cgc 306
Ala Gly Phe Ser Gly Tyr Pro Gin Thr íle Gly Thr Pro Glu Leu Arg
60 65 70
gca gcc atc agg ggc gcg ctt gag cgg cgc tac aac atg aca aag ctt 354
Ala Ala íle Arg Gly Ala Leu Glu Arg Arg Tyr Asn Met Thr Lys Leu
75 80 85
gtc gac gcc tcc ctc ctc ccc gtc gtg ggt acc aag gag gca att gcc 402
Val Asp Ala Ser Leu Leu Pro Val Val Gly Thr Lys Glu Ala íle Ala
90 95 100
ctt ctt cca ttc gcg ttg ggt att tcc ggc acc gtt gtc atc cca gag 450
Leu Leu Pro ’ Phe Ala Leu Gly íle Ser Gly Thr Val Val íle Pro Glu
105 110 115 120
• · ·· ·· ·· ·· · · · · · · · · ··· · ·· · · • ···· ·· ·· ··· · • · ···· · · ··· · ·· ·· ·· ·
att Íle gcg Ala tac Tyr cca Pro acc tac gaa gtc get gtc gtg gcc gca gga tgc acc 498
Thr Tyr 125 Glu Val Ala Val 130 Val Ala Ala Gly Cys 135 Thr
gtg ttg cgt tct gat tcg ctg ttt aag ctc ggc ccg cag atc ccg tcg 546
Val Leu Arg Ser Asp Ser Leu Phe Lys Leu Gly Pro Gin íle Pro Ser
140 145 150
atg atg ttt atc aac tca cca tcc aac ccc aca ggc aag gtt ctg ggc 594
Met Met Phe Íle Asn Ser Pro Ser Asn Pro Thr Gly Lys Val Leu Gly
155 160 165
atc cca íle Pro cac ttg ege aag gtt gtg aag tgg gcg cag gaa aac aac gtg 642
His Leu Arg Lys Val 175 Val Lys Trp Ala Gin 180 Glu Asn Asn Val
170
atc ctc gca get gat gaa tgc tac ttg ggt ctt ggc tgg gac gat gaa 690
íle 185 Leu Ala Ala Asp Glu 190 Cys Tyr Leu Gly Leu Gly 195 Trp Asp Asp Glu 200
aac cca ccg atc tca att ttg gat cca cgt gtc tgc gat ggc gac cac 738
Asn Pro Pro íle Ser íle 205 Leu Asp Pro Arg 210 Val Cys Asp Gly Asp His 215
acc aac ttg atc gcc att cac tcg ctg tct aaa acc tca aac ctc get 786
Thr Asn Leu íle Ala íle 220 His Ser Leu Ser 225 Lys Thr Ser Asn Leu Ala 230
tct tac ege gca ggt tac ctc gtt ggc gat cca gcg ctg att ggt gaa 834
Ser Tyr Arg 235 Ala Gly Tyr Leu Val 240 Gly Asp Pro Ala Leu íle Gly Glu 245
ctc acg gaa gtc cgt aag aac ttg ggt ctc atg gtt cct ttc cca atc 882
Leu Thr 250 Glu Val Arg Lys Asn 255 Leu Gly Leu Met Val 260 Pro Phe Pro íle
cag cag gcc atg atc gca gcc ctc aac gac gat gac caa gag gca ggg 930
Gin 265 Gin Ala Met íle Ala 270 Ala Leu Asn Asp Asp Asp 275 Gin Glu Ala Gly 280
cag aag ctc acc tac gcg att cgt ega gca aaa ctc atg ege gcc ctg 978
Gin Lys Leu Thr Tyr Ala 285 íle Arg Arg Ala 290 Lys Leu Met Arg Ala Leu 295
ttg gaa tcc ggc ttt cag gta gat aat tct gaa gcg ggt ctg tac ctc 1026
Leu Glu Ser Gly Phe Gin 300 Val Asp Asn Ser 305 Glu Ala Gly Leu Tyr Leu 310
tgg gcg acg cgt gaa gaa cct tgc cgt gac act gtc gat tgg ttc get 1074
Trp Ala Thr Arg Glu Glu Pro Cys Arg Asp Thr Val Asp Trp Phe Ala
315 320 325
gag Glu cgt ggc att Arg Gly íle 330 ctc gtt gcc cca gga gac ttc tat ggc cct ege gga 1122
Leu ť Val Ala 335 Pro Gly Asp Phe Tyr 340 Gly Pro Arg Gly
gcg cag cat gtg cgt gtg gcg atg acc gaa acc gac gag ege gtc gac 1170
Ala Gin His Val Arg Val Ala Met Thr Glu Thr Asp Glu Arg Val Asp
345 350 355 360
• · ·· · ·· ··· ···· ···· «·· ··· ··· • ···· ·· ·· ··· · · • · ······» ··· · ·· ·· · · · · 35 gcc ttt gtt tct cgc ctg agc taaacacgac taagcttatt ttgtttaatt 1221
Ala Phe Val Ser Arg Leu Ser
365 gagtttgaag ttttccgtcg aaagaggcca tttgagttcc gagtccagtc ctgagtcgag 1281 taccgagcaa aaaacctgg 1300 <210> 2 <211> 367 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2
Met Thr Ser Arg Thr Pro Leu Val Ser Val Leu Pro Asp Phe Pro Trp
1 5 10 15
Asp Ser Leu Ala Ser Ala Lys Ala Lys Ala Ala Ser His Pro Asp Gly
20 25 30
Íle Val Asn Leu Ser Val Gly Thr Pro Val Asp Pro Val Ala Pro Ser
35 40 45
íle Gin íle Ala Leu Ala Glu Ala Ala Gly Phe Ser Gly Tyr Pro Gin
50 55 60
Thr íle Gly Thr Pro Glu Leu Arg Ala Ala íle Arg Gly Ala Leu Glu
65 70 75 80
Arg Arg Tyr Asn Met Thr Lys Leu Val Asp Ala Ser Leu Leu Pro Val
85 90 95
Val Gly Thr Lys Glu Ala íle Ala Leu Leu Pro Phe Ala Leu Gly íle
100 105 110
Ser Gly Thr Val Val íle Pro Glu íle Ala Tyr Pro Thr Tyr Glu Val
115 120 125
Ala Val Val Ala Ala Gly Cys Thr Val Leu Arg Ser Asp Ser Leu Phe
130 135 140
Lys Leu Gly Pro Gin íle Pro Ser Met Met Phe íle Asn Ser Pro Ser
145 150 155 160
Asn Pro Thr Gly Lys Val Leu Gly íle Pro His Leu Arg Lys Val Val
165 170 175
Lys Trp Ala Gin Glu Asn Asn Val íle Leu Ala Ala Asp Glu Cys Tyr
180 185 190
Leu Gly Leu Gly Trp Asp Asp Glu Asn Pro Pro íle Ser íle Leu Asp
195 200 205
Pro Arg Val Cys Asp Gly Asp His Thr Asn Leu íle Ala íle His Ser
210 215 220
Leu Ser Lys Thr Ser Asn Leu Ala Ser Tyr Arg Ala Gly Tyr Leu Val
225 230 235 240 • · ·· ·· ·· • ·· ···· ··· ··· · · ·· · · • ···· ·· · η ··· · • · · · · · · · ··· · ·· ·· ·· ·
Gly Asp Pro Ala Leu íle Gly Glu Leu Thr Glu Val Arg Lys Asn Leu
245 250 255
Gly Leu Met Val 260 Pro Phe Pro íle Gin 265 Gin Ala Met íle Ala 270 Ala Leu
Asn Asp Asp 275 Asp Gin Glu Ala Gly 280 Gin Lys Leu Thr Tyr 285 Ala íle Arg
Arg Ala 290 Lys Leu Met Arg Ala 295 Leu Leu Glu Ser Gly 300 Phe Gin Val Asp
Asn 305 Ser Glu Ala Gly Leu 310 Tyr Leu Trp Ala Thr 315 Arg Glu Glu Pro Cys 320
Arg Asp Thr Val Asp 325 Trp Phe Ala Glu Arg 330 Gly íle Leu Val Ala 335 Pro
Gly Asp Phe Tyr 340 Gly Pro Arg Gly Ala 345 Gin His Val Arg Val 350 Ala Met
Thr Glu Thr Asp Glu Arg Val Asp Ala Phe Val Ser Arg Leu Ser
355 360 365 <210> 3 <211> 1300 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220>
<221> CDS <222> (91)..(1191) <223> Alela dapC <400> 3 gggctcccca ggtggtgcgg ctaagcttgg accacaagat tttgatcacc caatgatcgc 60 tgcgctgccg cctcaggcat aatctaacgc atg acc tct cgc acc ccg ctt gtt 114 Met Thr Ser Arg Thr Pro Leu Val
5
tct Ser gtt Val 10 ctt Leu cct Pro gat ttt ccg tgg gat Asp tcg ctc get tcc gca aaa gcc 162
Asp Phe Pro Trp 15 Ser Leu Ala 20 Ser Ala Lys Ala
aaa get gcg tct cac ccg gat ggg atc gtg aat ctt tct gtt ggc act 210
Lys Ala Ala Ser His Pro Asp Gly íle Val Asn Leu Ser Val Gly Thr
25 30 35 40
ccg gtt gat ccg gtc gcg ccc age att cag atc gcg ttg gca gaa gca 258
Pro Val Asp Pro Val Ala Pro Ser íle Gin íle Ala Leu Ala Glu Ala
45 50 55
gcg ggg ttt tcg ggt tac cct caa acc atc ggc acc ccg gaa ctc cgc 306
Ala Gly Phe Ser Gly Tyr Pro Gin Thr íle Gly Thr Pro Glu Leu Arg
60 65 70
• · ···· ·· • · · · · ·· • · · · · • · · · ·· ·· ·· ·· ·· ·
gca Ala gcc Ala atc agg ggc gcg ctt gag cgg cgc tac aac atg aca aag ctt Glu Arg Arg Tyr Asn Met Thr Lys Leu 354
íle Arg Gly 75 Ala Leu
80 85
gtc gac gcc t CC ctc ctc CCC gtc gtg ggt acc aag gag gca att gcc 402
Val Asp Ala Ser Leu Leu Pro Val Val Gly Thr Lys Glu Ala íle Ala
90 95 100
ctt ctt cca ttc gcg ttg ggt att tcc ggc acc gtt gtc atc cca gag 450
Leu Leu Pro Phe Ala Leu Gly lle Ser Gly Thr Val Val lle Pro Glu
105 110 115 120
att gcg tac cca acc tac Tyr gaa gtc get gtc gtg gcc gca gga tgc acc 498
íle Ala Tyr Pro Thr 125 Glu Val Ala Val 130 Val Ala Ala Gly Cys Thr 135
gtg ttg cgt tct gat tcg ctg ttt aag ctc ggc ccg cag atc ccg tcg 546
Val Leu Arg Ser Asp Ser Leu Phe Lys Leu Gly Pro Gin íle Pro Ser
140 145 150
atg atg ttt atc aac tca cca tcc aac CCC aca ggc aag gtt ctg ggc 594
Met Met Phe íle Asn Ser Pro Ser Asn Pro Thr Gly Lys Val Leu Gly
155 160 165
atc cca cac ttg cgc aag gtt gtg aag tgg gcg cag gaa aac aac gtg 642
íle Pro His Leu Arg Lys Val Val Lys Trp Ala Gin Glu Asn Asn Val
170 175 180
atc ctc gca get gat gaa tgc tac ttg ggt ctt ggc tgg gac gat gaa 690
íle Leu Ala Ala Asp Glu Cys Tyr Leu Gly Leu Gly Trp Asp Asp Glu
185 190 195 200
aac cca ccg atc tca att ttg gat cta cgt gtc tgc gat ggc gac cac 738
Asn Pro Pro íle Ser íle Leu Asp Leu Arg Val Cys Asp Gly Asp His
205 210 215
acc aac ttg atc gcc att cac tcg ctg tct aaa acc tca aac ctc get 786
Thr Asn Leu lle Ala íle His Ser Leu Ser Lys Thr Ser Asn Leu Ala
220 225 230
tct tac cgc gca ggt tac ctc gtt ggc gat cca gcg ctg att ggt gaa 834
Ser Tyr Arg Ala Gly Tyr Leu Val Gly Asp Pro Ala Leu íle Gly Glu
235 240 245
ctc acg gaa gtc cgt aag aac ttg ggt ctc atg gtt cct ttc cca atc 882
Leu Thr Glu Val Arg Lys Asn Leu Gly Leu Met Val Pro Phe Pro íle
250 255 260
cag cag gcc atg atc gca gcc ctc aac gac gat gac caa gag gca ggg 930
Gin Gin Ala Met íle Ala Ala Leu Asn Asp Asp Asp Gin Glu Ala Gly
265 270 275 280
cag aag ctc acc tac gcg att cgt ega gca aaa ctc atg cgc gcc ctg 978
Gin Lys Leu Thr Tyr 285 Ala íle Arg Arg Ala Lys 290 Leu Met Arg Ala 295 Leu
ttg gaa tcc ggc ttt cag gta gat aat tct gaa gcg ggt ctg tac ctc 1026
Leu Glu Ser Gly Phe Gin Val Asp Asn Ser Glu Ala Gly Leu Tyr Leu
300 305 310 • · ···· ·· ·· ·· • · ·· • · • · ·· ·« • · ·· ·
3S
tgg Trp gcg acg cgt gaa gaa cct tgc cgt gac act gtc gat tgg ttc get 1074
Ala Thr 315 Arg Glu Glu Pro Cys 320 Arg Asp Thr Val Asp 325 Trp Phe Ala
gag cgt ggc att ctc gtt gcc cca gga gac ttc tat ggc cct cgc gga 1122
Glu Arg Gly íle Leu Val Ala Pro Gly Asp Phe Tyr Gly Pro Arg Gly
330 335 340
gcg cag cat gtg cgt gtg gcg atg acc gaa acc gac gag cgc gtc gac 1170
Ala Gin His Val Arg Val Ala Met Thr Glu Thr Asp Glu Arg Val Asp
345 350 355 360
gcc ttt gtt tct cgc ctg age taaacacgac taagettatt ttgtttaatt 1221
Ala Phe Val Ser Arg Leu Ser
365
gagtttgaag ttttccgtcg aaagaggcca tttgagttcc gagtccagtc ctgagtcgag 1281 taccgagcaa aaaacctgg 1300 <210> 4 <211> 367 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum
<400> 4 Met Thr Ser Arg Thr Pro Leu Val Ser Val Leu Pro Asp Phe Pro Trp
1 5 10 15
Asp Ser Leu Ala 20 Ser Ala Lys Ala Lys Ala Ala 25 Sér His Pro Asp Gly 30
íle Val Asn Leu 35 Ser Val Gly Thr Pro Val Asp 40 Pro Val Ala Pro Ser 45
íle Gin íle Ala 50 Leu Ala Glu Ala Ala Gly Phe 55 Ser Gly Tyr Pro Gin 60
Thr íle Gly Thr 65 Pro Glu Leu Arg Ala Ala íle 70 75 Arg Gly Ala Leu Glu 80
Arg Arg Tyr Asn Met 85 Thr Lys Leu Val Asp Ala 90 Ser Leu Leu Pro Val 95
Val Gly Thr Lys 100 Glu Ala íle Ala Leu Leu Pro 105 Phe Ala Leu Gly íle 110
Ser Gly Thr Val 115 Val íle Pro Glu íle Ala Tyr 120 Pro Thr Tyr Glu Val 125
Ala Val Val Ala 130 Ala Gly Cys Thr Val Leu Arg 135 Ser Asp Ser Leu Phe 140
Lys Leu Gly Pro 145 Gin íle Pro Ser Met Met Phe 150 155 íle Asn Ser Pro Ser 160
Asn Pro Thr Gly Lys 165 Val Leu Gly íle Pro His 170 Leu Arg Lys Val Val 175
C ··'-' - 33 ·· • • • ·· • • · ···· • • · • • • · • • • · • · • · • · • ·
Lys Trp Ala Gin Glu Asn Asn Val íle Leu Ala Ala Asp Glu Cys Tyr
180 185 190
Leu Gly Leu Gly Trp Asp Asp Glu Asn Pro Pro íle Ser íle Leu Asp
195 200 205
Leu Arg Val Cys Asp Gly Asp His Thr Asn Leu íle Ala íle His Ser
210 215 220
Leu Ser Lys Thr Ser Asn Leu Ala Ser Tyr Arg Ala Gly Tyr Leu Val
• 225 230 235 240
Gly Asp Pro Ala Leu íle Gly Glu Leu Thr Glu Val Arg Lys Asn Leu
• 245 250 255
Gly Leu Met Val Pro Phe Pro íle Gin Gin Ala Met íle Ala Ala Leu
260 265 270
Asn Asp Asp Asp Gin Glu Ala Gly Gin Lys Leu Thr Tyr Ala íle Arg
275 280 285
Arg Ala Lys Leu Met Arg Ala Leu Leu Glu Ser Gly Phe Gin Val Asp
290 295 300
Asn Ser Glu Ala Gly Leu Tyr Leu Trp Ala Thr Arg Glu Glu Pro Cys
305 310 315 320
Arg Asp Thr Val Asp Trp Phe Ala Glu Arg Gly íle Leu Val Ala Pro
325 . 330 335
Gly Asp Phe Tyr Gly Pro Arg Gly Ala Gin His Val Arg Val Ala Met
340 345 350
Thr Glu Thr Asp Glu Arg Val Asp Ala Phe Val Ser Arg Leu Ser
355 360 365
<210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: primér· > · <220>
<223> Primér DapC (dCexl) <400> 5 gatctagaat tcgcctcagg cataatctaa cg 32 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> ľOpis umelej sekvencie: primér* • · ···· ·· • · ··· · • e ·· • · · · • · ·· • · · · • · · · ·· ·· ·· • · · • · • · · • · ·· · <220>
<223> Primér DapC (dCexna2) <400> 6 gatctatcta gacagaggac aaggcaatcg ga

Claims (20)

1. Izolovaný polynukleotid obsahujúci polynukleotidovú sekvenciu vybranú zo skupiny zahŕňajúcej
a) polynukleotid, ktorý je aspoň na 70 % identický s polynukleotidom, ktorý kóduje polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO 2,
b) polynukleotid, ktorý kóduje polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň na 70 % identická s aminokyselinovou sekvenciou SEQ ID NO 2,
c) polynukleotid, ktorý je komplementárny k polynukleotidom
a) alebo b), a
d) polynukleotid obsahujúci aspoň 15 za sebou nasledujúcich nukleotidov polynukleotidovej sekvencie a), b) alebo c).
2. Polynukleotid podía nároku 1, pričom týmto polynukleotidom je prednostne rekombinantné DNA, replikovatelná v koryneformných baktériách.
3. Polynukleotid podľa nároku 1, pričoír. týmto polynukleotidom je RNA.
4. Polynukleotid podľa nároku 2, obsahujúci sekvenciu nukleovej kyseliny znázornenú v SEQ ID NO 1.
5. Replikovatelná DNA podľa nároku 2 obsahujúca:
(i) nukleotidová sekvenciu znázornenú v SEQ ID NO 1 alebo • · ···· ·· ·· ·· • · · · · · · • · ·· t · • · ·· ··· · • · · · · · · ·«· · ·· ·· ·· · (ii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá zodpovedá sekvenciám (i) v oblasti degenerácie genetického kódu,alebo (iii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá hybridizuje so sekvenciami komplementárnymi k sekvenciánť (i) alebo (ii), a poprípade (iv) funkčne neutrálne mutácie so zmyslom v (i).
6. Vektor obsahujúci polynukleotid podľa nároku 1, najmä pXT-dapCexp, vyznačujúci sa tým, že reštrikčná mapa znázornená na obrázku 2, uložený pod označením DSM 13254 v Corynebacterium glutamicum.
7. Koryneformné baktérie slúžiace ako hostiteľské bunky, ktoré obsahujú vektor podľa nároku 6 alebo v ktorých sa zosilňuje gén zwal.
8. Spôsob ... výroby L-aminokyselín, najmä
L-lyzínu, vyznačujúci sa tým, že sa uskutočňujú nasledovné kroky:
a) fermentácia baktérií produkujúcich žiadanú
L-aminokyselinu, v ktorých sa zosilňuje aspoň gén dapC,
b) koncentrovanie žiadaného produktu v médiu alebo v bunkách baktérií a
c) izolácia L-aminokyseliny.
9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačuj úci tým, že sa používajú baktérie, v ktorých sa prídavné zosilňujú ďalšie gény pre biosyntetickú dráhu žiadanej ·· • · · · é · • · · · • · · ·· · · • · ···· ·· • t ·· • · · · • · · ·· ··
L-aminokyseliny.
10. Spôsob podľa nároku 8,vyznačujúci sa tým, že sa používajú baktérie, v ktorých sa aspoň čiastočne eliminujú metabolické dráhy, ktoré znižujú tvorbu L-lyzínu.
11. Spôsob podlá jedného alebo viacerých z nárokov 8až 12, vyznačujúci sa tým, že sa používajú koryneformné baktérie, ktoré produkujú L-lyzín.
12. Spôsob podlá nároku 8,vyznačujúci sa tým, že na výrobu L-lyzínu sa fermentujú baktérie, v ktorých sa prídavné ku génu dapC súčasne zosilňuje, najmä nadmerne exprimuje alebo amplifikuje jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej
12.1 gén lysC kódujúci aspartátkinázu rezistentnú na spätnú väzbu,
12.2 gén asd kódujúci aspartátsemialdehyddehydrogenázu,
12.3 gén dapA kódujúci dihydrodipikolinátsyntázu,
12.4 gén dapB kódujúci dihydrodipikolinátreduktázu,
12.5 gén dapD kódujúci tetrahydrodipikolinátsukcinylázu,
12.6 gén dapE kódujúci N-sukcinyiaminopimelátdesukcinylázu,
12.7 gén dapF kódujúci diaminopimelátepimerázu ·· · · · · · · · · • · · ···· ·· • . ···· ·· ·· ··· a • · ······ ··· · ·· a· aa a
12.8 gén lysA kódujúci diaminopimelátdekarboxylázu,
12.9 gén ddh kódujúci diaminopimelátdehydrogenázu,
12.10 gén lysE kódujúci export lyzínu,
12.11 gén pyc kódujúci pyruvátkarboxylázu, %
12.12 gén mqo kódujúci malátchinónoxidoreduktázu,
12.13 gén zwal,
12.14 gén gdh kódujúci glutamátdehydrogenázu.
13. Spôsob podľa nároku 8,vyznačujúci sa tým, že na výrobu L-lyzínu sa fermentujú baktérie, v ktorých sa súčasne zoslabuje jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej
13.1 gén pck kódujúci fosfoenolpyruvátkarboxykinázu,
13.2 gén pgi kódujúci glukóza-6-fosfátizomerázu,
13.3 gén poxB kódujúci pyruvátoxidázu,
13.4 gén zwa2,
13.5 gén sucC alebo sucD kódujúci sukcinyl-CoA-syntetázu.
14. Spôsob podlá jedného alebo viacerých z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že sa používajú mikroorganizmy rodu Corynebacterium glutamicum.
• ·
99 9 • · · a ···· • · ··· · ·· ·· • · · · a · ·· • · · · · a · · · oa ·· ·· ·
15. Použitie polynukleotidových sekvencii podlá nároku 1 ako hybridizačné sondy na izoláciu cDNA, ktorá kóduje génový produkt dapC.
16. Použitie polynukleotidových sekvencii podľa nároku 1 ako hybridizačné sondy na izoláciu cDNA alebo génov, ktoré vykazujú veľkú podobnosť so sekvenciou génu dapC.
17. DNA pochádzajúca z koryneformných baktérií, ktorá kóduje enzýmový proteín N-sukcinylaminoketopimeláttransaminázu, ktorého aminokyselinová sekvencia (SEQ ID No. 2) obsahuje v polohe 209 akúkoľvek aminokyselinu s výnimkou L-prolínu.
18. DNA podľa nároku 17,vyznačujúca sa tým, že kóduje enzýmový proteín N-sukcinylaminoketopimeláttransaminázu, ktorého aminokyselinová sekvencia obsahuje v polohe 209 L-leucín, znázornený v SEQ ID No. 4.
19. DNA podľa nároku 18,vyznačuj úca sa tým, že v polohe 716 obsahuje nukleovú bázu tymín, znázornený v SEQ ID No. 3.
20. Koryneformné baktérie, ktoré obsahujú DNA podľa nároku 17, 18 alebo 19.
SK338-2001A 2000-03-23 2001-03-12 Nucleotide sequences coding for the dapc gene and process for the preparation of l-lysine SK3382001A3 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10014546A DE10014546A1 (de) 2000-03-23 2000-03-23 Für das dapC-Gen kodierende Nukleotidsequenzen und Verfahren zur Herstellung von L-Lysin

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK3382001A3 true SK3382001A3 (en) 2001-12-03

Family

ID=7636124

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK338-2001A SK3382001A3 (en) 2000-03-23 2001-03-12 Nucleotide sequences coding for the dapc gene and process for the preparation of l-lysine

Country Status (18)

Country Link
US (2) US6740742B2 (sk)
EP (1) EP1136559B1 (sk)
JP (1) JP2001299372A (sk)
KR (1) KR20010090510A (sk)
CN (1) CN100523193C (sk)
AT (1) ATE465259T1 (sk)
AU (1) AU2816301A (sk)
BR (1) BR0101151B1 (sk)
CA (1) CA2339307A1 (sk)
DE (2) DE10014546A1 (sk)
DK (1) DK1136559T3 (sk)
ES (1) ES2344248T3 (sk)
HU (1) HUP0101166A3 (sk)
ID (1) ID29693A (sk)
MX (1) MXPA01002860A (sk)
PT (1) PT1136559E (sk)
SK (1) SK3382001A3 (sk)
ZA (1) ZA200102385B (sk)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030157642A1 (en) * 1997-07-15 2003-08-21 Caldwell Robert M. Increasing production of proteins in gram-positive microorganisms
JP3965821B2 (ja) * 1999-03-09 2007-08-29 味の素株式会社 Ｌ−リジンの製造法
US20020086371A1 (en) * 1999-07-07 2002-07-04 Degussa-Huls Aktiengesellschaft L-lysine-producing corynebacteria and process for the preparation of L-lysine
DE10101501A1 (de) * 2001-01-12 2002-08-01 Forschungszentrum Juelich Gmbh Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pantothensäure
WO2006112000A1 (ja) * 2005-03-30 2006-10-26 The Niigata Institute Of Science And Technology 大腸菌変異株による２－デオキシ－シロ－イノソースの合成および精製する方法並びに得られた２－デオキシ－シロ－イノソース
EP2066782A4 (en) * 2006-09-15 2010-02-03 Cj Cheiljedang Corp CORYNEBACTERIA WITH IMPROVED L-LYSINE PRODUCTIVITY AND METHOD FOR THE PREPARATION OF L-LYSINE THEREWITH
KR100830826B1 (ko) * 2007-01-24 2008-05-19 씨제이제일제당 (주) 코리네박테리아를 이용하여 글리세롤을 포함한탄소원으로부터 발효산물을 생산하는 방법
KR101126041B1 (ko) * 2008-04-10 2012-03-19 씨제이제일제당 (주) 트랜스포존을 이용한 형질전환용 벡터, 상기 벡터로형질전환된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산방법
US8932861B2 (en) 2008-04-10 2015-01-13 Cj Cheiljedang Corporation Transformation vector comprising transposon, microorganisms transformed with the vector, and method for producing L-lysine using the microorganism
GB2462645A (en) * 2008-08-15 2010-02-17 Advanced Technologies Modification of plant threonine production by aspartate kinase
DE102010019059A1 (de) * 2010-05-03 2011-11-03 Forschungszentrum Jülich GmbH Sensoren zur intrazellulären Metabolit-Detektion
CN103270155B (zh) * 2010-10-28 2016-02-10 安迪苏法国联合股份有限公司 2,4-二羟基丁酸的生产方法
CN102787106A (zh) * 2011-12-29 2012-11-21 西藏金稞集团有限责任公司 发酵法制取谷氨酸脱氢酶的工艺

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0655149B2 (ja) * 1985-03-12 1994-07-27 協和醗酵工業株式会社 Ｌ―リジンの製造法
JPH07155184A (ja) * 1993-12-08 1995-06-20 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−リジンの製造法
US20030049804A1 (en) * 1999-06-25 2003-03-13 Markus Pompejus Corynebacterium glutamicum genes encoding metabolic pathway proteins
KR100878334B1 (ko) * 1999-06-25 2009-01-14 백광산업 주식회사 대사 경로 단백질을 코딩하는 코리네박테리움 글루타미쿰유전자
JP4623825B2 (ja) * 1999-12-16 2011-02-02 協和発酵バイオ株式会社 新規ポリヌクレオチド

Also Published As

Publication number Publication date
ES2344248T3 (es) 2010-08-23
CN100523193C (zh) 2009-08-05
US6740742B2 (en) 2004-05-25
HUP0101166A3 (en) 2005-12-28
DK1136559T3 (da) 2010-08-02
CN1319668A (zh) 2001-10-31
ID29693A (id) 2001-09-27
PT1136559E (pt) 2010-07-14
MXPA01002860A (es) 2002-08-06
KR20010090510A (ko) 2001-10-18
US20050100927A1 (en) 2005-05-12
US7759056B2 (en) 2010-07-20
BR0101151A (pt) 2001-10-30
DE10014546A1 (de) 2001-09-27
US20010049123A1 (en) 2001-12-06
EP1136559A3 (de) 2003-12-10
JP2001299372A (ja) 2001-10-30
EP1136559B1 (de) 2010-04-21
EP1136559A2 (de) 2001-09-26
BR0101151B1 (pt) 2014-12-30
AU2816301A (en) 2002-07-25
ATE465259T1 (de) 2010-05-15
DE50115438D1 (de) 2010-06-02
HUP0101166A2 (hu) 2003-08-28
ZA200102385B (en) 2001-09-26
CA2339307A1 (en) 2001-09-23
HU0101166D0 (en) 2001-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK18342000A3 (sk) Nukleotidové sekvencie kódujúce gén zwa1 a spôsoby fermentačnej výroby l-aminokyselín
US7759056B2 (en) Nucleotide sequence encoding the dapC gene and process for the production of L-lysine
SK14582000A3 (sk) Nukleotidové sekvencie kódujúce gén eno
US6759218B2 (en) Nucleotide sequences coding for the glbO gene
WO2002024915A1 (en) Dcta (c4-dicarboxylate transporter) from corynebacterium glutamicum
SK362001A3 (en) Nucleotide sequences which code for the ptsh gene
US6913910B2 (en) Nucleotide sequences coding for the glk-gene
US6818432B2 (en) Nucleotide sequences encoding the ptsH gene
US6806068B1 (en) Nucleotide sequences which encode the pfk gene
SK17372000A3 (sk) Nukleotidové sekvencie kódujúce gén pfka
US7306939B2 (en) Nucleotide sequences encoding the gpm gene
US6680186B2 (en) Nucleotide sequences which encode plsC gene
US20020055154A1 (en) Nucleotide sequences which code for the acp gene
US20020107379A1 (en) Nucleotide sequences coding for the thyA gene
US6987015B1 (en) Nucleotide sequences encoding the pfkA gene
EP1311683B1 (en) Nucleotide sequences which code for the csta gene from corynebacterium glutamicum
US6638753B2 (en) Nucleotide sequences which code for the cma gene
US20020034794A1 (en) Nucleotide sequences which encode the gpsA gene
US20020155555A1 (en) Nucleotide sequences which code for the pgsA2 gene
KR20020097245A (ko) ｃｄｓＡ 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열
KR20020097250A (ko) ｃｍａ 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열