BR0101151B1 - "vetor contendo a sequência de nucleotídeos que codifica o gene dapc, sua bactéria corineforme e processo de produção de l-lisina". - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VETOR CONTENDO A SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS QUE CODIFICA O GENE DAPC, SUA BACTÉRIA CORINEFORME E PROCESSO DE PRODUÇÃO DE L-LISINA". A invenção proporciona seqüências de nucleotídeos que codificam para o gene dapC e processos para a produção por fermentação da L-lisina, com a utilização de bactérias corineformes nas quais o gene dapC (gene N-succinilaminocetopimelato transaminase) é aumentado, de forma específica expresso em excesso. Técnica Anterior Os aminoácídos, de modo específico a L-lisina, são usados na medicina humana e na indústria farmacêutica, porém de forma especifica na nutrição de animais. É sabido que os aminoácídos são produzidos pela fermentação de cepas da bactéria corineforme, e especifica mente da Corynebacterium glutami-cum. Devido a sua grande significação, têm sido feitos constante mente esforços para melhorar o processo de produção. Os aperfeiçoamentos no processo podem se relacionar com medidas que dizem respeito à tecnologia da fermentação, por exemplo a agitação e o suprimento de oxigênio, ou a oomposição do meio de nutrição, tal como por exemplo a concentração do açúcar durante a fermentação, ou trabalhar o produto, por exemplo por cromatografia de troca de íon, ou para as características intrínsecas do desempenho do próprio microorganismo.

As características de desempenho dos microorganismos são aumentadas com a utilização dos métodos de mutagênese, seleção e seleção mutante. Desse modo, são obtidas cepas que são resistentes aos anti-metabólitos, tais como por exemplo o análogo da lisina S-(2-aminoetil) cisterna, ou são auxotróficos para os metabólitos reguladores significativos e produzem L-aminoácidos, tais como, por exemplo a L-lisina, Durante alguns anos, os métodos para a tecnologia de DNA reco mbi na nte também foram usados da mesma forma para aperfeiçoar as cepas de Corynebacterium pela amplificação dos genes da biossíntese de a-minoácidos individuais e para investigar o efeito sobre a produção do ami- noácido. Artigos de revisão sobre este assunto podem ser encontrados entre outros em Kinoshita ("Glutamic Acid Bactéria", em: Biology of Indústrial Mi-croorganims, Demain e Solomon (Eds.), Benjamim Cummings, Londres, Inglaterra, 1985, 115 a 142), Hillinger (BioTec 2, 40 a 44 (1991)), Eggeling (Amino Acids 6: 261 a 272 (1994)), Jetten e Sinskey (Criticai Reviews in Bi-otechnology 15, 73 a 103 (1995)) e Sahm et al., (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25 a 39 (1996)).

Objetivo da Invenção Os inventores estabeleceram para si próprios o objetivo de proporcionar novas medidas para a produção por fermentação melhorada da L-lisina.

Descrição Detalhada da Invenção A L-lisina é usada na medicina humana, na indústria de produtos farmacêuticos e de forma específica na nutrição de animais. Existe, por conseguinte um interesse geral em proporcionar novos processos aperfeiçoados para a produção da L-lisina.

Qualquer menção subsequente da L-lisina deve ser levada em conta como significando não somente a base, porém também os sais, tais como por exemplo o monocloridrato de lisina ou o sulfato de lisina. A invenção proporciona um polinucleotídeo isolado a partir da bactéria corineforme que contém pelo menos uma sequência de polinucleo-tídeo selecionada a partir do grupo de: a) um polinucleotídeo que seja pelo menos 70% idêntico a um polinucleotídeo que codifique para um polipeptídio que contenha a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO. 2, b) um polinucleotídeo que codifique para um polipeptídio que contenha a seqüência de aminoácidos que seja pelo menos 70% idêntico à seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO. 2, c) um polinucleotídeo que seja complementar aos polinucleotídeos de a), b), ou d) um polinucleotídeo que contenha pelo menos 15 nucleotídeos sucessivos das seqüências de polinucleotídeos de a), b) ou c). A invenção também proporciona o polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, na qual ele de preferência compreende um DNA re-plicável contendo: (i) a seqüência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID no. 1, ou (ii) pelo menos uma seqüência que se iguale à seqüência (i) no interior da faixa de degeneração do código genético, ou (iii) pelo menos uma seqüência que se hibridize com a seqüência complementar às seqüências (i) ou (ii), e de modo opcional (iv) mutações de sentido funcionalmente neutras em (i). A invenção proporciona: um polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 4, que contém a seqüência de nucleotídeo como mostrada na SEQ ID NO. 1, um polinucleotídeo que codifica para um polipeptídio que contém a seqüência de aminoácidos como mostrada na SEQ ID NO. 2, um vetor que contem o polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, de forma específica um vetor de vaivém ou o vetor de plasmídio pXT-dapCexp, que está mostrado na Figura 2 e está depositado sob o número DSM 13254 na DSM 5715, e bactéria corineforme atuando como a célula hospedeira que contém o vetor. A invenção também proporciona polinucleotídeos que consistem de forma substâncial em uma seqüência de polinucleotídeo, que são obtidos pela triagem por meio de hibridização de um conjunto de genes adequados, que contenham o gene completo que tenha a seqüência de polinucleotídeo de acordo com a SEQ ID NO.1, com uma sonda que contenha a seqüência de polinucleotídeo determinada de acordo com a SEQ ID NO.1, ou um fragmento da mesma, e o isolamento da seqüência de DNA determinada.

As seqüências de polinucleotídeos de acordo com a invenção são além disso adequadas como sondas de hibridização para RNA, cDNA e DNA com a finalidade de isolar o cDNA de comprimento completo que codifica para N-succinilamino cetopimelato transaminase e para isolar esses cDNA ou genes, a seqüência dos quais exibe um nível elevado de similari- dade com aquela do gene da N-succinilamino cetopimelato transaminase.

As seqüências de polinucleotídeos de acordo com a invenção são, além disso, adequadas como inibidoras para a produção de DNA ou de genes que codifiquem para a N-succinilamino cetopimelato transaminase através da reação em cadeia da polimerase (PCR).

Esses nucleotídeos que agem como sondas ou iniciadores contém, pelo menos 30, de preferência pelo menos 20, de preferência muito específica pelo menos 15 nucleotídeos sucessivos. Os oligonucleotídeos que têm um comprimento de pelo menos 40 ou 50 nucleotídeos também são adequados. "Isolado" significa separado do seu meio ambiente natural. "Polinucleotídeo" de um modo geral se refere a poli ribonucleotí-deos, nos quais o RNA ou o DNA podem ser não modificados ou modificados. "Polipeptídios" são tomados para significar peptídios ou proteínas que contém dois ou mais aminoácidos ligados por ligações de peptídio.

Os polipeptídios de acordo com a invenção incluem um poli-peptídio de acordo com a SEQ ID NO. 2, de forma específica aqueles que tenham a atividade biológica da N-succinilamino cetopimelato transaminase e também aqueles que são pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, idênticos ao polipeptídio de acordo com a SEQ ID NO. 2, e de modo específico sejam pelo menos de 90 a 95% idênticos ao polipeptídio de acordo com a SEQ ID NO. 2 e exibam a atividade relatada. A invenção além disso se refere a um processo para a produção por fermentação de aminoácidos, de forma específica da L-lisina, com a utilização da bactéria corineforme, a qual já produz especificamente um amino-ácido e na qual as seqüências de nucleotídeos que codificam para o gene dapC são aumentadas, e de forma específica expressas em excesso.

Nesta conexão o termo "aumento " descreve o aumento na atividade intracelular de uma ou mais enzimas em um microorganismo, cujas enzimas são codificadas pelo DNA correspondente, por exemplo pelo aumento do número de cópias do gene ou genes, através da utilização de um promotor forte ou um gene que codifique para uma enzima correspondente que tenha uma atividade elevada e, de modo opcional pela combinação de tais medidas.

Os microorganismos proporcionados pela presente invenção podem produzir L-aminoácidos, de modo especial a L-lisina, a partir da glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, amido, celulose ou a partir de glicerol e etanol. Os microorganismos podem compreender representantes da bactéria corineforme e, de modo específico do gênero Corynebacte-rium. Dentro do gênero Corynebacterium, a espécie Corynebacterium gluta-micum pode ser mencionada de forma específica, que é conhecida nos círculos de versados pela sua capacidade de produção de L-aminoácidos.

As cepas adequadas do gênero Corynebacterium, e de forma específica da espécie Corynebacterium glutamicum, são, por exemplo as cepas conhecidas do tipo natural: Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 Corynebacterium termoaminogenes FERM BP -1539 Corynebacterium melassecola ATCC 17965 Brevibacterium flavum ATCC 14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 e Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 e os mutantes que produzem a L-lisina ou as cepas produzidas a partir dos mesmos, tais como, por exemplo Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709 Brevibacterium flavum FERM-P 1708 Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 Corynebacterium glutamicum DSM 5715 Corynebacterium glutamicum DSM 12866 e Corynebacterium glutamicum DM 58-1.

Os inventores tiveram êxito em isolar o novo gene dapC, que codifica para a enzima da N-succinil amino cetopimelato transaminase (EC 2.6.1.17), a partir do C. glutamicum. O gene dapC ou também outros genes da C. glutamicum são isolados por inicialmente construindo um conjunto de genes desse microorganismo em E. coli. A construção dos conjuntos de genes está descrita de um modo geral em livros de texto e manuais conhecidos. Os exemplos que podem ser mencionados são o livro de texto por Winnacker, Gene und Klo-ne, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Alemanha, 1990) ou o manual por Sambrook et al., Molecular Cloning, A Labo-ratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Um conjunto de genes bastante conhecido á aquele da cepa K-12 W 3110 do E. coli, que foi construída por Kohara et al., (Cell 50, 495 - 508 (1987)) em vetores λ. Bathe et al., (Molecular and General Genetics, 252: 255 a 265, 1996) descreve uma biblioteca de genes da C. glutamicum ATCC 13032, que foi construído com a utilização do vetor cosmídio SuperCos I (Wahl et al., 1987, Procee-dings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160 - 2164) na cepa K-12 NM554 do E. coli (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563 - 1575). Bõrmann et al. (Molecular Microbiology 6 (3), 317 - 326,1992)) também descreve uma biblioteca de genes da C. glutamicum ATCC 13032, com a utilização do cosmídio pHC79 (Hohn and Collins, Gene, 11, 291 - 298 (1980)). Uma biblioteca de genes da C. glutamicum em E. coli também pode ser produzida com a utilização de plasmídios tais como o pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807 -818 (1979)) ou pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259 - 268). Os hospedeiros adequados são de modo específico aquelas cepas de E. coli com defeitos de restrição e de recombinação. Um exemplo de uma tal cepa é a cepa DH5amcr, que foi descrita por Grant et al. (Procee-dings of the National Academy of Sciences USA, 87: (1990) 4645 -4649). Os fragmentos longos de DNA clonados com a assistência dos cosmídios podem por sua vez ser sub-clonados em vetores usuais adequados para o se-qüenciamento e em seguida ser seqüenciados, como descrito por exemplo, em Sanger et al., (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463 - 5467, (1977). A nova seqüência de DNA a partir do C. glutamicum a qual codifica para o gene dapC e, como a SEQ ID NO. 1, é provida pela presente invenção, foi obtida desta maneira. A seqüência de aminoácidos da proteína correspondente também foi além disso deduzida a partir da seqüência de DNA acima com a utilização dos métodos descritos acima. A SEQ ID NO. 2 mostra a seqüência de aminoácidos resultante do produto do gene dapC. A codificação das seqüências de DNA que aparecem a partir da SEQ ID NO.1 devido à degenerescência do código genético também é provida pela invenção. As seqüências de DNA que se hibridizam com a SEQ ID NO.1 ou com partes de SEQ ID NO.1 também são proporcionadas pela invenção. As substituições conservadoras de aminoácidos em proteínas, por exemplo a substituição de glicina por alanina ou de ácido aspártico por ácido glutâmico são conhecidas nos círculos de versados como "mutações de sentido", as quais não resultam em mudanças fundamentais na atividade da proteína, isto é, elas são funcionalmente neutras. Além do mais é sabido que as mudanças para os terminais N e C de uma proteína não prejudicam de modo substâncial ou que possam ainda estabilizar a função da mesma. Uma pessoa versada na técnica encontrará informação com relação a esse assunto, inter alia, em Bem-Bassat et al., (Journal of Bacteriology 169 : 751 -757 (1987)), em 0’Regan et al., (Gene 77 : 237 - 251 (1989)), em Sahin-Toth et al., (Protein Sciences 3: 240 - 247 (1994), em Hochuli et al., (Bio/Technology 6: 1321 - 1325 (1988) e em livros didáticos conhecidos de genética e de biologia molecular. As seqüências de aminoácidos que aparecem de uma maneira correspondente a partir da SEQ ID NO. 2 também são proporcionadas pela invenção.

De modo similar, as seqüências de DNA que se hibridizam com a SEQ ID NO. 1 ou partes da SEQ ID NO. 1 também são proporcionadas pela invenção. Finalmente, as seqüências de DNA produzidas pela reação em cadeia da polimerase (PCR) com a utilização de iniciadores obtidos a partir da SEQ ID NO. 1 também são proporcionadas pela invenção. Esses oligonucleotídeos tem tipicamente um comprimento de pelo menos 15 nu- cleotídeos. A pessoa versada na técnica pode encontrar instruções para a identificação de seqüências de DNA por meio de hibridização inter alia no manual "The DIG System Users Guide for Filter Hibridization" da Roche Dia-gnostics GmbH (Mannheim, Alemanha, 1993) e em Lieb et al., (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255 - 260). A pessoa versada na técnica pode encontrar instruções para a amplificação de seqüências de DNA com a utilização da reação em cadeia de polimerase (PCR) inter alia no manual por Gait, Oligonucelotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, Inglaterra, 1984) e em Newton & Graham, PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemanha, 1994).

Foi descoberto que a bactéria corineforme produz a L-lisina de uma maneira aumentada uma vez que o gene dapC tenha sido expresso em excesso. A expressão em excesso pode ser conseguida pelo aumento do número de cópias dos genes correspondentes ou pela mutação da região promotora e reguladora do sítio de ligação com o ribossoma localizado a montante do gene estrutural. Os cassetes de expressão incorporados a montante do gene estrutural atuam da mesma maneira. È possível, de modo adicional o aumento da expressão durante a produção da L-lisina por fermentação por meio de promotores induzíveis. A expressão também, é aumentada por medidas para o prolongamento do tempo de vida do mRNA. A atividade da enzima é além do mais aperfeiçoada pela prevenção da degradação da proteína da enzima. Os genes ou o constucto de genes podem tanto estar presentes em plasmídios em um número de cópias variadas como estar integrados no cromossoma e amplificados. De modo alternativo, a expressão em excesso dos genes em questão também pode ser conseguida pela modificação da composição do meio e das condições de cultura. A pessoa versada na técnica poderá encontrar orientação com relação a este assunto, inter alia, em Martin et al., (Bio/Technology 3, 137 a 146 (1987)), em Guerrero et al., (Gene 138, 35 - 41 (1994)), Tsuchiya e Mo-rinaga (Bio/Technology 6, 428 a 430 (1988)), em Eikmanns et al., (Gene 102, 93 a 98 (1991)), na EP 0 472 869, Na U. S. 4.601.893, em Schwarzer e Pühler (Bio/Technology 9, 84 a 87 (1991)), em Reinscheid et al., (Applied and Environamental Microbiology 60, 126 a 132 (1994)), em LaBarre et al., (Journal of Bacteriology 175, 1001 a 1007 (1993)), na WO 96/15246, em Malumbres et al., (Gene 134, 15 a 24 (1993)), na JP-A-10-229891, em Jen-sen e Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191 - 195 (1998)), em Makrides (Microbiological Reviews 60: 512 - 538 (1996)) e em livros didáticos conhecidos de genética e de biologia molecular. A título de exemplo, o gene dapC de acordo com a invenção foi expresso em excesso com a assistência de plasmídios.

Os plasmídios adequados são aqueles que são replicados em bactérias corineformes. Numerosos vetores de plasmídios conhecidos, tais como por exemplo pZ1 (Menkel et al., Applied and Environamental Microbiology (1989) 64: 549 - 554, pEKExl (Eikmanns et al., Gene 102: 93 - 98 (1991)) ou pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107: 69 a 74 (1991)), são baseados nos plasmídios crípticos pHM1519 ou pGA1. Outros vetores de plasmídio tais como por exemplo aqueles com base em pCG4 (U. S. 4.489.160), ou pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters, 66, 119 a 124 (1990)), ou pAG1 (U.S.-A 5.158.891) podem ser usados da mesma maneira.

Um exemplo de um plasmídio por meio do qual o gene dapC pode ser expresso em excesso é o vetor de vaivém pXT-dapCexp. De E. coli - C. glutamicum. O vetor contém a região e replicação rep do plasmídio pGA1, incluindo o per efetuador de replicação (U.S.-A 5.175.108; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179, 1525 - 1532 (1997)), o gene tetA(Z), que confere resistência à tetraciclina, do plasmídio pAG1 (U.S.-A 5.158.891; depositado no GenBank no National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) com o número de acesso AF121000), junto com a origem da replicação, o promotor trc, as regiões de terminação T1 e T2 e o gene laclq (supressor do operon lac do E. coli) do plasmídio pTRC99A (Amann et al., (1988), Gene 69: 301 - 315). O vetor de vaivém pXT-dapCexp está mostrado na Figura 2.

Outros vetores de plasmídio adequados são aqueles com a as- sistência dos quais a amplificação do gene pode ser realizada por integração no interior do cromossoma, tal como por exemplo foi descrito por Reinscheid et al., (Applied and Environamental Microbiology 60, 126 a 132 (1994)) para a duplicação ou a amplificação do operon hom-thrB. Neste método o gene completo é clonado no interior de um vetor de plasmídio que pode ser replicado em um hospedeiro (tipicamente o E. coli), porém não na C. glutami-cum. Os vetores que podem ser considerados são, por exemplo, pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784 a 791 (1983)), pK18mob ou pK19mob (Schàfer et al., Gene 145, 69 a 73 (1994), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, Wl, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994), Journal of Biological Chemistry 269: 32678 - 84; US-A 5.487.993), pCR®Blunt (Invitrogen, Gro-ningen, Holanda; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534 a 541 (1993) ) ou o pEM1 (Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510 a 4516). O vetor plasmídio que contém o gene a ser amplificado é em seguida transferido para dentro da cepa desejada da C. glutamicum por conjugação ou transformação. O método de conjugação está descrito, por exemplo em Schàfer et al., (Applied and Environamental Microbiology 60, 756 a 759 (1994) ). Os métodos para a transformação estão descritos, por exemplo, em Thierbach et al., (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356 a 362 (1988)), Dunican e Shivnan (Bio/Technology 7, 1067 a 1070 (1989)) e em Tauch et al., (FEMS Microbiological Letters 123, 343 a 347)). Depois da re-combinação homologa por meio de "Crossing over", a cepa resultante contem, pelo menos duas cópias do gene em questão.

Além do mais, foi descoberto que, pela substituição do aminoácido L-prolina na posição 209 da proteína da enzima (c. f. A SEQ ID NO. 2) com outro aminoácido gerador de proteína, de modo específico a L-íeucina (c. f. SEQ ID NO. 4), com a exceção da L-prolina, ocorre o aumento e a bactéria corineforme que tem a substituição do aminoácido correspondente produz o L-lisina de uma maneira melhorada. A substituição da L-prolina pela L-leucina na posição 209 pode, de preferência ser conseguida pela substituição da citosina do núcleo de base na posição 716 por timina, como mostrado na SEQ ID NO.3. A mutagênese pode ser realizada por métodos convencionais de mutagênese com a utilização de mutágenos tal como por exemplo N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina ou luz ultravioleta. A mutagênese também pode ser realizada através da utilização de métodos in vitro tais como por exemplo o tratamento com hidróxilamina (Molecular and General Genetics 145, 101 pp (1978)) ou oligonucleotídeos mutagênicos (T. A. Brown: Gentechnologie für Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993), ou a reação em cadeia de polimerase (PCR), como está descrito no manual por Newton e Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1994). A invenção por conseqüência também é bactéria corineforme que contém a proteína da enzima N-succinil amino cetopimelato transamina-se, na qual a seqüência do aminoácido mostrada na SEQ ID NO. 2 na posição 209, é substituído com outro aminoácido, com a exceção de L-prolina. Outro aspecto da invenção também é a bactéria corineforme que contém uma proteina de enzima respectiva, no qual o aminoácido L-prolina, na posição 209 da proteína da enzima (c. f. SEQ ID NO.2) é substituído com L-leucina (c. f. SEQ ID NO. 4).

Objeto da invenção é em conseqüência seqüências de polinu-cleotídeos, provindos de bactérias corineformes, que contêm genes que codificam proteínas de enzima para as assim chamadas N-succinil-aminocetopimelat-transaminase. A invenção, além disso proporciona bactérias corineformes que contêm o DNA que codifica para a N-succinil amino cetopimelato transamin-se, no qual a substituição da L-prolina pela L-leucina na posição 209 continua pela substituição da citosina da base do núcleo na posição 716 (cf. SEQ ID NO. 1) com timina, como mostrado na SEQ ID NO, 3.

Pode ser adicionalmente vantajoso para a produção da L-lisina a amplificação ou a sobre expressão não só do gene dapC, mas também de uma ou mais enzimas do trajeto bio sintético específico, de glicólise, de metabolismo anaplerótico, ou de exportação de aminoácido.

Para a produção da L-lisina, por exemplo, é possível dessa forma em adição ao gene dapC, de forma simultânea, para aumentar, e espe- cificamente sobre expressar ou amplificar, um ou mais genes selecionados a partir do grupo . o gene lysC que codifica para uma aspartato quinase resistente a retro alimentação (Kalinowski et al., (1990), Molecular and General Gene-tics, 224, 317 a 324), . o gene asd, que codifica para a desidrogenase do semialdeído do aspartato (EP-A 0 219 027; Kalinowski et al., (1991), Molecular Microbio-logy 5: 1197 a 1204, e Kalinowski et al., (1991), Molecular Microbiology 224: 317 a 324), . o gene dapA que codifica para a sintase do diidro picolinato (EP-B 0197 335), . o gene dapB que codifica para a redutase do diidro picolinato (número de entrada de acesso no GenBank X 67737; Pisabarro et al., (1993), Journal of Bacteriology, 175 (9): 2743 a 2749, . o gene dapD que codifica para a succinilase do tetraedro dipi-colinato (número de entrada de acesso no GenBank AJ004939; Werhmann et al., (1998), Journal of Bacteriology, 180: 3159 a 3163, . o gene dapE que codifica para a dessuccinilase do N-succinildiamino pimelato (número de entrada de acesso no GenBank X 81379; Werhmann et al., (1994), Microbiology 140: 3349 a 3356), . o gene dapF que codifica para a epimerase do diaminopimelato (DE: 199 43 587.1, DSM 12968), . o gene lysA que codifica para a descarboxilase do diamino pimelato (número de entrada de acesso no GenBank X 0-7563; Yeh et al., (1988), Molecular and General Genetics, 212: 112 a 119), . o gene ddh que codifica para a desidrogenase do diamino pimelato (Ishino et al., (1988), Agricultural and Biological Chemistry 52 (11): 2903 a 2909), . o gene lysE que codifica para a exportação da lisina (DE-A-195 48 222), . o gene pyc que codifica para a carboxilase do piruvirato (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076 a 6086), . o gene mqo, que codifica para a oxirreductase de mala-to:quinona (Molenaar et al., (1998), European Journal of Biochemistry 254: 395 - 403), . o gene zwa1 (DE: 19959328.0, DSM 13115), . o gene gdh, que codifica para a desidrogenase do glutamato (Bõrmann et al., (1992), Molecular Microbiology 6, 317 a 326). É de preferência intensificar de forma simultânea um ou mais genes selecionados a partir do grupo dapD, dapE e dapF.

Pode além do mais ser vantajoso para a produção da L-lisina, em adição ao incremento do gene dapC, em combinação de modo opcional com um ou mais genes selecionados a partir do grupo dapD, dapE e dapF, atenuar de modo simultâneo . o gene pck, que codifica para a carbóxi cinase do fosfoenol pi-ruvirato (DE 199 50 409.1, DSM 13047) ou . o gene pgi, que codifica para a isomerase do 6-fosfato de glicose (U.S. 09/396.478, DSM 12969), ou . o gene poxB, que codifica para a oxidase do piruvirato (DE: 19951975.7, DSM 13114), ou . o gene zwa2 (DE: 19959327.2, DSM 13113), ou . os genes sucC ou sucD que codificam para a sintase do succi-nilCoA (DE: 19956686.0).

Pode ainda ser vantajoso para a produção da L-lisina, além do aumento do gene dapC, de modo opcional em combinação com um ou mais genes selecionados a partir do grupo dapD, dapE e dapF suprimir as reações secundárias indesejáveis (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Produ-cing Micro-organisms", em "Over-production of Microbial Products, Krum-phanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londres, Inglaterra, 1982).

Para a finalidade da produção da L-lisina, os microorganismos produzidos de acordo com a invenção podem ser cultivados de forma contínua ou de forma descontínua com a utilização do processo de batelada ou do processo de alimentação de lotes ou o processo de alimentação repetida de lotes. Um resumo de métodos de cultura conhecidos é dado no livro didá- tico por Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) ou no livro didático por Storhas (Bi-oreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Brauns-chweig/Wiesbaden, 1994)). O meio de cultura a ser usado deve satisfazer de forma adequada as necessidades das cepas específicas. O meio de cultura para diversos microorganismos estão descritos no "Manual of Methods for General Bacte-riology" da American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981).

As fontes de carbono que podem ser usadas são os açúcares e os carboidratos, tais como, por exemplo a glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, amido e celulose, por exemplo, óleos e gorduras, tais como, por exemplo, o óleo de soja, óleo de sementes de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco, por exemplo, ácidos graxos tais como por exemplo o ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoléico, álcoois, tais como, por exemplo, o glicerol e o etanol e ácidos orgânicos, tais como, por exemplo o ácido acético. Essas substâncias podem ser usadas de forma individual ou como uma mistura.

As fontes de nitrogênio que podem ser usadas compreendem os compostos orgânicos que contêm nitrogênio, tais como as peptonas, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, licor de milho macerado, farinha de soja e uréia ou compostos inorgânicos, tais como o sulfato de amô-nia, cloreto de amônia, fosfato de amônia, carbonato de amônia e o nitrato de amônia. As fontes de nitrogênio podam ser usadas de modo individual ou como uma mistura.

As fontes de fósforo que podem ser usadas são o ácido fosfórico, fosfato dihidrogênio de potássio ou fosfato dipotássio de hidrogênio ou os sais correspondentes que contenham sódio. O meio de cultura tem que conter, de modo adicional sais de metais, tais como, por exemplo, o sulfato de magnésio ou o sulfato de ferro que são necessários para o crescimento. Finalmente, as substâncias essenciais de promoção do crescimento tais como aminoácidos e vitaminas também podem ser usadas em adição às substâncias acima mencionadas. Além disso podem ser adicionados ao meio de cultura precursores adequados. As substâncias de alimentação mencionadas podem ser adicionadas á cultura como uma batelada isolada ou podem ser alimentadas de forma apropriada durante a cultura. O compostos básicos, tais como o hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amônia ou água de amônia, ou compostos acídicos tais com o ácido fosfórico ou o ácido sulfúrico são usados de forma apropriada para o controle do PH da cultura. A formação de espuma pode ser controlada com a utilização de agentes para anti formação de espuma tais como os ésteres de poliglicol de ácidos graxos, por exemplo. A estabilidade do plasmídio pode ser mantida pela adição ao meio de substâncias que atuam de forma seletiva, por exemplo os antibióticos. O oxigênio ou as misturas de gás que contem oxigênio, tais como o ar, por exemplo, são introduzidas no interior da cultura com o propósito de manter as condições aeróbicas. A temperatura da cultura é normalmente a partir de 20SC até 45gC, e de preferência a partir de 252C até 402C. A cultura é continuada até que seja formada a quantidade máxima de lisina. Esse objetivo é normalmente alcançado dentro de 10 até 160 horas. A análise da L-lisina pode ser executada por cromatografia de troca de íon com a subseqüente derivação da ninhidrina, como descrito em Spackman et al., (Analytical Chemistry, 30 (1958, 1190). O microorganismo que se segue foi depositado com o Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemanha) de acordo com o Tratado de Budapeste: - Corynebacterium glutamicum cepa DSM 5715/pXT-dapCexp como DSM 13254. O processo de acordo com a presente invenção serve para a produção dà L-lisina por fermentação. A presente invenção é ilustrada em maior detalhe pelos exemplos práticos que se seguem.

Exemplo 1 Produção de um conjunto de gene cosmídio genômico a partir da Corvne-bacterium alutamicum ATCC 13032 O DNA cromossômico da Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 foi isolado como descrito em Tauch et al., (1995, Plasmid 33: 168 -179) e clivado de forma parcial com a enzima de restrição Sau3AI (Amer-sham Pharmacia, Freiburg, Alemanha, descrição do produto Sau3AI, código ng 27-0913-02). Os fragmentos do DNA foram desfosforilados com fosfatase alcalina de camarão (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha, descrição do produto SAP, código ns 1758250). O DNA do vetor cosmídio Su-perCosl (Wahl et al., (1987), Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: 2160 a 2164), adquirido de Stratagene (La Jolla, USA, descrição do produto SuperCosl Cosmid Vector Kit, código ns 251301) foi clivado com a enzima de restrição Xbal (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemanha, descrição do produto Xbal código ne 27-0948-02) e também desfosforilado com fosfatase alcalina de camarão. O DNA do cosmídio foi em seguida clivado com a enzima de restrição BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemanha, descrição do produto BamHI código nQ 27-0868-04). O DNA do cosmídio tratado dessa maneira foi misturado com o DNA tratado do ATCC 13032 e a batelada foi tratada com ligase de DNA T4 (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemanha, descrição do produto T4 código nQ 27-0870-04). A mistura de ligação foi em seguida embalada em fagos com a utilização do Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla, USA, descrição do produto Gigapack II XL Packing Extract. N} de código 200217). A cepa NM 554 do E. coli (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acid Research 16: 1563 a 1575) foi infectada pela suspensão das células em 10 mM MgS04 e misturando as mesmas com uma alíquota da suspensão de fagos. A biblioteca de cosmídio foi infectada e titulada como descrito em Sambroock et al., (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), as células sendo colocadas em placas sobre ágar LB (Lennox, 1955, Virology, 1: 190), com 100 mg/l de ampicilina. Depois da incubação de um dia para o outro a 379C, os clones recombinantes individuais foram selecionados.

Exemplo 2 Isolamento e seaüenciamento do gene dapC. O DNA de cosmídio de uma colônia individual foi isolado de acordo com as instruções do fabricante com a utilização do Qiaprep Spin Miniprep Kit (n9 de produto 27106, Qiagen, Hilden, Alemanha) e clivado de forma parcial com a enzima de restrição Sau3AI (Pharmacia Biotech, Frei-burg, Alemanha), descrição do produto Sau3AI, código n9 27-0913-02). Os fragmentos do DNA foram desfosforilados com fosfatase alcalina de camarão (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha, descrição do produto SAP, código n9 1758250). Uma vez separados por eletroforese em gel, os fragmentos do cosmídio de um tamanho de 1500 até 2000 pb foram isolados com a utilização do QiaExII Gel Extraction Kit (n9 de produto 20021, Qiagen, Hilden, Alemanha). O DNA do vetor de seqüenciamento pZero-1 adquirido da Invitrogen (Groningen, Holanda, descrição do produto Zero Background Cloning Kit, n9 do produto K2500-01) foi clivado com a enzima de restrição BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemanha, descrição do produto BamHI código n9 27-0868-04). A ligação dos fragmentos do cosmídio no interior do vetor de seqüenciamento pZero-1 foi realizada como descrita em Sambroock et al., (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), a mistura de DNA sendo incubada de um dia para o outro com ligase T4 (Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemanha). Essa mistura de ligação foi em seguida eletroporada dentro da cepa DH5aMCR (Grant, 1990, , Proceedings of the National Academis of Sciences USA, 87: 4645 - 4649) (Tauch et al., 1994 FEMS Microbiol Letters, 123: 343 - 7) e colocada em placas sobre ágar LB (Lennox, 1955, Virology, 11: 190) com 50 mg/l de Zeoci-na. Os plasmídios dos clones recombinantes foram preparados com a utilização do Biorobot 9600 (n9 de produto 900200, Qiagen, Hilden, Alemanha). O seqüenciamento foi executado com a utilização do método de terminação de cadeia dideóxi de acordo com Sanger et al., (1977, , Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 74: 5463 - 5467) como modificado por Zimmermann et al., (1990, Nucleic Acid Research, 18: 1067). Foi usado o "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" da PE Applied Biosys- tems (n9 de produto 403044, Weiterstadt, Alemanha). A separação através da eletroforese com gel e a análise da reação de seqüenciamento foi realizada em um "Rotiphorese NF" gel de acrilamida/bis acrilamida (29:1) (n9 de produto A124.1, Roth, Karlsruhe, Alemanha) com a utilização do seqüencia-dor "ABI Prism 377" da PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Alemanha).

Os dados da seqüência em bruto resultante foram processados em seguida com a utilização do pacote de software Staden (1986, Nucleic Acid Research, 14, 217 - 231), versão 97-0. As seqüências individuais dos derivados de pZerol. Foram montadas no interior de um "contig" coesivo. A análise da faixa de codificação auxiliada por computador foi realizada com a utilização do software XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217 a 231). Outra análise foi realizada com a utilização do "BLAST search pro-grams" (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25: 3389 a 3402), contra os dados de base não redundantes do "National Center for Biote-chnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, USA). A seqüência de nucleotídeo resultante do gene dapC está declarada na SEQ ID NO. 1. A análise da seqüência de nucleotídeo revelou uma estrutura de leitura aberta de 1101 pares de base, que foi designada o gene dapC. O gene dapC codifica para um polipeptídio de 367 aminoácidos, que está mostrado na SEQ ID NO. 2.

Exemplo 3 Produção de um vetor de vaivém pXT-dapCexp para o aumento do gene dapC em C. qlutamicum. 3.1 - Clonagem do gene dapC. O DNA do cromossoma foi isolado da cepa ATCC 13032 com a utilização do método de Eikmanns et al., (Microbiology 140: 1817 a 1828 (1994)). Sobre a base da seqüência do gene dapC para a C. glutamicum conhecida a partir do Exemplo 2, foram selecionados os seguintes nucleotí-deos para a reação em cadeia de polimerase (c. f também a DSEQ ID NO. 5 e 6): DapC (dCexl) 5’ GAT CTA (GAA TCC) GCC TCA GGC ATA ATC TA A CG 3’ DapC (dCexna2): 5’ GAT CTA (TCT AGA) CAG AGG ACA AGG CAA TCG GA 3’ Os iniciadores indicados foram sintetizados pela companhia ARK Scientific GmbH Biosystems (Darmstadt, Alemanha) e a reação de PCR foi executada de acordo com o método PCR padrão de Innis et al., (PCR Proto-cols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) com a utilização da polimerase Pwo da Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Alemanha). Por meio da reação em cadeia da polimerase, os iniciadores permitiram a amplificação de um fragmento de DNA de aproximadamente 1,6 kb, que tem o gene dapC. Além do mais, o iniciador DapC (dCexl) contém a sequência para o sítio de restrição da endonuclease de restrição EcoRI, e o iniciador DapC (dCex2) contém a seqüência para o sítio de restrição da endonuclease de restrição Xbal, que está indicado entre parênteses na seqüência de nucleotídeo indicada acima. O fragmento de DNA amplificado de aproximadamente 1,6 kb, que contem o gene dapC, foi ligado dentro do vetor pCR®Blunt II (Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534 - 541 (1993), com a utilização do Zero Blunt™ Kit da Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; número de catálogo K2700-20). A cepa Top10 do E. coli foi em seguida transformada com a batelada de ligação de acordo com as instruções do fabricante do kit (Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA). As células que continham o plasmídio foram selecionadas pela colocação em placas da batelada de transformação sobre ágar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Labo-ratory Manual, 2a ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) que tinha sido suplementada com 25 mg/l de canamicina. O DNA do plasmídio foi isolado a partir de um transformante com a utilização QIAprep Spin Miniprep Kit da Qiagen (Hilden, Alemanha) e verificado por restrição com as enzimas de restrição Xbal e EcoRI e pela subsequente ele-troforese com gel de agarose (0,8%). A seqüência de DNA do fragmento de DNA amplificado foi verificado por seqüenciamento. O plasmídio foi chamado de pCRsapC. A cepa foi designada como E.coli Top10 / pCRdapC. 3.2 - Produção do vetor de vaivém PEC-XT99A de E. coli - C.alutamicum O vetor de expressão do E. coli pTRC99A (Amann et al., 1988, Gene 69: 3101 - 315) foi usado como o vetor de partida para a construção do vetor de vaivém pEC-XT99A de E. coli - C.glutamicum. Depois da divagem de restrição BsdHI (Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Alemanha, descrição de produção BsdHI, n9 do produto 1467123) e o tratamento em seguida com Klenow (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemanha, descrição do produto Fragmento Klenow de Polimerase I de DNA, produto n9 27-0928-01; método de acordo com (Sambrook et al., 1989, Molecular Clo-ning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), o gene de resistência à ampicilina (bla) foi substituído pelo gene de resistência à tetraciclina do plasmídio pAG1 da C. glutamicum (GenBank número de acesso AF 121000). Para essa finalidade a região que continha o gene de resistência foi clonada como um fragmento Alui (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemanha, descrição do produto Alui, produto n9 27-0884-01) dentro do vetor de expressão linearizado do E. coli pTRC99A. A ligação foi realizada como descrita por Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), a mistura de DNA sendo incubada de um dia para o outro com li-gase T4 (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemanha, descrição do produto Ligase de DNA T4, produto n.9 27-0870-04). Essa mistura de ligação foi em seguida eletroporada dentro da cepa DH5aMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87: 4645 - 4649) (Tauch et al., 1994 FEMS Microbiol Letters, 123: 343 - 7). O vetor de expressão construído do E. coli foi designado como pXT99A. O plasmídio pGA1 (Sonnen et al., Gene, 107: 69 a 74) foi usado como a base para a clonagem de um replicon mínimo a partir da Coryne-bacterium glutamicum. Por meio da divagem de restrição Ba1l/Pstl (Prome-ga GmbH, Mannheim, Alemanha, descrição do produto Ba1l, n9 do produto R6691; Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemanha, descrição do produto Pstl, n9 do produto 27-0976-01) do vetor pGA1, provou ser possível a clonagem de um fragmento de 3484 pares de base no interior do vetor pK18mob2 (Tauch et al., 1998, Archives of Microbiology 169: 303 a 312) que tinha sido fragmentado com Smal e Pstl (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemanha, descrição do produto Smal, n9 do produto 27-0946-02, descrição do produto Pstl, n9 do produto 27-0976-01). Um fragmento de 839 pares de base foi cancelado pela divagem de restrição BamHI/Xhol (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemanha, descrição do produto BamHI, n9 do produto 27-086803; descrição do produto Xhol, n9 do produto 27-0950-01) e o subsequente tratamento com Klenow (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemanha, descrição do produto Fragmento Klenow de Polimerase I de DNA, produto n9 27-0928-01; método de acordo com (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor). O replicom mínimo de C. glutamicum pode ser clonado dentro do vetor de expressão do E. coli pXT99A como um fragmento de 2645 pares de base, a partir do constructo que havia sido religado com a ligase T4 (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemanha, descrição do produto Ligase de DNA T4, produto n9 27-0870-04). Para essa finalização, o DNA do constructo que incluía o replicon mínimo foi clivado com as enzimas de restrição Kpnl (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemanha, descrição do produto Knpl, produto n9 27-0908-01) e Pstl (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemanha, descrição do produto Pstl, produto n9 27-0886-03) e em seguida foi executado um tratamento de exonuclease 3’ - 5’(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) por meio de uma polimerase Klenow (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemanha, descrição do produto Fragmento Klenow de Polimerase I de DNA, produto n9 27-0928-01).

Em uma batelada paralela, o vetor de expressão do E. coli pXT99A foi clivado com a enzima de restrição Rsrll (Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Alemanha, descrição de produto Rsrll, n9 do produto 1292687) e preparado para ligação com a polimerase Klenow (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemanha, descrição do produto Fragmento Klenow de Polimerase I de DNA, produto n9 27-0928-01). A ligação do replicon com o vetor do constructo pXT99A foi realizada como descrita por Sambrook et al.(1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), a mistura de DNA sendo incubada de um dia para o outro com ligase Τ4 (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemanha, descrição do produto Ligase de DNA T4, produto n- 27-0870-04). O vetor de expressão vaivém de E. coli - C. glutamicum pEC-XT99A construído dessa maneira foi transferido para dentro do C. glutamicum DSM 5715 por eletroporação (Liebl et al., 1989, FEMS Microbiological Letters 53: 299 a 303). A seleção do transformante continuou sobre ágar LBHIS consistindo em 18,5 g/l de caldo de infusão de cérebro - coração, 0,5 M sorbitol, 5 g/l de triptona Bacto, 2,5 g/l de extrato de levedura Bacto, 5 g/l de NaCI e 18 g/l de ágar Bacto, que foi suplementado com 5 mg/l de tetraci-clina. A incubação foi realizada durante 2 dias a 33QC. O DNA do plasmídio foi isolado a partir de um transformante com a utilização de métodos convencionais (Peters-Wendish et al., 1998, Microbiology, 144, 915 - 927), cortado com a endonuclease de restrição Hin-dlll e o plasmídio foi verificado em seguida por eletroforese sobre gel de agarose. O constructo de plasmídio resultante foi nomeado como pEC-XT99A e está mostrado na Figura 1. A cepa obtida por eletroporação do plasmídio pEC-XT99A em Corynebacterium glutamicum DMS 5715 foi denominado de DSM7515/ pEC-XT99A e foi depositado com a Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemanha) de acordo com o Tratado de Budapeste: 3.3 - Clonagem do daoC no vetor de vaivém PEC-XT99A de E. coli e C. alu-tamicum. O vetor usado foi o vetor de vaivém pEC-XT99A de E. coli e C. glutamicum descrito no exemplo 3.2. O DNA a partir desse plasmídio foi complemente clivado com as enzimas de restrição EcoRI e Xbal e em seguida desfosforilado com fosfatase alcalina de camarão (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha, descrição do produto SAP, código ne 1758250). O gene dapC foi isolado a partir do plasmídio pCRdapC descrito no exemplo 3.1 por divagem completa com as enzimas EcoRI e Xbal. O fragmento de aproximadamente 1600 pares de base foi isolado a partir do gel de agarose com a utilização do QiaExII Gel Extraction Kit (número de produto 20021, Qiagen, Hilden, Alemanha). O fragmento de dapC obtido dessa maneira foi misturado com o vetor preparado pEC-XT99A e a batelada foi tratada com ligase de DNA T4 (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemanha, descrição do produto T4 código nQ 27-0870-04). A batelada de ligação foi em seguida transformada dentro da cepa E. coli DH5a (Hanahan, em: DNA Cloning. A Practical Approach, Vol. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA). As células que continham o plasmídio foram selecionadas pela colocação em placa da batelada de transformação sobre ágar LB Lennox, 1955, Virology, 1: 190), com 5 mg/l de ampicilina. Depois da incubação de um dia para o outro a 37QC, os clones recombinantes individuais foram selecionados. O DNA do plasmídio foi isolado a partir de um transformante com a utilização QIAprep Spin Miniprep Kit (produto ns 27106 da Qiagen, Hilden, Alemanha) e clivado com as enzimas de restrição Xbal e EcoRI para a verificação do plasmídio pela subsequente eletroforese com gel de agarose. O plasmídio resultante foi denominado como pXT-dapCexp. Ele é mostrado na Figura 2.

Exemplo 4 Transformação da cepa DSM 5715 com o plasmídio pXT-dapCexp.

Em seguida a cepa DSM 5715 foi transformada com o plasmídio pXT-dapCexp, com a utilização do método de eletroporação descrito por Li-ebl et al.(FEMS Microbiology Letters, 53: 299 a 303 (1989)). A seleção do transformante continuou sobre ágar LBHIS consistindo em 18,5 g/l de caldo de infusão de cérebro - coração, 0,5 M sorbitol, 5 g/l de triptona Bacto, 2,5 g/l de extrato de levedura Bacto, 5 g/l de NaCI e 18 g/l de ágar Bacto, quer foi suplementado com 5 mg/l de tetraciclina. A incubação foi realizada durante 2 dias á 339C. O DNA do plasmídio foi isolado a partir de um transformante com a utilização de métodos convencionais (Peters-Wendish et al., 1998, Microbiology, 144, 915 - 927), cortado com a endonuclease de restrição EcoRI e Xbal e o plasmídio foi verificado em seguida por eletroforese sobre gel de agarose. A cepa resultante foi nomeado como DSM 5715/pXT- dapCexp e foi depositada como DSM 13254 com a Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemanha) de acordo com o Tratado de Budapeste.

Exemplo 5 Produção da L-lisina A cepa do C.glutamicum DSM 5715/pXT-dapCexp obtida no Exemplo 4 foi cultivada em um meio de nutrição adequado para a produção de lisina e o teor de lisina do sobrenadante da cultura foi determinado.

Para essa finalidade, a cepa foi incubada inicialmente durante 24 horas a 33QC sobre uma placa de ágar com o antibiótico apropriado (ágar de cérebro e coração com tetraciclina (5 mg/l)). Iniciando a partir dessa cultura em placa de ágar, foi inoculada uma pré cultura (10 ml de meio em um frasco de Erlenmeyer de 100 ml). Como meio para esta pré cultura foi usado o meio completo Cg III.

Meio Cg III

NaCI 2,5 g/l Peptona Bacto 10 g/l Extrato de levedura Bacto 10 g/l Glicose (submetida a autoclave em separado) 2% (p/v) O valor do pH foi ajustado para pH 7,4 Foi adicionada tetraciclina (5 mg/l) a esse meio. A pré cultura foi incubada durante 16 horas à 33SC em um agitador á 240 rpm. Uma cultura principal foi inoculada a partir dessa pré cultura, de tal forma que o OD inicial (660 nm) da cultura principal foi de 0,1. Foi usado o meio MM para essa cultura principal.

Meio MM CLS (licor de milho macerado) 5 g/l MOPS (ácido morfolino propano sulfônico) 20 g/l Glicose (submetida a autoclave em separado) 50 g/l (NH4)2S04 25 g/l KH2P04 0,1 g/l MgS04*7H20 1,0 g/l CaCI2 * 2 H20 10 mg/l FeSo4 * 7 H20 10 mg/l MnS04 * H20 5,0 mg/l Biotina (filtrada estéril) 0,3 mg/l Tiamina * HCI (filtrada estéril) 0,2 mg/l L-leucina (filtrada estéril) 0,1 g/l CaC03 25 g/l CSL, MOPS e a solução de sal foram ajustados para o pH 7 com água de amônia, e submetidos a autoclave. O substrato estéril e as soluções de vitaminas, junto com o CaC03 submetido a autoclave a seco foram em seguida adicionados. O procedimento de cultura foi realizado em um volume de 10 ml em um frasco de Erlenmeyer de 100 ml com desviadores de fluxo. A tetraci-clina (5 mg/l) foi adicionada. O procedimento de cultura foi realizado a 339C e 80% de umidade atmosférica.

Depois de 72 horas, o OD foi determinado em uma medição de comprimento de onda de 660 nm com a utilização de um Biomeck 1000 (Be-ckmann Instruments GmbH, Munique). A quantidade de lisina formada foi determinada com a utilização de um analisador de aminoácido de Eppendorf BioTronik (Hamburgo, Alemanha), por cromatografia de troca de íon e derivação pós coluna com a detecção de ninidrina. A tabela 1 mostra o resultado do teste.

Tabela 1 Descrição resumida dos desenhos: Figura 1: Mapa do plasmídio pEC-XT99A Figura 2: Mapa do plasmídio pXT-dapCexp As abreviaturas e os nomes são definidos da forma que se segue: per: gene para o controle do número de cópias de pGA1 oriE: origem da replicação do plasmídio codificado a partir de E. coli. rep: origem da replicação do plasmídio codificado a partir do plasmí- dio pGA1 de C. glutamicum.

Ptrc: promotor trc a partir de pTRC99A

Τ1, T2: Regiões terminadoras 1 e 2 do pTRC99A

Laclq : gene repressor do operon Lac Tet: gene de resistência para a tetraciclina dapC: gene dapC de C. glutamicum EcoRI: sítio de restrição da enzima de restrição EcoRI

EcoRV: sítio de restrição da enzima de restrição EcoRV.

Hindlll: sítio de restrição da enzima de restrição Hindlll Kpnl: sítio de restrição da enzima de restrição Kpnl Sall: sítio de restrição da enzima de restrição Sall Smal: sítio de restrição da enzima de restrição Smal Ndel: sítio de restrição da enzima de restrição Ndel BamHI: sítio de restrição da enzima de restrição BanHI

Ncol: sítio de restrição da enzima de restrição Ncol Xbal: sítio de restrição da enzima de restrição Xbal Saci: sítio de restrição da enzima de restrição Saci.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Evonik Degussa GmbH

<120> VETOR CONTENDO A SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS QUE CODIFICA O GENE DAPC, SUA BACTÉRIA CORINEFORME E PROCESSO DE PRODUÇÃO DE L-LISINA

<130> 990217 BT <140> PI0101151-0 <141> 23/03/2001 <150> DE 10014546.9 <151> 23/03/2000 <160> 6 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 1300 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> CDS <222> (91) .. (1191) <223> dapC-Gene <400> 1 gggctcccca ggtggtgcgg ctaagcttgg accacaagat tttgatcacc caatgatcgc 60 tgcgctgccg cctcaggcat aatctaacgc atg acc tct cgc acc ccg ctt gtt 114 Met Thr Ser Arg Thr Pro Leu Vai 1 5 tct gtt ctt cct gat ttt ccg tgg gat tcg ctc gct tcc gca aaa gcc 162 Ser Vai Leu Pro Asp Phe Pro Trp Asp Ser Leu Ala Ser Ala Lys Ala 10 15 20 aaa gct gcg tct cac ccg gat ggg ate gtg aat ctt tct gtt ggc act 210 Lys Ala Ala Ser His Pro Asp Gly Ile Vai Asn Leu Ser Vai Gly Thr 25 30 35 40 ccg gtt gat ccg gtc gcg ccc age att cag ate gcg ttg gca gaa gca 258 Pro Vai Asp Pro Vai Ala Pro Ser Ile Gin Ile Ala Leu Ala Glu Ala 45 50 55 gcg ggg ttt tcg ggt tac cct caa acc ate ggc acc ccg gaa etc cgc 306 Ala Gly Phe Ser Gly Tyr Pro Gin Thr Ile Gly Thr Pro Glu Leu Arg 60 65 70 gea gcc ate agg ggc gcg ctt gag cgg cgc tac aac atg aca aag ctt 354 Ala Ala Ile Arg Gly Ala Leu Glu Arg Arg Tyr Asn Met Thr Lys Leu 75 80 85 gtc gac gcc tcc etc etc ccc gtc gtg ggt acc aag gag gea att gcc 402 Vai Asp Ala Ser Leu Leu Pro Vai Vai Gly Thr Lys Glu Ala Ile Ala 90 95 100 ctt ctt cea ttc gcg ttg ggt att tcc ggc acc gtt gtc ate cea gag 450 Leu Leu Pro Phe Ala Leu Gly Ile Ser Gly Thr Vai Vai Ile Pro Glu 105 110 115 120 att gcg tac cea acc tac gaa gtc gct gtc gtg gcc gea gga tgc acc 498 Ile Ala Tyr Pro Thr Tyr Glu Vai Ala Vai Vai Ala Ala Gly Cys Thr 125 130 135 gtg ttg cgt tet gat tcg ctg ttt aag etc ggc ccg cag ate ccg tcg 546 Vai Leu Arg Ser Asp Ser Leu Phe Lys Leu Gly Pro Gin Ile Pro Ser 140 145 150 atg atg ttt ate aac tea cea tcc aac ccc aca ggc aag gtt ctg ggc 594 Met Met Phe Ile Asn Ser Pro Ser Asn Pro Thr Gly Lys Vai Leu Gly 155 160 165 ate cea cac ttg cgc aag gtt gtg aag tgg gcg cag gaa aac aac gtg 642 Ile Pro His Leu Arg Lys Vai Vai Lys Trp Ala Gin Glu Asn Asn Vai 170 175 180 ate etc gea gct gat gaa tgc tac ttg ggt ctt ggc tgg gac gat gaa 690 Ile Leu Ala Ala Asp Glu Cys Tyr Leu Gly Leu Gly Trp Asp Asp Glu 185 190 195 200 aac cea ccg ate tea att ttg gat cea cgt gtc tgc gat ggc gac cac 738 Asn Pro Pro Ile Ser Ile Leu Asp Pro Arg Vai Cys Asp Gly Asp His 205 210 215 acc aac ttg ate gcc att cac tcg ctg tet aaa acc tea aac etc gct 786 Thr Asn Leu Ile Ala Ile His Ser Leu Ser Lys Thr Ser Asn Leu Ala 220 225 230 tet tac cgc gea ggt tac etc gtt ggc gat cea gcg ctg att ggt gaa 834 Ser Tyr Arg Ala Gly Tyr Leu Vai Gly Asp Pro Ala Leu Ile Gly Glu 235 240 245 etc acg gaa gtc cgt aag aac ttg ggt ctc atg gtt cct ttc cca ate 882 Leu Thr Glu Vai Arg Lys Asn Leu Gly Leu Met Vai Pro Phe Pro Ile 250 255 260 cag cag gcc atg ate gea gcc ctc aac gac gat gac caa gag gea ggg 930 Gin Gin Ala Met Ile Ala Ala Leu Asn Asp Asp Asp Gin Glu Ala Gly 265 270 275 280 cag aag ctc acc tac gcg att cgt cga gea aaa ctc atg cgc gcc ctg 978 Gin Lys Leu Thr Tyr Ala Ile Arg Arg Ala Lys Leu Met Arg Ala Leu 285 290 295 ttg gaa tcc ggc ttt cag gta gat aat tet gaa gcg ggt ctg tac ctc 1026 Leu Glu Ser Gly Phe Gin Vai Asp Asn Ser Glu Ala Gly Leu Tyr Leu 300 305 310 tgg gcg acg cgt gaa gaa cct tgc cgt gac act gtc gat tgg ttc gct 1074 Trp Ala Thr Arg Glu Glu Pro Cys Arg Asp Thr Vai Asp Trp Phe Ala 315 320 325 gag cgt ggc att ctc gtt gcc cca gga gac ttc tat ggc cct cgc gga 1122 Glu Arg Gly Ile Leu Vai Ala Pro Gly Asp Phe Tyr Gly Pro Arg Gly 330 335 340 gcg cag cat gtg cgt gtg gcg atg acc gaa acc gac gag cgc gtc gac 1170 Ala Gin His Vai Arg Vai Ala Met Thr Glu Thr Asp Glu Arg Vai Asp 345 350 355 360 gcc ttt gtt tet cgc ctg age taaacacgac taagcttatt ttgtttaatt 1221 Ala Phe Vai Ser Arg Leu Ser 365 gagtttgaag ttttccgtcg aaagaggcca tttgagttcc gagtccagtc ctgagtcgag 1281 taccgagcaa aaaacctgg 1300 <210> 2 <211> 367 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Met Thr Ser Arg Thr Pro Leu Vai Ser Vai Leu Pro Asp Phe Pro Trp 15 10 15 Asp Ser Leu Ala Ser Ala Lys Ala Lys Ala Ala Ser His Pro Asp Gly 20 25 30 Ile Vai Asn Leu Ser Vai Gly Thr Pro Vai Asp Pro Vai Ala Pro Ser 35 40 45 Ile Gin Ile Ala Leu Ala Glu Ala Ala Gly Phe Ser Gly Tyr Pro Gin 50 55 60 Thr Ile Gly Thr Pro Glu Leu Arg Ala Ala Ile Arg Gly Ala Leu Glu 65 70 75 80 Arg Arg Tyr Asn Met Thr Lys Leu Vai Asp Ala Ser Leu Leu Pro Vai 85 90 95 Vai Gly Thr Lys Glu Ala Ile Ala Leu Leu Pro Phe Ala Leu Gly Ile 100 105 110 Ser Gly Thr Vai Vai Ile Pro Glu Ile Ala Tyr Pro Thr Tyr Glu Vai 115 120 125 Ala Vai Vai Ala Ala Gly Cys Thr Vai Leu Arg Ser Asp Ser Leu Phe 130 135 140 Lys Leu Gly Pro Gin Ile Pro Ser Met Met Phe Ile Asn Ser Pro Ser 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gly Lys Vai Leu Gly Ile Pro His Leu Arg Lys Vai Vai 165 170 175 Lys Trp Ala Gin Glu Asn Asn Vai Ile Leu Ala Ala Asp Glu Cys Tyr 180 185 190 Leu Gly Leu Gly Trp Asp Asp Glu Asn Pro Pro Ile Ser Ile Leu Asp 195 200 205 Pro Arg Vai Cys Asp Gly Asp His Thr Asn Leu Ile Ala Ile His Ser 210 215 220 Leu Ser Lys Thr Ser Asn Leu Ala Ser Tyr Arg Ala Gly Tyr Leu Vai 225 230 235 240 Gly Asp Pro Ala Leu Ile Gly Glu Leu Thr Glu Vai Arg Lys Asn Leu 245 250 255 Gly Leu Met Vai Pro Phe Pro Ile Gin Gin Ala Met Ile Ala Ala Leu 260 265 270 Asn Asp Asp Asp Gin Glu Ala Gly Gin Lys Leu Thr Tyr Ala Ile Arg 275 280 285 Arg Ala Lys Leu Met Arg Ala Leu Leu Glu Ser Gly Phe Gin Vai Asp 290 295 300 Asn Ser Glu Ala Gly Leu Tyr Leu Trp Ala Thr Arg Glu Glu Pro Cys 305 310 315 320 Arg Asp Thr Vai Asp Trp Phe Ala Glu Arg Gly Ile Leu Vai Ala Pro 325 330 335 Gly Asp Phe Tyr Gly Pro Arg Gly Ala Gin His Vai Arg Vai Ala Met 340 345 350 Thr Glu Thr Asp Glu Arg Vai Asp Ala Phe Vai Ser Arg Leu Ser 355 360 365 <210> 3 <211> 1300 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> CDS <222> (91) .. (1191) <223> dapC-Alelo <400> 3 gggctcccca ggtggtgcgg ctaagcttgg accacaagat tttgatcacc caatgatcgc 60 tgcgctgccg cctcaggcat aatctaacgc atg acc tct cgc acc ccg ctt gtt 114 Met Thr Ser Arg Thr Pro Leu Vai 1 5 tct gtt ctt cct gat ttt ccg tgg gat tcg ctc gct tcc gca aaa gcc 162 Ser Vai Leu Pro Asp Phe Pro Trp Asp Ser Leu Ala Ser Ala Lys Ala 10 15 20 aaa gct gcg tct cac ccg gat ggg ate gtg aat ctt tct gtt ggc act 210 Lys Ala Ala Ser His Pro Asp Gly Ile Vai Asn Leu Ser Vai Gly Thr 25 30 35 40 ccg gtt gat ccg gtc gcg ccc age att cag ate gcg ttg gca gaa gca 258 Pro Vai Asp Pro Vai Ala Pro Ser Ile Gin Ile Ala Leu Ala Glu Ala 45 50 55 gcg ggg ttt tcg ggt tac cct caa acc ate ggc acc ccg gaa ctc cgc 306 Ala Gly Phe Ser Gly Tyr Pro Gin Thr Ile Gly Thr Pro Glu Leu Arg 60 65 70 gca gcc ate agg ggc gcg ctt gag cgg cgc tac aac atg aca aag ctt 354 Ala Ala Ile Arg Gly Ala Leu Glu Arg Arg Tyr Asn Met Thr Lys Leu 75 80 85 gtc gac gcc tcc ctc ctc ccc gtc gtg ggt acc aag gag gca att gcc 402 Vai Asp Ala Ser Leu Leu Pro Vai Vai Gly Thr Lys Glu Ala Ile Ala 90 95 100 ctt ctt cca ttc gcg ttg ggt att tcc ggc acc gtt gtc ate cca gag 450 Leu Leu Pro Phe Ala Leu Gly Ile Ser Gly Thr Vai Vai Ile Pro Glu 105 110 115 120 att gcg tac cca acc tac gaa gtc gct gtc gtg gcc gca gga tgc acc 498 Ile Ala Tyr Pro Thr Tyr Glu Vai Ala Vai Vai Ala Ala Gly Cys Thr 125 130 135 gtg ttg cgt tct gat tcg ctg ttt aag ctc ggc ccg cag ate ccg tcg 546 Vai Leu Arg Ser Asp Ser Leu Phe Lys Leu Gly Pro Gin Ile Pro Ser 140 145 150 atg atg ttt ate aac tea cea tcc aac cee aca ggc aag gtt ctg ggc 594 Met Met Phe Ile Asn Ser Pro Ser Asn Pro Thr Gly Lys Vai Leu Gly 155 160 165 ate cea cac ttg cgc aag gtt gtg aag tgg gcg cag gaa aac aac gtg 642 Ile Pro His Leu Arg Lys Vai Vai Lys Trp Ala Gin Glu Asn Asn Vai 170 175 180 ate ctc gea gct gat gaa tgc tac ttg ggt ctt ggc tgg gac gat gaa 690 Ile Leu Ala Ala Asp Glu Cys Tyr Leu Gly Leu Gly Trp Asp Asp Glu 185 190 195 200 aac cca ccg ate tea att ttg gat cta cgt gtc tgc gat ggc gac cac 738 Asn Pro Pro Ile Ser Ile Leu Asp Leu Arg Vai Cys Asp Gly Asp His 205 210 215 acc aac ttg ate gcc att cac tcg ctg tct aaa acc tea aac ctc gct 786 Thr Asn Leu Ile Ala Ile His Ser Leu Ser Lys Thr Ser Asn Leu Ala 220 225 230 tct tac cgc gea ggt tac ctc gtt ggc gat cca gcg ctg att ggt gaa 834 Ser Tyr Arg Ala Gly Tyr Leu Vai Gly Asp Pro Ala Leu Ile Gly Glu 235 240 245 ctc acg gaa gtc cgt aag aac ttg ggt ctc atg gtt cct ttc cca ate 882 Leu Thr Glu Vai Arg Lys Asn Leu Gly Leu Met Vai Pro Phe Pro Ile 250 255 260 cag cag gcc atg ate gea gcc ctc aac gac gat gac caa gag gea ggg 930 Gin Gin Ala Met Ile Ala Ala Leu Asn Asp Asp Asp Gin Glu Ala Gly 265 270 275 280 cag aag ctc acc tac gcg att cgt cga gea aaa ctc atg cgc gcc ctg 978 Gin Lys Leu Thr Tyr Ala Ile Arg Arg Ala Lys Leu Met Arg Ala Leu 285 290 295 ttg gaa tcc ggc ttt cag gta gat aat tct gaa gcg ggt ctg tac ctc 1026 Leu Glu Ser Gly Phe Gin Vai Asp Asn Ser Glu Ala Gly Leu Tyr Leu 300 305 310 tgg gcg acg cgt gaa gaa cct tgc cgt gac act gtc gat tgg ttc gct 1074 Trp Ala Thr Arg Glu Glu Pro Cys Arg Asp Thr Vai Asp Trp Phe Ala 315 320 325 gag cgt ggc att ctc gtt gcc cca gga gac ttc tat ggc cct cgc gga 1122 Glu Arg Gly Ile Leu Vai Ala Pro Gly Asp Phe Tyr Gly Pro Arg Gly 330 335 340 gcg cag cat gtg cgt gtg gcg atg acc gaa acc gac gag cgc gtc gac 1170 Ala Gin His Vai Arg Vai Ala Met Thr Glu Thr Asp Glu Arg Vai Asp 345 350 355 360 gcc ttt gtt tct cgc ctg age taaacacgac taagcttatt ttgtttaatt 1221 Ala Phe Vai Ser Arg Leu Ser 365 gagtttgaag ttttccgtcg aaagaggcca tttgagttcc gagtccagtc ctgagtcgag 1281 taccgagcaa aaaacctgg 1300 <210> 4 <211> 367 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 4 Met Thr Ser Arg Thr Pro Leu Vai Ser Vai Leu Pro Asp Phe Pro Trp 15 10 15 Asp Ser Leu Ala Ser Ala Lys Ala Lys Ala Ala Ser His Pro Asp Gly 20 25 30 Ile Vai Asn Leu Ser Vai Gly Thr Pro Vai Asp Pro Vai Ala Pro Ser 35 40 45 Ile Gin Ile Ala Leu Ala Glu Ala Ala Gly Phe Ser Gly Tyr Pro Gin 50 55 60 Thr Ile Gly Thr Pro Glu Leu Arg Ala Ala Ile Arg Gly Ala Leu Glu 65 70 75 80 Arg Arg Tyr Asn Met Thr Lys Leu Vai Asp Ala Ser Leu Leu Pro Vai 85 90 95 Vai Gly Thr Lys Glu Ala Ile Ala Leu Leu Pro Phe Ala Leu Gly Ile 100 105 110 Ser Gly Thr Vai Vai Ile Pro Glu Ile Ala Tyr Pro Thr Tyr Glu Vai 115 120 125 Ala Vai Vai Ala Ala Gly Cys Thr Vai Leu Arg Ser Asp Ser Leu Phe 130 135 140 Lys Leu Gly Pro Gin Ile Pro Ser Met Met Phe Ile Asn Ser Pro Ser 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gly Lys Vai Leu Gly Ile Pro His Leu Arg Lys Vai Vai 165 170 175 Lys Trp Ala Gin Glu Asn Asn Vai Ile Leu Ala Ala Asp Glu Cys Tyr 180 185 190 Leu Gly Leu Gly Trp Asp Asp Glu Asn Pro Pro Ile Ser Ile Leu Asp 195 200 205 Leu Arg Vai Cys Asp Gly Asp His Thr Asn Leu Ile Ala Ile His Ser 210 215 220 Leu Ser Lys Thr Ser Asn Leu Ala Ser Tyr Arg Ala Gly Tyr Leu Vai 225 230 235 240 Gly Asp Pro Ala Leu Ile Gly Glu Leu Thr Glu Vai Arg Lys Asn Leu 245 250 255 Gly Leu Met Vai Pro Phe Pro Ile Gin Gin Ala Met Ile Ala Ala Leu 260 265 270 Asn Asp Asp Asp Gin Glu Ala Gly Gin Lys Leu Thr Tyr Ala Ile Arg 275 280 285 Arg Ala Lys Leu Met Arg Ala Leu Leu Glu Ser Gly Phe Gin Vai Asp 290 295 300 Asn Ser Glu Ala Gly Leu Tyr Leu Trp Ala Thr Arg Glu Glu Pro Cys 305 310 315 320 Arg Asp Thr Vai Asp Trp Phe Ala Glu Arg Gly Ile Leu Vai Ala Pro 325 330 335 Gly Asp Phe Tyr Gly Pro Arg Gly Ala Gin His Vai Arg Vai Ala Met 340 345 350 Thr Glu Thr Asp Glu Arg Vai Asp Ala Phe Vai Ser Arg Leu Ser 355 360 365 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Iniciador <220> <223> Iniciador DapC (dCexl) <400> 5 gatctagaat tcgcctcagg cataatctaa cg 32 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Iniciador <220> <223> Iniciador DapC (dCexna2) <400> 6 gatctatcta gacagaggac aaggcaatcg ga 32 Este anexo apresenta o código de controle da listagem de sequências biológicas de que trata a Resolução INPI 228 de 11/11/2009: Código de Controle Campo 1 BB0CBEBBCEF22B9E

Claims (6)

1. Vetor, caracterizado pelo fato de que contém o polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: (a) um polinucleotídeo com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO. 1, (b) uma sequência que se correlaciona à sequência (a) dentro da faixa de degeneração do código genético, (c) um polinucleotídeo que é complementar aos polinucleotídeos de (a), ou (b), e (d) mutações senso funcionalmente neutras em (a), particularmente o pXT-dapCexp, em que ele é definido pelo mapa de restrição mostrado na Figura 2, depositado sob a designação de DSM 13254 em Corynebacterium glutamicum.

2. Bactéria corineforme, caracterizada pelo fato de que atua como célula hospedeira que contém o vetor, como definido na reivindicação 1.

3. Processo para a produção de L-lisina, caracterizado pelo fato de que são executadas as seguintes etapas: (a) fermentação da bactéria produzindo o L-aminoácido desejado, na qual, pelo menos, o gene dapC é superexpresso, (b) acumulação do produto desejado no meio ou nas células da bactéria, e (c) isolamento do L-aminoácido.

4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a sequência de polinucleotídeos do gene dapC é selecionada do grupo que consiste em: (a) um polinucleotídeo com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO. 1, (b) uma sequência que se correlaciona à sequência (a) dentro da faixa de degeneração do código genético, (c) um polinucleotídeo que é complementar aos polinucleotídeos de (a), ou (b), e (d) mutações senso funcionalmente neutras em (a).

5. Processo de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que são utilizadas as bactérias corineformes que produzem a L-lisina.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que são usados os microrganismos do gênero Corynebacterium glutamicum.