ES2241538T3

ES2241538T3 - Secuencias de nucleotidos que codifican el gen zwa1.

Info

Publication number: ES2241538T3
Application number: ES00124042T
Authority: ES
Inventors: Bettina Dr. Mockel; Walter Dr. Pfefferle; Achim Dr. Marx; Jorn Dr. Kalinowski; Brigitte Dr. Bathe; Alfred Prof. Puhler
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 1999-12-09
Filing date: 2000-11-04
Publication date: 2005-11-01
Anticipated expiration: 2020-11-04
Also published as: BR0005804A; SK18342000A3; ID28607A; DE19959328A1; PL202783B1; MXPA00010971A; JP2001197893A; US20060205046A1; KR20010062272A; US6632644B2; DE50010097D1; CN1304998A; EP1111062B1; US20020127663A1; EP1111062A1; ZA200007269B; RU2260048C2; AU7201800A; US7262036B2; US20040063180A1

Abstract

Los aminoácidos, en especial L-lisina, tienen aplicación en medicina humana, en la industria farmacéutica y, en particular, en la nutrición animal. Existe, por consiguiente, un interés general en poner a disposición nuevos procedimientos mejorados para la fabricación de aminoácidos, en especial de L-lisina. Cuando en lo sucesivo se mencione L-lisina o lisina, se da a entender no sólo la base, sino también sales de las mismas tales como, por ejemplo, monohidrocloruro de lisina o sulfato de lisina. Objeto de la invención es un polinucleótido aislado de bacterias corineformes que contiene una secuencia de polinucleótidos, seleccionado del grupo a) polinucleótido que es idéntico en al menos 70% a un polinucleótido que codifica un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 2, b) polinucleótido que codifica un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos 70% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 2, c) polinucleótido que es complementario para los polinucleótidos de a) o b), y d) polinucleótido que contiene al menos 30 nucleótidos consecutivos de la secuencia de polinucleótidos de a), b) o c).

Description

Secuencias de nucleótidos que codifican el gen zwa1.

Objeto de la invención son secuencias de nucleótidos que codifican el gen zwa1, y procedimientos para la fabricación por fermentación de aminoácidos, en especial L-lisina, utilizando bacterias corineformes en las que se potencia el gen zwa1.

Estado de la técnica

Los aminoácidos, en particular L-lisina, encuentran aplicación en medicina humana y en la industria farmacéutica, así como también en la nutrición animal.

Es sabido que los aminoácidos se fabrican por fermentación de cepas de bacterias corineformes, en especial de Corynebacterium glutamicum. Debido a su gran importancia, se trabaja constantemente en la mejora de los procedimientos de fabricación. Las mejoras de los procedimientos pueden afectar a las medidas en las técnicas de fermentación tales como, por ejemplo, agitación y suministro de oxígeno, o la composición de los medios de nutrientes tales como, por ejemplo, la concentración de azúcares durante la fermentación, o el procesamiento de la forma del producto mediante, por ejemplo, cromatografía de intercambio de iones, o las propiedades de rendimiento intrínsecas del propio microorganismo.

Para mejorar las propiedades de rendimiento de estos microorganismos se utilizan métodos de mutagénesis, selección y elección de mutantes. De esta manera se obtienen cepas que son resistentes contra antimetabolitos tales como, por ejemplo, el análogo de lisina S-(2-aminoetil)-cisteína, o que son auxotróficos para metabolitos importantes desde el punto de vista de la regulación, y que producen L-aminoácidos.

Desde hace algunos años se utilizan, asimismo, métodos de la técnica de ADN recombinante para la mejora de cepas de Corynebacterium productoras de aminoácidos, en los que se amplifican genes aislados para la biosíntesis de aminoácidos, investigándose su efecto sobre la producción de aminoácidos. Entre otros, se encuentran artículos relacionados con este asunto en Kinoshita ("Glutamic Acid Bacteria", en: Biology of Industrial Microorganisms, Demain y Solomon (recopiladores), Bejamin Cummings, Londres, Reino Unido, 1985, 115-142), Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), Eggeling (Amino Acids 6:261-272 (1994)), Jetten y Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995), y Sahm et al. (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)).

Misión de la invención

Los presentes inventores se han propuesto la misión de poner a disposición nuevas medidas para una fabricación por fermentación optimizada de aminoácidos, en especial de L-lisina.

Descripción de la invención

Los aminoácidos, en especial L-lisina, tienen aplicación en medicina humana, en la industria farmacéutica y, en particular, en la nutrición animal. Existe, por consiguiente, un interés general en poner a disposición nuevos procedimientos mejorados para la fabricación de aminoácidos, en especial de L-lisina.

Cuando en lo sucesivo se mencione L-lisina o lisina, se da a entender no sólo la base, sino también sales de las mismas tales como, por ejemplo, monohidrocloruro de lisina o sulfato de lisina.

Objeto de la invención es un polinucleótido aislado de bacterias corineformes que contiene una secuencia de polinucleótidos, seleccionado del grupo

a): polinucleótido que es idéntico en al menos 70% a un polinucleótido que codifica un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 2,

b): polinucleótido que codifica un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos 70% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 2,

c): polinucleótido que es complementario para los polinucleótidos de a) o b), y

d): polinucleótido que contiene al menos 30 nucleótidos consecutivos de la secuencia de polinucleótidos de a), b) o c).

Objeto de la invención es, igualmente, un polinucleótido según la reivindicación 1, en el que se trata, preferentemente, de un ADN replicable, que contiene:

(i): la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO 1, o

\newpage

(ii): al menos una secuencia correspondiente a las secuencias (i) en el ámbito de la degeneración del código genético, o

(iii): al menos una secuencia que hibrida con las secuencias complementarias para las secuencias (i) o (ii).

Objetos adicionales son

un polinucleótido según la reivindicación 2, que contiene las secuencias de nucleótidos representadas en SEQ ID NO 1, en el que el polinucleótido es un ADN preferentemente recombinante, replicable en bacterias corineformes,

un polinucleótido según la reivindicación 2, que codifica un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO 2,

un vector que contiene la secuencia de ADN que codifica el gen zwa1de C. glutamicum, contenido en el vector (plasmidio) pCR2.1zwa1exp., depositado en E. coli Top10F', bajo el número DSM 13115,

y bacterias corineformes que actúan como células hospedadoras, que contienen el vector según la reivindicación 6, o en las que el gen zwa1 está potenciado.

Objeto de la invención son, asimismo, polinucleótidos que están compuestos esencialmente por una secuencia de polinucleótidos, obtenibles por "screening" mediante hibridación de un correspondiente banco de genes, que contiene el gen completo con la secuencia de polinucleótidos correspondiente a SEQ ID NO 1, o partes del mismo, con una sonda que contiene la secuencia del citado polinucleótido según SEQ ID NO 1, o un fragmento del mismo, y aislamiento de la mencionada secuencia de ADN.

Las secuencias de polinucleótidos según la invención son adecuadas como sondas de hibridación para ARN, ADNc y ADN, para aislar ADNc en toda su longitud, que codifican el producto génico Zwa1, y para aislar el citado ADNc o genes, que exhiben una gran semejanza de la secuencia con la del gen zwa1.

Las secuencias de polinucleótidos según la invención son, adicionalmente, adecuadas como cebadores, con cuya ayuda se puede preparar, a través de la cadena de reacción de la polimerasa (PCR), ADN de genes que codifican el gen zwa1.

Los oligonucleótidos que actúan como sondas o cebadores contienen al menos 30, preferentemente al menos 20 y, de forma muy especialmente preferida, al menos 15 nucleótidos consecutivos. Son también adecuados los oligonucleótidos con una longitud de al menos 40 ó 50 nucleótidos.

"Aislado" significa separado de su entorno natural.

"Polinucleótido" se refiere, en general, a poli-ribonucleótidos y polidesoxi-ribonucleótidos, en donde se puede tratar de ARN o ADN no modificado, o de ARN o ADN modificado.

Por "polipéptidos" se entienden péptidos o proteínas que contienen dos o más aminoácidos unidos a través de enlaces peptídicos.

Los polipéptidos según la invención incluyen polipéptidos según SEQ ID NO 2, en especial aquéllos con la actividad biológica del producto génico del gen zwa1, así como aquéllos que son idénticos en al menos 70% al polipéptido según SEQ ID NO 2, preferentemente en al menos 80% y, en particular, los que muestran una identidad de al menos 90% hasta 95% con el polipéptido según SEQ ID NO 2, y que exhiben la citada actividad.

La invención se refiere, adicionalmente, a un procedimiento para la fabricación por fermentación de aminoácidos, en especial de L-lisina, utilizando bacterias corineformes, especialmente las que producen los aminoácidos de inmediato, y en las que están potenciadas y, en particular sobre-expresadas, las secuencias de nucleótidos que codifican el gen zwa1.

El término "potenciación" describe, en este contexto, el incremento de la actividad intracelular de una o múltiples enzimas en un microorganismo, codificado por el correspondiente ADN, en donde se eleva, por ejemplo, el número de copias del o de los genes, se utiliza un potente promotor, o un gen que codifica una enzima correspondiente con una elevada actividad y, eventualmente, donde se combinan estas medidas.

Los microorganismos que son objeto de la presente invención, pueden producir L-lisina a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, almidón, celulosa, o a partir de glicerina y etanol. Pueden ser representantes de bacterias corineformes, en especial del género Corynebacterium. Dentro del género Corynebacterium se debe citar, en particular, la especie Corynebacterium glutamicum que es conocida, en este campo, por su capacidad para producir L-aminoácidos.

Cepas adecuadas del género Corynebacterium, sobre todo de la especie Corynebacterium glutamicum, son, por ejemplo, las cepas de tipo salvaje conocidas

: Corynebacterium glutamicum ATCC13032

: Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806

: Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870

: Corynebacterium melassecoloa ATCC17965

: Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539

: Brevibacterium flavum ATCC14067

: Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, y

: Brevibacterium divaricatum ATCC14020.

y los mutantes o cepas productoras de L-lisina, preparadas a partir de las mismas

: Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709

: Brevibacterium flavum FERM-P 1708

: Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712

: Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463

: Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464, y

: Corynebacterium glutamicum DSM5715.

Los presentes inventores pudieron aislar el nuevo gen zwa1, que codifica el producto génico Zwa1, de C. glutamicum.

Para el aislamiento del gen zwa1 o de otros genes de C. glutamicum, se inserta en primer lugar una genoteca de este microorganismo en E. coli. La inclusión de genotecas se describe en libros de texto y manuales generalmente conocidos. Como ejemplos, cabe citar el libro de texto de Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (editorial Chemie, Weinheim, Alemania, 1990), o el manual de Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Una genoteca muy conocida es la de la cepa W3110 de E. coli K-12, insertada por Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987)) en vectores \lambda. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252:255-265, 1996) describen una genoteca de C. glutamicum ATCC13032 que, con ayuda del vector cosmídico SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84:2160-2164), se ha insertado en la cepa NM554 de E. coli K-12 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575). Börmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326 (1992)) describen, igualmente, una genoteca de C. glutamicum ATCC13032 utilizando el cósmido pHC79 (Hohn y Collins, Gene 11, 291-298 (1980)). Para la preparación de genotecas de C. glutamicum en E. coli se pueden utilizar también plasmidios tales como pBR322 (Bolívar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)), o pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19:259-268). Como hospedadoras son especialmente adecuadas las cepas de E. coli que exhiben defectos de restricción y recombinación. Un ejemplo de las mismas es la cepa DH5\alphaMCR, descrita por Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649). Los fragmentos largos de ADN, clonados con ayuda de cósmidos, se pueden sub-clonar nuevamente en vectores corrientes, adecuados para la secuenciación, secuenciándolos a continuación, de la forma descrita, por ejemplo, por Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74:5463-5467, 1977).

De esta manera se obtuvo la nueva secuencia de ADN de C. glutamicum que codifica el gen zwa1, que forma parte, como SEQ ID NO 1, de la presente invención. Adicionalmente, se ha derivado de la presente secuencia de ADN la secuencia de aminoácidos del correspondiente producto génico del gen zwa1. En SEQ ID NO 2 aparece representada la secuencia de aminoácidos resultante del producto génico Zwa1.

Las secuencias de ADN codificadoras, resultantes de SEQ ID NO 1 por la degeneración del código genético, son también componentes de la invención. Del mismo modo, las secuencias de ADN que hibridan con la SEQ ID NO 1 o partes de SEQ ID NO 1, son componentes de la invención. En la técnica se conocen, adicionalmente, intercambios conservadores de aminoácidos tales como, por ejemplo, un intercambio de glicina contra alanina, o de ácido aspártico contra ácido glutámico, en proteínas como "mutaciones de sentido" ("sense mutations"), que no dan lugar a alteraciones fundamentales de la actividad de la proteína, es decir, que son neutros desde el punto de vista funcional. Adicionalmente, se sabe que las alteraciones en los extremos N y/o C de una proteína no influyen de manera esencial sobre su función, o que, incluso, la pueden estabilizar. El especialista puede encontrar información a este respecto en, entre otros, Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987)), en O'Regan et al. (Gene 77:237-251 (1989)), en Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3:240-247 (1994)), en Hochuli et al. (Bio/Technology 6:1321-1325 (1988)), y en libros de texto conocidos de genética y biología molecular. Las secuencias de aminoácidos, resultantes de manera correspondiente de SEQ ID NO 2, son también componentes de la invención.

De la misma forma, las secuencias de ADN que hibridan con SEQ ID NO 1 o partes de SEQ ID NO 1, forman parte de la invención. Por último, forman parte de la invención las secuencias de ADN preparadas por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando cebadores, resultantes de SEQ ID NO 1. Este tipo de oligonucleótidos tienen típicamente una longitud de, por lo menos, 15 nucleótidos.

Indicaciones para la identificación de las secuencias de ADN mediante hibridación las encontrará el especialista, entre otras, en el manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization", de la Compañía Boehringer
Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993), y en Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991), 41:255-260). El especialista encontrará información sobre la amplificación de secuencias de ADN con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), entre otras, en el manual de Gait: Oligonucleotide Synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1984), y en Newton y Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania, 1994).

Los inventores descubrieron que las bacterias corineformes, tras la sobre-expresión del gen zwa1, producen aminoácidos, en especial L-lisina, de manera optimizada.

Para lograr una sobre-expresión, se puede incrementar el número de copias del gen correspondiente, o se puede mutar la región de promoción y regulación, o el sitio de unión a ribosomas, que se encuentra corriente arriba del gen estructural. Del mismo modo actúan los casetes de expresión, incorporados corriente arriba del gen estructural. Por medio de promotores inducibles es posible, adicionalmente, aumentar la expresión en el transcurso de la producción fermentativa de aminoácidos. A través de medidas para prolongar la duración de la vida del ARNm se mejora también la expresión. Además, evitando la degradación de la proteína enzimática, se puede potenciar, igualmente, la actividad enzimática. Los genes o construcciones génicas pueden estar presentes en plasmidios con diferentes números de copias, o estar integrados y amplificados en el cromosoma. De manera alternativa, se puede alcanzar una sobre-expresión del gen correspondiente modificando la composición de los medios y la realización del
cultivo.

El especialista puede encontrar información a este respecto, entre otras, en Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), en Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994), Tsuchiya y Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988), en Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991), en la memoria de la Patente Europea EPS 0 472 869, en la Patente de EE.UU. 4.601.893, en Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), en Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994), en LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en la Solicitud de Patente WO 96/15246, en Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), en la Memoria Japonesa Abierta al Público JP-A-10-229891), en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), en Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996)), y en libros de texto conocidos sobre genética y biología molecular.

A modo de ejemplo, el gen zwa1 según la invención se duplicó o sobre-expresó con ayuda del método de integración, descrito, por ejemplo, por Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)). En este método, se clona el gen completo en un vector plasmídico que puede replicar en un hospedador (típicamente, E. coli), pero no en C. glutamicum. Como vectores se toman en consideración, por ejemplo, pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob o pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, EE.UU.), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994), Journal of Biological Chemistry 269:32678-84; Patente de EE.UU. 5.487.993), pCR®Blunt (Compañía Invitrogen, Groningen, Holanda; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), o pEM1 (Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516). El vector plasmídico, que contiene el gen a amplificar, se transfiere, seguidamente, por conjugación o transformación, en la cepa de C. glutamicum deseada. Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)) describen por ejemplo, el método de la conjugación. El método de transformación aparece descrito, por ejemplo, en Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican y Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)), y Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994). Tras la recombinación homóloga por medio de un episodio de "sobre-cruzamiento", la cepa resultante contiene dos copias del gen correspondiente. De esta manera, y con la ayuda del plasmidio de integración pCR2.1zwa1exp se preparó la cepa DSM5715::pCR2.1zwa1exp, que porta dos copias del gen zwa1.

Adicionalmente, para la producción de aminoácidos y, en especial de L-lisina, puede ser conveniente potenciar y, en particular, sobre-expresar, además del producto génico Zwa1, una o múltiples enzimas de la correspondiente vía de biosíntesis de la glicólisis, de la anaplerosis, del ciclo del ácido cítrico o de la exportación de aminoácidos.

De esta forma, puede ser ventajoso sobre-expresar simultáneamente, por ejemplo, para la fabricación de L-lisina, uno o varios de los genes seleccionados del grupo

\bullet: el gen dapA que codifica la dihidrodipicolinato-sintetasa (documento EP-B 0 197 335),

\bullet: el gen lysC que codifica una aspartato-quinasa resistente a la retroalimentación,

\bullet: el gen dapD que codifica la tetradihidrodipicolinato succinilasa (Wehrmann et al., Journal of Bacteriology 180, 3159-3165 (1998)).

\bullet: el gen dapE que codifica el gen para la succinil-diaminopimelato-desuccinilasa (Wehrmann et al., Journal of Bacteriology 177: 5991-5993 (1995)),

\bullet: el gen gap que codifica la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (Eikmanns (1992). Journal of Bacteriology 174:6076-6086),

\bullet: el gen pyc que codifica la piruvato carboxilasa (Eikmanns (1992). Journal of Bacteriology 174:6076-6086),

\bullet: el gen mqo que codifica la malato-quinona óxido-reductasa (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)),

\bullet: el gen lysE que codifica una proteína para la exportación de lisina (documento DE-A-195 48 222).

Adicionalmente, para la producción de aminoácidos y, en especial de L-lisina, puede ser conveniente, además del gen zwa1, atenuar simultáneamente

\bullet: el gen que codifica la fosfato-piruvato-carboxi-quinasa (documento DE 199 50 409; DSM 13047), y/o

\bullet: el gen pgi que codifica la glucosa-6-fosfato-isomerasa (documento US 09/396.478; DSM 12969).

Adicionalmente, para la producción de aminoácidos y, en especial de L-lisina, puede ser conveniente, además de la sobre-expresión del gen zwa1, la desactivación de reacciones secundarias no deseadas (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", en: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (recopiladores), Academic Press, Londres, Reino Unido, 1982).

Los microorganismos preparados de acuerdo con la invención se pueden cultivar de manera continua o discontinua en procedimientos de lote (cultivo de lote), o en procedimientos de lote de alimentación (procedimiento de alimentación) o de lote de alimentación repetido (procedimiento de alimentación repetida) para la producción de aminoácidos y, en especial de L-lisina. En el libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnick (Editorial Gustav Fischer, Stuttgart, 1991), o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Editorial Vieweg, Braunschweig/Wiesbaden,1994) se describen recopilaciones sobre métodos de cultivo conoci-
dos.

El medio de cultivo utilizado debe ser apropiado para las necesidades de las correspondientes cepas. Descripciones de medios de cultivo para diferentes microorganismos aparecen en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology", de la American Society for Bacteriology (Washington D.C., EE.UU., 1981). Como fuente de carbono se pueden utilizar azúcares e hidratos de carbono tales como, por ejemplo, glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, almidón y celulosa, aceites y grasas tales como, por ejemplo, aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete, y manteca de coco, ácidos grasos tales como, por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes tales como, por ejemplo, glicerina y etanol, y ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético. Estos elementos se pueden emplear de manera aislada o como mezclas. Como fuente de nitrógeno se pueden utilizar compuestos orgánicos que contienen nitrógeno tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, maíz fermentado, harina de semillas de soja, y urea, o compuestos inorgánicos tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno se pueden utilizar de manera aislada o como mezclas. Como fuentes de fósforo se pueden utilizar ácido fosfórico, hidrógeno-fosfato de potasio o hidrógeno-fosfato dipotásico, o las correspondientes sales que contienen sodio. El medio de cultivo debe contener, adicionalmente, sales de metales tales como, por ejemplo, sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Por último, se pueden emplear nutrientes esenciales tales como aminoácidos y vitaminas junto con los elementos anteriormente mencionados. Al medio de cultivo se pueden agregar, además, precursores adecuados. Los citados componentes se pueden agregar al cultivo como una única adición, o suministrar de manera apropiada, durante el cultivo.

Para el control de pH del cultivo se utilizan, de modo adecuado, compuestos básicos tales como hidróxido sódico, hidróxido potásico, amoniaco o agua amoniacal, o compuestos ácidos tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Para controlar el desarrollo de espuma se pueden agregar antiespumantes tales como, por ejemplo, éster poliglicólico de ácidos grasos. Para mantener la estabilidad de los plasmidios se pueden aportar al medio elementos adecuados con acción selectiva tales como, por ejemplo, antibióticos. Para conservar las condiciones aeróbicas, se alimenta al cultivo oxígeno o mezclas gaseosas que contienen oxígeno tales como, por ejemplo, aire. La temperatura del cultivo se encuentra normalmente entre 20ºC y 45ºC y, preferentemente, entre 25ºC y 40ºC. El cultivo se continúa hasta que se haya formado la cantidad máxima de lisina. Este objetivo se alcanza, habitualmente, en el plazo de 10 horas hasta 160 horas.

El análisis de L-lisina se puede llevar a cabo por cromatografía de intercambio de aniones, con la subsiguiente derivatización de ninhidrina, como se describe en Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190).

Se han depositado los siguientes microorganismos en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ [Deutsche Sammlung für Mikroorganismen un Zellkulturen], Braunschweig, Alemania), de acuerdo con el Tratado de Budapest:

Escherichia coli cepa Top10F'/pCR2.1zwa1exp como DSM 13115.

El procedimiento según la invención sirve para la fabricación por fermentación de aminoácidos, en especial de L-lisina.

Ejemplos

La presente invención se explicará de manera más detallada a continuación en los siguientes ejemplos de realización.

Ejemplo 1 Preparación de una genoteca genómica de cósmidos a partir de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

Se aisló ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 de la forma descrita por Tauch et al. (1995, Plasmid 33:168-179), y se escindió parcialmente con la enzima de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Friburgo, Alemania, Descripción de Producto Sau3AI, Código nº 27-0913-02). Los fragmentos de ADN se defosforilaron con fosfatasa alcalina de gamba (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania, Descripción de Producto SAP, Código nº 1758250). El ADN del vector cosmídico SuperCos1 (Wahl et al. (1987), Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84:2160-2164), obtenido de Stratagene (La Jolla, EE.UU., Descripción del Producto SuperCos1 Cosmid Vector Kit, Código nº 251301), se escindió con la enzima de restricción XbaI (Amersham Pharmacia, Friburgo, Alemania, Descripción del Producto XbaI, Código nº 27-0948-02), y se defosforiló igualmente con fosfatasa alcalina de gamba. El ADN cosmídico se escindió, entonces, con la enzima de restricción BamHI (Amersham Pharmacia, Friburgo, Alemania, Descripción del Producto BamHI, Código nº 27-0868-04). El ADN cosmídico tratado de esta manera se mezcló con el ADN de ATCC13032 tratado, y el lote se trató con T4 ADN-ligasa (Amersham Pharmacia, Friburgo, Alemania, Descripción del Producto T4-ADN-ligasa, Código nº 27-0870-04). A continuación, la mezcla de ligadura se incorporó en fagos con la ayuda de Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla, EE.UU., Descripción del Producto Gigapack II XL Packing Extract, código nº 200217). Para la infección de la cepa NM554 de E. coli (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acid Research 16:1563-1575), las células se recogieron en MgSO_{4} 10 mM y se mezclaron con una parte alícuota de la suspensión de fagos. La infección y titulación de la genoteca cosmídica se llevaron a cabo de la forma descrita por Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), sembrándose las células sobre agar LB (Lennox, 1955, Virology 1:190) con 100 \mug/ml de ampicilina. Después de la incubación durante la noche a 37ºC, se seleccionaron clones individuales recombi-
nantes.

Ejemplo 2 Aislamiento y secuenciación del gen zwa1

El ADN cosmídico de una colonia individual se aisló con el Qiaprep Spin Miniprep Kit (Producto nº 27106, Qiagen, Hilden, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se escindió parcialmente con la enzima de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Friburgo, Alemania, Descripción del Producto Sau3AI, Producto nº 27-0913-02). Los fragmentos de ADN se defosforilaron con fosfatasa alcalina de gamba (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania, Descripción del Producto SAP, Producto nº 1758250). Tras la separación por electroforesis sobre gel, se aislaron los fragmentos cosmídicos en un intervalo de tamaño de 1500 a 2000 pb, con ayuda del QiaExII Gel Extraction Kit (Producto nº 20021, Qiagen, Hilden, Alemania). El ADN del vector de secuenciación pZero-1, adquirido en Invitrogen (Groningen, Holanda, Descripción del Producto Zero Background Cloning Kit, Producto nº K2500-01), se escindió con la enzima de restricción BamHI (Amersham Pharmacia, Friburgo, Alemania, Descripción del Producto BamHI, Producto nº 27-0868-04). La ligadura de los fragmentos cosmídicos en el vector de secuenciación pZero-1 se llevó a cabo de la forma descrita por Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), incubando la mezcla de ADN durante la noche con T4 ligasa (Pharmacia Biotech, Friburgo, Alemania). Seguidamente, esta mezcla de ligadura se sometió a electroporación (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123:343-347), en la cepa DH5\alphaMCR de E. coli (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87:4645-4649), y se sembró sobre placas de agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190), con 50 \mug/ml de zeocina. La preparación del plasmidio de los clones recombinantes se llevó a cabo con Biorobot 9600 (Producto nº 900200, Qiagen, Hilden, Alemania). La secuenciación se llevó a cabo por el método de detención de la cadena de dideoxi de Sanger et al. (1977, Proceedings of The National Academy of Sciences USA, 74:5463-5467), con modificaciones según Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18:1067). Se utilizó el "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" de PE Applied Biosystems (Producto nº 403044, Weiterstadt, Alemania). La separación por electroforesis sobre gel y el análisis de la reacción de secuenciación se llevaron a cabo en un gel "Rotiphoresis NF Acrylamide/Bisacrylamide" (29:1) (Producto nº A124.1, Roth, Karlsruhe, Alemania) con el secuenciador "ABI Prism 377" de PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Alemania).

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A continuación, los datos de secuencia brutos obtenidos se procesaron usando el paquete de programa Staden (1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231), versión 97.0. Se ensamblaron las secuencias individuales de los derivados de pZero1 para formar un cóntigo continuo. El análisis computarizado de la región de codificación se preparó con el programa XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231). Se llevaron a cabo análisis adicionales con el "BLAST search program" (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25:3389-3402) frente al banco de datos no redundante del "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.).

La secuencia de nucleótidos obtenida del gen zwa1 aparece representada en SEQ ID NO 1. El análisis de la secuencia de nucleótidos dio como resultado un marco de lectura abierto de 597 pares de bases, que se designó como gen zwa1. El gen zwa1 codifica un polipéptido de 199 aminoácidos, representado en SEQ ID NO 2.

Ejemplo 3 Preparación de un vector para la sobre-expresión de zwa1

A partir de la cepa ATCC 13032 se aisló ADN cromosómico de acuerdo con el método de Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)). Sobre la base de la secuencia del gen zwa1 conocida del Ejemplo 2 para C. glutamicum, se seleccionaron los siguientes oligonucleótidos para la reacción en cadena de la polimerasa:

zwa1-d1:

5' TCA CA CCG ATG ATT CAG GC 3'

zwa1-d2:

5' AGA TTT AGC CGA CGA AAG CG 3'

Los cebadores representados fueron sintetizados por la Compañía MWG Biotech (Ebersberg, Alemania), y la reacción de PCR se llevó a cabo de acuerdo con el método estándar de PCR de Innis et al. (PCR Protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press), con Pwo-polimerasa de la Compañía Boehringer. Con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa, se aisló un fragmento de ADN de un tamaño aproximado de 1,0 kb, portador del gen zwa1.

El fragmento de ADN amplificado se ligó con el TOPO TA Cloning Kit de la Compañía Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, EE.UU.; Número de Catálogo K4500-01) en el vector pCR2.1-TOPO (Mead et al. (1991), Bio/Technology 9:657-663). A continuación, la cepa Top10F' de E. coli se sometió a electroporación con la mezcla de ligadura (Hanahan, en: "DNA cloning. A practical approach". Vol. I, IRL-Press, Oxford, Washington D.C., EE.UU.). La selección de células portadoras de plasmidios se llevó a cabo sembrando en placas de agar LB el lote de transformación (Sambrook et al., Molecular cloning: a Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., EE.UU., 1989), suplementadas con 25 mg/l de kanamicina. Se aisló el ADN plasmídico de un transformante con la ayuda del QIAprep Spin Minoprep Kit de la Compañía Qiagen, y se comprobó la restricción con la enzima de restricción EcoRI y subsiguiente electroforesis sobre gel de agarosa (al 0,8%). El plasmidio se denominó pCR2.1zwa1exp.

Ejemplo 4 Duplicación del gen zwa1 en el productor de lisina DSM 5715

El vector pCR2.1zwa1 mencionado en el Ejemplo 3 se electroporó según el método de electroporación de Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123:343-347 (1994)) en Corynebacterium glutamicum DSM 5715. La cepa DSM es un productor de lisina resistente a AEC (aminoetil-cisteína). El vector pCR2.1zwa1exp no puede replicarse de manera independiente en DSM 5715 y sólo permanece presente en la célula cuando se encuentra integrado en el cromosoma de DSM 5715. La selección de clones con pCR2.1zwa1exp integrado en el cromosoma se llevó a cabo sembrando sobre placas de agar LB el lote de electroporación (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2ª edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), suplementadas con 15 mg/l de kanamicina. Para la detección de la integración se llevaron a cabo, de acuerdo con el método estándar de Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press), con Pwo-polimerasa de la Compañía Boehringer, reacciones de PCR de control. Mediante la combinación de los cebadores zwa1-d1 y zwa-d2 (véase el Ejemplo 3) con los cebadores M13 universal directo (5'-gttttcccagtcacgac-3') (Invitrogen Corporation, Nº de Catálogo N540-02) y M13 universal inverso (5'-caggaaacagctatgac-3') (Invitrogen Corporation, Nº de Catálogo N530-02), capaces de fijarse únicamente en el interior de la secuencia del vector pCR2.1zwa1exp, se pudo demostrar que el plasmidio pCR2.1zwa1exp se encontraba insertado en el cromosoma del productor de lisina DSM 5715. La cepa se designó DSM5715::pCR2.1zwa1exp.

Ejemplo 5 Preparación de lisina

La cepa de C. glutamicum DSM5715::pCR2.1zwa1exp, obtenida en el Ejemplo 4, se cultivó en un medio de nutrientes apto para la producción de lisina, determinándose el contenido en lisina en el sobrenadante del cultivo.

Para esto, se incubó la cepa, en primer lugar, sobre placas de agar con el correspondiente antibiótico (agar de cerebro-corazón con kanamicina (25 mg/l) durante 24 horas a 33ºC. A partir de este cultivo sobre placa de agar, se inoculó un cultivo previo (10 ml de medio en un matraz de Erlenmeyer de 100 ml). Como medio para el cultivo previo se utilizó el cultivo completo CgIII. Se agregó a este medio kanamicina (25 mg/l). El cultivo previo se incubó durante 48 horas a 33ºC y a 240 rpm sobre un dispositivo de agitación. A partir de este cultivo previo se inoculó un cultivo principal, de modo que la DO inicial (660 nm) del cultivo principal fue de 0,1. Para el cultivo principal se utilizó el medio MM.

Medio MM:

CSL (licor de maíz fermentado)	5 g/l
MOPS	20 g/l
Glucosa (tratada en autoclave por separado)	50 g/l

Sales:

(NH_{4})_{2}SO_{4}	25 g/l
KH_{2}PO_{4}	0,1 g/l
MgSO_{4} * 7 H_{2}O	1,0 g/l
CaCl_{2} * 2 H_{2}O	10 mg/l
FeSO_{4} * 7 H_{2}O	10 mg/l
MnSO_{4} * H_{2}O	5,0 mg/l
Biotina (filtrada a esterilización)	0,3 mg/l
Tiamina * HCl (filtrada a esterilización)	0,2 mg/l
L-Leucina (filtrada a esterilización)	0,1 g/l
CaCO_{3}	25 g/l

El CSL, MOPS y la solución salina se llevaron a pH 7 con amoniaco acuoso, y se trataron en autoclave. Se agregaron, entonces, las soluciones estériles de sustrato y de vitaminas, así como el CaCO_{3}, que se trató en autoclave en estado seco.

El cultivo se lleva a cabo en un volumen de 10 ml en un matraz cónico de 100 ml con placas de desviación. Se agregó kanamicina (25 mg/l). El cultivo se llevó a cabo a 33ºC y una humedad atmosférica de 80%.

Después de 48 horas, se determinó la DO con una longitud de onda de medición de 660 nm, con el dispositivo Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich). Se determinó la cantidad de lisina formada por medio de un analizador de aminoácidos de la Compañía Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania), por cromatografía de intercambio de iones y derivatización de post-columna con detección de ninhidrina.

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TABLA 1

Cepa	DO (660 nm)	Lisina-HCl (g/l)
DSM5715::pCR2.1zwa1exp	12,1	11,93
DSM5715	13,1	9,54

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Se adjuntan los siguientes dibujos:

Figura 1: Mapa del plasmidio pCR2.1zwa1exp

Los datos de longitud se deben entender como valores aproximados.

Las abreviaturas y designaciones utilizadas tienen los siguientes significados.

ColE1 ori:	Origen de replicación del plasmidio ColE1
lacZ:	Extremo 5' del gen de \beta-galactosidasa
fl ori:	Origen de replicación del fago f1
KmR:	Resistencia a la kanamicina
ApR:	Resistencia a la ampicilina
EcoRI:	Punto de corte de la enzima de restricción EcoRI
zwa1:	Gen zwa1

<110> Degussa-Hüls AG

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<120> Nuevas secuencias de nucleótidos que codifican el gen zwa1

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<130> 990172 BT

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<140>

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<141>

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<160> 2

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 1260

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<212> ADN

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<213> Corinebacterium glutamicum

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<220>

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<221> -10_señal

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<222> (383)..(388)

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<220>

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<221> -35_señal

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<222> (360)..(365)

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<220>

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<221> CDS

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<222> (413)..(1009)

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<400> 1

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1

2

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<210> 2

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<211> 199

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<212> PRT

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<213> Corynobacteruim glutamicum

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<400> 2

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3

4

Claims

1. Polinucleótidos aislados, que codifican un polipéptido con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2.

2. Polinucleótidos según la reivindicación 1, caracterizados por una secuencia de nucleótidos, seleccionada del grupo:

a): secuencia de nucleótidos según SEQ ID NO:1, o

b): una secuencia que se corresponde con la secuencia a) en el interior de la región de degeneración del código genético, o

c): secuencia de nucleótidos son las posiciones 413 hasta 1009 según SEQ ID NO:1.

3. Polinucleótido según la reivindicación 2, con una secuencia complementaria para la secuencia a) o b).

4. Polinucleótido según las reivindicaciones 1 a 3, con el origen de Corynebacterium.

5. Vectores replicables en bacterias corineformes, que contienen una secuencia de nucleótidos según las reivindicaciones 1 a 4.

6. Bacterias corineformes, en las que la expresión de un polinucleótido, que (codifica) un polipéptido con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2, se potencia en un grado que eleva la producción de L-aminoácidos de estas bacterias.

7. Bacterias corineformes según la reivindicación 6, en las que se incrementa la actividad intracelular del polipéptido con la secuencia SEQ ID NO:2, en donde se aumenta el número de copias del polinucleótido que codifica este polipéptido, o se utiliza un promotor potente y, eventualmente, se combinan estas medidas.

8. Bacterias corineformes según la reivindicación 6 ó 7, que se transforman con un vector que contiene un polinucleótido que codifica el polipéptido con la SEQ ID NO:2.

9. Procedimiento para la fabricación de L-aminoácidos, caracterizado porque las bacterias según las reivindicaciones 6 a 8 fermentan en un medio adecuado.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque

a): estas bacterias fermentan en un medio adecuado,

b): el o los L-aminoácidos deseados se concentran en el medio o en las células de las bacterias, y

c): se aíslan el o los L-aminoácidos.

11. Procedimiento según las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque se utilizan bacterias corineformes que producen L-lisina.

12. Procedimiento según las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque para la fabricación de L-lisina se fermentan bacterias en las que, simultáneamente, se potencian, en especial se sobre-expresan o amplifican, uno o múltiples genes, seleccionados del grupo

a): el gen dapA que codifica la dihidrodipicolinato-sintetasa,

b): el gen lysC que codifica una aspartato-quinasa resistente a la retroalimentación,

c): el gen dapD que codifica la tetra-dihidrodipicolinato-succinilasa,

d): el gen dapE que codifica el gen para la succinil-diamino-pimelato-desuccinilasa,

e): el gen gap que codifica la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa,

f): el gen pyc que codifica la piruvato-carboxilasa,

g): el gen mqo que codifica la malato:quinona óxido-reductasa,

h): el gen lysE que codifica una proteína para la exportación de lisina.

13. Procedimiento según las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque para la fabricación de L-lisina se fermentan bacterias en las que se atenúa el gen pgi que codifica la glucosa-6-fosfato isomerasa.

14. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 9 a 13 anteriores, caracterizado porque se utilizan microorganismos de la especie Corynebacterium glutamicum.

15. Vector pCR2.1zwa1exp, depositado bajo la designación DSM 13115 en E. coli.

16. Cebador o sonda que contiene al menos 30 nucleótidos consecutivos de la secuencia de polinucleótidos según SEQ ID NO:1.

17. Cebador o sonda según la reivindicación 16, caracterizado porque el cebador o la sonda contiene al menos 40 nucleótidos consecutivos de la secuencia de polinucleótidos según SEQ ID NO:1.