ES2223900T3 - Secuencias de nucleotidos que codifican el gen iysr2. - Google Patents
Secuencias de nucleotidos que codifican el gen iysr2.Info
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Abstract
Una bacteria corineforme aislada en la que la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID 5 NO:2, está eliminada, en donde el polipéptido tiene la función de un regulador de la transcripción de la familia lysR.
Description
Secuencias de nucleótidos que codifican el gen
lysR2.
La invención proporciona bacterias corineformes
aisladas, en donde la expresión de las secuencias de nucleótidos que
codifican el gen lysR2 está eliminada y un procedimiento para la
preparación fermentativa de L-lisina y
L-valina mediante la eliminación del gen lysR2. El
gen lysR2 codifica la proteína LysR2 que es un regulador de la
transcripción de la familia LysR.
Los L-aminoácidos, en particular
L-lisina y L-valina, se emplean en
la medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria
de productos alimenticios y muy particularmente en la nutrición
animal.
Se sabe que estos aminoácidos se preparan por
fermentación de cepas de bacterias corineformes, en particular de
Corynebacterium glutamicum. A causa de su gran importancia,
se trabaja constantemente en la mejora de los procedimientos de
preparación. Las mejoras de los procedimientos pueden referirse a
medidas técnicas de fermentación, tales como, por ejemplo, agitación
y suministro de oxígeno, o a la composición de los medios
nutricios, tales como, por ejemplo, la concentración de azúcar
durante la fermentación o el tratamiento para dar forma al producto
mediante, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico o las
propiedades intrínsecas de rendimiento del propio
microorganismo.
Para la mejora de las propiedades de rendimiento
de estos microorganismos se utilizan métodos de mutagénesis,
selección y elección de mutantes. De esta manera se obtienen cepas
que son resistentes a antimetabolitos o son auxótrofas con respecto
a metabolitos importantes en la regulación y que producen
aminoácidos.
Desde hace algunos años se utilizan también
métodos de la técnica de ADN recombinante para la mejora de cepas
productoras de L-aminoácidos de la cepa
Corynebacterium.
M. Vrljic y col. (Molecular Microbiology,
Blackwell Scientific, Oxford, GB, vol. 22 nº 5, 1 de diciembre de
1996 (1-12-1996), páginas
815-826, documento XP 000675794 ISSN:
0950-382X describen una cepa de bacterias
corineformes que carece de lysG, un miembro de la familia LysR de
reguladores. Sin embargo, no hay una homología significativa de las
secuencias entre LysG y LysR y el efecto sobre la producción de
lisina que se observaba estaba relacionado con la destrucción de la
proteína exportadora LysE más que con la destrucción de LysG.
Los inventores tenían el objeto de proporcionar
nuevas medidas técnicas para una preparación fermentativa mejorada
de L-lisina y L-valina.
La invención proporciona:
una bacteria corineforme aislada en la que la
expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido que
tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a
la secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO:2, está eliminada, en
donde el polipéptido tiene la función de un regulador de la
transcripción de la familia lysR.
Preferentemente, dicho polipéptido tiene la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2.
El polinucleótido tiene preferentemente
a) la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID
NO:1 o
b) al menos una secuencia que se corresponde con
la secuencia a) dentro del margen de degeneración del código
genético, u
opcionalmente,
c) mutaciones de hebra transcrita de función
neutra a) que no modifican la actividad de la
proteína/polipéptido.
La invención también proporciona:
un vector que comprende el fragmento interno de
SEQ ID NO:1 presente en SEQ ID NO:3 y bacterias corineformes en las
que se elimina el gen lysR2, en particular mediante inserción o
deleción.
Se describen polinucleótidos que comprenden
sustancialmente una secuencia de polinucleótidos que son obtenibles
escrutando mediante la hibridación de una genoteca correspondiente,
que comprende el gen completo con la secuencia de polinucleótidos
correspondiente a SEQ ID NO:1, con una sonda que comprende la
secuencia de los polinucleótidos mencionada, según la SEQ ID NO:1 o
un fragmento de la misma, y el aislamiento de la secuencia de ADN
mencionada.
Las secuencias de polinucleótidos de acuerdo con
la invención son adecuadas como sondas para la hibridación para
ARN, ADNc y ADN, para aislar ácidos nucleicos de longitud completa,
o polinucleótidos o genes que codifican la proteína LysR2 o para
aislar los ácidos nucleicos o los polinucleótidos o los genes que
tienen una gran similitud con la secuencia del gen lysR2. También
son adecuados para incorporar en los denominados "conjuntos",
"microconjuntos" o "chips de ADN", para detectar y
determinar los polinucleótidos correspondientes.
Las secuencias de polinucleótidos de acuerdo con
la descripción también son útiles como cebadores y con su ayuda se
puede preparar ADN de genes que codifican la proteína LysR2,
mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Tales oligonucleótidos que sirven como sondas o
cebadores comprenden al menos 25, 26, 27, 28, 29 ó 30,
preferentemente al menos 20, 21, 22, 23 ó 24, muy particularmente
preferido al menos 15, 16, 17, 18 ó 19 nucleótidos sucesivos. Los
oligonucleótidos con una longitud de al menos 31, 32, 33, 34, 35,
36, 37, 38, 39 ó 40, o al menos 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49
ó 50 nucleótidos también son adecuados. Los oligonucleótidos con
una longitud de al menos 100, 150, 200, 250 ó 300 nucleótidos son
opcionalmente también adecuados.
"Aislado" significa separado de su entorno
natural.
"Polinucleótido" se refiere en general a
polirribonucleótidos y polidesoxirribonucleótidos, siendo posible
que éstos sean ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado.
"Polipéptidos" significa péptidos o
proteínas que comprenden dos o más aminoácidos unidos mediante
enlaces peptídicos.
Los polinucleótidos incluyen un polipéptido según
la SEQ ID NO:2 con la actividad biológica de la proteína LysR2 y
también los que son al menos 90% idénticos y muy particularmente
preferidos al menos 91%, 93%, 95%, 97% o 99% idénticos al
polipéptido según la SEQ ID NO:2 y que tienen la actividad
mencionada.
La invención se refiere adicionalmente a un
procedimiento para la preparación fermentativa de aminoácidos
escogidos entre el grupo consistente en L-lisina y
L-valina que emplea bacterias corineformes que ya
producen en particular dichos aminoácidos y en las que las
secuencias de nucleótidos que codifican el gen lysR2 están
eliminadas.
El término "atenuación" en este contexto,
describe la eliminación de la actividad intracelular de una o
varias enzimas (proteínas) en un microorganismo, que están
codificadas por el ADN correspondiente, por ejemplo, empleando un
promotor débil o empleando un gen o un alelo que codifica una enzima
correspondiente con una baja actividad o que inactiva el gen, el
alelo o la enzima (proteína) correspondiente y, opcionalmente,
combinando estas medidas.
Los microorganismos que proporciona la presente
invención pueden preparar L-lisina y
L-valina a partir de glucosa, sacarosa, lactosa,
fructosa, maltosa, melazas, almidón, celulosa o a partir de
glicerina y etanol. Pueden ser representantes de bacterias
corineformes, en particular del género Corynebacterium. En
caso del género Corynebacterium, se pueden mencionar en
particular las especies Corynebacterium glutamicum, que es
conocida en el mundo especializado por su capacidad para producir
L-aminoácidos.
Cepas adecuadas del género
Corynebacterium, en particular de la especie
Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), son en
particular las cepas de tipo silvestre conocidas
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum
ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum
ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM
BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869
y
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
o mutantes que producen
L-aminoácidos o cepas preparadas a partir de los
mismos, tales como, por ejemplo, las cepas que producen
L-lisina
Corynebacterium glutamicum
FERM-P 1709
Brevibacterium flavum
FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum
FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum
FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum
FERM-P 6464
Corynebacterium glutamicum
DM58-1
Corynebacterium glutamicum
DG52-5
Corynebacterium glutamicum DSM 5715 y
Corynebacterium glutamicum DSM 12866
o tales como, por ejemplo, las cepas que producen
L-valina
Corynebacterium glutamicum DSM 12455
Corynebacterium glutamicum
FERM-P 9325
Brevibacterium lactofermentum
FERM-P 9324
Brevibacterium lactofermentum
FERM-BP 1763.
El gen lysR2 de C. glutamicum codifica la
proteína LysR2 que es un regulador de la transcripción de la
familia LysR.
Para aislar el gen lysR2 o también otros genes de
C. glutamicum, se establece en primer lugar una genoteca de
este microorganismo en Escherichia coli (E. coli). La
forma de establecer genotecas se describe en general en libros de
texto conocidos y en manuales. El libro de texto de Winnacker: Gene
und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie [Genes y clones,
una introducción en la tecnología genética] (Editorial Chemie,
Weinheim, Alemania, 1990) o el manual de Sambrook y col.: Molecular
Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989) se puede mencionar como ejemplo. Una genoteca bien conocida
es la de la cepa W3110 de E. coli K-12,
establecida en vectores \lambda por Kohara y col. (Cell 50,
495-508 (1987)). Bathe y col. (Molecular and
General Genetics, 252:255-265, 1996) describen una
genoteca de C. glutamicum ATCC13032 que se estableció con
ayuda del vector del cósmido SuperCos I (Wahl y col., 1987,
Proceedings of the National Academy of Sciences USA,
84:2160-2164) en la cepa NM554 de E. coli
K-12 (Raleigh y col., 1988, Nucleic Acids Research
16:1563-1575). Börmann y col. (Molecular
Microbiology 6(3), 317-326 (1992)) describen
a su vez una genoteca de C. glutamicum ATCC13032 empleando
el cósmido pHC79 (Hohn y Collins, 1980, Gene 11,
291-298).
Para preparar una genoteca de C.
glutamicum en E. coli también es posible utilizar
plásmidos tales como pBR322 (Bolivar, 1979, Life Sciences, 25,
807-818) o pUC9 (Vieira y col, 1982, Gene,
19:259-268). Los hospedadores adecuados son, en
particular, las cepas de E. coli que son defectuosas para la
restricción y la recombinación, tales como, por ejemplo, la cepa
DH5\alpha (Jeffrey H. Miller: "A Short Course in Bacterial
Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia
coli and Related Bacteria", Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1992).
Los fragmentos largos de ADN clonados con ayuda
de cósmidos u otros vectores \lambda, se pueden subclonar a
continuación a su vez en vectores usuales, adecuados para la
secuenciación de ADN.
Los métodos de secuenciación de ADN los
describen, entre otros, Sanger y col. (Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America USA,
74:5463-5467, 1977).
Las secuencias de ADN resultantes se pueden
investigar a continuación con algoritmos conocidos o con programas
de análisis de secuencias, tales como p. ej., el de Staden (Nucleic
Acids Research 14, 217-232 (1986)), el de Marck
(Nucleic Acids Research 16, 1829-1836 (1988)) o el
programa GCG de Butler (Methods of Biochemical Analysis 39,
74-97 (1998)).
La secuencia de ADN de C. glutamicum que
codifica el gen lysR2 y que se describe, como SEQ ID NO:1, en la
presente solicitud, se ha obtenido del modo siguiente. La secuencia
de aminoácidos de la proteína correspondiente se ha obtenido
adicionalmente a partir de la secuencia de ADN presente, por los
métodos descritos anteriormente. La secuencia de aminoácidos
resultante del producto del gen lysR2 se muestra en SEQ ID NO:2. Se
sabe que las enzimas endógenas en el hospedador pueden separar por
corte el aminoácido N-terminal metionina o
formilmetionina de la proteína formada.
Las secuencias de ADN codificadoras que son el
resultado de SEQ ID NO:1, por la degeneración del código genético,
también son conocidas. Del mismo modo, se describen secuencias de
ADN que se hibridan con SEQ ID NO:1 o con partes de SEQ ID NO:1.
Los intercambios conservadores de aminoácidos, tales como por ej.
el cambio de glicina por alanina o de ácido aspártico por ácido
glutámico en proteínas, se conoce adicionalmente entre los expertos
como "mutaciones de hebra transcrita" que no conducen a un
cambio fundamental en la actividad de la proteína, es decir, tienen
una función neutra. También se conoce que los cambios en el extremo
N y/o C-terminal de una proteína, no pueden dañar
sustancialmente su función o incluso pueden estabilizarla. El
experto puede encontrar información en este contexto, entre otros,
en Ben-Bassat y col. (Journal of Bacteriology
169:751-757 (1987)), en O'Regan y col. (Gene
77:237-251 (1989)), en Sahin-Toth y
col. (Protein Sciences 3:240-247 (1994)), en Hochuli
y col. (Bio/Technology 6:1321-1325 (1988)) y en
libros de texto conocidos de genética y de biología molecular. Se
describen secuencias de aminoácidos que son el resultado de SEQ ID
NO:2 de una forma correspondiente.
Finalmente, se describen secuencias de ADN que se
preparan por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR),
empleando cebadores que son el resultado de SEQ ID NO:1. Tales
oligonucleótidos tienen típicamente una longitud de al menos 15
nucleótidos.
Las instrucciones para identificar secuencias de
ADN mediante hibridación las puede encontrar el experto, entre
otros, en el manual "The DIG System Users Guide for Filter
Hybridization" de Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania,
1993) y en Liebl y col. (International Journal of Systematic
Bacteriology 41:255-260 (1991)). Las instrucciones
para la amplificación de secuencias de ADN con ayuda de la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) las puede encontrar el experto,
entre otros, en el manual de Gait: Oligonucleotide Synthesis: A
Practical Approach (IRL Press Oxford, UK, 1984) y en Newton y
Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania,
1994).
En el trabajo de la presente invención, se ha
encontrado que las bacterias corineformes producen
L-lisina y L-valina de un modo
mejorado después de eliminar el gen lysR2.
Para conseguir una atenuación, se puede eliminar
la expresión del gen lysR2 o las propiedades catalíticas de la
proteína enzimática. Las dos medidas se pueden combinar
opcionalmente.
La eliminación de la expresión génica puede tener
lugar cultivando de forma adecuada o por modificación genética
(mutación) de las estructuras de señal de la expresión génica. Las
estructuras de señal de la expresión génica son, por ejemplo, los
genes represores, los genes activadores, los operadores, los
promotores, los atenuadores, los sitios de unión al ribosoma, el
codón de iniciación y los terminadores. El experto puede encontrar
información sobre ésto, p. ej., en el documento de solicitud de
patente WO 96/15246, en Boyd y Murphy (Journal of Bacteriology
170:5949 (1988)), en Voskuil y Chambliss (Nucleic Acids Research
26:3548 (1998), en Jensen y Hammer (Biotechnology and
Bioengineering 58:191 (1998)), en Pátek y col. (Microbiology
142:1297 (1996)), Vasicova y col. (Journal of Bacteriology 181:6188
(1999)) y en libros de texto conocidos de genética y de biología
molecular, tales como, p. ej., el libro de texto de Knippers
("Molekulare Genetik [Genética Molecular]", 6ª ed., Georg
Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995) o el de Winnacker
("Gene und Klone [Genes y Clones]", VCH Verlagsgesellschaft,
Weinheim, Alemania, 1990).
Las mutaciones que conducen a un cambio o a una
reducción de las propiedades catalíticas de las proteínas
enzimáticas se encuentran en la técnica anterior; ejemplos que se
pueden mencionar son los trabajos de Qiu y Goodman (Journal of
Biological Chemistry 272:8611-8617 (1997)), Sugimoto
y col. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry
61:1760-1762 (1997)) y Möckel ("Die
Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung
der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms [Deshidratasa
de treonina procedente de Corynebacterium glutamicum:
Supresión de la regulación alostérica y de la estructura de la
enzima]", Informes del Jülich Research Centre,
Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Alemania, 1994).
Se pueden encontrar descripciones resumidas en
libros de texto de genética y de biología molecular, tales como, p.
ej., el de Hagemann ("Allgemeine Genetik [Genética General]",
Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
Mutaciones posibles son transiciones,
transversiones, inserciones y deleciones. Dependiendo del efecto
del cambio de aminoácidos sobre la actividad enzimática, se
denominan mutaciones de aminoácido o mutaciones terminadoras. Las
inserciones o las deleciones de al menos un par de bases (pb) en un
gen, conducen a mutaciones del marco de lectura, que tienen como
consecuencia la incorporación de aminoácidos incorrectos o la
interrupción prematura de la traducción. Las deleciones de diversos
codones conduce típicamente a una pérdida total de la actividad
enzimática. Instrucciones sobre la generación de tales mutaciones
pertenecen a la técnica anterior y se pueden encontrar en libros de
texto conocidos de genética y de biología molecular, tales como p.
ej., el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik [Genética
Molecular]", 6ª ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania,
1995), el de Winnacker ("Gene und Klone [Genes y Clones]", VCH
Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) o el de Hagemann
("Allgemeine Genetik [Genética General]", Gustav Fischer
Verlag, Stuttgart, 1986).
Un método común para mutar genes de C.
glutamicum es el método de rotura de genes y la sustitución de
genes, descritos por Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9,
84-87 (1991)).
En el método de la rotura génica, una parte
central de la región codificadora del gen de interés, se clona en
un vector de plásmido que se puede replicar en un hospedador
(típicamente, E. coli), pero no puede en C.
glutamicum. Los posibles vectores son, por ejemplo, pSUP301
(Simon y col., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)),
pK18mob o pK19mob (Schäfer y col., Gene 145, 69-73
(1994)), pK18mobsacB o pK19mobsacB (Jäger y col., Journal of
Bacteriology 174:5462-65 (1992)),
pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, EE.UU.),
pCR2.1-TOPO (Shuman (1994) Journal of Biological
Chemistry 269:32678-84; documento de patente de
EE.UU. 5.487.993), pCR®Blunt (Invitrogen, Groningen, Holanda;
Bernard y col., Journal of Molecular Biology,
234:534-541 (1993)) o pEM1 (Schrumpf y col., 1991,
Journal of Bacteriology 173:4510-4516). El vector
de plásmido que contiene la parte central de la región codificadora
del gen se transfiere a continuación a la cepa deseada de C.
glutamicum por conjugación o por transformación. El método de
conjugación está descrito, por ejemplo, por Schäfer y col. (Applied
and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)).
Los métodos para transformar están descritos, por ejemplo, por
Thierbach y col. (Applied Microbiology and Biotechnology 29,
356-362 (1988)), Dunican y Shivnan (Bio/Technology
7, 1067-1070 (1989)) y Tauch y col. (FEMS
Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)).
Después de la recombinación homóloga mediante un "entrecruzamiento
genético", la región codificadora del gen en cuestión está
interrumpida por la secuencia del vector y se obtienen dos alelos
incompletos, uno que carece de extremo 3' y uno que carece de
extremo 5'. Este método ha sido utilizado, por ejemplo, por
Fitzpatrick y col. (Applied Microbiology and Biotechnology 42,
575-580 (1994)) para eliminar el gen recA de C.
glutamicum.
La Figura 1 muestra a modo de ejemplo, el vector
de plásmido pCR2.1lysR2int, con cuya ayuda se puede destruir o
eliminar el gen lysR2.
En el método de sustitución génica, se establece
in vitro una mutación, tal como p. ej., una deleción, una
inserción o un cambio de base, en el gen de interés. El alelo
preparado se clona a su vez en un vector que no es replicativo para
C. glutamicum y éste se transfiere a continuación al
hospedador deseado de C. glutamicum por transformación o
conjugación. Después de una recombinación homóloga mediante un
primer "entrecruzamiento genético", que realiza la integración
y un segundo "entrecruzamiento genético" que realiza la
escisión en el gen diana o en la secuencia diana, se consigue la
incorporación de la mutación o del alelo. Este método lo emplearon,
por ejemplo, Peters-Wendisch y col. (Microbiology
144, 915-927 (1998)) para eliminar el gen pyc de
C. glutamicum con una deleción, una deleción, una inserción o
un cambio de base se pueden incorporar en el gen lysR2 de este
modo.
Además, puede ser ventajoso para la producción de
L-lisina y L-valina el potenciar,
en particular, sobreexpresar, una o varias enzimas de la ruta
biosintética particular, de la glicólisis, de la anaplerosis, del
ciclo de la pentosa-fosfato o de la exportación de
aminoácidos, además de atenuar el gen lysR2.
El término "potenciador" en este contexto,
describe el incremento de la actividad intracelular de una o varias
enzimas (proteínas) en un microorganismo que se codifican mediante
el ADN correspondiente, por ejemplo, incrementando el número de
copias del gen o de los genes, empleando un promotor potente o
empleando un gen o un alelo que codifica una enzima correspondiente
(proteína) que tiene una alta actividad y, opcionalmente,
combinando estas medidas.
De este modo, por ejemplo, para la preparación de
L-lisina, se puede potenciar, en particular
sobreexpresar, simultáneamente uno o varios de los genes escogidos
entre el grupo consistente en
\bullet el gen dapA que codifica la sintetasa
de dihidrodipicolinato (documento EP-B0197335)
\bullet el gen eno que codifica la enolasa
(documento DE: 19947791.4),
\bullet el gen zwf que codifica el producto
génico de zwf (documento
JP-A-09224661),
\bullet el gen pyc que codifica la carboxilasa
de piruvato (Peters-Wendisch y col. (Microbiology
144, 915-927 (1998)),
\bullet el gen lysE que codifica la exportación
de lisina (documento
DE-A-19548222),
\bullet el gen lysC que codifica una quinasa de
aspartato resistente a la retroalimentación (documentos
EP-B-0387527;
EP-A-0699759),
\bullet el gen zwa1 que codifica la proteína
Zwa1 (documento DE:19959328.0, DSM 13115).
Por tanto, por ejemplo, para la producción de
L-valina, se pueden potenciar, en particular
sobreexpresar simultáneamente uno o varios de los genes o alelos
escogidos entre el grupo consistente en
\bullet simultáneamente el gen ilvBN que
codifica la sintetasa de ácido acetohidroxi (Keilhauer y col.,
(1993) Journal of Bacteriology 175:5595-5603), o
\bullet simultáneamente el gen ilvD que
codifica la deshidratasa de ácido dihidroxi (Sahm y Eggeling (1999)
Applied and Environmental Microbiology
65:1973-1979), o
\bullet simultáneamente el gen mqo que codifica
la oxireductasa de malato:quinona (Molenaar y col., European
Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)).
Puede ser adicionalmente ventajoso para la
producción de L-lisina, además de la eliminación
del gen lysR2, eliminar simultáneamente uno o varios de los genes
escogidos entre el grupo consistente en
\bullet el gen pck que codifica la
carboxiquinasa de fosfoenol-piruvato (documento DE
19950409.1, DSM 13047),
\bullet el gen pgi que codifica la isomerasa de
glucosa-6-fosfato (documento US
09/396.478, DSM 12969),
\bullet el gen poxB que codifica la oxidasa de
piruvato (documento DE:19951975.7, DSM 13114),
\bullet el gen zwa2 que codifica la proteína
Zwa2 (documento DE 19959327.2, DSM 13113).
Finalmente, puede ser ventajoso para la
producción de L-lisina, además de la eliminación
del gen lysR2, eliminar simultáneamente uno o varios de los genes
escogidos entre el grupo consistente en
\bullet el gen hom que codifica la
deshidrogenasa de homoserina (documento
EP-A-0131171),
\bullet el gen thrB que codifica la quinasa de
homoserina (Peoples, O.W. y col., Molecular Microbiology 2 (1988):
63-72), y
\bullet el gen panD que codifica la
descarboxilasa de aspartato (documento
EP-A-1006192).
La eliminación de la deshidrogenasa de homoserina
también se puede conseguir, entre otros, mediante cambios de
aminoácidos, tales como por ejemplo, el cambio de
L-valina por L-alanina,
L-glicina o L-leucina en posición 59
de la proteína enzimática por cambio de L-valina
por L-isoleucina, L-valina o
L-leucina en posición 104 de la proteína enzimática
y/o por cambio de L-asparagina por
L-treonina o L-serina en posición
118 de la proteína enzimática.
La eliminación de la quinasa de homoserina
también se puede conseguir, entre otros, por cambios de
aminoácidos, tales como por ejemplo, el cambio de
L-alanina por L-valina,
L-glicina o L-leucina en posición
133 de la proteína enzimática y/o por cambio de
L-prolina por L-treonina,
L-isoleucina o L-serina en posición
138 de la proteína enzimática.
La eliminación de la descarboxilasa de aspartato
también se puede conseguir, entre otros, por cambios de
aminoácidos, tales como por ejemplo, por cambios de
L-alanina por L-glicina,
L-valina o L-isoleucina en posición
36 de la proteína enzimática.
Además de eliminar el gen lysR2, puede ser
adicionalmente ventajoso para la producción de
L-lisina y L-valina, eliminar
reacciones secundarias no deseables (Nakayama: "Breeding of Amino
Acid Producing Micro-organisms", en:
Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek
(compiladores), Academic Press, Londres, UK, 1982).
La invención también proporciona microorganismos
preparados según la invención y éstos se pueden cultivar continua o
discontinuamente en el procedimiento por cargas (cultivo por
cargas) o en la carga de alimentación (procedimiento de
alimentación) o el procedimiento de cargas de alimentación repetido
(procedimiento de alimentación repetitivo) con el fin de producir
L-aminoácidos, en particular
L-lisina y L-valina. Un resumen de
los métodos de cultivo conocidos se describe en el libro de texto
de Chmiel ("Bioprozesstechnik 1. Einführung in die
Bioverfahrenstechnik [Tecnología de Bioprocesos 1ª Introducción en
Tecnología de Bioprocesos" (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart,
1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und
periphere Einrichtungen [Bioreactores y Equipos periféricos] (Vieweg
Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
El medio de cultivo que se va a emplear debe
cumplir los requisitos de las cepas particulares en una forma
adecuada. Descripciones de los medios de cultivo para diversos
microorganismos están contenidas en el manual "Manual of Methods
for General Bacteriology" de la Sociedad Americana de
Bacteriología (Washington D.C., EE.UU. 1981). Azúcares e hidratos
de carbono, tales como p. ej., glucosa, sacarosa, lactosa,
fructosa, maltosa, melazas, almidón y celulosa, aceites y grasas,
tales como por ejemplo, aceite de habas de soja, aceite de girasol,
aceite de cacahuete y aceite de coco, ácidos grasos, tales como por
ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico,
alcoholes, tales como por ejemplo, glicerina y etanol, y ácidos
orgánicos, tales como por ejemplo, ácido acético, se pueden utilizar
como fuente de carbono. Estas sustancias se pueden emplear
individualmente o en forma de mezcla.
Los compuestos que contienen nitrógeno orgánico,
tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne,
extracto de malta, agua de fermentación de maíz, harina de habas de
soja y urea, o compuestos inorgánicos, tales como sulfato de
amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y
nitrato de amonio, se pueden emplear como fuente de nitrógeno. Las
fuentes de nitrógeno se pueden utilizar individualmente o como
mezcla.
El ácido fosfórico, el
dihidrógeno-fosfato potásico o el
hidrógeno-fosfato dipotásico o las sales
correspondientes que contienen sodio se pueden utilizar como fuente
de fósforo. El medio de cultivo debe comprender adicionalmente sales
de metales, tales como, por ejemplo, sulfato de magnesio o sulfato
de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente, se
pueden emplear sustancias esenciales para el crecimiento, tales
como aminoácidos y vitaminas, además de las sustancias mencionadas
anteriormente. Los precursores adecuados se pueden añadir, además,
al medio de cultivo. Las sustancias de partida mencionadas se pueden
añadir al cultivo en forma de una carga aislada o se pueden añadir
de forma adecuada durante el cultivo.
Los compuestos de carácter básico, tales como
hidróxido sódico, hidróxido potásico, amoniaco o amoniaco acuoso, o
los compuestos de carácter ácido, tales como ácido fosfórico o
ácido sulfúrico, se pueden emplear de una forma adecuada para
vigilar el pH del cultivo. Los antiespumantes, tales como por
ejemplo ésteres poliglicólicos de ácidos grasos se pueden emplear
para vigilar el desarrollo de la espuma. Sustancias adecuadas que
tienen una acción selectiva, tales como, por ejemplo, antibióticos,
se pueden añadir al medio para conservar la estabilidad de los
plásmidos. Para mantener las condiciones aeróbicas, se introducen
en el cultivo oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno,
tales como por ejemplo, aire. La temperatura del cultivo se sitúa
generalmente en 20ºC a 45ºC y preferentemente 25ºC a 40ºC. El
cultivo se prolonga hasta que se forma un máximo del producto
deseado. Este objetivo se consigue generalmente en el intervalo de
10 a 160 horas.
Por la técnica anterior se conocen métodos para
determinar los L-aminoácidos. El análisis se puede
realizar, por tanto, por ejemplo, tal y como describen Spackman y
col. (Analytical Chemistry, 30 (1958), 1190) mediante cromatografía
de intercambio aniónico con una posterior modificación de
ninhidrina o se puede realizar por HPLC de fase inversa, por ejemplo
tal y como describen Lindroth y col. (Analytical Chemistry (1979)
51:1167-1174).
Un cultivo puro del siguiente microorganismo fue
depositado el 28 de julio de 2000 ante la "Deutsche Sammlung für
Mikroorganismen und Zellkulturen" (DSMZ = Colección Alemana de
Microorganismos y Cultivos Celulares, Braunschweig, Alemania) de
acuerdo con el Tratado de Budapest:
\bullet cepa TOP10F/pCR2.1lysR2int de
Escherichia coli, como DSM 13617.
El procedimiento de acuerdo con la invención se
emplea para la preparación fermentativa de L-lisina
y L-valina.
La presente invención se ilustra con más detalle
a continuación con ayuda de ejemplos de realización.
El aislamiento del ADN de plásmido de
Escherichia coli y todas las técnicas de restricción, el
tratamiento con Klenow y con fosfatasa alcalina, se realizaron
según el método de Sambrook y col. (Molecular Cloning. A Laboratory
Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY, EE.UU.). Los métodos para transformar Escherichia
coli también se describen en este manual.
La composición de los medios nutrientes usuales,
tales como medio LB o TY, se puede encontrar en el manual de
Sambrook y col.
El ADN cromosómico de C. glutamicum ATCC
13032 se aisló tal y como describen Tauch y col. (1995, Plasmid
33:168-179) y se cortó parcialmente con la enzima
de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania,
Descripción del producto Sau3AI, nº de código
27-0913-02). Los fragmentos de ADN
de desfosforilaron con fosfatasa alcalina de gamba (Roche Molecular
Biochemicals, Mannheim, Alemania, Descripción del producto SAP, nº
de código 1758250). El ADN del vector del cósmido superCos1 (Wahl y
col., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences, EE.UU.
84:2160-2164), obtenido de Stratagene (La Jolla,
EE.UU., Descripción del producto SuperCos1 Cosmid Vector Kit, nº de
código 251301) se cortó con la enzima de restricción XbaI (Amersham
Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del producto XbaI, nº de
código 27-0948-02) y se desfosforiló
asimismo con fosfatasa alcalina de gamba.
El ADN del cósmido se cortó a continuación con la
enzima de restricción BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Alemania, Descripción del producto BamHI, nº de código
27-0868-04). El ADN del cósmido
tratado de este modo se mezcló con el ADN ATCC13032 y la carga se
trató con ligasa T4 de ADN (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania,
Descripción del producto
T4-DNA-Ligase, nº de código
27-0870-04). La mezcla de ligación
se empaquetó a continuación en fagos con ayuda de Gigapack II XL
Packing Extract (Stratagene, La Jolla, EE.UU., Descripción del
producto Gigapack II XL Packing Extract, nº de código 200217).
Para la infección de la cepa de E. coli
NM554 (Raleigh y col. 1988, Nucleic Acid Res.
16:1563-1575) se tomaron las células en MgSO_{4}
10 mM y se mezclaron con una parte alícuota de la suspensión de
fagos. La infección y la titulación de la genoteca de cósmidos se
realizaron tal y como describen Sambrook y col. (1989, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), las células se
extendieron en placas sobre agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190)
+ 100 \mug/ml de ampicilina. Después de incubar durante una noche
a 37ºC, se seleccionaron los clones individuales recombinantes.
El ADN del cósmido de una colonia individual, se
aisló con el equipo de reactivos de Qiaprep Spin Miniprep (producto
nº 27106, Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante y se cortó parcialmente con la enzima
de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania,
Descripción del producto Sau3AI, nº de producto
27-0913-02). Los fragmentos de ADN
se desfosforilaron con fosfatasa alcalina de gamba (Roche Molecular
Biochemicals, Mannheim, Alemania, Descripción del producto SAP, nº
de producto 1758250). Después de separar con electroforesis en gel,
los fragmentos del cósmido dentro del intervalo de tamaño de 1500 a
2000 pb, se aislaron con el equipo de reactivos de QiaExII Gel
Extraction (nº de producto 20021, Qiagen, Hilden, Alemania).
El ADN del vector de secuenciación
pZero-1, obtenido a partir de Invitrogen (Groningen,
Holanda, Descripción del producto Zero Background Cloning Kit, nº de
producto K2500-01) se cortó con la enzima de
restricción BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania,
Descripción del producto BamHI, nº de código
27-0868-04). La ligación de los
fragmentos del cósmido en el vector de secuenciación
pZero-1 se realizó tal y como describen Sambrook y
col. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor), incubando la mezcla de ADN durante una noche con ligasa T4
(Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania). Esta mezcla de ligación se
electroporó a continuación (Tauch y col. 1994, FEMS Microbiol.
Letters, 123:343-7) en la cepa de E. coli
DH5\alphaMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of
Sciences, EE.UU., 87:4645-4649) y se extendió en
placas sobre agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) con 50
\mug/ml de zeocina.
La preparación de los plásmidos de los clones
recombinantes se realizó con Biorobot 9600 (Nº de producto 900200,
Qiagen, Hilden, Alemania). La secuenciación se realizó por el
método didesoxi de terminación de cadena de Sanger y col. (1977,
Proceedings of the National Academies of Sciences, EE.UU.,
74:5463-5467) con las modificaciones de Zimmermann y
col. (1990, Nucleic Acids Research, 18:1067). Se empleó el equipo
de reactivos "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" de
PE Applied Biosystems (nº de producto 403044, Weiterstadt,
Alemania). La separación por electroforesis en gel y el análisis de
la reacción de secuenciación se realizaron en un gel de
"Rotiphoresis NF Acrilamida/Bisacrilamida" (29:1) (nº de
producto A124.1, Roth, Karlsruhe, Alemania) con el secuenciador
"ABI Prism 377" de PE Applied Biosystems (Weiterstadt,
Alemania).
Los datos obtenidos de la secuencia en bruto se
procesaron a continuación empleando el programa de empaquetamiento
de Staden (1986, Nucleic Acids Research,
14:217-231) versión 97-0. Las
secuencias individuales de los derivados de pZero1 se ensamblaron
para formar una secuencia contigua continua. Los análisis de la
región codificadora, asistidos con ordenador, se prepararon con el
programa XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research,
14:217-231). Otros análisis se realizaron con el
programa "BLAST search" (Altschul y col., 1997, Nucleic Acids
Research, 25:3389-3402) frente al banco de datos no
redundante del "National Center for Biotechnology Information"
(NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.)
La secuencia de nucleótidos resultante se muestra
en SEQ ID NO:1. El análisis de la secuencia de nucleótidos mostraba
un marco de lectura abierto de 933 pares de bases que se denominó
el gen lysR2. El gen lysR2 codifica un polipéptido de 310
aminoácidos.
A partir de la cepa ATCC 13032, se aisló ADN
cromosómico por el método de Eikmanns y col. (Microbiology 140:
1817-1828 (1994)). Basándose en la secuencia del
gen lysR2 conocida para C. glutamicum del ejemplo 2, se
escogieron los siguientes oligonucleótidos para la reacción en
cadena de la polimerasa (véase, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO:5):
lysR2intA:
5' CCA TCG TCG CAG AAT TCA AC 3'
lysR2intB:
5' GCT TCT TCG GCT AAT GCA TC 3'
Los cebadores mostrados se sintetizaron por MWG
Biotech (Ebersberg, Alemania) y la reacción de la PCR se realizó
según el método convencional de la PCR de Innis y col. (PCR
protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic
Press) con la polimerasa Pwo de Boehringer. Con ayuda de la reacción
en cadena de la polimerasa, se aisló un fragmento interno del gen
lysR2 de 439 pb, mostrándose el mismo en SEQ ID NO:3.
El fragmento de ADN amplificado se ligó con el
equipo de reactivos de TOPO TA Cloning de Invitrogen Corporation
(Carlsbad, CA, EE.UU.; número de catálogo K4500-01)
en el vector pCR2.1-TOPO (Mead y col. (1991)
Bio/Technology 9:657-663).
La cepa de E. coli TPO10F se transformó a
continuación con la carga de ligación (Hanahan, en: DNA cloning. A
practical approach. Vol. I, IRL-Press, Oxford,
Washington DC, EE.UU., 1985). La selección de las células portadoras
de plásmidos se realizó extendiendo en placas la carga de
transformación sobre agar LB (Sambrook y col., Molecular cloning: A
Laboratory Manual. 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, N.Y., 1989) que se había suplementado con 25 mg/l de
kanamicina. El ADN del plásmido se aisló a partir de un
transformante con ayuda del equipo de reactivos QIAprep Spin
Miniprep Kit de Qiagen y se comprobó por restricción con la enzima
de restricción EcoRI y posteriormente electroforesis sobre gel de
agarosa (0,8%). El plásmido se denominó pCR2.1lysR2int.
El vector pCR2.1lysR2int mencionado en el ejemplo
3, se electroporó por el método de electroporación de Tauch y col.
(FEMS Microbiological Letters, 123:343-347 (1994))
en Corynebacterium glutamicum DSM 5715 y en
Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1763.
La cepa DSM 5715 es un productor de lisina resistente a AEC
(documento EP-B-435132). La cepa
FERM BP-1763 es un productor de valina con
necesidad de isoleucina y metionina (documento US-A-
5.188.948). El vector pCR2.1lysR2int no se puede replicar
independientemente en DSM 5715 o en FERM BP-1763 y
se retiene en la célula sólo si se ha integrado en el cromosoma de
DSM 5715 o de FERM BP-1763. La selección de clones
con pCR2.1lysR2int integrado en el cromosoma se realizó extendiendo
en placas la carga de electroporación sobre agar-LB
(Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) que
se había suplementado con 15 mg/l de kanamicina.
Para detectar la integración, el fragmento
lysR2int se marcó con el equipo de reactivos de hibridación Dig de
Boehringer, según el método de "The DIG System Users Guide for
Filter Hybridization" de Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim,
Alemania, 1993). El ADN cromosómico de un integrante potencial se
aisló por el método de Eikmanns y col. (Microbiology
140:1817-1828 (1994)) y en cada caso se cortó con
las enzimas de restricción SalI, SacI y HindIII. Los fragmentos
formados se separaron por electroforesis en gel de agarosa y se
hibridaron a 68ºC con el equipo de reactivos de hibridación Dig de
Boehringer. El plásmido pCR2.1lysR2int mencionado en el ejemplo 3,
se había insertado en el cromosoma de DSM 5715 y FERM
BP-1763 dentro del gen cromosómico lysR2. Las cepas
se denominaron DSM5715::pCR2.1lysR2int y FERM
BP-1763::pCR2.1lysR2int.
Las cepas de C. glutamicum y B.
lactofermentum DSM5715::pCR2.1lysR2int y FERM
BP-1763::pCR2.1lysR2int obtenidas en el ejemplo 4,
se cultivaron en un medio nutriente adecuado para la producción de
L-lisina y L-valina y se determinó
el contenido en L-lisina y L-valina
en el material sobrenadante del cultivo.
Para ello, se incubaron las cepas en primer lugar
sobre una placa de agar con el antibiótico correspondiente (agar de
cerebro-corazón con kanamicina (25 mg/l) durante 24
horas a 33ºC. Partiendo de este cultivo en placas de agar, se
sembró un pre-cultivo (10 ml de medio en un frasco
cónico de 100 ml). El medio completo CgIII se empleó como medio
para el pre-cultivo.
| NaCl | 2,5 g/l |
| Bacto-peptona | 10 g/l |
| Extracto de bacto-levadura | 10 g/l |
| Glucosa (autoclavada separadamente) | 2% (p/v) |
| El pH se llevó a pH 7,4 |
La kanamicina (25 mg/l) se añadió al mismo. El
pre-cultivo se incubó durante 24 horas a 33ºC a 240
rpm en un agitador. Un cultivo principal se sembró a partir de este
pre-cultivo de modo que la DO inicial (660 nm) del
cultivo principal era DO 0,1. El medio MM se empleó para el cultivo
principal.
| CSL (agua de fermentación de maíz) | 5 g/l |
| MOPS | 20 g/l |
| Glucosa (autoclavada separadamente) | 50 g/l |
| Sales: | |
| (NH_{4})_{2}SO_{4} | 25 g/l |
(Continuación)
| KH_{2}PO_{4} | 0,1 g/l |
| MgSO_{4} * 7 H_{2}O | 1,0 g/l |
| CaCl_{2} * 2 H_{2}O | 10 mg/l |
| FeSO_{4} * 7 H_{2}O | 10 mg/l |
| MnSO_{4} * H_{2}O | 5,0 mg/l |
| Biotina (filtrada estéril) | 0,3 mg/l |
| Tiamina * HCl (filtrada estéril) | 0,2 mg/l |
| CaCO_{3} | 25 g/l |
El CSL, el MOPS y la solución salina se llevaron
a pH 7 con amoniaco acuoso y se autoclavaron. El sustrato estéril y
las soluciones de vitaminas se añadieron a continuación, así como
el CaCO_{3} autoclavado en estado seco. Para el cultivo de DSM
5715, se añadieron adicionalmente al medio 0,1 g/l de leucina. Para
el cultivo de FERM BP-1763, se añadieron al medio
adicionalmente 0,1 g/l de isoleucina y 0,1 g/l de metionina.
El cultivo se realizó en un volumen de 10 ml en
un frasco cónico de 100 ml con deflectores. Se añadió kanamicina
(25 mg/l). El cultivo se realizó a 33ºC y 80% de humedad
atmosférica.
Después de 72 horas, se determinó la DO con una
medición de la longitud de onda a 660 nm con un Biomek 1000
(Beckmann Instruments GmbH, Munich). La cantidad de
L-lisina y de L-valina formada se
determinó con un analizador de aminoácidos de
Eppendorf-Bio Tronik (Hamburgo, Alemania) mediante
cromatografía de intercambio iónico y reacción de
post-columna con detección de ninhidrina.
Los resultados del experimento se muestran en las
tablas 1 y 2.
Figura 1: Mapa del plásmido pCR2.1lysR2int.
Las abreviaturas y las designaciones empleadas
tienen el siguiente significado:
| KmR: | Gen de resistencia a la kanamicina |
| EcoRI: | Sitio de corte de la enzima de restricción EcoRI |
| lysR2int: | Fragmento interno del gen lysR2 |
| ColE1 ori: | Origen de replicación del plásmido ColE1. |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Degussa AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevas secuencias de nucleótidos que
codifican el gen lysR2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 000181 BT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1364
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (232)..(1161)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> gen lysR2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 310
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 439
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> lysR2int
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador lysR2intA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatcgtcgc agaattcaac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador lysR2intB
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskipgcttcttcgg ctaatgcatc
\hfill20
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Claims (17)
1. Una bacteria corineforme aislada en la que la
expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene
una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a la
secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO:2, está eliminada, en
donde el polipéptido tiene la función de un regulador de la
transcripción de la familia lysR.
2. La bacteria según la reivindicación 1, en
donde dicha bacteria es de la especie Corynebacterium
glutamicum.
3. La bacteria según la reivindicación 1, en
donde dicho polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos descrita
en SEQ ID NO:2.
4. La bacteria según la reivindicación 1, en la
que dicho polinucleótido tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ
ID NO:1.
5. Un procedimiento para preparar
L-lisina o L-valina que
comprende:
la fermentación de las bacterias según una de las
reivindicaciones 1 a 4, que producen dichos aminoácidos.
6. Un procedimiento para la preparación de
L-lisina o L-valina que
comprende:
la fermentación de dichas bacterias que producen
aminoácidos en donde la actividad intracelular del polipéptido
mostrado en SEQ ID NO:2, está eliminada.
7. Un procedimiento para la preparación de
L-lisina o L-valina que
comprende
la fermentación de dichas bacterias que producen
aminoácidos en donde la expresión del polinucleótido (gen lysR2)
descrito en SEQ ID NO:1, está eliminada.
8. El procedimiento según las reivindicaciones 6
ó 7 que comprende
a) la fermentación de dichas bacterias
b) la concentración de dichos aminoácidos, en el
medio o en las células de las bacterias, y
c) el aislamiento de dichos aminoácidos.
9. Un procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 5-8, en donde se emplean bacterias
en las que otros genes de la ruta biosintética de dichos
aminoácidos están potenciados o sobreexpresados adicionalmente.
10. Un procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 5-9, en donde se emplean bacterias
en las que las vías metabólicas que reducen la formación de dichos
aminoácidos, están eliminadas.
11. Un procedimiento según la reivindicación 9,
en donde se fermentan bacterias en las que simultáneamente se
potencia o se sobreexpresa uno o varios de los genes escogidos
entre el grupo consistente en
a) el gen dapA que codifica la sintetasa de
dihidrodipicolinato,
b) el gen eno que codifica la enolasa,
c) el gen zwf que codifica el producto génico de
zwf,
d) el gen pyc que codifica la carboxilasa de
piruvato,
e) el gen lysE que codifica una proteína para la
exportación de lisina,
f) el gen lysC que codifica una quinasa de
aspartato resistente a la retroalimentación,
g) el gen zwa1 que codifica la proteína Zwa1.
12. Un procedimiento según la reivindicación 10,
en el que se elimina o se eliminan simultáneamente uno o varios de
los genes escogidos entre el grupo consistente en:
a) el gen pck que codifica la carboxiquinasa de
fosfoenol-piruvato,
b) el gen pgi que codifica la isomerasa de
glucosa-6-fosfato,
c) el gen poxB que codifica la oxidasa de
piruvato,
d) el gen zwa2 que codifica la proteína Zwa2,
e) el gen hom que codifica la deshidrogenasa de
homoserina,
f) el gen thrB que codifica la quinasa de
homoserina y
g) el gen panD que codifica la descarboxilasa de
aspartato.
13. Un procedimiento según se ha revindicado en
una o en varias de las reivindicaciones 5-12, en
donde se emplean bacterias del género Corynebacterium.
14. El procedimiento según la reivindicación 13,
en donde se emplean dichas bacterias de la especie
Corynebacterium glutamicum.
15. Vector para la mutagénesis por integración,
que comprende el fragmento interno de SEQ ID NO:1, descrito en SEQ
ID NO:3.
16. El vector pCR2.1lysR2int,
a) que transporta un fragmento interno del gen
lysR2 de 439 pb de tamaño,
b) cuyo mapa de restricción está reproducido en
la figura 1, y
c) que está depositado en la cepa de E.
coli TOP10F/pCR2.1lysR2int con el número DSM 13617 en la
Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen [Colección
alemana de microorganismos y cultivos celulares].
17. Bacterias corineformes transformadas con un
vector de integración que es portador de un fragmento del
polinucleótido descrito en SEQ ID NO:1.
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