ES2247181T3 - Secuencias de nucleotidos que codifican para el gen tmk. - Google Patents
Secuencias de nucleotidos que codifican para el gen tmk.Info
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Abstract
Bacteria coryneform aislada donde la actividad o la concentración de la proteína que tienen una secuencia de amino ácido que tiene al menos 90% de identidad con la secuencia de amino ácidos establecida en SEQ ID NO:2 y tiene actividad de la timidilato quinasa es reducida a 0 % de la actividad o concentración de dicha proteína del microorganismo de partida.
Description
Secuencias de nucleótidos que codifican para el
gen tmk.
La invención proporciona bacterias coryneform
aisladas, donde la expresión de las secuencias de nucleótidos a
partir de las bacterias coryneform que codifican para el gen tmk es
eliminada y un proceso para la preparación fermentativa de
L-lisina usando bacterias en las cuales el gen tmk
es eliminado.
Los L-amino ácidos, en particular
la L-lisina, son usados en la medicina humana y en
la industria farmacéutica, en la industria de los alimentos y muy
particularmente en la nutrición animal.
Es conocido que los amino ácidos son preparados
por fermentación a partir de cepas de bacterias coryneform, en
particular la Corynebacterium glutamicum. Debido a su gran
importancia, el trabajo es constantemente retomado para mejorar el
proceso de preparación. Las mejoras al proceso pueden estar
relacionadas con las medidas de fermentación, tales como, por
ejemplo, la agitación y el suministro de oxígeno, o la composición
del medio nutriente, tal como, por ejemplo, la concentración de
azúcar durante la fermentación, o el trabajo hasta la conformación
del producto por, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico,
o las propiedades de rendimiento intrínsecas del propio
microorganismo.
Métodos de mutagénesis, selección y selección de
mutante son usados para mejorar las propiedades de rendimiento de
estos microorganismos. Las cepas que son resistentes a los
antimetabolitos o que son auxotróficas para los metabolitos de
importancia regulatoria y que producen amino ácidos son obtenidas de
esta forma.
Los métodos de la técnica de ADN recombinante han
sido también empleados durante algunos años para mejorar la clase de
las cepas Corynebacterium que producen L-amino
ácidos, amplificando los genes de biosíntesis de amino ácidos
individuales e investigando el efecto sobre la producción de amino
ácidos.
Los inventores tuvieron el objetivo de
proporcionar nuevas medidas para mejorar la preparación fermentativa
de la L-lisina.
Cuando la L-lisina o lisina son
mencionadas a continuación, no significan solo las bases sino
también las sales, tales como por ejemplo lisina monohidrocloruro o
lisina sulfato.
Un polinucleótido aislado a partir de la bacteria
coryneform, que comprende una secuencia de polinucleótidos que
codifica para el gen tmk, seleccionado del grupo que consiste de
- a)
- polinucleótido que codifica para un polipéptido el cual tiene la secuencia de amino ácidos de SEQ ID No. 2,
- b)
- polinucleótido que codifica para un polipéptido el cual comprende una secuencia de amino ácidos la cual es idéntica en una extensión de al menos el 90% a la secuencia de amino ácidos de SEQ ID No. 2,
- c)
- polinucleótido que es complementario a los polinucleótidos de a) o b), es descrito.
El polipéptido tiene la actividad de la
timidilato quinasa.
La descripción también contiene:
un polinucleótido, en particular ADN, el cual
tiene capacidad de replicación y tiene la secuencia de nucleótidos
mostrada en SEQ ID No.1;
un polinucleótido que codifica para un
polipéptido el cual tiene la secuencia de amino ácidos mostrada en
SEQ ID No. 2.
Se está reivindicando:
un vector pXK99Etmk que contiene partes del
polinucleótido descrito con SEQ ID NO:1,
y bacterias coryneform, en las cuales el gen tmk
es eliminado por una inserción o una eliminación.
\newpage
La invención proporciona:
- 1.
- Bacterias coryneform aisladas donde la actividad o la concentración de la proteína que tiene una secuencia de amino ácidos que tiene al menos 90% de identidad con la secuencia de amino ácidos establecida en SEQ ID NO:2 y tiene actividad de la timidilato quinasa es reducida a 0% de la actividad o concentración de dicha proteína del microorganismo de partida.
- 2.
- Bacterias coryneform de acuerdo a la reivindicación 1, donde la secuencia de amino ácidos de dicha proteína está establecida en SEQ ID NO:2.
- 3.
- Bacterias coryneform aisladas donde la actividad o la concentración de la proteína codificada por el polinucleótido establecido en SEQ ID NO:1 es reducida a 0% de la actividad o concentración de la proteína del microorganismo de partida.
La descripción también proporciona
polinucleótidos que comprenden sustancialmente una secuencia de
polinucleótidos, los cuales son obtenidos mediante selección por
medio de la hibridación de una biblioteca del gen correspondiente de
una bacteria coryneform, la cual comprende el gen completo o partes
del mismo, con una sonda que comprende la secuencia del
polinucleótidos descrita por la invención de acuerdo a SEQ ID N0.1 o
un fragmento de la misma, y aislamiento de la secuencia de
polinucleótidos mencionada.
Los polinucleótidos que comprenden las secuencias
descritas por la invención son apropiados como sondas de hibridación
para el ARN, cADN y ADN, con vistas a aislar, en toda la longitud,
los ácidos nucleicos o polinucleótidos o genes que codifican para la
timidilato quinasa o aislar aquellos ácidos nucleicos o
polinucleótidos o genes que tienen una alta similitud con la
secuencia del gen tmk. Ellos también son apropiados para la
incorporación en los llamados "arrays", "micro arrays" o
"chips de ADN" para detectar y determinar los polinucleótidos
correspondientes.
Los polinucleótidos que comprenden las secuencias
de acuerdo a la descripción son además apropiados como cebadores
con la ayuda de los cuales el ADN de los genes que codifican para la
timidilato quinasa pueden ser preparados mediante la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR).
Tales oligonucleótidos que sirven como sondas o
cebadores comprenden al menos 25, 26, 27, 28, 29 o 30,
preferiblemente al menos 20, 21, 22, 23 o 24, muy particularmente de
manera preferida al menos 15, 16, 17, 18 o 19 nucleótidos sucesivos.
Los oligonucleótidos que tienen una longitud de al menos 31, 32, 33,
34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 o al menos 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47,
48, 49 o 50 nucleótidos son también apropiados. Los oligonucleótidos
con una longitud de al menos 100, 150, 200, 250 o 300 nucleótidos
son también opcionalmente apropiados.
"Aislado" significa separado de su medio
natural.
"Polinucleótido" en general se refiere a
polirribonucleótidos y polideoxirribonucleótidos, siendo posible que
estos sean ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado.
Los polinucleótidos de acuerdo a la descripción
incluyen un polinucleótido de acuerdo a la SEQ ID N0. 1 o un
fragmento preparado a partir del mismo.
"Polipéptidos" es entendido como péptidos o
proteínas que comprenden dos o más amino ácidos enlazados por medio
de enlaces peptídicos.
Los polipéptidos de acuerdo a la descripción
incluyen un polipéptido de acuerdo a la SEQ ID No. 2 con la
actividad biológica de la timidilato quinasa, y también aquellos que
son 90% y preferiblemente al menos 91%, 93%, 95%, 97% o 99%
idénticos al polipéptido de acuerdo a la SEQ ID No. 2, y tienen la
actividad mencionada.
La invención además se relaciona con un proceso
para la preparación fermentativa de L-lisina usando
bacterias coryneform las cuales en particular ya producen
L-lisina y en las cuales las secuencias de
nucleótidos que codifican para el gen tmk son eliminadas.
El término "atenuación" en este contexto
describe la reducción o eliminación de la actividad intracelular de
una o más enzimas (proteínas) en un microorganismo las cuales son
codificadas por el ADN correspondiente, por ejemplo usando un
promotor débil o un gen o alelo que codifica para una enzima
correspondiente con una baja actividad o que inactiva el gen o
enzima (proteína) correspondiente, y que opcionalmente combina estas
medidas.
Por las medidas de atenuación, la actividad o
concentración de la proteína correspondiente es en general reducida
a 0% de la actividad o concentración de una proteína natural o de la
actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de
partida.
Los microorganismos con los cuales la presente
invención se relaciona pueden preparar amino ácidos a partir de
glucosa, sucrosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón,
celulosa o a partir de glicerol y etanol. Ellos pueden ser
representativos de bacterias coryneform, en particular del género de
la Corynebacterium. Del género de la Corynebacterium, pueden ser
mencionadas en particular las especies Corynebacterium glutamicum,
la cual es conocida entre los expertos por su capacidad para
producir L-amino ácidos.
Cepas apropiadas del género
Corynebacterium, en particular de las especies
Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), son en
particular las cepas naturales conocidas
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum
ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum
ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM
BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869
y
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
y mutantes que producen
L-amino ácidos o cepas preparadas a partir de los
mismos.
El gen tmk de C. glutamicum que codifica
para la timidilato quinasa (EC 2.7.4.9) ha sido aislado.
Para aislar el gen tmk o también otros genes de
C. glutamicum, una biblioteca de genes de este microorganismo
es primero establecida en Escherichia coli (E. coli).
El establecimiento de bibliotecas de genes es descrito en los libros
de textos y manuales generalmente conocidos. El libro de texto de
Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie
[Genes y Clones, Una Introducción a la Ingeniería Genética] (Verlag
Chemie, Weinheim, Alemania, 1990), o el manual de Sambrook y otros:
Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989) pueden ser mencionados como un ejemplo. Una
biblioteca de genes bien conocida es aquella de la cepa W3110
K-12 de E. coli establecida en vectores
\lambda por Kohara y otros (Cell 50, 495-508
(1987)). Bathe y otros (Molecular and General Genetics, 252:
255-265, 1996) describen una biblioteca de genes de
C. glutamicum ATCC13032, la cual fue establecida con la ayuda
del vector cósmido SuperCos I (Wahl y otros, 1987, Proceedings of
the National Academy of Sciences USA, 84:2160-2164)
en la cepa NM554 K-12 de E. coli (Raleigh y
otros, 1998, Nucleic Acids Research
16:1563-1575).
Börmann y otros (Molecular Microbiology
6(3), 317-326 (1992)) a su vez describen una
biblioteca de genes de C. glutamicum ATCC13032 usando el
cósmido pHC79 (Hohn y Collins, 1980, Gene 11,
291-298).
Para preparar una biblioteca de genes de C.
glutamicum en E. coli es también posible usar plásmidos tales
como pBR322 (Bolivar, 1979, Life Sciences, 25,
807-818) o pUC9 (Vieira y otros, 1982, Gene,
19:259-268). Hospederos apropiados son, en
particular, aquellas cepas de E. coli las cuales son
defectivas de recombinación y restricción, tales como, por ejemplo,
la cepa DH5\alphamcr, la cual ha sido descrita por Grant y otros
(Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990)
4645-4649). Los fragmentos largos de ADN clonados
con la ayuda de cósmidos u otros vectores \lambda pueden entonces
a su vez ser subclonados y subsiguientemente secuenciados en los
vectores comunes los cuales son apropiados para secuenciar ADN, tal
como es descrito por ejemplo por Sanger y otros (Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America,
74:5463-5467, 1977).
Las secuencias de ADN resultantes pueden entonces
ser investigadas con algoritmos o programas de análisis de
secuencias conocidos, tales como por ejemplo aquel de Staden
(Nucleic Acids Research 14, 217-232(1986)),
aquel de Mark (Nucleic Acids Research 16, 1829-1836
(1988)) o el programa GCG de Butler (Methods of Biochemical Analysis
39, 74-97 (1998)).
La secuencia de ADN de C. glutamicum que
codifica para el gen tmk y la cual, como SEQ ID No. 1, es un
constituyente de la presente descripción ha sido encontrada de esta
manera. La secuencia de amino ácidos de la proteína correspondiente
además ha sido derivada de la presente secuencia de ADN por medio de
los métodos descritos anteriormente. La secuencia de amino ácidos
resultante del producto del gen tmk es mostrada en SEQ ID No. 2.
Las secuencias que codifican el ADN las cuales
resultan de la SEQ ID No. 1 por la degeneración del código genético
son también un constituyente de la descripción. De la misma manera,
las secuencias de ADN que hibridan con SEQ ID No. 1 o partes de SEQ
ID No. 1 son un constituyente de la descripción. Intercambios de
amino ácidos conservativos, tales como por ejemplo intercambio de
glicina por alanina o de ácido aspártico por ácido glutámico en
proteínas, son además conocidos entre los expertos como
"mutaciones del mismo sentido" las cuales no conllevan a un
cambio fundamental en la actividad de la proteína, es decir son de
función neutral. Es además conocido que los cambios en el terminal N
o C de una proteína no pueden deteriorar sustancialmente la función
de la misma e incluso pueden estabilizarla. Información en este
contexto puede ser encontrada por el experto, entre otros, en
Ben-Bassat y otros (Journal of Bacteriology
169:751-757 (1987)), en O'Regan y otros (Gene
77:237-251 (1989)), en Sahin-Toth y
otros (Protein Sciences 3:240-247 (1994)), en
Hochuli y otros (Bio/Technology 6:1321-1325 (1988))
y en los libros de textos conocidos de genética y biología
molecular. Las secuencias de amino ácidos que resultan de una manera
correspondiente a partir de la SEQ ID No. 2 son también un
constituyente de la invención.
De la misma manera, las secuencias de ADN que
hibridan con SEQ ID No. 1 o partes de SEQ ID No. 1 son un
constituyente de la descripción. Finalmente, las secuencias de ADN
que son preparadas por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
usando cebadores que resultan de la SEQ ID No. 1 son un
constituyente de la descripción. Tales oligonucleótidos típicamente
tienen una longitud de al menos 15 nucleótidos.
Las instrucciones para identificar las secuencias
de ADN por medio de la hibridación pueden ser encontradas por el
experto, entre otros, en el manual "The DIG System User's Guide
for Filter Hibridization" de Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim,
Alemania, 1993) y en Liebl y otros (International Journal of
Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)). La
hibridación tiene lugar bajo condiciones astringentes, eso quiere
decir que solamente son formados híbridos en los cuales la sonda y
la secuencia diana, es decir los polinucleótidos tratados con la
sonda, que son al menos 70% idénticos son formados. Es conocido que
la astringencia de la hibridación, incluyendo los pasos de lavado,
es influenciada o determinada variando la composición del buffer, la
temperatura y la concentración de la sal. La reacción de hibridación
es preferiblemente llevada a cabo bajo astringencia relativamente
baja comparada con los pasos de lavado (Hybaid Hybridisation Guide,
Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996)
Un buffer 5x SSC a una temperatura de
aproximadamente 50ºC - 68ºC, por ejemplo, puede ser empleado para la
reacción de hibridación. Las sondas pueden también hibridarse aquí
con polinucleotidos que son menos del 70% idénticos a la secuencia
de la sonda. Tales híbridos son menos estables y son removidos por
el lavado bajo condiciones astringentes. Esto puede ser logrado, por
ejemplo, disminuyendo la concentración de sal a 2x SSC y
subsiguientemente de manera opcional a 0.5x SSC (The DIG System
User's Guide for Filter Hibridization, Boehringer Mannheim,
Mannheim, Alemania, 1995) siendo establecida una temperatura de
aproximadamente 50ºC - 68ºC. Es opcionalmente posible disminuir la
concentración de sal a 0.1x SSC. Los fragmentos de polinucleótidos
que son, por ejemplo, al menos 70% o al menos 80% o al menos 90% a
95% idénticos a la secuencia de la sonda empleada pueden ser
aislados incrementando la temperatura de hibridación de manera
escalonada desde 50ºC a 68ºC en pasos de aproximadamente 1 - 2ºC.
Instrucciones adicionales sobre la hibridación son obtenibles en el
mercado en forma de los llamados kits (por ejemplo DIG Easy Hyb de
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, Catalogo No.
1603558).
Las instrucciones para la amplificación de las
secuencias de ADN con la ayuda de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) pueden ser encontradas por el experto, entre otros,
en el manual de Gait: Oligonukleotide Synthesis: A Practical
Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) y en Newton y Graham: PCR
(Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania, 1994).
Ha sido encontrado que las bacterias coryneform
producen L-lisina en una manera mejorada después de
la eliminación del gen tmk.
Para lograr una atenuación, la expresión del gen
tmk o las propiedades catalíticas de la proteína de la enzima pueden
ser eliminadas. Las dos medidas pueden ser opcionalmente
combinadas.
La reducción en la expresión del gen puede tener
lugar por medio del cultivo apropiado o la modificación genética
(mutación) de las estructuras de señales de la expresión del gen.
Las estructura de señales de la expresión del gen son, por ejemplo,
genes represores, genes activadores, operadores, promotores,
atenuadores, sitios que enlazan el ribosoma, el codón de inicio y
los terminadores. El experto puede encontrar información sobre esto
por ejemplo en WO 96/15246, en Boyd y Murphy (Journal of
Bacteriology 170: 5949 (1988)), en Voskuil y Chambliss (Nucleic
Acids Research 26: 3548 (1998)), en Jesen y Hammer (Biotechnology
and Bioengineering 58: 191 (1998)), en Pátek y otros (Microbiology
142: 1297 (1996)), Vasicova y otros (Journal of Bacteriology 181:
6188 (1999)) y en libros de texto conocidos de biología molecular y
genética, tal como por ejemplo el libro de texto de Knippers
("Molekulare Genetik [Genética Molecular]", 6ta edición, Georg
Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995) o aquel de Winnacker
("Gene und Klone [Genes y Clones]", VCH Verlagsgesellschaft,
Weinheim, Alemania, 1990).
Las mutaciones que conducen a un cambio o
reducción en las propiedades catalíticas de las proteínas de las
enzimas son conocidas del arte anterior; los ejemplos que pueden ser
mencionados son los trabajos de Qiu y Goodman (Journal of Biological
Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto y otros
(Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61:
1760-1762 (1997)) y Möckel ("Die
Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung
der allosterischem Regulation und Struktur des Enzyms [Treonina
dehidratasa a partir de Corynebacterium glutamicum:
Cancelando la regulación alostérica y la estructura de la
enzima]", Reports from the Jülich Research Center,
Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Alemania, 1994).
Resumiendo, las descripciones pueden ser encontradas en libros de
textos conocidos de biología molecular y genética, tal como por
ejemplo aquel de Hagemann ("Allgemeine Genetik [Genética
General]", Gustav Fischer Verlag, Sttutgart, 1986).
Las posibles mutaciones son transiciones,
transversiones, inserciones y eliminaciones. Dependiendo del efecto
del intercambio de amino ácidos en la actividad de la enzima, se
refieren a "mutaciones de diferente sentido" o "mutaciones
sin sentido". Las inserciones o eliminaciones de al menos un par
base (pb) en un gen conduce a mutaciones con cambio, desplazamiento
o desfase del marco de lectura, como consecuencia de lo cual amino
ácidos incorrectos son incorporados o la traducción es interrumpida
prematuramente. Las eliminaciones de varios codones típicamente
conducen a una perdida completa de la actividad de la enzima. Las
instrucciones sobre la generación de tales mutaciones pertenecen al
arte anterior y pueden ser encontradas en libros de texto conocidos
de biología molecular y genética, tal como por ejemplo el libro de
texto de Knippers ("Molekulare Genetik [Genética Molecular]",
6ta edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995), aquel
de Winnacker ("Gene und Klone [Genes y Clones]", VCH
Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) o aquel de Hagemann
("Allgemeine Genetik [Genética General]", Gustav Fischer
Verlag, Sttutgart, 1986).
Un método común de mutar genes de C.
glutamicum es el método de "disrupción de genes" y
"reemplazo de genes" descritos por Schwarzer y Pühler
(Bio/Technology 9, 84-87 (1991)).
En el método de la disrupción de genes una parte
central de la región que codifica del gen de interés es clonada en
un vector plásmido el cual puede replicarse en un hospedero
(típicamente E. coli), pero no en C. glutamicum. Los
posibles vectores, son, por ejemplo, pSUP301 (Simon y otros,
Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob o
pK19mob (Schäfer y otros, Gene 145, 69-73 (1994)),
pK18mobsacB o pK19mobsacB (Jäger y otros, Journal of Bacteriology
174: 5462-65 (1992)), pGEM-T
(Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO
(Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry
269:32678-84; Patente US 5,487,993), pCR®Blunt
(Invitrogen, Groningen, Holanda; Bernard y otros, Journal of
Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) o pEM1
(Schrumpf y otros, 1991, Journal of Bacteriology
173:4510-4516). El vector plásmido que contiene la
parte central de la región que codifica del gen es entonces
transferido dentro de la cepa deseada de C. glutamicum por
conjugación o transformación. El método de conjugación es descrito,
por ejemplo, por Schäfer y otros (Applied and Environmental
Microbiology 60, 756-759 (1994)). Métodos para la
transformación son descritos, por ejemplo, por Thierbach y otros
(Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362
(1988)), Dunican y Shivnan (Bio/Technology 7,
1067-1070 (1989)) y Tauch y otros (FEMS
Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)).
Después de la recombinación homóloga por medio de un evento de
"cruzamiento", la región que codifica del gen en cuestión es
interrumpida por la secuencia del vector y dos alelos incompletos
son obtenidos, uno careciendo del extremo 3' y uno careciendo del
extremo 5'. Este método ha sido usado, por ejemplo, por Fitzpatrick
y otros (Applied Microbiology and Biotechnology 42,
575-580 (1994)) para eliminar el gen recA de C.
glutamicum.
En el método del "reemplazo de genes", una
mutación, tal como por ejemplo una eliminación, inserción o cambio
de base, es establecida in vitro en el gen de interés. El
alelo preparado es a su vez clonado en un vector el cual es no
replicativo para C. glutamicum por transformación o
conjugación. Después de la recombinación homóloga por medio de un
primer evento de "cruzamiento" el cual efectúa la integración y
un segundo evento de "cruzamiento" apropiado el cual efectúa la
escisión en el gen diana o en la secuencia diana, la incorporación
de la mutación o del alelo es lograda. Este método fue usado, por
ejemplo, por Peters-Wendisch y otros (Microbiology
144, 915 - 927 (1998)) para eliminar el gen pyc de C.
glutamicum por medio de una eliminación.
Una eliminación, inserción o un cambio de base
puede ser incorporada en el gen tmk de esta forma.
En adición, puede ser ventajoso para la
producción de L-amino ácidos mejorar, en particular
sobre-expresar, una o más enzimas de la ruta de la
biosíntesis particular, de la glicólisis, de la anaplerosis, del
ciclo de ácido cítrico, del ciclo de la fosfato pentosa, de la
exportación de amino ácidos y proteínas regulatorias opcionalmente,
en adición a la atenuación del gen tmk.
El término "mejoramiento" en este contexto
describe el incremento de la actividad intracelular de una o más
enzimas (proteínas) en un microorganismo las cuales son codificadas
por el ADN correspondiente, por ejemplo incrementando el número de
copias del gen o genes, usando un promotor potente o usando un gen o
alelo que codifica para una enzima (proteína) correspondiente que
tiene una actividad alta, y opcionalmente combinando estas
medidas.
Por medio de las medidas de mejoramiento, en
particular la sobre-expresión, la actividad o
concentración de la proteína correspondiente es en general
incrementada por al menos 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%,
300%, 400% o 500%, hasta un máximo de 1000% o 2000%, basado en
aquella de la proteína natural o la actividad o la concentración de
la proteína en el microorganismo de partida.
Así, por ejemplo, para la preparación de
L-amino ácidos, en adición a la eliminación del gen
tmk al mismo tiempo uno o más genes seleccionados del grupo que
consiste de
- \bullet
- el gen dapA que codifica para la dihidrodipicolinato sintasa (EP-B 0 197 335),
- \bullet
- el gen gap que codifica para la gliceraldehído 3-fosfato dehidrogenasa (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- \bullet
- el gen tpi que codifica para la triosa fosfato isomerasa (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086),
- \bullet
- el gen pgk que codifica para la 3-fosfoglicerato quinasa (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- \bullet
- el gen zwf que codifica para la glucosa 6-fosfato dehidrogenasa (JP-A-09224661),
- \bullet
- el gen pyc que codifica para la piruvato carboxilasa (DE-A-198 31 609),
- \bullet
- el gen mqo que codifica para la malato-quinona oxidoreductasa (Molenaar y otros, European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)),
- \bullet
- el gen lysC que codifica para una aspartato quinasa resistente a la regeneración (No. de acceso P26512; EP-B-0387527; EP-A-0699759),
- \bullet
- el gen lysE que codifica para la exportación de lisina (DE-A-195 48 222),
- \bullet
- el gen hom que codifica para la homoserina dehidrogenasa (EP-A 0131171),
- \bullet
- el gen ilvA que codifica para la treonina dehidratasa (Mökel y otros, Journal of Bacteriology (1992) 8065-8072)) o el alelo ilvA(Fbr) que codifica para una treonina dehidratasa "resistente a la regeneración" (Mökel y otros (1994), Molecular Microbiology 13: 833-842),
- \bullet
- el gen ilvBN que codifica para la acetohidroxy-ácido sintasa (EP-B 0356739),
- \bullet
- el gen ilvD que codifica para la dihidroxy-ácido dehydratasa (Sahm y Eggeling (1999) Applied and Enviromental Microbiology 65: 1973-1979),
- \bullet
- el gen zwa1 que codifica para la proteína Zwal (DE: 19959328.0, DSM 13115)
pueden ser mejorados, en particular
sobre-expresados.
Puede ser además ventajoso para la producción de
amino ácidos, en adición a la eliminación del gen tmk, que al mismo
tiempo uno o más genes seleccionados del grupo que consiste de
- \bullet
- el gen pck que codifica para la fosfoenol piruvato carboxiquinasa (DE 199 50 409.1, DSM 13047),
- \bullet
- el gen pgi que codifica para la glucosa 6-fosfato isomerasa (US 09/396,478, DSM 12969),
- \bullet
- el gen poxB que codifica para la piruvato oxidasa (DE: 1995 1975.7, DSM 13114),
- \bullet
- el gen zwa2 que codifica para la proteína Zwa2 (DE: 19959327.2, DSM 13113)
sean
eliminados.
En adición a la eliminación del gen tmk puede ser
ventajoso además para la producción de amino ácidos eliminar
reacciones colaterales indeseadas (Nakayama: "Reproducción de
Microorganismos que Producen Amino Ácidos", en: Overproduction of
Microbial Products, Kurumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic
Press, Londres, UK, 1982).
La invención también proporciona los
microorganismos preparados de acuerdo a la invención, y estos pueden
ser cultivados continuamente o discontinuamente en el proceso por
lotes (cultivo por lotes) o en el de lotes alimentados (proceso de
alimentación) o procesos por lotes alimentados repetidos (proceso de
alimentación repetitivo) para el propósito de la producción de
L-amino ácidos. Un resumen de los métodos de cultivo
conocidos es descrito en el libro de texto de Chmiel
(Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik
[Tecnología de los Bioprocesos 1. Introducción a la Tecnología de
los Bioprocesos] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el
libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen
[Bioreactores y Equipamiento Periférico] (Vieweg Verlag,
Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
El medio de cultivo a ser usado debe satisfacer
los requisitos de las cepas particulares de una manera apropiada.
Descripciones del medio de cultivo para varios microorganismos están
contenidas en el manual "Manual of Methods for General
Bacteriology" of the American Society for Bacteriology
(Washington D.C., USA, 1981).
Azúcares y carbohidratos, tales como por ejemplo
glucosa, sucrosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón y
celulosa, aceites y grasas, tales como por ejemplo aceite de soya,
aceite de girasol, aceite de maní y grasa de coco, ácidos grasos,
tales como por ejemplo ácido palmítico, ácido esteárico y ácido
linoleico, alcoholes, tales como por ejemplo glicerol y etanol, y
ácidos orgánicos, tales como por ejemplo ácido acético, pueden ser
usados como fuente de carbono. Estas sustancias pueden ser usadas
individualmente o como una mezcla.
Compuestos orgánicos que contienen nitrógeno,
tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne,
extracto de malta, licor de maíz fermentado, harina del fríjol de
soya y urea, o compuestos inorgánicos, tales como sulfato de amonio,
cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato
de amonio, pueden ser usados como la fuente de nitrógeno. Las
fuentes de nitrógeno pueden ser usadas individualmente o como una
mezcla.
El ácido fosfórico, fosfato de dihidrógeno
potasio o fosfato de hidrógeno dipotasio o las sales que contienen
sodio correspondientes pueden ser usadas como la fuente de fósforo.
El medio de cultivo debe además comprender sales de metales, tales
como por ejemplo sulfato de magnesio o sulfato de hierro, los cuales
son necesarios para el crecimiento. Finalmente, las sustancias de
crecimiento esenciales, tales como amino ácidos y vitaminas, pueden
ser empleadas en adición a las sustancias antes mencionadas.
Precursores adecuados pueden además ser adicionados al medio de
cultivo. Las sustancias de partida mencionadas pueden ser
adicionadas al medio de cultivo en la forma de un lote simple, o
pueden ser alimentadas durante el cultivo en una forma
apropiada.
Compuestos básicos, tales como hidróxido de
sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o amoníaco acuoso, o
compuestos ácidos, tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico,
pueden ser empleados de una manera apropiada para controlar el pH
del cultivo. Antiespumantes, tales como por ejemplo ésteres de
poliglicol de ácidos grasos, pueden ser empleados para controlar el
desarrollo de la espuma. Sustancias apropiadas que tienen una acción
selectiva, tales como por ejemplo antibióticos, pueden ser
adicionados al medio para mantener la estabilidad de los plásmidos.
Para mantener las condiciones aeróbicas, oxígeno o mezclas de gases
que contienen oxígeno, tales como por ejemplo aire, son introducidos
en el cultivo. La temperatura del cultivo es usualmente de 20ºC a
45ºC, y preferiblemente de 25ºC a 40ºC. El cultivo es continuado
hasta que un máximo del producto deseado se ha formado. Esta
selección es usualmente enriquecida en el rango de 10 horas a 160
horas.
Los métodos para la determinación de
L-amino ácidos son conocidos del arte anterior. Los
análisis pueden ser de esta manera llevados a cabo, por ejemplo,
como es descrito por Spackman y otros (Analytical Chemistry, 30,
(1958), 1190) por cromatografía de intercambio aniónico con una
derivación de ninhidrina subsiguiente, o pueden llevarse a cabo por
HPLC de fase revertida, por ejemplo como es descrito por Lindroth y
otros (Analytical Chemistry (1979) 51:
1167-1174).
El proceso de acuerdo a la invención es usado
para la preparación fermentativa de L-lisina.
Los siguientes microorganismos fueron depositados
como cultivos puros el 31 de Julio de 2001 en el Deutsche Sammlung
für Mikrorganismen und Zellkulturen (DSMZ = Colección Alemana de
Cultivos de Células y Microorganismos, Braunschweig, Alemania) de
acuerdo con el Tratado de Budapest:
- \bullet
- Escherichia coli DH5alphamcr/pXK99E (= DH5\alphamcr/pXK99E) como DSM 14440,
- \bullet
- Escherichia coli DH5alphamcr/pXK99Etmk (= DH5\alphamcr/pXK99Etmk) como DSM 14439.
La presente invención es explicada en más
detalles a continuación con la ayuda de los ejemplos de
realización.
El aislamiento del ADN plásmido a partir de la
Escherichia coli y todas las técnicas de restricción,
tratamiento de fosfatasa alcalina y Klenow fueron llevadas a cabo
por el método de Sambrook y otros, (Molecular Cloning. A Laboratory
Manual, (1989), Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY, USA). Los métodos para la transformación de la
Escherichia coli son también descritos en este manual.
La composición del medio nutriente usual, tal
como el medio LB o TY, puede también ser encontrada en el manual de
Sambrook y otros.
El ADN cromosomal de C. glutamicum ATCC
13032 fue aislado como es descrito por Tauch y otros (1995, Plasmid
33:168-179) y parcialmente escindido con la enzima
de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania,
Descripción del Producto Sau3AI, Código no.
27-0913-02). Los fragmentos de ADN
fueron desfoforilatados con fosfatasa alcalina de camarón (Roche
Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania, Descripción del Producto
SAP, Código no. 1758250). El ADN del vector cósmido SuperCos1 (Wahl
y otros (1987), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA
84:2160-2164), obtenido de Stratagene (La Jolla,
USA, Descripción del Producto Kit del Vector Cósmido SuperCos1,
Código no. 251301), fue escindido con la enzima de restricción XbaI
(Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto
XbaI, Código no. 27-0948-02) e
igualmente desfosforilatado con fosfatasa alcalina de camarón.
El ADN cósmido fue luego escindido con la enzima
de restricción BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania,
Descripción del Producto BamHI, Código no.
27-0868-04). El ADN cósmido tratado
de esta manera fue mezclado con el ADN ATCC13032 tratado y el lote
fue tratado con ligasa ADN T4 (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Alemania, Descripción del Producto
Ligasa-ADN-T4, Código
no.27-0870-04). La mezcla de
ligación fue entonces empacada en fagos con la ayuda de Extractos de
Empaque Gigapack II XL (Stratagene, La Jolla, USA, Descripción del
Producto Extractos de Empaque Gigapack II XL, Código no.
200217).
Para la infección de la cepa NM554 de E.
coli (Raleigh y otros 1988, Nucleic Acid Res.
16:1563-1575) las células fueron recogidas en 10 mM
de MgSO_{4} y mezcladas con una alícuota de la suspensión del
fago. La infección y titulado de la biblioteca del cósmido fueron
llevadas a cabo como es descrito por Sambrook y otros (1989,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), las
células siendo depositadas en agar LB (Lennox, 1955, Virology,
1:190) + 100 \mug/ml de ampicillina. Después de la incubación toda
la noche a 37ºC, clones individuales recombinantes fueron
seleccionados.
El ADN cósmido de una colonia individual fue
aislado con un Kit Qiaprep Spin Miniprep (Producto No. 27106,
Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo a las instrucciones del
fabricante y parcialmente escindido con la enzima de restricción
Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del
Producto Sau3AI, Producto No.
27-0913-02). Los fragmentos de ADN
fueron desfosforilatados con fosfatasa alcalina de camarón (Roche
Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania, Descripción del Producto
SAP, Producto No. 1758250). Después de la separación mediante
electroforesis en gel, los fragmentos cósmidos en un rango de tamaño
de 1500 a 2000 bp fueron aislados con el Kit de Extracción en Gel
QiaExII (Producto No. 20021, Qiagen, Hilden, Alemania).
El ADN del vector de secuenciación
pZero-1, obtenido de Invitrogen (Groningen, Holanda,
Descripción del Producto Kit de Clonación Zero Background, Producto
No. K2500-01) fue escindido con la enzima de
restricción BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania,
Descripción del Producto BamHI, Producto No.
27-0868-04). La ligación de los
fragmentos cósmidos en el vector de secuenciación
pZero-1 fue llevado a cabo como es descrito por
Sambrook y otros (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring, Harbor), la mezcla de ADN siendo incubada toda la noche con
ligasa T4 (Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania). Esta mezcla de
ligación fue entonces electroporada (Tauch y otros 1994, FEMS
Microbiol. Letters, 123:343-7) en la cepa
DH5\alphamcr de E. coli (Grant, 1990, Proceedings of the
National Academy of Sciences, U.S.A., 87:4645-4649).
Letters, 123.343-7 y depositada en agar LB (Lennox,
1995, Virology, 1:190) con 50 mg/l de zeocina.
La preparación del plásmido de los clones
recombinantes fue llevada a cabo con el Biorobot 9600 (Producto No.
900200, Qiagen, Hilden, Alemania). La secuenciación fue llevada a
cabo por el método de terminación de la cadena de dideoxi de Sanqer
y otros (1977, Proceedings of the National Academy of Sciences,
U.S.A., 74:5463-5467) con modificaciones de acuerdo
a Zimmermann y otros (1990, Nucleic Acids Research, 18:1067). El
"Kit de Secuenciación del Ciclo Terminador de RR dRodamina" de
PE Applied Biosystems (Producto No. 403044, Weiterstadt, Alemania)
fue usado. La separación por electroforesis en gel y el análisis de
la reacción de secuenciación fueron llevados a cabo en un gel de
"Acrilamida/Bisacrilamida de Rotiforesis NF" (29:1) (Producto
No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Alemania) con el secuenciador "ABI
Prism 377" de PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Alemania).
Los datos de la secuencia primaria obtenidos
fueron luego procesados usando el paquete de programa Staden (1986,
Nucleic Acid Research, 14:217-231) versión
97-0. Las secuencias individuales del pZero1
derivativas fueron reunidas en una secuencia contigua. Los análisis
asistidos por computadora de la región que codifica fueron
preparados con el programa XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids
Reseach, 14:217-231). Análisis adicionales fueron
llevados a cabo con el "Programa de investigación BLAST"
(Altschul y otros, 1997, Nucleic Acids Reseach,
25:3389-3402) contra el banco de datos no redundante
del "National Center for Biotecnology Information" (NCBI,
Bethesda, MD,
USA).
USA).
La secuencia de nucleótidos resultante es
mostrada en SEQ ID N0 1. El análisis de la secuencia de nucleótidos
mostró un marco de lectura abierto de 612 bp, el cual fue llamado el
gen tmk. El gen tmk codifica para un polipéptido de 203 amino
ácidos.
A partir de la cepa ATCC 13032, el ADN cromosomal
es aislado por el método de Eikmanns y otros (Microbiology 140:
1817-1828 (1994)). En base a la secuencia del gen
tmk conocida para C. glutamicum del ejemplo 2, los siguientes
oligonucleótidos fueron seleccionados de la reacción en cadena de la
polimerasa (ver SEQ ID No. 3 y SEQ ID No. 4):
tmk for:
5'-TG GGT ACC-ATT CAA GCC
GGA GCA CTA CC-3'
tmk int:
5'-GA TCT AGA-CAG CGC CGA
ATC CGA TTC AT-3'
Los cebadores fueron seleccionados aquí de manera
que el fragmento amplificado contuviera el gen incompleto,
comenzando con el ribosoma nativo que enlaza el sitio sin la región
promotora, y la región frontal del gen tmk. Además, el cebador tmk
for contiene la secuencia para el sitio de escisión de la
endonucleasa de restricción Kpn1, y el cebador tmk int el sitio de
escisión de la endonucleasa de restricción XbaI, las cuales están
marcadas por medio del subrayado en la secuencia de nucleótido
mostrada anteriormente.
Los cebadores mostrados fueron sintetizados por
MWG-Biotech AG (Ebersberg, Alemania) y la reacción
PCR fue llevada a cabo por el método PCR estándar de Innis y otros
(Protocolos de PCR. Una Guía para los Métodos y las Aplicaciones,
1990, Academic Press) con Pwo-Polimerasa de Roche
Diagnostics GmbH (Mannheim, Alemania). Con la ayuda de la reacción
en cadena de la polimerasa, los cebadores permitieron la
amplificación de un fragmento de ADN de 520 bp de tamaño, el cual
porta el gen tmk incompleto, incluyendo el ribosoma nativo que
enlaza el sitio.
El fragmento tmk de 520 bp de tamaño fue
escindido con endonucleasas de restricción KpnI y XbaI y luego
aislado a partir del gel de agarosa con el Kit de Extracción de Gel
QiaExII (Producto No. 20021, Qiagen, Hilden, Alemania).
El vector de expresión
IPTG-inducible pXK99E fue construido de acuerdo al
arte anterior. El vector está basado en el vector de expresión de la
Escherichia coli pTRC99A (Amann y otros, Gene 69:
301-315 (1988)) y contiene el promotor trc, el cual
puede ser inducido por adición de lactosa derivada IPTG (isopropil
\beta-D-tiogalactopiranosida), las
regiones de terminación T1 y T2, el origen de replicación ColE1 de
E. coli, el gen lacI^{q} (represor del operon lac de E.
coli), un sitio de clonación múltiple (mcs) (Norrander, J.M. y
otros Gene 26, 101-106 (1983)) y el gen
aph(3')-IIa de E. coli resistente a la
kanamicina (Beck y otros (1982), Gene 19:
327-336).
Se ha encontrado que el vector pXK99E es
específicamente apropiado para regular la expresión de un gen, en
particular para efectuar la expresión atenuada en la bacteria
coryneform. El vector pXK99E es un vector de expresión de E.
coli y puede ser usado en E. coli para la expresión
mejorada de un gen.
Ya que el vector no puede replicarse
independientemente en la bacteria coryneform, este es retenido en la
célula solamente si es integrado en el cromosoma. La peculiaridad de
este vector aquí es el uso para la expresión regulada de un gen
después de la clonación de una sección del gen de la región frontal
del gen correspondiente en el vector que contiene el codón de inicio
y el sitio de enlace del ribosoma nativo, y la integración
subsiguiente del vector en la bacteria coryneform, en particular
C. glutamicum. La expresión del gen es regulada por la
adición de cantidades dosificadas de IPTG al medio nutriente.
Cantidades de 1 \muM/l hasta 10 \muM/l de IPTG tienen el efecto
de una expresión muy débil del gen correspondiente, y cantidades de
l0 \muM/l hasta 100 \muM/l tienen el efecto de una expresión de
ligeramente atenuada a normal del gen correspondiente.
El vector de expresión pXK99E de E. coli
construido fue transferido por medio de electroporación (Tauch y
otros 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-347) en
DH5\alphamcr de E. coli (Grant, 1990, Proceedings of the
National Academy of Sciences U.S.A., 87:4645-4649).
La selección de los transformantes fue llevada acabo en LB Agar
(Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^{da}
Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,
1989), el cual había sido suplementado con 50 mg/l de
kanamicina.
El ADN del plásmido fue aislado a partir de un
transformante por métodos convencionales
(Peters-Wendisch y otros, 1988, Microbiology, 144,
915 - 927), escindido con la endonucleosa de restricción NcoI, y el
plásmido fue chequeado por electroforesis subsiguiente en gel de
agarosa.
La construcción del plásmido obtenida de esta
forma fue llamada pXK99E (figura 1). La cepa obtenida por
electroporación del plásmido pXK99E en la cepa DH5\alphamcr de
E. coli fue llamada DH5alphamcr/pXK99E de E. coli (=
DH5\alphamcr/pXK99E) y depositada el 31 de Julio de 2001 como DSM
14440 en el Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen
(DSMZ = Colección Alemana de Cultivos de Células y Microorganismos,
Braunschweig, Alemania) de acuerdo con el Tratado de Budapest.
El vector de expresión pXK99E de E. coli
descrito en el ejemplo 3.2 fue usado como el vector. El ADN de este
plásmido fue escindido completamente con las enzimas de restricción
KpnI y XbaI y luego defosforilatado con fosfatasa alcalina de
camarón (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, Descripción del
Producto SAP, Producto No. 1758250).
El fragmento de tmk de aproximadamente 500 bp de
tamaño descrito en el ejemplo 3.1, obtenido por medio de la PCR y
escindido con las enzimas de restricción KpnI y XbaI fue mezclado
con el vector pXK99E preparado y el lote fue tratado con ligasa ADN
T4 (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto
T4-ADN-Ligasa, Codigo
no.27-0870-04). El lote de ligación
fue transformado en la cepa DH5\alphamcr (Hanahan, In: DNA
cloning. A Practical Approach. Vol. I, IRL-Press,
Oxford, Washington DC, USA). La selección de las células que portan
plásmidos fue hecha por deposición del lote de transformación en
agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) con 50 mg/l de kanamicina.
Después de la incubación por una noche a 37ºC, clones recombinantes
individuales fueron seleccionados. El ADN del plásmido fue aislado a
partir de un transformante con el Kit Qiaprep Spin Miniprep
(Producto No. 27106, Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante y escindido con las enzimas de
restricción KpnI y XbaI para chequear el plásmido con electroforesis
subsiguiente en gel de agarosa. El plásmido resultante fue llamado
pXK99Etmk. Este es mostrado en la figura 2.
El vector pXK99E mencionado en el ejemplo 3 fue
electroporado por el método de electroporación de Tauch y otros,
(1989 FEMS Microbiology Letters, 123: 343-347) en la
cepa DSM5715 de C. glutamicum. El vector no puede replicarse
independientemente en DSM5715 y es retenido en la célula solamente
si se ha integrado en el cromosoma. La selección de los clones con
pXK99Etmk integrado fue llevado a cabo por deposición del lote de
electroporación en agar LB (Sambrock y otros, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. 2da Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989), que
habían sido suplementados con 15 mg/l de kanamicina y IPTG
(1mM/l).
Para la detección de la integración, el fragmento
tmk fue marcado con el kit de hibridación Dig de Boehringer por el
método de "La Guía de Usuarios del Sistema DIG para la Hibridación
sobre Filtro" de Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania,
1993). El ADN cromosomal de un integrante potencial fue aislado por
el método de Eikmanns y otros (Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994))
y en cada caso escindido con enzimas de restricción NcoI y KpnI. Los
fragmentos formados fueron separados por medio de electroforesis en
gel de agarosa e hibridados a 68ºC con el kit de hibridación Dig de
Boehringer. El plásmido pXK99Etmk mencionado en el ejemplo 3 había
sido insertado en el cromosoma de DSM5715 dentro del gen tmk
cromosomal. La cepa fue llamada DSM5715::pXK99Etmk.
La cepa DSM5715::pXK99Etmk de C.
glutamicum obtenida en el ejemplo 4 fue cultivada en un medio
nutriente apropiado para la producción de lisina y la lisina
contenida en el cultivo sobrenadante fue determinada. Por la adición
de IPTG (10 \muM/l), ocurre una expresión atenuada del gen tmk,
regulada por el promotor trc.
Para esto, la cepa fue primero incubada sobre una
placa de agar con el antibiótico correspondiente (agar
cerebro-corazón con kanamicina (25 mg/l) y IPTG (10
\muM/l)) por 24 horas a 33ºC. Comenzando a partir de este cultivo
en placa de agar, un precultivo fue sembrado (10 ml del medio en un
matraz cónico de 100 ml). El medio completo CgIII fue usado como el
medio para el precultivo.
| Medio Cg III | |
| NaCl | 2.5 g/l |
| Bacto-peptona | 10 g/l |
| Extracto de Bacto-Levadura | 10 g/l |
| Glucosa (puesta en autoclave separadamente) | 2% (p/v) |
| El pH fue llevado a pH 7.4. |
Kanamicina (25 mg/l) y IPTG (10 \muM/l) fueron
adicionados a esto. El precultivo fue incubado durante 16 horas a
33ºC a 240 rpm en una batidora. El cultivo principal fue sembrado a
partir de este precultivo de manera que el OD inicial (660 nm) del
cultivo principal fue 0.1 OD. El medio MM fue usado para el cultivo
principal.
| Medio MM | |
| CSL (licor de maíz fermentado) | 5 g/l |
| MOPS (ácido morfolinopropanosulfónico) | 20 g/l |
| Glucosa (en autoclave separadamente) | 50 g/l |
| Sales: | |
| (NH_{4})_{2}SO_{4} | 25 g/l |
| KH_{2}PO_{4} | 0.1 g/l |
| MgSO_{4} * 7 H_{2}O | 1.0 g/l |
| CaCl_{2} * 2 H_{2}O | 10 mg/l |
| FeSO_{4} * 7 H_{2}O | 10 mg/l |
| MnSO_{4} * H_{2}O | 5.0 mg/l |
| Biotina (estéril-filtrada) | 0.3 mg/l |
| Tiamina * HCL (estéril-filtrada) | 0.2 mg/l |
| Leucina (estéril-filtrada) | 0.1 g/l |
| CaCO_{3} | 25 g/l |
\newpage
El CSL, MOPS y la solución de la sal fueron
llevados a pH 7 con amoníaco acuoso y puestos en autoclave. El
sustrato estéril y las soluciones de vitamina fueron luego
adicionadas, así como el CaCO_{3} puesto en autoclave en estado
seco es adicionado.
El cultivo es llevado a cabo en un volumen de 10
ml en un matraz cónico de 100 ml con bafles. Kanamicina (25 mg/l) y
IPTG (10 \muM/l) fueron adicionados. El cultivo fue llevado a cabo
a 33ºC y 80% de humedad atmosférica.
Después de 72 horas, el OD fue determinado a una
longitud de onda de medición de 660 nm con un Biomek 1000 (Beckmann
Instruments GmbH, Munich). La cantidad de lisina formada fue
determinada con un analizador de amino ácido de
Eppendorf-BioTronic (Hamburgo, Alemania) por
cromatografía de intercambio iónico y derivación
post-columna con detección de ninhidrina.
El resultado del experimento es mostrado en la
tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
| Cepa | OD (660 nm) | Lisina HCl g/l |
| DSM5715 | 7.8 | 13.58 |
| DSM5715::pXK99Etmk | 11.3 | 15.51 |
\vskip1.000000\baselineskip
- Figura 1: Mapa del plásmido pXK99E,
- Figura 2: Mapa del plásmido pXK99Etmk.
\vskip1.000000\baselineskip
Las abreviaturas y designaciones usadas tienen el
siguiente significado.
- Kan:
- Gen aph(3')-IIa de Escherichia coli resistente a la kanamicina.
- KpnI
- Sitio de escisión de la enzima de restricción KpnI.
- NcoI
- Sitio de escisión de la enzima de restricción NcoI.
- XbaI
- Sitio de escisión de la enzima de restricción XbaI.
- Ptrc
- Promotor trc
- T1
- Región de terminación T1
- T2
- Región de terminación T2
- LacIq
- Represor lacIq del operón lac de la Escherichia coli
- OriV
- Origen de replicación ColEl de E. coli
- Tmk
- Región clonada del gen tmk.
<110> Degussa Ag
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Secuencias de nucleótidos que
codifican para el gen tmk
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 000481 BT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1120
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (244)..(852)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gen tkm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 203
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador tmk for
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgggtaccat tcaagccgga gcactacc
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador tmk for
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatctagaca gcgccgaatc agattcat
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (15)
1. Bacteria coryneform aislada donde la actividad
o la concentración de la proteína que tienen una secuencia de amino
ácido que tiene al menos 90% de identidad con la secuencia de amino
ácidos establecida en SEQ ID NO:2 y tiene actividad de la timidilato
quinasa es reducida a 0% de la actividad o concentración de dicha
proteína del microorganismo de partida.
2. Bacteria coryneform de acuerdo a la
reivindicación 1, donde la secuencia de amino ácidos de dicha
proteína está establecida en SEQ ID NO:2.
3. Bacteria coryneform aislada donde la actividad
o la concentración de la proteína codificada por el polinucleótido
establecido en SEQ ID NO:1 es reducida a 0% de la actividad o
concentración de la proteína del microorganismo de partida.
4. Cepas de las especies Corynebacterium
glutamicum de acuerdo a una o más de las reivindicaciones 1 a 3,
donde la actividad o concentración de dicha proteína es reducida a
0%.
5. DH5alphamcr/pXK99Etmk de E. coli (=
DH5\alphamcr/pXK99Etmk), depositada bajo DSM 14439 en el Deutsche
Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen [Colección Alemana de
Cultivo de Células y Microorganismos], DSMZ, Braunschweig,
Alemania.
6. Proceso para la preparación fermentativa de
L-lisina, que comprende:
- fermentación de la bacteria coryneform de acuerdo a una o más de las reivindicaciones 1 a 4 las cuales producen dicho L-amino ácido.
7. El proceso de acuerdo a la reivindicación 6,
que comprende
- fermentación de dicha bacteria
- concentración de dicho amino ácido, en el medio o en las células de dicha bacteria, y
- aislamiento de dicho amino ácido.
8. Proceso de acuerdo a las reivindicaciones 6 o
7, donde bacterias son empleadas, en las cuales la concentración o
la actividad de las proteínas codificadas por genes adicionales de
la ruta de la biosíntesis de la L-lisina son
incrementadas de 10 a 2000%.
9. Proceso de acuerdo a las reivindicaciones 6 o
7, donde bacterias son empleadas, en las cuales la concentración o
la actividad de las proteínas codificadas por genes adicionales de
la ruta metabólica las cuales reducen la formación del ácido de
L-lisina son reducidas a 0%.
10. Proceso de acuerdo a la reivindicación 6,
donde la expresión del polinucleótido(s) que
codifica(n) para el gen de la timidilato quinasa cuya
secuencia está establecida en SEQ ID NO:1 es eliminada por
transición, transversión, inserción o eliminación.
11. Proceso de acuerdo a la reivindicación 8,
donde para la preparación de L-lisina,
microorganismos coryneform son fermentados en los cuales al mismo
tiempo la actividad y concentración de una o más de las proteínas
codificadas por los genes seleccionados del grupo que consiste
de
- el gen dapA que codifica para la dihidrodipicolinato sintasa,
- el gen gap que codifica para la gliceraldehído 3-fosfato dehidrogenasa,
- el gen tpi que codifica para la triosa fosfato isomerasa,
- el gen pgk que codifica para la 3-fosfoglicerato quinasa,
- el gen zwf que codifica para la glucosa 6-fosfato dehidrogenasa,
- el gen pyc que codifica para la piruvato carboxilasa,
- el gen mqo que codifica para la malato-quinona oxidoreductasa,
- el gen lysC que codifica para una quinasa aspartato resistente a la regeneración,
- el gen lysE que codifica para la exportación de lisina,
- el gen zwal que codifica para la proteína Zwal
es o son incrementadas en 10 a
2000%.
12. Proceso de acuerdo a la reivindicación 9,
donde para la preparación de L-lisina,
microorganismos coryneform son fermentados en los cuales al mismo
tiempo la actividad y concentración de una o más de las proteínas
codificadas por los genes seleccionados del grupo que consiste
de
- el gen pck que codifica para la fosfoenol piruvato carboxiquinasa,
- el gen pgi que codifica para la glucosa 6-fosfato isomerasa,
- el gen poxB que codifica para la piruvato oxidasa,
- el gen zwa2 que codifica para la proteína Zwa2,
es o son reducidas a
0%.
13. Proceso de acuerdo a una o más de las
reivindicaciones 5 - 12, donde microorganismos de las especies
Corynebacterium glutamicum son empleados.
14. Proceso de acuerdo a la reivindicación 10,
donde la cepa DSM5715::pXK99Etmk de Corynebacterium es
empleada.
15. Vector pXK99Etmk,
- cuyo mapa de restricción es reproducido en la figura 2, y
- el cual es depositado en la cepa DH5alphamcr/pXK99Etmk de E. coli bajo el no. DSM 14439 en el Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen [Colección Alemana de Cultivos de Células y Microorganismos].
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-
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