KR20040031866A - 데옥시당의 중간체인티디피-4-케토-6-데옥시-디-글루코즈의 생합성 방법, 이를위한 재조합 효소들, 재조합 벡터들 및 형질전환체들 - Google Patents

데옥시당의 중간체인티디피-4-케토-6-데옥시-디-글루코즈의 생합성 방법, 이를위한 재조합 효소들, 재조합 벡터들 및 형질전환체들 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항생제 및 항암제의 생물학적 활성면에서 중요한 역할을 하는 데옥시당의 생합성 중간체 물질인 TDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈(TDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose)를 효율적으로 제조하는 방법, 이에 필요한 재조합 효소들 티민 일인산 키나제(Thymidine monophosphate kinase), 초산염 키나제(Acetate kinase), TDP-글루코즈 합성효소(TDP-glucose synthase) 및 TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제(TDP-D-glucose-4,6-dehydratase), 이들 효소를 생산하기 위한 재조합 벡터들, 및 형질전환체들에 관한 것이다.
따라서, 본 발명에 의하면, 저가 기질인 티민 일인산(Thymidine monophosphate)으로부터 한번의 반응에 의해 고부가 데옥시당 중간체 물질인 TDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈를 경제적으로 제조할 수 있으므로, 항생, 항암제의 저가 대량 생산에 따른 생산성 증가 효과와 함께, 다양한 신약의 개발 등 의약 분야에서 획기적인 발전을 기대할 수 있다.

Description

데옥시당의 중간체인 티디피-4-케토-6-데옥시-디-글루코즈의 생합성 방법, 이를 위한 재조합 효소들, 재조합 벡터들 및 형질전환체들{A biosynthetic process of TDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose as an intermediate of deoxy sugar, recombinant enzymes therefor, recombinant vectors and transformants}
본 발명은 항생제 및 항암제의 생물학적 활성면에서 중요한 역할을 하는 데옥시당의 생합성 중간체 물질인 TDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈(TDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose)를 효율적으로 제조하는 방법, 이에 필요한 재조합 효소들 티민 일인산 키나제(Thymidine monophosphate kinase), 초산염 키나제(Acetate kinase), TDP-글루코즈 합성효소(TDP-glucose synthase) 및 TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제(TDP-D-glucose-4,6-dehydratase), 이들 효소를 각각 생산하기 위한 재조합 벡터들, 및 이들 재조합 벡터들로 형질전환된 각각의 형질전환체들에 관한 것이다.
일반적으로, 생체에 있어서 당 성분(글리콘)은 주 에너지원으로서의 역할 외에, 많은 이차 대사 물질의 생물학적 활성 및 기능과 관련하여서도 중요한 영향을 미친다. 예컨대 마크롤라이드계(macrolides) 화합물이나 안트라사이클린계 (anthracyclines) 화합물 같은 항생, 항암적 활성을 지닌 많은 이차 대사 물질들이 구조내에 데옥시헥소즈(deoxyhexose)와같은 데옥시당, 이데옥시당, 삼데옥시당, 아미노-데옥시당 및 니트로-데옥시당 등을 포함하고 있으며, 이러한 이차 대사 물질의 데옥시당 성분은 항생, 항암제의 생물학적 활성 및 친화력에 직간접적으로 관여하고 있을 뿐아니라, 항생제의 내성에도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
이에, 최근 들어서는 많은 연구진들에 의해, 새로운 탄수화물 구조를 가진 화합물을 합성하고, 이를 여러가지로 변형된 어글리콘(aglycon)에 결합시켜 보다 다양한 유도체를 합성하는 과정을 통해 새로운 활성을 가지거나 기능이 강화된 신규 화합물을 제조함으로써, 기존의 항생제에 비해 훨씬 강력하고 내성이 극복된 새로운 신물질을 개발하기 위한 노력이 광범위하게 이루어지고 있다.
그 일례로서, 프린스톤 대학의 칸(D. Kahn) 교수는 글리코실화 기술을 이용하여 기존의 글리콘을 선택적으로 새로운 데옥시당인 UDP-4-에피-반코사민으로 치환함으로써 기존의 반코마이신 보다 생물학적 활성이 커진 새로운 화합물을 합성하였다[참고문헌:Biochemistry2001; 40(15):4745-55. Losey HC, Peczuh MW, Chen Z, Eggert US, Dong SD, Pelczer I, Kahne D, Walsh CT. Related Articles,Nucleotide, Protein Tandem action of glycosyltransferases in the maturation of vancomycin and teicoplanin aglycones: novel glycopeptides].
그러나, 이러한 신규 화합물 합성에 있어, 기존의 유기 화학적 합성 방법은 통상 여러 단계를 거쳐 합성 과정이 수행되며, 따라서 반응 수율이 매우 낮아 대량 생산에는 어려움이 많다는 문제점이 있어 왔다. 전술한 유기 합성 방법의 문제점을 극복하기 위해 제시된 방법의 하나가 생체 촉매를 이용한 생물학적 합성 공정으로의 전환이다.
생체 촉매를 이용한 합성법은 반응 기질에 대한 입체 특이성 및 반응 수율이 매우 높으며, 이에 반해 반응 부산물은 매우 낮은 잇점이 있다. 따라서 이런 생합성 공정에 있어서는 합성에 사용되는 반응 기질의 저가 대량 생산 공정 및 이때 필요한 생체 촉매의 대량 생산이 중요한 요소라 할 수 있다.
이에, 각종 항생 및 항암 물질에 대한 생체내 생합성 과정과 관련하여, 미생물을 대상으로 연구를 거듭한 결과, 세포 밖에서 일-, 이-, 혹은 삼데옥시당 등을 포함하는 항생제를 생산하는 여러 미생물들이 공통적으로 TDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈의 생합성 경로를 갖고 있음을 미생물 유전자 집단의 염기 서열 분석 과정을 통해 알 수 있었다[참고문헌: Sohng, J. K., Oh, T.J., Kim, C. G., (1998) Method for cloning biosynthetic genes of secondary metabolites including deoxysugar from Actinomycetes.J. Biochem. Mol. Biol., 31, 475-483].
이에 따라, TDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈가 여러 가지 데옥시당을 만드는 중간체 물질로서 생합성 경로의 분기점 역할을 하는 중요한 물질임이 알려지게 되었으며, 새로운 데옥시당 화합물의 합성을 위해 TDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈의 대량 생산이 중요한 과제로 떠올랐다.
TDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈 제조를 위한 초기의 연구에서는 TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제에 의해 TDP-D-글루코즈로부터 이 화합물을 생합성하는 방법이 이용되었다 [참고문헌:Angew. Chem. Int. Ed1995, 34. No. 16 Andreas Stein, Maria-Regina Kela and Lather Elling, Stefan Verseck, and Werner Klaffke Synthesis of TDP-6-Deoxy-4-keto glucose and Analogues with Native and Recombinant TDP-Glucose-4,6-dehydratase]. 그러나 이 방법은 기질로서 고가의 물질인 TDP-D-글루코즈를 이용하는 방법으로 경제성이 매우 낮은 문제점이 있다.
따라서 다른 기질을 이용하는 또다른 연구가 시도되었는데, 그 하나로서 독일의 쿨라(Kula) 연구팀은 수크로즈(sucrose)와 티디피(TDP)로부터 수크로즈 합성효소를 이용하여 TDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈를 생합성하는 방법을 개발하였다[참고문헌:Glycoconj J1998 Feb;15(2):139-45 Stein A, Kula MR, Elling L. Combined preparative enzymatic synthesis of TDP-6-deoxy-4-keto-D-glucose from TDP and sucrose]. 이 방법은 TDP-D-글루코즈를 이용하는 종래의 방법에 비해서는 경제적이고 효과적이지만, 반응물질인 TDP도 역시 고가의 시약이므로 그 사용이 제한된다는 단점을 가지고 있다.
새로운 항생, 항암 물질의 개발 및 이들의 대량 생산을 위해, 데옥시당 화합물의 생합성 중간체 물질인 TDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈를 저 비용, 고 생산성으로 제조하기 위한 경제적인 생합성 방법을 제공하는데 본 발명의 목적이 있다.
도 1a는 효소 티민 일인산 키나제 유전자(tmk)를 발현 벡터 pET15b내로 삽입하여 제작한 재조합 벡터 pET15b:tmk의 유전자 지도.
도 1b는 효소 초산염 키나제 유전자(ack)를 발현 벡터 pET24ma내로 삽입하여 제작한 재조합 벡터 pET24ma:ack의 유전자 지도.
도 1c는 효소 TDP-글루코즈 합성효소 유전자(rffH)를 발현 벡터 pET24ma내로 삽입하여 제작한 재조합 벡터 pET24ma:rffH의 유전자 지도.
도 1d는 효소 TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제 유전자(rfb'B')를 발현 벡터 pRSETB내로 삽입하여 제작한 재조합 벡터 pRSETB:rfb'B'의 유전자 지도.
도 2는 형질전환 미생물인 대장균 균주들의 효소 발현 유도후 수득된 조 추출물을 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동한 결과를 나타내는 사진[1 레인은 저 분자량 마커이고, 2 레인은 과다발현된 티민 일인산 키나제 추출물이고, 3 레인은 과다발현된 초산염 키나제 추출물이며, 4 레인은 과다발현된 dTDP-글루코즈 합성효소 추출물이고, 5 레인은 과다발현된 dTDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제 추출물이며, 6 레인은 대조용으로서 대장균 BL21 추출물임].
도 3은 dTDP-4-케토-6-데옥시 글루코즈 합성 반응에 미치는 Mg2+의 영향을 나타내는 그래프.
도 4는 dTDP-4-케토-6-데옥시 글루코즈 합성 반응에 미치는 아세틸 포스페이트의 영향을 나타내는 그래프.
도 5은 dTDP-4-케토-6-데옥시 글루코즈 합성 반응에 미치는 글루코즈-1-인산의 영향을 나타내는 그래프.
도 6은 하기 실시예 4에서 실시한 dTDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈의 합성을 나타내는 고속 액체 크로마토그래피 결과에 대한 그래프.
도 7는 하기 실시예 5에서 실시한 dTDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈의 그램 단위 생산을 나타내는 고속 액체 크로마토그래피 결과에 대한 그래프.
본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위한 것으로서, 4종의 재조합 효소를 사용하여, 저가 기질인 티민 일인산(Thymidine 5'-monophosphate, TMP)으로부터 데옥시당의 생합성 중간체인 TDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈를 효율적으로 제조하는 것에 관한 것으로, 구체적으로는 TDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈의 제조에 필요한 4종의 효소, 티민 일인산 키나제(Thymidine 5'-monophosphate kinase), 초산염 키나제(Acetate kinase), TDP-글루코즈 합성효소(TDP-glucose synthase) 및 TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제(TDP-D-glucose-4,6-dehydratase)의 유전자를 포함하는 각각의 재조합 벡터들, 이들 재조합 벡터들로 형질전환된 각각의 형질전환체들, 이들 형질전환체로부터 생산된 상기 효소 및 이들 4종의 재조합 효소들을 사용하여 한번에 반응시킴으로써, 저가 기질인 티민 일인산으로부터 하기 화학식 1의 TDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈를 효율적으로 제조하는 방법에 관한 것이다:
더욱 구체적으로, 본 발명은 티민 일인산으로부터 TDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈를 제조하는데 사용되는 효소의 유전자를 포함하는 재조합 벡터들 즉, 대장균 K-12로부터 유래한 티민 일인산 키나제 유전자(tmk)를 포함하는 재조합 벡터 pET15b:tmk, 초산염 키나제 유전자(ack)를 포함하는 재조합 벡터 pET24ma:ack, TDP-글루코즈 합성효소 유전자(rffH)를 포함하는 재조합 벡터 pET24ma:rffH 및 살모넬라 티피무럼으로부터 유래한 TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제 유전자(rfb'B')를 포함하는 재조합 벡터 pRSETB:rfb'B'에 관한 것이다.
본 발명은 이들 재조합 벡터들로 형질전환된 미생물 형질전환체들에 관한 것이다.
본 발명은 이들 형질전환체로부터 생산된 효소 티민 일인산 키나제, 초산염 키나제, TDP-글루코즈 합성효소 및 TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 티민 일인산, ATP, 아세틸 포스페이트 및 글루코즈-1-인산을 포함하는 반응 용액에, 상기 티민 일인산 키나제, 초산염 키나제, TDP-글루코즈 합성효소 및 TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제를 첨가하여 합성 반응시켜 데옥시당 중간체인 TDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 제조하고자 하는 목적 산물인 상기 화학식 1의 TDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈는 데옥시당 생합성시에 필요한 핵심 중간체 물질로서, 생체내에서 1-5 단계의 효소 반응에 의해 생물학적 활성을 가진 데옥시당, 이데옥시당, 삼데옥시당 및 아미노-데옥시당, 니트로-데옥시당 등으로 전환된다. 이러한 데옥시당 물질은 항생제, 항암제 등의 여러 이차 대사 물질에 있어 생물학적 활성, 친화력 및 내성 등에 직간접적으로 관여하는 중요한 물질이나, 유기 합성 방법으로는 직접 제조할 수 없거나 제조하기 어려운 관계로, 다양한 활성 신물질 개발을 위해서는 데옥시당 생합성 중간체 물질인 TDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈의 효율적인 대량 생산이 필히 요구되고 있다.
이러한 TDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈 화합물을 제조하기 위한 방법으로는 종래의 TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제를 사용하여 TDP-글루코즈로부터 생합성하는 방법이나 수크로즈 합성효소에 의해 수크로즈와 TDP로부터 생합성하는 방법 등 여러 가지가 시도되어 왔으나, 본 발명에서는 저가의 기질인 티민 일인산으로부터 4종의 재조합 효소를 이용하여 한번의 반응에 의해 TDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈를 효율적으로 제조함으로써, 종래 기술에 비해 수율, 생산성 및 경제성면에서 유리한 효과를 제공한다.
본 발명은 출발 기질로서 티민 일인산(TMP)을 사용하고, 하기 반응식 1에 따라, 단계별로 사용되는 총 4종의 다른 효소, 티민 일인산 키나제, 초산염 키나제, TDP-글루코즈 합성효소 및 TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제를 동시에 반응시키는 것을 특징으로 한다:
본 발명에 있어, 각각의 효소들은 미생물로부터 분리 정제한 효소 유전자를 포함하는 각 재조합 벡터를 사용하여 형질전환된 4종의 형질전환체들로부터 각각 대량 생산된 재조합 효소들이다.
이들의 생산 과정을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
우선, 대장균 K-12 균주의 염색체 유전자로부터 티민 일인산 키나제 유전자(tmk), 초산염 키나제 유전자(ack) 및 TDP-글루코즈 합성효소 유전자(rffH)를 각각 분리 정제하고, 살모넬라 티피무럼(Salmonella typhimurium) 균주의 염색체 유전자로부터 TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제 유전자(rfb'B')를 분리 정제한 후, 이들 효소 유전자들을 각각 발현 벡터 pET15b, pET24ma, pET24ma 및 pRSETB 내로 삽입하여 4종의 재조합 벡터 pET15b:tmk, pET24ma:ack, pET24ma:rffH 및 pRSETB:rfb'B'를 제작한다.
이들 재조합 벡터들을 각각 사용하여 발현 균주를 형질전환시켜 상기 재조합 벡터를 포함하는 각각의 형질전환체를 제작한다. 이때 사용되는 발현 숙주로는 대장균 XL1-Blue 또는 대장균 BL21이 사용될 수 있는데, 대장균 XL1-Blue는 균주 안정성면에서 그리고 대장균 BL21은 발현 효율면에서 비교적 우수한 특성을 지닌다.
이들 중에서, 상기 재조합 벡터에 의해 대장균 XL1-Blue를 형질전환시켜 수득한 형질전환체 즉, 대장균 XL1-Blue/pET15b:tmk는 수탁 번호 KCTC 10334BP로서, 대장균 XL1-Blue/pET24ma:ack는 KCTC 10331BP로서, 대장균 XL1-Blue/pET24ma:rffH는 KCTC 10332BP로서 그리고 대장균 XL1-Blue/pRSETB:rfb'B'는 KCTC 10333BP로서 2002년 9월 9일자로 국제 미생물 기탁 기관인 KCTC(한국 유전자 은행)에 기탁되어 있다.
전술한 바와 같이 제작한 형질전환 균주들은 개별적으로 대량 배양하여 다량의 목적하는 효소 티민 일인산 키나제, 초산염 키나제, TDP-글루코즈 합성효소 및 TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제를 수득하고, 이들 효소들을 티민 일인산, ATP, 아세틸 포스페이트 및 글루코즈-1-인산을 포함하는 반응 용액에 첨가하여 한번에 반응시킴으로써, 목적 산물인 TDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈 화합물을 대량으로 제조한다.
이하, 본 발명에 대한 보다 상세한 설명 및 구체적인 시험 과정을 실시예를 통해 설명하고자 한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하고 설명하기 위해 제시된 것으로, 본 발명이 이들 실시예로만 한정되는 것으로 이해해서는 안된다.
[실시예]
실시예 1: 대장균 K-12와 살모넬라 티피무럼 균주로부터 전체 염색체 DNA의 분리 및 정제
대장균 K-12와 살모넬라 티피무럼 균주를 멸균된 액상 엘비(LB) 배지 50㎖에 각각 접종한 후, 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 배양액을 원뿔형 튜브로 옮긴 후, 4,000rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 침전물 (pellet)에 용균 완충용액(15% 수크로즈 150㎎, 2M 트리스-염산(Tris-HCl) 12.5㎖ 및 0.5M EDTA 50㎖를 넣고 나머지는 증류수를 채워 총 1ℓ가 되도록 제조함)을 30㎖ 첨가한 후, 서서히 녹이고, 4,000rpm에서 10분 동안 다시 원심분리하였다. 상기 용균 완충용액 10㎖를 첨가하여 재차 세포를 녹였다. 여기에 리소자임(5㎎/㎖)을 첨가한 후, 37℃의 항온조에서 약 1시간 가량 반응시켰다. 0.5M EDTA 1.2㎖와 프로나제(Pronase) 용액 0.13㎖를 넣고 37℃에서 5분간 반응시켰다. 10% SDS(Sodium dodecyl sulfate) 3㎖를 넣고 충분히 혼합한 후, 70℃에서 10분간 반응시키고, 얼음물에서 10분간 방치하였다. 여기에 5M 초산 칼륨 3㎖를 넣고 다시 얼음물에서 15분간 방치하였다. 튜브 내용물과 동량의 페놀-클로로포름(50:50)을 넣고 서서히 흔들었다. 충분히 교반한 후, 4℃에서 15,000rpm으로 30분간 원심분리하였다. 상층액을 새로운 원뿔형 튜브로 옮긴 후, RNA 제거를 위해 RNA 가수분해효소를 50㎍/㎖ 단위로 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 0.8배 부피의 이소-프로필알콜과 2.5배 부피의 에탄올을 넣고 서서히 흔들어 주었다. 침전된 염색체 DNA를 회수한 후, 충분히 건조시켜 에탄올을 제거하였다. 400㎕의 TE 완충용액(2M 트리스-염산 5㎖, 0.5M EDTA 2㎖ 및 증류수 993㎖를 혼합하여 제조함)에 용해시킴으로써 대장균 K-12와 살모넬라 티피무럼 균주의 전체 염색체 DNA를 분리, 정제하여 수득하고, 이 유전자를 이하 실시예의 PCR 과정에서 주형(template)으로 사용한다.
실시예 2: 효소 티민 일인산 키나제, 초산염 키나제, TDP-글루코즈 합성효소 및 TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제에 대한 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 형질전환체의 제작
목적하는 4종의 효소 유전자를 포함하는 각각의 재조합 벡터 및 형질전환체의 제조를 위해, 이에 앞서 통상의 PCR 방법에 의해 각 유전자를 증폭시키는 다음과 같은 시험 과정을 실시하였다.
우선, 공개된 염색체 유전자 서열 자료로부터 대장균 K-12의 티민 일인산 키나제 유전자(tmk), 초산염 키나제 유전자(ack) 및 TDP-글루코즈 합성효소 유전자(rffH)의 염기 서열과 살모넬라 티피무럼 균주의 TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제 유전자(rfb'B')의 염기 서열을 찾아, 다음과 같이 효소 유전자별로 정방향 및 역방향 PCR 프라이머 2종을 각각 합성하였다.
tmk 정방향 프라이머 tmk-NcoI-CCATGGCAGTAAGTATATCGTCA
역방향 프라이머 tmk-BamHI-GGATCCTCATGCGCTCCAACTCCTTCACCCAG
ack 정방향 프라이머 ack-NdeI-CATATGTCGAGAGTAAGTTAGTACTGGTTCTG
역방향 프라이머 ack-EcoRI-GAATTCTCAGGCAGTCAGGCGGCTCGCGTC
rffH 정방향 프라이머 rffH-NdeI-CATATGAAAGGTATTATCCTGGCGG
역방향 프라이머 rffH-EcoRI-GAATTCTCAATACTGGCGCGGACGGG
rfb'B'정방향 프라이머 rfbB-NdeI-CCAAGTCGATATGCTAGCAGTGCACTGG
역방향 프라이머 rfbB-HindIII-CGGGACGAAGCTTACGAACGGTT
상기 실시예 1에서 수득한 대장균 K-12와 살모넬라 티피무럼 균주의 전체 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머들을 사용하여 통상의 방법에 의해 PCR 반응을 수행하였다.
구체적으로, 10x PCR 완충용액(500mM KCl, 100mM 트리스-Cl(실온에서 pH 8.3), 15mM MgCl2, 0.1% 젤라틴) 6㎕, dNTP(각각 10mM) 6㎕, 정방향 프라이머 1㎕, 역방향 프라이머 1㎕, Taq DNA 폴리머라제 2.5㎕ 및 실시예 1의 주형 DNA 0.1㎕를 넣은 후, 총 60㎕가 되도록 증류수를 첨가하여 PCR 반응액을 제조한 후, 이를 95℃의 변성(denaturation), 40℃의 결합(annealing) 및 72℃의 합성(extension) 단계를 거치도록 세팅된 PCR 기계에 넣고 30 내지 40회 PCR 과정이 반복되도록 작동시켰다.
상기 PCR 과정 수행 후, 수득된 PCR 산물을 아가로스 겔상에서 전기영동시켜 각 효소의 유전자 띠를 확인하였다. 목적하는 4종의 효소 유전자 띠를 각각 취하고, 하기 표 1에 제시된 바와 같이 유전자별로 적당한 제한 효소에 의해 절단된 발현 벡터내로 삽입시켜 각각 티민 일인산 키나제 유전자(tmk), 초산염 키나제 유전자(ack), TDP-글루코즈 합성효소 유전자(rffH) 및 TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제 유전자(rfb'B')를 포함하는 재조합 벡터 pET15b:tmk, pET24ma:ack, pET24ma:rffH 및 pRSETB:rfb'B'를 수득하였다. 이때 각 효소 유전자에 대한 재조합과정을 보여주는 유전자 지도가 도 1a 내지 도 1d로서 첨부되어 있다.
이후, 이렇게 수득한 4종의 재조합 벡터들을 각각 대장균 XL1-Blue내로 형질전이하여 형질전환체 대장균 XL1-Blue/pET15b:tmk, 대장균 XL1-Blue/pET24ma:ack, 대장균 XL1-Blue/pET24ma:rffH 및 대장균 XL1-Blue/pRSETB:rfb'B'를 수득하였다.
상기 형질전환된 미생물, 대장균 XL1-Blue/pET15b:tmk는 수탁 번호 KCTC 10334BP로서, 대장균 XL1-Blue/pET24ma:ack는 KCTC 10331BP로서, 대장균 XL1-Blue/pET24ma:rffH는 KCTC 10332BP로서 그리고 대장균 XL1-Blue/pRSETB:rfb'B'는 KCTC 10333BP로서 2002년 9월 9일자로 국제 미생물 기탁 기관인 KCTC(한국 유전자 은행)에 기탁되어 있다.
전술한 4종의 효소 유전자에 대한 재조합 벡터 및 형질전환체 제작 과정과 관련한 사항이 하기 표 1로서 간략히 제시되어 있다:
효소의 명칭 유전자 기원 발현 벡터(절단위치) 재조합 벡터 형질전환체
티민 일인산 키나제 대장균 K-12 pET15b(NcoI-BamHI) pET15b:tmk 대장균XL1-Blue/pET15b:tmk
초산염 키나제 대장균 K-12 pET24ma(NdeI-EcoRI) pET24ma:ack 대장균XL1-Blue/pET24ma:ack
TDP-글루코즈 합성효소 대장균 K-12 pET24ma(NdeI-EcoRI) pET24ma:rffH 대장균XL1-Blue/pET24ma:rffH
TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제 살모넬라 티피무럼 pRSETB(NdeI-HindIII) pRSETB:rfb'B' 대장균XL1-Blue/pRSETB:rfb'B'
상기 제한 효소 절단, 재조합 벡터 및 형질전환체 제작 방법 등은 일반적인 분자생물학적 실험 방법을 참조하였다[참고문헌: Joseph Sambrook et al., (2001) Molecular Cloning. A laboratory Manual. 3rd ed].
또한, 동일한 방법으로 상기 4종의 재조합 벡터를 사용하여 발현 숙주로서 대장균 BL21을 형질전이시켜, 형질전환체 대장균 BL21/pET15b:tmk, 대장균 BL21/pET24ma:ack, 대장균 BL21/pET24ma:rffH 및 대장균 BL21/pRSETB:rfb'B'를 수득하였다.
실시예 3: 티민 일인산 키나제, 초산염 키나제, TDP-글루코즈 합성효소 및 TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제 효소의 발현 및 확인
본 실시예에서는 상기 실시예 2에서 수득한 형질전환체내에서 목적하는 효소가 발현되도록 유도하고, 이를 분리 정제하여 전기영동에 의해 발현 정도를 확인하는 시험을 실시하였다.
우선, 형질전환체들로부터 각각 효소 티민 일인산 키나제, 초산염 키나제, TDP-글루코즈 합성효소 및 TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제를 얻기 위하여, 형질전환 미생물중 대장균 BL21/pET15b:tmk, 대장균 BL21/pET24ma:ack, 대장균 BL21/pET24ma:rffH 및 대장균 BL21/pRSETB:rfb'B'를 액상 엘비(LB) 배지에 접종하여 37℃에서 밤새 배양하여 종균 배양을 실시하였다. 이후, 종균 배양균을 5%(v/v)의 양으로 새로운 액상 엘비(LB) 배지 50㎖에 접종하여 37℃에서 약 2시간 동안 본 배양을 실시하였다. 하기 표 2에 제시된 바와 같이, 각 배양액에 효소별로 적당한 농도의 IPTG(Isopropyl β-D-thiogalacto pyranodside)를 첨가하여 해당 효소의 발현을 유도하였다.
종균 배양 조건 본 배양 조건 IPTG 첨가 농도 발현 유도 조건
티민 일인산 키나제 37℃, 12시간 37℃, 2시간 (OD600=0.5) 1mM 37℃, 6시간 (OD600=3.5)
초산염 키나제 37℃, 12시간 37℃, 2시간 (OD600=0.5) 1mM 37℃, 6시간 (OD600=3.5)
TDP-글루코즈 합성효소 37℃, 12시간 37℃, 2시간 (OD600=0.5) 0.4mM 22℃, 20시간 (OD600=3.5)
TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제 37℃, 12시간 37℃, 2시간 (OD600=0.5) 0.4mM 27℃, 12시간 (OD600=3.5)
최종 OD600=3.5 정도인 세포 배양액을 50㎖ 용량의 원뿔형 튜브에 옮긴 후, 4℃에서 4,000rpm으로 10분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 50mM 트리스-염산 완충용액(pH=7.5) 20㎖를 사용하여 세포 표면의 배지 성분을 세척한 후, 4℃에서 4,000rpm으로 10분간 재차 원심분리하였다. 다시 상층액을 제거하고 4㎖의 음파처리 완충용액[10% 글리세롤을 포함한 50mM 트리스-염산 완충용액(pH=7.5)에 프로나제 억제제로서 1mM EDTA(pH=8.5)와 1mM PMSF(phenyl methyl sulfunyl fluoride)를, 이황화 결합을 억제하기 위해서 1mM DTT(DL-dithiothreitol)를, 그리고 효소의 활성을 위해서 1mM MgCl2를 첨가하여 제조함]을 넣어서 세포를 다시 현탁시켰다. 초음파 분쇄기로 세포를 파쇄하였다. 4℃에서 15,000rpm으로 30분간 원심분리한 후, 상층액을 취해 에펜도르프 튜브에 분주하였다. 얻어진 효소액은 -40℃ 이하에서 보관한다. 수득한 효소액을 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동하여 과다발현 정도를 확인하였다.
전기영동한 결과, 도 2에 제시된 바와 같은 사진을 얻을 수 있었다. 도 2에서, 1 레인은 저 분자량 마커이고, 2 레인은 과다발현된 티민 일인산 키나제 추출물이고, 3 레인은 과다발현된 초산염 키나제 추출물이며, 4 레인은 과다발현된 dTDP-글루코즈 합성효소 추출물이고, 5 레인은 과다발현된 dTDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제 추출물이며, 6 레인은 대조용으로서 대장균 BL21 추출물을 전기영동한 것이다.
도 2로부터, 전기영동에 의해 4종의 효소, 티민 일인산 키나제, 초산염 키나제, TDP-글루코즈 합성효소 및 TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제를 겔상에서 단백질 띠의 형태로 확인함으로써, 본 발명에 의해 제작된 형질전환체 대장균 BL21/pET15b:tmk, 대장균 BL21/pET24ma:ack, 대장균 BL21/pET24ma:rffH 및 대장균 BL21/pRSETB:rfb'B'가 각각 효소 티민 일인산 키나제, 초산염 키나제, TDP-글루코즈 합성효소 및 TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제를 대량 생산함을 알 수 있다.
또한, 또다른 형질전환체 대장균 XL1-Blue/pET15b:tmk, 대장균 XL1-Blue/pET24ma:ack, 대장균 XL1-Blue/pET24ma:rffH 및 대장균 XL1-Blue/pRSETB:rfb'B'에 대해서도 동일한 과정의 시험을 실시한 결과, 도 2의 전기영동 사진과 유사한 결과를 얻을 수 있었다.
실시예 4: 티민 일인산 키나제, 초산염 키나제, TDP-글루코즈 합성효소 및 TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제 효소를 이용한 TDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈의 합성
본 실시예에서는 상기 실시예 3에서 생산한 단계별 효소 티민 일인산 키나제, 초산염 키나제, TDP-글루코즈 합성효소 및 TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제를 이용하여 출발 물질 티민 일인산으로부터 목적 산물인 TDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈를 한번의 반응으로 합성하는 과정을 실시하였다.
이에 앞서, 단계별로 다양한 농도의 반응 물질을 사용하여 합성 반응을 실시함으로써 최적의 반응에 필요한 적당한 기질의 농도와 반응시간을 결정하였다(도 3-5).
상기 반응식 1에서 알 수 있는 바와 같이, 1 단계 반응에서의 반응 물질인 ATP는 초산염 키나제를 사용하여 재생함으로서 반응의 경제성과 효율을 높이도록 하였다.
반응은 37℃의 항온조에서 실시하는데, 우선 초기 출발물질인 1M 티민-5'-일인산 20㎕에, 1M ATP 1㎕, 2M MgCl2ㆍ6H2O 1㎕, 1M 아세틸 포스페이트(Acetyl phosphate) 10㎕, 0.5mM 글루코즈-1-인산 32㎕ 및 50mM 트리스 완충용액 4㎕를 첨가하고, 반응에 필요한 효소 TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제 효소 12㎕, TDP-글루코즈 합성효소 12㎕, 초산염 키나제 4㎕ 및 티민 일인산 키나제 4㎕를 순서대로(반응의 역순) 첨가하여 총 부피가 100㎕로 되도록 조정하고, 120분간 반응시켰다. 반응후, 용액을 취하여 HPLC에 의해 반응 진행 정도를 확인하였다.
RP-HPLC(이온쌍 역상 고속 액체 크로마토그래피)는 뉴클레오타이드나 당 뉴클레오타이드를 분석하는 가장 효과적인 방법중의 하나로 알려진 것으로서[참고문헌: Christoph Albermann, Jurgen Dister and Wolfgang Piepersberg Preparative synthesis of GDP-β-L-fucose by recombinant enzymes from enterobacterial sources.Glycobiology2000, vol. 10 no.9 875-881], 본 실시예에서는 분석용 컬럼으로 C18(4.6x150 mm KC-PACK ODS-A, KYOTO CHROMATO)을 사용하였으며, 용출액으로는 90%의 100 mM KH2PO4/ K2HPO4, 8mM 테트라부틸암모늄 하이드로젠 설페이트(Tetrabutylammonium hydrogen sulfate (pH 7.0)) 및 5% 메탄올을 사용하여, 1㎖/min의 유속으로 용출시켰다.
그 결과가 첨부하는 도면의 도 6에 제시되어 있다.
도 6의 그래프로부터 본 발명의 4종 효소 티민 일인산 키나제, 초산염 키나제, TDP-글루코즈 합성효소 및 TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제를 사용한 1 단계 반응에 의해 목적 산물인 dTDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈가 효과적으로 제조될 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 그램 단위의 TDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈의 합성과 분리, 정제
상기 실시예 4 결과, 단계별 효소의 생물학적 활성을 확인할 수 있었으므로, 본 실시예에서는 본 발명의 목적인 그램 단위의 최종 목적물 수득을 위한 반응을 실행하였다.
본 반응은 500㎖ 용량의 둥근 플라스크에서 100㎖ 부피로 실행되었으며 다른 반응 기질과 효소 추출액들은 상기 실시예 4에서와 같은 비율로 증가시켜 반응시켰다.
20mM 티민-5'-일인산 672.4㎎, 1mM ATP 60㎎, 20mM MgCl2ㆍ6H2O 407㎎, 100mM 아세틸 포스페이트 1.84g 및 150mM 글루코즈-1-인산 4.5g을 50mM 트리스-염산 완충용액 80㎖에 넣은 후, 교반하여 기질들을 용해시켰다. 37℃에서 교반하며반응 효소 TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제 4㎖, TDP-글루코즈 합성효소 4㎖, 초산염 키나제 2㎖ 및 티민 일인산 키나제 2㎖를 순서대로 첨가한 후, 총 80분간 반응시켰다. 반응 후, 용액을 취하여 실시예 4에서와 같이 HPLC에 의해 반응 진행 정도를 확인하였다.
그 결과가, 첨부 도면의 도 7에 그래프로서 제시되어 있다.
반응후, 수득한 반응액을 100℃의 끓는 물에서 약 3분간 가열하여 효소를 비활성화시키고, 15,000rpm에서 30분간 원심분리한 후, 상층액을 동결건조하여 농축시켰다. 농축된 반응액을 음이온 교환 수지 다우엑스 염소형(Dowex-1 x 2, Cl--form) 컬럼의 상부에 주입하고 염의 농도 구배를 이용하여 분리하였다. 목적물이 포함된 용출액을 다시 재 농축하여 세파덱스 지-10(Sephadex G-10) 겔 투과법에 의해서 염을 제거하였다. 이 단계를 거쳐 고 순도의 최종 생성물을 얻고, 동결 건조를 통해 농축시켰다. 각 정제 단계를 거쳐 최종적으로 81%의 수율을 얻을 수 있었다. 정제된 최종 생성물에 대해1H-NMR과13C-NMR 및 말디-토프(MALDI-TOF) 분석 결과, 다음과 같은 결과를 얻었다.
1H-NMR(D2O, 500MHz): 5.56 ppm(dd,J=3.53, [6.73]), 1H, 헥소즈 1"), 3.64 ppm(ddd,J= 9.95, [3.03]), 1H, 헥소즈 2"), 3.81 ppm(d,J= 9.95, 1H, 헥소즈 3"), 4.11 ppm(q,J= 6.36, 1H, 헥소즈 5"), 1.24 ppm(d,J= 6.40, 1H, 헥소즈 6"), 6.36 ppm(t,J= 6.86, 1H, 리보즈 1'), 2.42-2.37 ppm(dd+m, 2H, 리보즈 2'), 4.66 ppm(mc, 1H, 리보즈 3'), 4.20 ppm(m, 1H, 리보즈 4', 2H, 리보즈 5'), 7.76 ppm(s, 1H, 베이스 6), 1.95ppm (s, 3H, 베이스 CH3)
13C-NMR(D2O, 500MHz): 94.10 ppm(헥소즈 1"), 73.02 ppm(헥소즈 2"), 74.11 ppm(헥소즈 3"), 206.31ppm(헥소즈 4"), 71.41 ppm(헥소즈 5"), 12.33 ppm(헥소즈 6"), 85.23 ppm(리보즈 1'), 38.97 ppm(리보즈 2'), 71.41 ppm(리보즈 3'), 86.28 ppm(리보즈 4'), 65.80 ppm(리보즈 5'), 152.14 ppm(베이스 2), 166.99 ppm(베이스 4), 112.16 ppm(베이스 5), 137.65 ppm(베이스 6), 11.67 ppm(베이스 CH3)
[M+2Na-H] 591.1 m/z
[M+3Na-2H] 613.1 m/z
본 발명은 4종의 재조합된 효소를 이용한 단 1회의 합성 반응에 의해 저가 기질인 티민 일인산(TMP)으로부터 고부가 데옥시당 중간체 물질인 TDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈를 합성함으로써 종래의 합성 방법에 비해 경제성과 효율성면에서 뛰어난 새로운 제조 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명에 의하면 유기 합성 방법으로 제조가 어렵고 종래의 생합성 방법에 의해서는 높은 제조 비용이 드는 데옥시당 중간체 물질을 적은 비용으로 용이하게 대량 생산하는 것이 가능하므로, 이를 원료로 사용한 다양한 데옥시당 유도체의 제조를 통해 새로운 활성을 가지거나 활성이 강화된 항생제 또는 항암제의 개발과 함께, 이들의 저가 대량 생산에 따른 생산성 증가 효과를 얻을 수 있다.
항생제 및 항암제 등의 의약 분야의 신약 개발과 관련하여, 생물학적 활성면에서 중요한 역할을 하는 데옥시당 및 그 생합성 중간체인 TDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈의 중요성이 날로 부각되고 있으나, 그 합성이 용이치 않고, 제조 원가가 지나치게 높은 현 기술 수준을 고려해 볼 때, 종래 기술에서 원료로 사용하는 TTP 가격의 약 1/30에 불과한 저가의 TMP로부터 고 순도의 TDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈를 다량으로 제공할 수 있는 본 발명의 방법은 그 효용 가치 및 파급 효과가 매우 커서 해당 분야에서 다양한 용도로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (18)

  1. 대장균 K-12로부터 유래한 티민 일인산 키나제 유전자(tmk)를 포함하는 재조합 벡터 pET15b:tmk.
  2. 대장균 K-12로부터 유래한 초산염 키나제 유전자(ack)를 포함하는 재조합 벡터 pET24ma:ack.
  3. 대장균 K-12로부터 유래한 TDP-글루코즈 합성효소 유전자(rffH)를 포함하는 재조합 벡터 pET24ma:rffH.
  4. 살모넬라 티피무럼으로부터 유래한 TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제 유전자(rfb'B')를 포함하는 재조합 벡터 pRSETB:rfb'B'.
  5. 제 1 항의 재조합 벡터로 형질전환된 미생물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    제 1 항의 재조합 벡터로 형질전환된 미생물 대장균 XL1-Blue/pET15b:tmk(KCTC 10334BP).
  7. 제 2 항의 재조합 벡터로 형질전환된 미생물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    제 2 항의 재조합 벡터로 형질전환된 미생물 대장균 XL1-Blue/pET24ma:ack(KCTC 10331BP).
  9. 제 3 항의 재조합 벡터로 형질전환된 미생물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    제 3 항의 재조합 벡터로 형질전환된 미생물 대장균 XL1-Blue/pET24ma:rffH(KCTC 10332BP).
  11. 제 4 항의 재조합 벡터로 형질전환된 미생물.
  12. 제 11 항에 있어서,
    제 4 항의 재조합 벡터로 형질전환된 미생물 대장균 XL1-Blue/pRSETB:rfb'B'(KCTC 10333BP).
  13. 제 5 항의 형질전환된 미생물로부터 생산된 효소 티민 일인산 키나제.
  14. 제 7 항의 형질전환된 미생물로부터 생산된 효소 초산염 키나제.
  15. 제 9 항의 형질전환된 미생물로부터 생산된 TDP-글루코즈 합성효소.
  16. 제 11 항의 형질전환된 미생물로부터 생산된 효소 TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제.
  17. 티민 일인산, ATP, 아세틸 포스페이트 및 글루코즈-1-인산을 포함하는 반응 용액에, 티민 일인산 키나제, 초산염 키나제, TDP-글루코즈 합성효소 및 TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제를 첨가하여 합성 반응시켜 TDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈를 제조하는 방법.
  18. 제 12 항에 있어서,
    티민 일인산, ATP, 아세틸 포스페이트 및 글루코즈-1-인산을 포함하는 반응 용액에, 제 9 항의 티민 일인산 키나제, 제 10 항의 초산염 키나제, 제 11 항의 TDP-글루코즈 합성효소 및 제 12 항의 TDP-D-글루코즈-4,6-디히드라타제를 첨가하여 합성 반응시켜 TDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코즈를 제조하는 방법.
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US20020137065A1 (en) * 2000-09-19 2002-09-26 Degussa Ag Nucleotide sequences which code for the tmk gene

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석사학위논문, 서울대 대학원, 2002.02, 동일발명자, Table 2.2(p.13)-재조합 벡터, Fig 2.1(p.14), 결론(p.45~46)] *

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