CN116355874A - 糖基转移酶突变体及其在制备槲皮素-3-o鼠李糖苷中的应用 - Google Patents

糖基转移酶突变体及其在制备槲皮素-3-o鼠李糖苷中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及糖基转移酶突变体及其在制备槲皮素‑3‑O鼠李糖苷中的应用，通过将葡萄糖基转移酶AtUGT78D2氨基酸序列C‑端PSPG结构域的44个氨基酸替换为糖基转移酶AtUGT78D1的C‑端PSPG结构域的44个氨基酸，获得结构域工程改造的糖基转移酶AtUGT78D2‑D1PSPG；再将糖基转移酶AtUGT78D2‑D1PSPG进行定点突变，获取选择性好、稳定性好、表达量高的鼠李糖基转移酶突变体，本发明还提供了利用蔗糖合酶AtSuSy、UDP‑鼠李糖合成酶AtRHM‑NRS、糖基转移酶AtUGT78D2‑D1PSPG突变体构建的三酶偶联催化合成槲皮素‑3‑O‑鼠李糖苷的反应体系，实现了以蔗糖为底物，在UDP‑鼠李糖合成酶的作用下生成UDP‑鼠李糖供体，减少了UDP‑鼠李糖供体购买的生产成本，进而在糖基转移酶的作用下，催化槲皮素一步法定向合成槲皮素‑3‑O‑鼠李糖苷。

Description

糖基转移酶突变体及其在制备槲皮素-3-O鼠李糖苷中的应用
技术领域
本发明属于中医药的生物制药技术领域，具体涉及一种PSPG结构域替换的糖基转移酶AtUGT78D2-D1 PSPG突变体及其在高选择性制备槲皮素-3-O鼠李糖苷中的应用。
背景技术
槲皮素（Quercetin）是植物界分布广泛，具有多种生物活性的黄酮醇类化合物，具有C6-C3-C6 碳骨架的苯并（γ）-吡喃酮结构，槲皮素可调节众多与疾病进展有关的细胞内外信号通路，是天然的抗氧化剂，具有抗氧化、抗炎、降血糖、抗癌、预防和治疗心脑血管疾病等作用，但是槲皮素由于其溶解度差和较低的生物利用度限制了在临床上的应用。
构效关系研究显示：糖链的存在或糖基化修饰还能显著提高化合物的水溶性及稳定性，改善目标化合物的生物活性，增加其生物利用度, 增强靶向性作用并减少毒副作用等。糖基化修饰糖种类的也能影响目标化合物的靶向性；种类多样的糖基化修饰中，鼠李糖基化修饰是很重要的一种，且取代形式多样。且药理学研究显示，槲皮素在经过鼠李糖基化后表现出了显著的药理学活性，例如：槲皮素-3-O-鼠李糖苷对人流感 A/WS/33 病毒也有较好的抑制作用；也能够有效预防大鼠的腹泻，稳定大鼠结肠内液体的运输，最大限度降低对结肠的损害；此外， 12.5~50μg/mL槲皮素-3-O-鼠李糖苷能减轻阿霉素（ADR）对心肌细胞损伤，具有明显的心肌细胞保护作用，对该类化合物进行研究具有重要意义。
槲皮素-3-O-鼠李糖苷的结构式如下：
Figure SMS_1
植物天然糖苷糖基化相关的糖基转移酶多属GT1超家族，主要是UDP糖依赖性的GT-B折叠模式的糖基转移酶。GT-B型糖基转移酶在C-端序列非常保守，存在一段44个氨基酸的富含谷氨酸和甘氨酸残基的植物次级代谢产物相关PSPG模序，用于结合糖基供体，该保守序列已被用作植物糖苷合成相关酶的常规鉴定。而N-端序列具有多变的螺旋和环状结构以适应种类繁杂的受体底物，N-端序列的不确定性赋予了糖基转移酶泛杂的底物谱，也使得底物催化功能预测非常困难，理论上通过交换具有不同底物特异性的N-端和C-端PSPG结构域可以挖掘具有新催化特性的糖基转移酶。但该方法局限于亲本相似性很高的酶序列，即该PSPG结构域替换的策略在两个相似性较低的糖基转移酶之间并不适用。
此外，鼠李糖基转移酶通常以NAD-鼠李糖为糖供体，将鼠李糖基转移到目标受体上，参与鼠李糖苷类化合物的合成。目前报道的与活性小分子鼠李糖基化修饰相关的鼠李糖基转移酶主要来自于植物还有少部分来自于微生物，通过生物信息学分析及各种分子生物学手段，已从植物及微生物中鉴定了多种鼠李糖基转移酶基因。如 Jones（J Biol Chem,2003, 278(45): 43910-8.）等通过同源序列比对在拟南芥中克隆得到可以鼠李糖基化槲皮素和山奈酚的3-OH，分别生成槲皮素-3-O-鼠李糖苷和山奈酚-3-O-鼠李糖苷的UGT78D1。Rojas （Plant Mol Biol, 2014, 84(3): 287-300.）大豆中克隆得到类黄酮醇-3-O-葡糖苷（1→6）鼠李糖基转移酶GmF3G6’R。Casas 等（Plant Cell, 2016, 28(6): 1297-309.）从玉米 Sm2 基因座中克隆得到可催化异荭草素鼠李糖基化生成2’-O-鼠李糖基异荭草素的UGT91L1。
综上所述，植物来源的鼠李糖基转移酶已取得了较大进展，但仍存在如下问题：(1)目前已鉴定功能的鼠李糖基转移酶仍为少数，因此还无法通过多序列比对分析来总结出鼠李糖基转移酶的特征性保守序列；(2)无论是体内或体外的鼠李糖基化反应，都需要有鼠李糖基供体的参与，如UDP-鼠李糖（UDP-Rha），由于其来源非常有限，且合成路线复杂，这在很大程度上限制了更多鼠李糖基转移酶的鉴定。
发明内容
本发明的目的在于针对现有鼠李糖基转移酶来源有限、底物浓度差、反应选择性差，且催化过程中需要添加外源昂贵的UDP-Rha作为糖供体等问题，提供一种糖基转移酶突变体。
为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
通过将葡萄糖基转移酶AtUGT78D2氨基酸序列C-端PSPG结构域的44个氨基酸替换为糖基转移酶AtUGT78D1的C-端PSPG结构域的44个氨基酸，获得结构域工程改造的糖基转移酶AtUGT78D2-D1PSPG；再将糖基转移酶AtUGT78D2-D1PSPG中第350位、第353位、第374位、第377位、第378位、第381位氨基酸残基中的一个或多个点突变为另一种氨基酸残基，得到所述糖基转移酶突变体；
其中，第350位蛋氨酸突变为苏氨酸、第353位天冬酰胺突变为苯丙氨酸、第374位甘氨酸突变为半胱氨酸、第377位异亮氨酸突变为苯丙氨酸、第378位亮氨酸突变为苯丙氨酸，第381位天冬酰胺突变为谷氨酰胺；
所述糖基转移酶AtUGT78D2-D1PSPG的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
作为一种优选的实施方式，所述突变体为糖基转移酶AtUGT78D2-D1PSPG的第350位、第353位、第374位、第377位、第378位、第381位氨基酸残基中的两个位点或三个位点的组合突变。
作为一种优选的实施方式，所述突变体为M350T/I377F、M350T/N381Q、N353F/G374C、N353F/I377F、N353F/L378F或N353F/N381Q。
本发明的另一目的在于提供上述突变体在制备槲皮素-3-O鼠李糖苷中的应用。
作为一种优选的实施方式，以蔗糖为底物，利用三酶偶联催化反应体系合成槲皮素-3-O-鼠李糖苷产物；
所述三酶偶联催化合成槲皮素-3-O-鼠李糖苷的体系包括：所述糖基转移酶突变体、拟南芥来源的蔗糖合成酶AtSuSy、UDP-鼠李糖合成酶AtRHM-NRS、蔗糖、尿苷二磷酸二钠UDP、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+、二甲亚砜DMSO、槲皮素和磷酸缓冲液。
作为一种优选的实施方式，三酶偶联催化体系中蔗糖合成酶的用量为0.01-0.12mg/mL，优选0.02 mg/mL；反应体系中三酶质量比为蔗糖合成酶：UDP-鼠李糖合成酶：糖基转移酶突变体=1:8:2~8。
作为一种优选的实施方式，三酶偶联催化反应体系中UDP的添加的浓度为0.2 mM-3 mM，优选1.5 mM；NAD+添加的浓度为0.1 mM-0.9mM，优选0.7mM。
作为一种优选的实施方式，三酶偶联催化反应体系中蔗糖添加的浓度为100 mM-600 mM，优选400 mM。
作为一种优选的实施方式，三酶偶联催化反应体系中槲皮素添加的浓度为0.5mM-3 mM，优选1.5 mM；二甲亚砜浓度为5%-30 % V/V。
作为一种优选的实施方式，三酶偶联催化反应体系反应温度为20℃-40℃，优选30℃；反应液缓冲的pH为6.0-9.0，优选7.5。。
本发明所用到的两种拟南芥来源的糖基转移酶AtUGT78D2和AtUGT78D1两者的氨基酸相似性为80.3%。鼠李糖基转移酶UGT78D1可以催化槲皮素的3-OH 位羟基，生成槲皮素-3-O-鼠李糖苷，拟南芥来源的葡萄糖基转移酶UGT78D2可以催化槲皮素的3-OH 位羟基，生成槲皮素-3-O-葡萄糖苷。将UGT78D1的PSPG结构域替换到葡萄糖基转移酶UGT78D2上，通过改替换手段，获得能专一性接受鼠李糖的鼠李糖基转移酶。结合定点突变后，突变体由原来的接受UDP-葡萄糖供体变为可以接受UDP-鼠李糖供体，且对UDP-鼠李糖供体的选择性显著提升，实现了糖基转移酶的糖供体选择性改变，最终获得选择性好、稳定性好、表达量高的鼠李糖基转移酶突变体。
本发明还提供了基于该突变体的三酶偶联催化反应体系。该反应体系利用廉价的蔗糖为底物，在蔗糖合酶AtSuSy和UDP-鼠李糖合成酶AtRHM-NRS的作用下合成UDP-Rha，可大大降低UDP-Rha的制备成本。实现将以槲皮素为底物，UDP-Rha为糖供体，一锅法催化合成槲皮素-3-O-鼠李糖苷。该反应体系不仅可大大降低鼠李糖苷产物的制备成本，而且多酶催化反应生成的产物单一，有助于减少后续的分离纯化步骤，精简产物的分离制备过程。
附图说明
图1为本发明的技术实施路线图。
图2为糖基转移酶及其突变体、蔗糖合酶、鼠李糖合成酶的SDS-PAGE蛋白表达情况；其中，1：Marker；2、3分别为pET-28a破碎上清、沉淀； 4、5分别为UGT78D1-D1PSPG破碎上清、沉淀； 6、7分别为UGT78D1-D1PSPG-N353F破碎上清、沉淀；8、9分别为UGT78D1-D1PSPG-G374C破碎上清、沉淀；10、11分别为UGT78D1-D1PSPG-N381Q破碎上清、沉淀；12、13分别为UGT78D1-D1PSPG-N353F/N381Q破碎上清、沉淀；14、15为Marker；16、17分别为蔗糖合酶AtSuSy破碎上清、沉淀；18、19分别为鼠李糖合成酶AtRHM-NRS破碎上清、沉淀；20为pET-28a破碎上清；上述粗酶液均为原浓度，未浓缩。
图3为蔗糖合酶AtSuSy和鼠李糖合成酶AtRHM-NRS添加比例对UDP-Rha合成的影响。
图4为UDP添加比例对UDP-Rha反应生成的影响。
图5为NAD+添加比例对UDP-Rha反应生成的影响。
图6为不同温度、pH对UDP-Rha反应生成的影响。
图7为反应时长对UDP-Rha反应生成的影响。
图8为三酶添加比例对三酶偶联催化槲皮素-3-O-鼠李糖苷合成体系转化率的影响。
图9是DMSO添加量对三酶偶联催化槲皮素-3-O-鼠李糖苷合成体系转化率的影响。
图10是底物槲皮素浓度对三酶偶联催化槲皮素-3-O-鼠李糖苷合成体系转化率的影响。
图11是双位点组合突变体转化率和区域选择性结果。
图12是三位点组合突变体转化率和区域选择性结果。
图13为槲皮素标品、UGT78D1和UGT78D2-D1PSPG的液相图。
图14为UGT78D2-D1PSPG突变体的三酶反应催化液相图。
实施方式
实施例1：本实施例说明糖基转移酶AtUGT78D2-D1 PSPG的构建
在NCBI网站上搜索AtUGT78D2（ID:At5g17050）、AtUGT78D1（ID:At1g30530），二者PSPG结构域的氨基酸如下：
将AtUGT78D1的PSPG结构域替换到AtUGT78D2的结构域上，获得结构域工程改造的糖基转移酶UGT78D2-D1 PSPG。将突变体的基因序列构建到pET-28a载体中，在5’端插入NdeⅠ 酶切位点，在3’端插入BamH Ⅰ 位点，该质粒载体pET-28a-UGT78D2-D1 PSPG由苏州金唯智公司全基因合成，将质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，挑取经菌落 PCR 验证的阳性克隆作为表达目标糖基转移酶的重组大肠杆菌，即为工程菌E. coli BL21(DE3)/pET28a-UGT78D2-D1PSPG，并冻存于-80℃冰箱内备用。
实施例2：本实验说明糖基转移酶UGT78D2-D1 PSPG的定点突变
根据Axygen质粒提取试剂盒中的实验说明步骤提取工程菌E. coli BL21(DE3)/pET28a-UGT78D2-D1 PSPG的质粒。以野生型UGT78D2-D1 PSPG基因为模板，其核酸序列如SEQ ID NO：1所示，用 Agilent Quick Change 在线突变引物设计网站设计定点突变引物；以提取的 pET28a-UGT78D2-D1 PSPG质粒为模板，用高保真 DNA 聚合酶 2×PhantaMastermix 方向 PCR 扩增全质粒，将突变体引入质粒，主要突变引物如下所示：
M350T-R 5'-ACATTCACACCCGTTGCTTCGTGTTTCAGCAGTTCC-3'
M350T-F 5'-GGAACTGCTGAAACACGAAGCAACGGGTGTGAATGT-3'
N353F-R 5'-CATCCACAATGCGTCACAAACACACCCATTGCTTCGTG-3'
N353F-F 5'-CACGAAGCAATGGGTGTGTTTGTGACGCATTGTGGATG-3'
G374C-R 5'-AATTGGCCTGCAAATCATCGGTACACCAGCCGA-3'
G374C-F 5'-TCGGCTGGTGTACCGATGATTTGCAGGCCAATT-3'
I377F-R 5'-TCTGTTATCCGCAAGAAATGGCCTGCCAATCATCG-3'
I377F-F 5'-CGATGATTGGCAGGCCATTTCTTGCGGATAACAGA-3'
L378F-R 5'-CTGTTATCCGCAAAAATTGGCCTGCCAATCATCGG-3'
L378F-F 5'-CCGATGATTGGCAGGCCAATTTTTGCGGATAACAG-3'
N381Q-R 5'-CTCTTCCGTTCAATCTCTGATCCGCAAGAATTGGCCTGC-3'
N381Q-F 5'-GCAGGCCAATTCTTGCGGATCAGAGATTGAACGGAAGAG-3'
突变体全质粒扩增的PCR体系如下所示：
模板质粒 1µL
引物-R 2µL
引物-F 2µL
ddH2O 20µL
Phanta 高保真酶 25µL
突变体全质粒扩增的PCR反应体系如下所示：
1 预热：95℃，3min
2 变性：95℃，30s
3 退火：60℃，30s
4 延伸：72℃，5min
5 2~4循环30次
6 彻底延伸：72℃，10min
7 Hold 4℃
模板消化：在50μL PCR扩增体系中加入1μL DpnI和5μL Buffer，37℃保温45min-60min，冷却至4℃保存。琼脂糖凝胶电泳验证。
将上述突变PCR产物转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑选单克隆子，采用T7通用引物进行菌落PCR验证(T7：5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'，T7-Term：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3')，挑选阳性的克隆子送公司进行DNA测序。挑取测序验证成功的阳性菌落接种于新鲜的含有卡那霉素的LB培养基内培养12h，冻存于-80℃冰箱内备用。
实施例3：本实施例说明糖基转移酶UGT78D2-D1 PSPG及其突变体的诱导表达
将实施例1、2中所得的突变体，接种至含有卡那霉素的LB培养基中，37℃，180rpm振荡培养12h，获得种子液。按2％(v：v)的接种量接入含有卡那霉素的新鲜LB培养基中，37℃，180rpm振荡培养1～2h，当培养基OD600约为0.6时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG诱导，20℃培养24h。
将发酵液离心收集菌体，用pH 7.5的磷酸缓冲洗涤两次并悬浮细胞。超声破碎，离心收集上清液，即得粗酶液。上清液作为菌体细胞内可溶蛋白待测样品，除去上清后剩余部分用1mL磷酸缓冲液重悬后作为胞内不可溶蛋白待测样品。蛋白表达情况，采用SDS-PAGE凝胶电泳分析。
实施例4：本实施例说明双酶偶联体系高效再生UDP-鼠李糖体系的优化过程
（1）蔗糖合酶AtSuSy和鼠李糖合成酶AtRHM-NRS的异源表达
本实验为了解决昂贵的UDP-Rha来源问题，同时进一步提升反应的底物浓度，建立了UDP-Rha合成酶AtRHM-NRS和蔗糖合酶AtSuSy 的双酶偶联体系用于合成UDP-Rha。由于大肠杆菌 E.coli 表达系统背景清晰，操作相对简单，因此本研究选择以pET-28a 为载体在大肠杆菌中表达UDP-Rha合成酶基因AtRHM-NRS和蔗糖合酶AtSuSy。
本研究采用实验室先前构建的E. coli BL21(DE3)/pET28a-AtSuSy异源表达拟南芥来源的蔗糖合酶AtSuSy（参见CN114836398A）。挑取大肠杆菌于添加了千分之一卡那霉素母液的固体LB培养基平板上，37℃培养 12h活化，再挑取单菌于添加卡那霉素的液体LB培养基中，置于37℃，180 rpm摇床内过夜培养12h。按照1%（v/v）的接种量将种子液加入40 mL液体培养基，置于37℃，180 rpm摇床内至菌液OD600达到0.6~0.8，添加0.02 mM IPTG 诱导剂，16℃诱导24 h。4℃，12000 rpm，10 min离心，去上清。加入pH 7.5磷酸缓冲悬浮菌体，超声破碎后12000 rpm，10 min离心，获得上清粗酶液。
同样的，表达拟南芥来源的UDP-Rha合成酶E. coli BL21(DE3)/pET28a-AtRHM-NRS，在添加0.1 mM IPTG诱导剂的条件下，20℃诱导24 h。4℃，12000 rpm，10 min离心，去上清。加入pH 7.5磷酸缓冲悬浮菌体，超声破碎后12000 rpm，10 min离心，获得上清粗酶液。
蔗糖合酶和UDP-鼠李糖合成酶的破碎上清、破碎沉淀经 SDS-PAGE分析，蔗糖合酶AtSuSy 的相对分子量约为96 kDa。UDP-Rha合成酶AtRHM-NRS的相对分子量约为66.4 kDa。这两种酶在大肠杆菌中实现了表达，且在胞内较多地可溶性表达，产生较少的包涵体，因此后续实验将采用粗酶液进行反应。
（2）蔗糖合酶AtSuSy和鼠李糖合成酶AtRHM-NRS添加比例对UDP-Rha合成的影响。
研究表明，双酶体系中的酶添加比例对于反应的整体转化率和产物的种类有着明显的影响。首先以牛血清蛋白（BSA）溶液作为标准蛋白，制作标准蛋白浓度曲线。在酶标板中加入20 µL特定浓度的标准蛋白溶液，再加入200 µL BCA工作液，37℃孵育 30 min，静置到室温，用酶标仪测定各孔的A562值，以各孔的A562值为纵坐标，对应蛋白浓度为横坐标，制作标准蛋白曲线。将待测目标蛋白稀释至适当倍数，以同样方法测定A562值，根据标准曲线，计算出AtRHM-NRS和AtSuSy粗酶对应的蛋白浓度。
UDP-Rha供体生成反应体系中需要添加蔗糖合酶AtSuSy，鼠李糖合成酶AtRHM-NRS，UDP、NAD+、蔗糖以及磷酸缓冲溶液。初定NAD+的添加量为1mM，UDP的添加量为2mM，蔗糖添加量为400mM，所用的磷酸缓冲溶液为pH=7.5，改变双酶比例AtSuSy：AtRHM-NRS=1:1~1:8。反应条件为30℃，5h后煮沸使酶失活，冷却后再加入等体积甲醇终止反应。离心取上清过膜，HPLC分析。
UDP-Rha的HPLC检测分析程序：仪器：戴安(DIONEX)P680高效液相色谱仪；分析柱：Kromasil C18色谱柱(250mm×4.6mm，3μm)；检测波长：260nm；进样20µL；检测温度：30℃；流动相：5%甲醇水溶液中含50mM 甲酸铵（pH=4.5）；流速0.5mL/min。
双酶添加比例对UDP-Rha生成量的结果如图3所示，双酶比例AtSuSy：AtRHM-NRS=1:8时结果如下表1所示：
表1
AtSuSy（mg/mL） AtRHM-NRS（mg/mL） NAD+（mM） UDP(mM) 蔗糖（mM） UDP-Rha生成量（mM）
0.02 0.16 1 1 400 0.294
可以得出，当AtSuSy的添加量为0.02 mg/mL，AtRHM-NRS的添加量为0.16mg/mL，即双酶比例为1:8时，反应体系中生成的UDP-Rha含量最高，为0.294 mM。
（3）UDP添加比例对UDP-Rha反应生成的影响。
初始反应体系为AtSuSy 0.02mg/mL，AtRHM-NRS 0.16mg/mL，NAD+浓度为1mM，蔗糖浓度为400mM，磷酸缓冲溶液pH=7.5，UDP的添加范围为0.2mM~4mM。反应条件为30℃，5h后煮沸使酶失活，冷却后再加入等体积甲醇终止反应。离心取上清过膜，HPLC检测UDP-Rha。结果如图4所示，UDP添加量为1.5mM时结果如下表2所示：
表2
AtSuSy（mg/mL） AtRHM-NRS（mg/mL） NAD+（mM） UDP(mM) 蔗糖（mM） UDP-Rha生成量（mM）
0.02 0.16 1 1.5 400 0.3401
可以得出，当UDP添加浓度为1.5mM时，反应体系中UDP-Rha的生成量最大为0.3401mM。当UDP浓度大于3 mM时，反应中UDP-Rha的生成量显著降低，可知高浓度的UDP对酶有抑制作用。
（4）NAD+添加比例对UDP-Rha反应生成的影响。
初始反应体系为AtSuSy 0.02 mg/mL，AtRHM-NRS 0.16 mg/mL，UDP添加浓度为1.5mM，蔗糖浓度为400 mM，磷酸缓冲溶液pH7.5，NAD+的添加范围为0.1mM~1.0mM。反应条件为30℃，5h后煮沸使酶失活，冷却后再加入等体积甲醇终止反应。离心取上清过膜，HPLC检测UDP-Rha。结果如图5所示，NAD+添加量为0.7mM的结果如下表3所示：
表3
可以得出，当NAD+添加浓度为0.7mM时，反应体系中UDP-Rha的生成量最大为0.946mM。当NAD+浓度大于0.9 mM时，反应中UDP-Rha的生成量呈降低趋势，NAD+也是AtRHM- NRS活性的潜在抑制剂，高浓度的NAD+可以抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）作为AtRHM NRS的辅助因子。
（5）不同温度、pH对UDP-Rha反应生成的影响。
温度的影响：反应体系为：AtSuSy 0.02mg/mL，AtRHM-NRS 0.16mg/mL，UDP添加浓度为1.5mM，NAD+添加浓度为0.7mM，蔗糖浓度为400mM，磷酸缓冲溶液pH7.5。将反应体系分别置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃条件下检测UDP-Rha的生成量。
pH的影响：反应体系为：AtSuSy 0.02mg/mL，AtRHM-NRS 0.16mg/mL，UDP添加浓度为1.5mM，NAD+添加浓度为0.7mM，蔗糖浓度为400 mM，反应温度为30℃，在不同pH的缓冲溶液反应，检测UDP-Rha的生成量。缓冲溶液分别为50mM的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲(pH 6.0，6.5，7.0，7.5)，50mM的Tris-HCl缓冲(pH 8.0，8.5，9.0)。结果如图6所示：
（6）反应时长对UDP-Rha反应生成的影响。
反应体系为AtSuSy 0.02mg/mL，AtRHM-NRS 0.16mg/mL，UDP添加浓度为1.5mM，NAD+添加浓度为0.7 mM，蔗糖浓度为400 mM，磷酸缓冲溶液pH 7.5。反应条件为30℃，隔一段时间取样，每次取样100µL后煮沸使酶失活，冷却后再加入等体积甲醇终止反应。离心取上清过膜，HPLC检测UDP-Rha。结果如图7所示，反应时长为6h的结果如下表4所示：
表4
可以得出，当反应时间为6h时，反应体系中UDP-Rha的生成量最大为0.987mM。
综上所述，利用双酶法构建UDP-Rha的循环体系，最优条件为AtSuSy 0.02mg/mL，AtRHM-NRS 0.16mg/mL，UDP添加浓度为1.5 mM，NAD+添加浓度为0.7 mM，蔗糖浓度为400mM，磷酸缓冲溶液pH 7.5。反应条件为30℃，反应时间6h。
实施例5：本实施例说明三酶（蔗糖合酶、UDP-鼠李糖合成酶、糖基转移酶）偶联催化槲皮素-3-O-鼠李糖苷合成体系的优化。
根据实施例4中的优化条件，先利用双酶偶联体系（AtSuSy 0.02 mg/mL，AtRHM-NRS 0.16mg/mL，1.5mM UDP，0.7mM NAD+，400 mM蔗糖，磷酸缓冲溶液pH7.5），在30℃条件下，反应6h，使得反应体系中有一定量的UDP-Rha糖供体生成，再添加鼠李糖基转移酶粗酶液、槲皮素底物和一定量的DMSO进行体外糖基化反应，催化合成槲皮素-3-O-鼠李糖苷。
HPLC检测槲皮素-3-O-鼠李糖苷的方法为：仪器：戴安(DIONEX)P680高效液相色谱仪；分析柱：Kromasil C18色谱柱(250mm×4.6mm，3μm)；检测波长：368 nm；进样量：20µL；检测温度：30℃；流动相：55%的甲醇水溶液；流速0.6 mL/min。
首先探究三酶比例（蔗糖合酶、UDP-鼠李糖合成酶、糖基转移酶）的添加对合成槲皮素-3-O-鼠李糖苷的影响。根据实施例3中的方法，获取糖基转移酶UGT78D2-D1 PSPG及其突变体的粗酶液，用BCA法测定粗酶液的蛋白浓度。糖基转移酶添加量从0.02 mg/mL~0.16mg/mL。HPLC检测槲皮素-3-O-鼠李糖苷的生成量，计算其转化率。结果如图8所示。
其次是探究DMSO添加量对合成槲皮素-3-O-鼠李糖苷的影响。DMSO的添加量为5~30%(V:V)。HPLC检测槲皮素-3-O-鼠李糖苷的生成量，计算其转化率。结果如图9所示。
最后是探究底物槲皮素浓度对合成槲皮素-3-O-鼠李糖苷的影响。槲皮素的添加浓度为0.5mM ~3mM。HPLC检测槲皮素-3-O-鼠李糖苷的生成量，计算其转化率。结果如图10所示：
综上，三酶偶联催化合成槲皮素-3-O-鼠李糖苷体系的优化条件为：
三酶的最佳比例为AtSuSy 0.02mg/mL，AtRHM-NRS 0.16mg/mL，糖基转移酶0.12mg/mL，即反应体系中的三酶添加比例为1:8:6；UDP的最适添加浓度为1.5mM；NAD+的最适添加浓度为0.7mM；DMSO的最适添加比例为10%；底物槲皮素浓度的最适添加比例为1.5mM；最适反应温度为30℃；最适反应pH为7.5。
实施例6：本实施例说明糖基转移酶UGT78D2-D1 PSPG及其突变体的糖供体选择性。
根据实施例5中的方法，进行三酶反应催化。反应结束后煮沸使酶失活，冷却后添加等体积的甲醇终止，离心取上清过膜。HPLC检测，计算转化率和区域选择性。
糖基化转化率=[总产物峰面积/（总产物峰面积+底物槲皮素峰面积）]×100%
糖基化区域选择性=（对应产物峰面积/总产物峰面积）×100%
不同突变体的转化率和区域选择性如图11-12所示。
如图13所示，在该条件下，槲皮素的峰保留时间为14.8min。已知糖基转移酶AtUGT78D1专一性接受UDP-Rha为糖供体，催化槲皮素的3-OH羟基位置，合成产物槲皮素-3-O-鼠李糖苷，在该HPLC条件下，产物槲皮素-3-O-鼠李糖苷的峰保留时间为10.54min。对经过PSPG结构域替换的糖基转移酶突变体UGT78D2-D1 PSPG进行点突变，糖基转移酶UGT78D2-D1 PSPG及其突变体的催化结果如下表所示，催化液相图如图14所示。
结果表明：糖基转移酶UGT78D2-D1 PSPG的突变体M350T/I377F、M350T/N381Q、N353F/G374C、N353F/I377F、N353F/L378F或N353F/N381Q有良好的合成槲皮素-3-O-鼠李糖苷的能力。表明该突变体接受UDP-Rha为糖供体，选择性较强且有较好的催化活力。利用糖基转移酶和蔗糖合酶、鼠李糖合成酶偶联反应，可实现一步法由蔗糖直接制备产物，且在反应过程中也不需要高能活化糖的加入，简化了制备过程，大大降低生产成本，在生物制药工业中具有广阔的应用前景。

Claims (10)

1.一种糖基转移酶突变体，其特征在于，通过将葡萄糖基转移酶AtUGT78D2氨基酸序列C-端PSPG结构域的44个氨基酸替换为糖基转移酶AtUGT78D1的C-端PSPG结构域的44个氨基酸，获得结构域工程改造的糖基转移酶AtUGT78D2-D1PSPG；再将糖基转移酶AtUGT78D2-D1PSPG中第350位、第353位、第374位、第377位、第378位、第381位氨基酸残基中的一个或多个点突变为另一种氨基酸残基，得到所述糖基转移酶突变体；
其中，第350位蛋氨酸突变为苏氨酸、第353位天冬酰胺突变为苯丙氨酸、第374位甘氨酸突变为半胱氨酸、第377位异亮氨酸突变为苯丙氨酸、第378位亮氨酸突变为苯丙氨酸，第381位天冬酰胺突变为谷氨酰胺；
所述糖基转移酶AtUGT78D2-D1PSPG的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体为糖基转移酶AtUGT78D2-D1PSPG的第350位、第353位、第374位、第377位、第378位、第381位氨基酸残基中的两个位点或三个位点的组合突变。
3.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体为M350T/I377F、M350T/N381Q、N353F/G374C、N353F/I377F、N353F/L378F或N353F/N381Q。
4.权利要求1~3任一项所述突变体在制备槲皮素-3-O鼠李糖苷中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，以蔗糖为底物，利用三酶偶联催化反应体系合成槲皮素-3-O-鼠李糖苷产物；
所述三酶偶联催化合成槲皮素-3-O-鼠李糖苷的体系包括：所述糖基转移酶突变体、拟南芥来源的蔗糖合成酶AtSuSy、UDP-鼠李糖合成酶AtRHM-NRS、蔗糖、尿苷二磷酸二钠UDP、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+、二甲亚砜DMSO、槲皮素和磷酸缓冲液。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，三酶偶联催化反应体系中蔗糖合成酶AtSuSy的使用量为0.01mg/mL-0.12mg/mL，三酶质量比为蔗糖合成酶：UDP-鼠李糖合成酶：糖基转移酶突变体=1:8:2~8。
7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，三酶偶联催化反应体系中UDP的添加的浓度为0.2 mM -3 mM，优选1.5 mM；NAD+添加的浓度为0.1 mM-0.9mM，优选0.7mM。
8. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，三酶偶联催化反应体系中蔗糖添加的浓度为100 mM-600 mM，优选400 mM。
9. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，三酶偶联催化反应体系中槲皮素添加的浓度为0.5 mM-3 mM，优选1.5 mM；二甲亚砜浓度为5%-30 % V/V。
10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，三酶偶联催化反应体系反应温度为20℃-40℃，优选30℃；反应液缓冲的pH为6.0-9.0，优选7.5。
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