KR101818561B1

KR101818561B1 - 바실러스 유래 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 이용한 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 제조 방법

Info

Publication number: KR101818561B1
Application number: KR1020160033392A
Authority: KR
Inventors: 노갑수; 김병균; 최강현
Original assignee: 에스티팜 주식회사
Priority date: 2016-03-21
Filing date: 2016-03-21
Publication date: 2018-01-15
Also published as: WO2017164615A1; KR20170109369A

Abstract

본 발명은 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) 유래 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 이용한 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 제조 방법에 의하면, 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 고수율 및 고순도로 전환 및 정제하여 경제적이면서 효율적으로 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 대량 생산할 수 있다.

Description

바실러스 유래 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 이용한 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 제조 방법 {Method for Preparing 3'-Amino-2',3'-dideoxyadenosine by Using Nucleoside Phosphorylase Derived from Bacillus}

본 발명은 바실러스 유래 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 이용한 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 제조 방법에 관한 것이다.

특정 핵산 서열이나 단백질과 결합을 기반으로 하는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 및 올리고뉴클레오티드 유사체(oligonucleotide analogue) 약물의 활용에 대하여 광범위한 연구가 진행되고 있다. 특히, 올리고뉴클레오티드 유사체 약물은 뉴클레아제(nuclease)에 대한 저항성, 결합물질과의 결합력 및 특이성을 향상시킬 수 있도록 연구개발이 진행되고 있다.

그 중 N3' → P5' 포스포아미데이트(phosphoramidate) 결합으로 이루어진 올리고뉴클레오티드는 생체 내외에서 목적한 유전자서열과 특이적인 상보적 결합을 이루어 뉴클레아제에 대한 저항성을 갖는 것으로 보고되었다 (J. K. Chen et. al., Nucleic Acids Res., 23, 2661-2668 (1994); C. Escude et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 4365-4369 (1996); S. M. Gryaznov et. al. Nucleic Acids Res., 24, 1508-0514 (1996); C. Giovannangeli et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 79-84 (1997)). 하지만 N3'→ P5' 포스포아미데이트 올리고뉴클레오티드 제조의 가장 큰 문제점은 단량체인 3'-아미노-2',3'-디데옥시뉴클레오시드(3'-amino-2',3'-dideoxynucleoside)의 산업적인 제조가 어렵다는 점에 있다.

그 중 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신(3'-amino-2',3'-dideoxyadenosine; ADA)의 화학적 및 효소적 제조방법의 연구 개발을 위해 3'-아지도-3'-데옥시티미딘(3'-azido-3'-deoxythymidine; AZT)이 전구물질로 사용되어 왔다. 3'-아지도-3'-데옥시티미딘은 항 인간 면역 결핍 바이러스 활성이 밝혀진 중요한 의약원료로써 티미딘(thymidine)을 원료로 제조하며(N. Miller et. al., J. Org. Chem., 29, 1772-1776 (1964), Horwitz et. al., J. Org. Chem., 29, 2076-2078 (1964)) 산업적으로 대량생산이 진행되어 공급이 용이한 물질이다.

Imazawa 등은 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 화학적 당전이 통해 제조하는 연구결과를 다음과 같이 보고하였다. 3'-아지도-3'-데옥시티미딘에 초산을 가하여 당의 5' 부분을 아세틸화하여 3'-아지도-3'-데옥시-5'-O-아세틸티미딘(3'-azido-3'-deoxy-5'-O-acertylthymidine)을 합성 후 N⁶-옥타노일아데닌(N⁶-octanoyladenine)을 화학적 당 전이 시켜 9-(3'-아지도-2',3'-디데옥시-5'-O-아세틸리보퓨라노실)-N⁶-옥타노일아데닌 (9-(3'-azido-2',3'-dideoxy-5'-O-acetylribofuranosyl)-N⁶-octanoyladenine)을 합성하였다. 여기에 강염기가 포함된 알코올을 이용하여 탈아실화 반응을 진행하여 9-(3'-아지도-2',3'-디데옥시-D-리보퓨라노실)아데닌(9-(3'-azido-2',3'-dideoxy-D-ribofuranosyl)adenine)으로 전환 후 이온교환수지를 사용하여 잔여 염기를 제거하고 실리카겔 컬럼을 사용하여 9-(3'-아지도-2',3'-디데옥시-β-D-리보퓨라노실)아데닌(9-(3'-azido-2',3'-dideoxy-β-D-ribofuranosyl)adenine)을 회수하였다. 여기에 트리페닐포스핀(triphenylphosphine)을 이용하여 당 부분의 아자이드 부분을 환원시켜 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 합성할 수 있었다고 보고하였다(M. Imazawa and F. Eckstein, J. Org. Chem., 43(15), 3044 (1978)). 그러나 상기의 화학적 당 전이 방법은 약 21%의 매우 낮은 몰 수율(3'-아지도-3'-데옥시티미딘 기준)을 나타내며, 알파-아노머(α-anomer)의 생성으로 분리정제가 어려운 단점이 있다.

3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 효소적 전환 연구는 3'-아지도-3'-데옥시티미딘의 아자이드(azide)부분을 추가적으로 환원시켜 제조한 3'-아미노-3'-데옥시티미딘(3'-amino-3'-deoxythymidine; ATMD)을 이용하여 아데닌(adenine; ADE)에 3-아미노-2,3-디데옥시리보스를 당 전이하여 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신으로 전환시키는 방법이 보고된 바 있다.

이러한 예로 Zaitseva 등(G. V. Zaitseva et. al., Nucleosides & Nucleotides, 13(1-3), 819-834 (1994))은 200 ml의 반응액에 3'-아미노-3'-데옥시티미딘 477 mg(10 mM), 아데닌 800 mg(30 mM), 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)로 전처리한 건조한 대장균(Escherichia coli BM-11) 3 g을 첨가하여 5 mM의 인산 버퍼(pH 6.75) 조건과 50 ℃에서 24시간 반응한 후 이온교환 수지 등을 통한 정제를 통하여 46 %의 몰 수율로 110 mg의 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 제조한 사실을 보고하였다. 여기에서 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 합성이 대장균 내에 존재하는 티미딘 포스포릴라아제(thymidine phosphorylas, EC2.4.2.4), 우리딘 포스포릴라아제(uridine phosphorylase, EC2.4.2.3) 또는 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제(purine nucleoside phosphorylase; PUNP, EC2.4.2.1) 등의 작용에 의해 합성될 수 있다고 하였으나, 이의 구체적인 수율 및 합성능에 대해 밝힌 바가 없다.

또한 미국 공개특허 제2007/0065922호에서는 티미딘 포스포릴라아제와 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제가 높은 활성을 보이는 대장균(Escherichia coli 1K/1T)을 선별하여 효소 반응을 수행한 결과를 제시하였다. 20 mM 인산버퍼(pH 6.0) 반응액 100 ml에 3'-아미노-3'-데옥시티미딘 2.42 g(100 mM), 아데노신 0.68 g(50 mM), 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)로 전처리한 대장균 (Escherichia coli 1K/1T)의 습균체 3 g을 첨가하거나 또는 정제된 티미딘 포스포릴라아제(1250 IU)와 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제(950 IU)를 첨가하여 50 ℃에서 16 ~ 24시간 반응한 후 이온교환 수지를 이용한 정제를 통하여 3'-아미노-3'-데옥시티미딘 기준 35 ~ 38%의 몰 수율로 0.87 ~ 0.95 g의 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 제조한 사실을 보고한 바 있다.

그러나, 위 보고된 생물전환을 통한 당 전이 방법에서 다음과 같은 문제점을 가져, 상업적 이용이 매우 제한적이다.

첫째, 낮은 수율(3'-아미노-3'-데옥시티미딘 기준 35 ~ 46 %의 몰 수율)로 인해 산업적으로 적용하기에 효율적이지 못하다.

둘째, 3'-아미노-3'-데옥시티미딘 10 mmol(2.42 g)을 전환하기 위해 사용되는 미생물 균체 첨가량이 건조 균체 기준 0.6 ~ 15 g에 달하며, 이러한 다량의 균체 사용시 균체를 제조하기 위한 원료 비용 및 생물전환의 완료 후 균체를 제거하기 위해 소모되는 공정 시간 및 수율 감소 때문에, 산업화가 불가능하다.

셋째, 주원료인 3'-아미노-3'-데옥시티미딘의 낮은 농도(10 mM ~ 100 mM)조건에 의해 설비 효율성이 떨어진다.

넷째, 당 전이 수율을 높이기 위하여 반응 기질 간 몰 비율이 2~3 배의 차이를 보여 효소 전환 종료 후 미 반응 물질이 다량 포함되어 후속 정제에 부담이 되고, 산업적으로도 원료가가 상승하는 원인이 때문에 대량 생산에 부적합하다.

다섯째, 고온의 반응조건(50 ℃)에 따른 미생물 균체의 파괴를 방지하기 위해 글루타르알데히드 전 처리를 필요로 한다(P. H. Ninh et. al., Appl. Environ. Microbiol.,79(6), 1996-2001 (2013)).

여섯째, 생물전환 반응 후 이온교환 수지를 사용한 정제 방법은 공정설계시 별도의 수지탑이 필요하며, 흡착 및 탈착과 제품 분액의 농축과정 추가에 따른 공정의 장기화 및 제품의 제조경비가 상승하는 문제점이 있다.

이러한 배경 하에, 고농도에서 기질 간 몰 비율의 차이를 줄이고 당 전이 수율을 높일 수 있는 적절한 효소의 선택 및 당 전이 반응 최적화에 대한 연구 개발이 필요하다. 더욱이, 위와 같은 생물전환이 종료된 반응액에서 경제적이면서 효율적으로 순수한 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 정제할 수 있는 방법을 개발할 필요가 있다.

본 발명은 바실러스 스테아로써모필러스 유래 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및 바실러스 스테아로써모필러스 유래 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 3'-아미노-3'-데옥시티미딘 및 아데닌에 처리하여 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 제조하는 단계를 포함하는 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 제조하는 단계 후, 상기 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 제조하는 단계의 반응물에 알코올 및 강염기를 첨가하여 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제의 효소원과 반응 부산물을 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 제조 방법을 제공한다.

본 발명자들은 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 산업적 대량 생산을 위한 제조 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 바실러스 스테아로써모필러스 유래 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및 바실러스 스테아로써모필러스 유래 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제을 이용하는 경우, 기존에 알려진 방법과 대비하여 높은 수율로 고순도의 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 생산할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 있어서, 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신은 하기 화학식 1의 구조를 가지는 화합물이다.

[화학식 1]

본 발명에 있어서, 3'-아미노-3'-데옥시티미딘은 하기 화학식 2의 구조를 가지는 화합물이다.

[화학식 2]

본 발명에 있어서, 아데닌은 하기 화학식 3의 구조를 가지는 화합물이다.

[화학식 3]

본 발명에 있어서, 티민은 하기 화학식 4의 구조를 가지는 화합물이다.

[화학식 4]

본 발명에 있어서, 뉴클레오시드 포스포릴라아제(nucleoside phosphorylase; NP)는 인산 존재 하에 뉴클레오시드의 N-글리코시딕 결합(N-glycosidic linkage)을 가인산분해(phosphorolysis)하는 효소를 총칭하며, 다음 식으로 표시되는 반응을 촉매한다.

리보뉴클레오시드 + 인산 → 핵산 염기 + 리보스 -1-인산

본 발명에 따른 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 제조 방법은 바실러스 스테아로써모필러스 유래 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 이용하여 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신으로 높은 전환율을 나타내여 효율적으로 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 대량 생산할 수 있다. 특히, 타 유래의 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 사용한 제조방법, 또는 기타 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 사용한 제조방법과 대비하여 현저히 우수한 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신 생산능을 보인다.

본 발명에 따른 바실러스 스테아로써모필러스 유래 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및 바실러스 스테아로써모필러스 유래 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 3'-아미노-3'-데옥시티미딘 및 아데닌에 처리하는 생물전환 공정은 하기 2 단계 당전이 반응으로 설명된다.

1) 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제 반응

3'-아미노-3'- 데옥시티미딘 + 인산 → 티민 + 3-아미노-2,3- 디데옥시리보스 -1-인산

2) 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 반응

아데닌 + 3-아미노-2,3- 디데옥시리보스 -1-인산 → 3'-아미노-2',3'- 디데옥시 아데노신 + 인산

위 반응에서와 같이, 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 3'-아미노-3'-데옥시티미딘을 3-아미노-2,3-디데옥시리보스-1-인산으로 치환하며, 3-아미노-2,3-디데옥시리보스-1-인산은 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제에 의해 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신으로 전환된다.

본 발명에 있어서 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) 유래 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제이다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면 상기 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)는 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) TH6-2 (FERM BP-2758)이다.

분자 생물학 및 유전자 공학에 의해 상술한 바실러스 스테아로써모필러스 유래 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및/또는 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제의 분자 생물학적인 특성 및 아미노산 서열 등을 해석함으로써 상기 단백질의 유전자를 상기 균주로부터 취득하여 상기 유전자 및 발현에 필요한 제어 영역이 삽입된 재조합 플라스미드를 구축하고, 이를 임의의 숙주에 도입하여 상기 단백질을 발현시킨 유전자 재조합 균주를 제조할 수 있다. 이에 따라, 바실러스 스테아로써모필러스 균주의 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및/또는 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제 유전자를 임의의 숙주에 도입한 유전자 재조합 균주도 본 발명의 범주에 포함된다.

본 발명의 바실러스 스테아로써모필러스 유래 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 서열번호 1의 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 또는 이의 활성을 나타내는 단편을 포함하며, 바실러스 스테아로써모필러스 유래 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 서열번호 2의 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제 또는 이의 활성을 나타내는 단편을 포함한다.

바실러스 스테아로써모필러스 유래 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 서열번호 3의 염기서열로부터 합성될 수 있다.

바실러스 스테아로써모필러스 유래 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 서열번호 4의 염기서열로부터 합성될 수 있다.

상기 재조합 플라스미드는 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 상기 발현에 필요한 제어 영역이란 프로모터(promotor) 서열(전사를 제어하는 오퍼레이터 서열을 포함한다), 리보좀(ribosome) 결합 서열(SD 서열), 전사 종결 서열 등을 포함하여 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산서열이 포함되어 있는 것을 말한다.

프로모터 서열의 구체예로서는 대장균 유래의 트립토판 오페론(tryptophan operon)의 trp 프로모터, 락토스 오페론(lactose operon)의 lac 프로모터, 람다 파지(lamda phage) 유래의 프로모터 또는 고초균 유래의 글루콘산 합성 효소 프로모터(gluconic acid synthase promotor; gnt), 알칼리 프로테아제 프로모터(alkaline protease promotor; apr), 중성 프로테아제 프로모터(neutral protease promotor; npr) α-아밀라제 프로모터(α-amylase promotor; amy) 등을 들 수 있다. 또한, tac 프로모터와 같이 독자적으로 개변·설계된 서열도 이용할 수 있다.

리보좀 결합 서열로서는 대장균 유래 또는 고초균 유래의 서열을 들 수 있지만 대장균이나 고초균 등의 목적으로 하는 숙주 내에서 기능하는 서열이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면 16S 리보좀 RNA의 3' 말단 영역에 상보적인 서열이 4염기 이상 연속된 콘센서스(consensus) 서열을 DNA 합성에 의해 제조하여 이것을 이용하여도 좋다.

전사종결 서열은 필요에 따라 ρ 인자 비의존성인 것, 예를 들면 리포프로테인 터미네이터(lipoprotein terminator), trp 오페론 터미네이터(trp operon terminator) 등을 이용할 수 있다.

이들 제어 영역의 재조합 플라스미드 상에서 서열 순서는 5' 말단 측 상류부터 프로모터 서열, 리보좀 결합 서열, 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 코드하는 유전자, 전사 종결 서열의 순으로 배열하는 것이 바람직하다.

상기 플라스미드의 예시로써, 이에 제한되지 않으나 대장균 중에서의 자율 복제 가능한 영역을 가지고 있는 pFRPT(대한민국 특허 제10-0449639호), pBR322, pUC18, Bluescript II SK(+), pKK223-3 또는 pSC101, 또는 고초균 중에서의 자율 복제 가능한 영역을 가지고 있는 pUB110, pTZ4, pC194, ρ11 또는 φ1ㅡ φ105를 이용할 수 있으며, 2 종류 이상의 숙주 내에서의 자율 복제가 가능한 플라스미드의 예로서 pHV14, TRp7, YEp7 또는 pBS7 등을 이용할 수가 있다.

상기 임의의 숙주는 이에 제한되는 것은 아니나, 대장균(Escherichia coli), 고초균(Bacillus subtilis) 등의 바실루스 속 균주를 포함하며, 산업적으로 그 이용이 용이한 대장균(Escherichia coli)이 바람직하게 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면 위 숙주는 Escherichia coli JM109이다.

본 발명에 있어서, 상기 바실러스 스테아로써모필러스 유래 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및/또는 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제의 사용가능한 형태는 효소 자체, 효소 활성을 갖는 균체, 균체 처리물 또는 이들의 고정화물을 모두 포함하며, 이를 이용하여 반응을 수행할 수 있다. 균체는 원심분리를 통해 분리한 습균체 또는 동결 건조된 형태의 균체일 수 있다. 균체 처리물이란, 예를 들면 아세톤(acetone) 건조균체나 기계적 파괴, 초음파 파쇄, 동결 융해 처리, 가압 감압 처리, 침투압 처리, 자기 소화, 세포벽 분해 처리, 계면 활성제 처리 등에 의해 제조한 균체 파쇄물을 포함하며, 또한 필요에 따라 황산암모늄(ammonium sulfate) 침전 또는 아세톤 침전, 칼럼 크로마토그래피(column chromatography)에 의해 정제를 거듭한 균체 처리물을 포함한다.

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 발명자들은 대장균용 발현 벡터 pFRPT(대한민국 특허 제0449639호)에 바실러스 스테아로써모필러스 유래 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 또는 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제의 유전자를 삽입하고 E. coli JM109에 이를 도입함으로써 각각 pFRPT-BPUNP/JM109, pFRPT-BPYNP/JM109 유전자 재조합 균주를 완성하였다. 완성된 유전자 재조합 균주의 배양과정 및 원심분리를 통해 회수한 습균체 또는 습균체에 추가적인 동결건조 처리를 하여 회수한 건조균체가 제조되었다. 위 제조된 습균체를 3'-아미노-3'-데옥시티미딘 및 아데닌과 반응시켜 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 생산할 수 있다.

본 발명의 바실러스 스테아로써모필러스 유래 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및 바실러스 스테아로써모필러스 유래 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 3'-아미노-3'-데옥시티미딘 및 아데닌에 처리하여 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 제조하는 단계는 하기 조건 하에 반응을 통해 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 효율적으로 생산할 수 있다.

바실러스 스테아로써모필러스 유래 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및 바실러스 스테아로써모필러스 유래 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제의 단위 활성도는 다음과 같이 계산하였다.

1) 바실러스 스테아로써모필러스 유래 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성도 측정

반응식 : 구아노신(guanosine) + 인산 → 구아닌(guanine) + 리보스-1-인산

활성도 계산 : U = 구아닌 몰 수(umol) / 반응시간(min)

2) 바실러스 스테아로써모필러스 유래 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성도 측정

반응식 : 5-메틸우리딘(5-methyl uridine) + 인산 → 티민(thymine) + 리보스-1-인산

활성도 계산 : U = 티민 몰 수(umol) / 반응시간(min)

위 활성도 계산에 따른 본 발명에 따른 바실러스 스테아로써모필러스 유래 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및 바실러스 스테아로써모필러스 유래 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제의 최적의 효소 사용비는 이에 제한되지 않으나, 효소 활성단위 비율로 바실러스 스테아로써모필러스 유래 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및 바실러스 스테아로써모필러스 유래 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제가 1 (U) : 1 내지 3 (U), 바람직하게 1 (U) : 2 (U)인 것이 바람직하다.

본 발명의 바실러스 스테아로써모필러스 유래 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및 바실러스 스테아로써모필러스 유래 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 3'-아미노-3'-데옥시티미딘 및 아데닌에 처리하여 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 제조하는 단계에 있어서 반응 pH는 pH 7.5 내지 9.5, 바람직하게 pH 8.0 내지 9.0, 보다 바람직하게, pH 8.5 내지 9.0일 수 있다.

본 발명의 바실러스 스테아로써모필러스 유래 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및 바실러스 스테아로써모필러스 유래 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 3'-아미노-3'-데옥시티미딘 및 아데닌에 처리하여 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 제조하는 단계에 있어서 반응 온도는 50 ℃ 미만, 바람직하게, 30 내지 40 ℃, 보다 바람직하게 약 40 ℃일 수 있다. 50 ℃ 이상의 고온 조건에서는 아미노-카르보닐 반응(amino-carbonyl reaction)에 의해 갈변이 발생하며, 이에 따라 최종 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 수율 저하의 원인이 되고 갈변에 의해 생성된 불순물로 인해 정제과정에서의 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 결정화가 방해되어 이온교환수지에 의한 정제방법을 이용하는 문제점이 발생한다. 따라서 반응 온도를 바람직하게 약 40℃로 설정하여 위 현상을 억제할 수 있다.

본 발명의 바실러스 스테아로써모필러스 유래 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및 바실러스 스테아로써모필러스 유래 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 3'-아미노-3'-데옥시티미딘 및 아데닌에 처리하여 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 제조하는 단계에 있어서, 반응 시간은 효소 처리량에 따라 달라질 수 있으나, 48 시간 내지 96시간, 바람직하게 48 시간 내지 60 시간 반응시키는 것이 바람직하다.

본 발명의 바실러스 스테아로써모필러스 유래 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및 바실러스 스테아로써모필러스 유래 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 3'-아미노-3'-데옥시티미딘 및 아데닌에 처리하여 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 제조하는 단계에 있어서, 반응은 추가로 인산 또는 이의 염 존재 하에 반응이 수행될 수 있다. 위 반응에서 인산 또는 이의 염은 바람직하게 인산이수소나트륨이며, 3 내지 10 mM, 바람직하게, 3 내지 5 mM의 저농도로 반응액 내에 포함될 수 있다.

본 발명의 바실러스 스테아로써모필러스 유래 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및 바실러스 스테아로써모필러스 유래 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 3'-아미노-3'-데옥시티미딘 및 아데닌에 처리하여 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 제조하는 단계에 있어서, 기질의 농도는 1 M 이상으로 하여 3'-아미노-3'-데옥시티미딘 및 아데닌의 반응을 수행하는 것이 바람직하다. 즉, 고농도 기질에서 반응이 원활하게 진행되어 산업적인 제조공정 개발에 적합한 제조방법을 제공한다.

상기 기질로 3'-아미노-3'-데옥시티미딘 및 아데닌은 1 : 1의 몰비율로 포함되는 것이 바람직하다. 1: 1의 몰비율을 가짐으로써 원료의 낭비를 줄일 수 있고 후속공정에서 정제를 보다 용이하게 진행할 수 있는 장점이 있다. 이는 기존에 알려진 방법들이 특정 기질의 당량 비율을 증가시켜 전환 반응을 수행한 것과 대비하여 원료의 낭비를 줄이며 후속 공정에서 정제를 용이하게 한다.

본 발명은 상기 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 제조하는 단계 후,

상기 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 제조하는 단계의 반응물에 알코올 및 강염기를 첨가하여 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제의 효소원과 반응 부산물을 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 제조 방법은 위 단계를 추가로 더 포함하여 이온교환수지에 의한 정제 없이도 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 고수율로 생산함으로써 이온 교환 수지 등을 이용하는 방법에서 흡착, 탈착 및 분액 농축에 의해 공정 시간의 장기화되는 단점을 해결하여 산업적 대량생산에 바람직하다.

본 발명에 따른 상기 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 제조하는 단계의 반응물에 알코올 및 강염기를 첨가하여 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제의 효소원과 반응 부산물을 제거하는 단계는 하기 조건 하에 반응을 통해 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 효율적으로 생산할 수 있고 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 고순도로 정제할 수 있다.

상기 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 제조하는 단계의 반응물에 알코올 및 강염기를 첨가하여 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제의 효소원과 반응 부산물을 제거하는 단계는 효소원인 바실러스 스테아로써모필러스 유래 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및 바실러스 스테아로써모필러스 유래 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제와 반응에 따른 부산물로 미반응 기질 및 반응을 통해 생산되는 주된 부산물인 티민을 동시에 제거하는 단계이다.

3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 제조하는 단계의 반응물에 알코올 및 강염기를 첨가하여 위 효소원과 반응 부산물을 제거하는 단계는, 생물 전환 반응액에서 목적물을 정제하는 공정으로 통상적으로 효소원으로 사용되는 균체의 제거를 우선 수행할 수 있다.

효소원으로 사용되는 균체를 제거하기 위해 통상 한외 여과막(UF)을 사용하는 여과, 멤브레인 필터(MF) 여과, 연속 원심 분리 처리, 및 규조토 여과 등을 사용하여 균체를 여과할 수 있으며, 바람직하게는 규조토 여과 방법을 이용한다. 상기 여과를 위해서는 효소원(바람직하게 균체)을 제외한 물질들이 용매에 용해된 상태가 바람직하다. 통상의 뉴클레오시드의 경우 강염기의 수용액에서 높은 용해도를 갖는 특성을 가지므로 효소전환 후 강염기를 가하여 균체를 제외한 뉴클레오시드 및 염기를 완전히 용해시킨 후 균체의 여과 과정을 거치는 것이 바람직하다.

3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 제조하는 단계에 알코올 및 강염기를 첨가하여 위 효소원과 반응 부산물을 제거하는 단계는, 여과를 통한 효소원 (바람직하게 균체) 제거 공정 후 티민을 포함하는 부산물을 제거하는 공정을 수행할 수 있다. 바람직하게 효소원(균체)이 제거된 반응물에서 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 정제하기 위해서 주요 부산물인 티민의 제거 공정을 포함할 수 있다.

뉴클레오시드 및 타염기와 달리 티민이 강염기의 알코올(alcohol)에서 용해도가 매우 낮음이 확인되었고, 이에 따라 상기 여과를 통한 효소원 (바람직하게 균체) 제거액에 강염기의 알코올 현탁액을 처리하여 티민 등의 부산물을 제거할 수 있다.

상기 여과 및 제거 공정을 함께 수행하기 위해 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 제조하는 단계의 반응물에 강염기를 녹인 알코올과 규조토를 함께 처리하여 반응액에서 효소원(바람직하게 균체) 및 티민을 함께 제거할 수도 있다. 균체 및 효소원의 동시 제거공정은 공정 간소화의 장점과 더불어 균체만을 제거하는 공정과 대비하여 티민이 균체의 포집하여 여과성을 향상시켜 분리공정의 시간을 단축시켜주는 효과를 포함한다.

상기 강염기는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘 및 수산화바륨으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 상기 알코올은 1 내지 4의 탄소수를 가진 저급 알코올, 바람직하게 메틸알코올, 에틸알코올, 1-프로필알코올 및 2-프로필알코올로부터 선택될 수 있다. 바람직하게 강염기의 알코올 현탁액은 3'-아미노-3'-데옥시티미딘 투입량 기준 8 내지 12배, 바람직하게 약 10배의 0.5 N 가성소다-메틸알코올 현탁액일 수 있다.

상기 효소원 및 티민 등의 불순물을 제거한 여과액에서 추가의 불순물 제거를 위해 부분 농축 후 3'-아미노-3'-데옥시티미딘 투입량 기준 3 내지 7배, 바람직하게 5배의 1 내지 4의 탄소수를 가진 저급 알코올, 바람직하게 메틸알코올, 에틸알코올, 1-프로필알코올 및 2-프로필알코올을 첨가한 후 1 내지 4의 탄소수를 가진 저급 알코올이 첨가된 현탁액의 수분을 14% ~ 17% 사이에 도달하도록 조절하여 승온 및 냉각과정을 통해 잔존한 부산물로 티민을 추가로 제거할 수 있다.

위와 같이 티민을 제거한 여과액은 완전농축 후 알코올을 사용하여 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신를 결정화 할 수 있다. 바람직하게는 3'-아미노-3'-데옥시티미딘 투입량 기준 2 내지 6배, 바람직하게 4배의 1 내지 4의 탄소수를 가진 저급 알코올을 사용할 경우 효율적으로 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신를 결정화 할 수 있다.

위 단계는 고순도로 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신를 생산하기 위해 반복하여 수행될 수 있으며, 각 결정화 단계 사이에는 0.2 μm의 멤브레인(MF) 여과 공정을 추가하여 공정상의 이물 혼입 및 균체 유래 수용성 단백질의 응고체를 제거할 수 있다.

본 발명에 따른 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 제조 방법에 의하면, 바실러스 스테아로써모필러스 유래 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 이용하여 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신으로 높은 수준의 전환율을 가짐으로써 고수율로 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 생산하고, 이온교환수지에 의한 정제방법 없이도 고순도로 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 생산함으로써 경제적이면서 효율적으로 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 대량 생산할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신(3'-amino-2',3'-dideoxyadenosine) 제조 과정을 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 제조된 pFRPT-BPUNP 발현 벡터의 구조를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따라 제조된 pFRPT-BPYNP 발현 벡터의 구조를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따라 제조된 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 정제과정 별 HPLC 분석결과를 나타낸다.

이하에서는, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 아래의 실시예는 발명의 이해를 돕기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

< 실시예 1>바실러스 스테아로써모필러스 유래 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 (Purine nucleoside phosphorylase ) 발현 균주의 제조

3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신 제조 과정의 당 전이(transglycosylation)에 사용할 바실러스 스테아로써모필러스 유래 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 (Purine nucleoside phosphorylase derived from Bacillus, BPUNP)를 과발현하는 형질전환 대장균을 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

바실러스 스테아로써모필러스TH 6-2 (Bacillus stearothermophilus TH 6-2) (FERM BP-2758)의 유전자 염기서열(Genebank Accession Number D87960의 염기번호 619 - 1323, 서열번호 3)에 해당하는 705 bp의 올리고뉴클레오타이드의 합성 및 pUC57로의 클로닝을 마크로젠사(한국, www.macrogen.com)을 통해 수행하여, pUC57-BPUNP를 확보하였다. 또한 발현 벡터로의 클로닝을 위한 PCR용 프라이머(서열번호 5, 6)를 하기와 같이 설계하고, 바이오닉스사(한국, www.bionicsro.co.kr)에서 제조하여 사용하였다.

[표 1] BPUNP 합성 프라이머 서열

상기 pUC57-BPUNP를 주형으로 하여, 200 μM의 dNTP, 20 pmol의 프라이머, 1× Taq DNA 중합효소 완충액 및 2.5 U의 Taq DNA 중합효소(TaKaRa Ex Taq, cat. # RR001A, TAKARA, 일본, www.takara-bio.com)가 존재하는 조건에서, 94 ℃에서 30초, 50 ℃에서 1분, 72 ℃에서 1분의 조건을 30회 반복하여 PCR 반응을 수행하였다. 그 결과, 증폭된 723bp의 PCR 산물을 아가로스 젤 전기영동법(agarose gel electorphoresis)으로 확인하고, 이를 젤 추출 키트(QIAquick Gel Extraction Kit, cat. # 28704, Qiagen, 독일, www.qiagen.com)를 이용하여 정제하였다. pGEM-T easy 벡터(pGEM-T easy vector system II, cat. # A1380, Promega, 미국, www.promega.com)에 정제한 DNA 절편을 라이게이션(ligation) 후, JM109 대장균 세포(pGEM-T easy vector system II에 포함)를 형질전환(transformation)시켜 얻은 대장균 집락(colony) 중, 원하는 플라스미드를 함유하는 집락을 선별하여 이를 pGEM-BPUNP/JM109로 명명하였다. pGEM-BPUNP/JM109 균주를 하기 표 2의 배지 3ml에 접종하여 37 ℃, 200 rpm 및 pH 7 조건에서 하룻밤 동안 배양한 후 원심분리하여 세포를 수확하였다. 플라스미드 정제 키트(Dyne Plasmid Miniprep Kit, cat. # A510, 다인바이오, 한국, www.dynebio.co.kr)를 사용하여 pGEM-BPUNP를 분리하였다.

[표 2] pGEM - BPUNP /JM109 균주 배양 배지 성분

상기 제조된 바실러스 스테아로써모필러스 유래 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 대장균용 발현 벡터 pFRPT(대한민국 특허 제 0449639호)에 삽입하기 위해, 10 ug의 pFRPT를 10 U의 NdeI(cat. # 1161A, TAKARA, 일본, www.takara-bio.com)과 10 U의 XbaI(cat. # 1093A, TAKARA, 일본, www.takara-bio.com)가 함유된 반응액 20ul에서 절단하고 절단된 플라스미드를 아가로즈 젤 전기영동법으로 분석하여, 6.45 kbp의 절편을 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 한편, pGEM-BPUNP 10 ug을 10 U의 NdeI과 10 U의 XbaI이 함유된 반응액 20㎕에서 절단하고 상기와 같이 아가로스 전기영동법으로 분석하여 716bp의 BPUNP DNA 절편을 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다.

상기 방법을 통해 얻은 두 DNA 절편을 3 U의 리가아제(T4 DNA ligase, cat. # 2011A, TAKARA, 일본, www.takara-bio.com)와 1X 리가아제 완충액이 함유된 반응액에 첨가하여 16 ℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 상기 반응액으로 JM109 대장균 세포를 형질전환시킨 후 이를 배양하여 얻은 대장균 집락으로부터 플라스미드를 추출하고, 목적의 DNA 절편이 삽입된 플라스미드를 pFRPT-BPUNP라 명명하였으며, 이의 모식도를 도 2에 나타내었다. 상기 방법으로 얻어진 형질전환 균주를 pFRPT-BPUNP/JM109라 명명하였다.

< 실시예 2> 바실러스 스테아로써모필러스 유래 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제 (Pyrimidine nucleoside phosphorylase ) 발현 균주의 제조

3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신 제조 과정의 당 전이(transglycosylation)에 사용할 바실러스 스테아로써모필러스 유래 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제 (Pyrimidine nucleoside phosphorylase derived from Bacillus, BPYNP)를 과발현하는 형질전환 대장균을 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

바실러스 스테아로써모필러스 TH 6-2(Bacillus stearothermophilus TH 6-2)(FERM BP-2758)의 유전자 염기서열(Genebank Accession Number D87961의 염기번호 138-1439, 서열번호 4)에 해당하는 1302bp의 올리고뉴클레오타이드의 합성 및 pUC57로의 클로닝을 위탁제조사인 마크로젠사을 통해 수행하여, pUC57-BPYNP를 확보하였다. 또한 발현벡터로의 클로닝을 위해 PCR용 프라이머를 설계하고(서열번호 7, 8)을 하기와 같이 설계하고, 바이오닉스사에서 제조하여 사용하였다.

[표 3] BPYNP 합성 프라이머 서열

상기 pUC57-BPYNP를 주형으로 하여, 200 μM의 dNTP, 20 pmol의 프라이머, 1× Taq DNA 중합효소 완충액 및 2.5 U의 Taq DNA 중합효소가 존재하는 조건에서, 94 ℃에서 1분, 55 ℃에서 1분, 72 ℃에서 2분의 조건을 30회 반복하여 PCR 반응을 수행하였다. 그 결과, 증폭된 1.3kbp의 PCR 산물을 아가로스 젤 전기영동법으로 확인하고, 이를 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 정제한 DNA 절편을 pGEM-T easy vector에 라이게이션한 후, JM109 대장균 세포를 형질전환시켜 얻은 대장균 집락 중, 원하는 플라스미드를 함유하는 클론을 선별하여 이를 pGEM-BPYNP/JM109로 명명하였다. pGEM-BPYNP/JM109 균주를 상기 표 2의 배지와 동일 성분 하에 3ml 접종하여 37 ℃, 200 rpm, pH 7 조건에서 하룻밤 동안 배양 한 후 원심분리하여 세포를 수확하였다. 수확한 미생물을 플라스미드 정제 키트를 사용하여 pGEM-BPYNP를 분리하였다.

상기 제조된 바실러스 스테아로써모필러스 유래 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 대장균용 발현 벡터 pFRPT에 삽입하기 위해, 10 ug의 pFRPT를 10 U의 NdeI과 10 U의 HindIII(cat. # 1060A, TAKARA, 일본, www.takara-bio.com)가 함유된 반응액 20 ul에서 절단하고 절단된 플라스미드를 아가로즈 젤 전기영동법으로 분석하여, 6.45 kbp의 절편을 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 한편, pGEM-BPYNP 10 ug을 10 U의 10 U의 NdeI과 10 U의 HindIII가 함유된 반응액 20ul에서 절단하고 상기와 같이 아가로스 전기영동법으로 분석하여 1.3kbp의 BPYNP DNA 절편을 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다.

상기 방법을 통해 얻은 두 DNA 절편을 3 U의 리가아제와 1X 리가아제 완충액이 함유된 반응액에 첨가하여 16 ℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 상기 반응액으로 JM109 대장균 세포를 형질전환시킨 후 이를 배양하여 얻은 대장균 집락으로부터 플라스미드를 추출하고, 목적의 DNA 절편이 삽입된 플라스미드를 pFRPT-BPYNP라 명명하였으며, 이의 모식도를 도 3에 나타내었다. 상기 방법으로 얻어진 형질전환 균주를 pFRPT-BPYNP/JM109라 명명하였다.

< 실시예 3> pFRPT - BPUNP /JM109 습균체의 제조

pFRPT-BPUNP/JM109 습균체 제조를 위하여 하기 표 4의 배지 조성에 따라 균주를 배양하였다.

[표 4] pFRPT - BPUNP /JM109의 배양 배지 성분

표 4의 배지 25 ml이 담긴 250 ml 엘렌마이어 플라스크(Erlenmyer flask)에 pFRPT-BPUNP/JM109를 접종하고, 37 ℃ 및 240 rpm으로 하룻밤 동안 진탕 배양하였다. 위 배양액 2 ml를 1 L 엘렌마이어 플라스크에 담긴 상기 표 4의 배지 200 ml에 무균적으로 접종하고, 37 ℃ 및 240 rpm으로 진탕 배양하였다. 흡광도가 0.8이 되었을 때, 1 mM의 농도가 되도록 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside, Carbosynth사 제)를 첨가하였다. 3시간 동안 추가로 진탕 배양하여 얻어진 배양액을 8000 rpm에서 10분간 원심분리하고 이를 20 ml의 10 mM 인산 완충액으로 세척하였다. 이를 통해, 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제의 효소원을 수득하였다.

< 실시예 4> pFRPT - BPYNP /JM109 습균체의 제조

pFRPT-BPYNP/JM109 습균체 제조를 위하여 상기 표 4의 배지 조성에 따라 균주를 배양하였다.

표 4의 배지 25 ml이 담긴 250 ml 엘렌마이어 플라스크(Erlenmyer flask)에 pFRPT-BPYNP/JM109를 접종하고, 37 ℃ 및 240 rpm으로 하룻밤 동안 진탕 배양하였다. 위 배양액 2 ml를 1 L 엘렌마이어 플라스크에 담긴 상기 표 4의 배지 200 ml에 무균적으로 접종하고, 37 ℃ 및 240 rpm으로 진탕 배양하였다. 흡광도가 0.8이 되었을 때, 1 mM의 농도가 되도록 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside, Carbosynth사 제)를 첨가하였다. 3시간 동안 추가로 진탕 배양하여 얻어진 배양액을 8000 rpm에서 10분간 원심분리하고 이를 20 ml의 10 mM 인산 완충액으로 세척하였다. 이를 통해, 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제의 효소원을 수득하였다.

< 실시예 5> 효소원에 따른 3'-아미노-2',3'- 디데옥시아데노신의 효소 전환 확인

3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신 합성을 위한 전구물질로 3'-아미노-3'-데옥시티미딘(3'-amino-3'-deoxythymidine; ATMD)을 합성하였다. 3'-아미노-3'-데옥시티미딘은 1 Kg의 3'-아지도-3'-데옥시티미딘(3'-azido-3'-deoxythymidine; AZT, 3.74 mol)를 7.8 L 아세토니트릴(acetonitrile)과 함께 교반하였다. 1.17 Kg의 트리페닐포스핀(triphenylphosphine, 4.45 mol)을 가한 후 실온에서 4시간 교반한 다음 1 L의 증류수를 가하고 실온에서 4시간 교반하고, 감압 하에서 농축한 다음 2 L의 메탄올을 가하였다. 이를 실온에서 8시간 교반 후, 여과하여 결정을 모아 건조하여 0.79Kg의 3'-아미노-3'-데옥시티미딘(3.27 mol, AZT 대비 몰 수율 87.4%)을 수득함으로써 제조되었다.

상기 합성된 0.241 g의 3'-아미노-3'-데옥시티미딘(3'-amino-3'-deoxythymidine; ATMD, 0.2 M), 0.135 g의 아데닌(ADE, 0.2 M), 2.5 ml 증류수 및 0.5 ml 1N-인산나트륨 완충액(pH 7.5)을 함유하는 기질용액을 혼합하였다.

여기에 상기 실시예들의 바실러스 스테아로써모필러스 유래 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 효소원(pFRPT-BPUNP/JM109) 및 바실러스 스테아로써모필러스 유래 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제 효소원(pFRPT-BPYNP/JM109)을 각각 20 U/ml이 되도록 정제수에 현탁 후 1 ml 씩 반응에 투입하였다. 대조군으로 대장균 유래의 우리딘 포스포릴라아제 효소원(pFRPT-EUDP/JM109, 대한민국 특허 제 0680765호), 대장균 유래 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 효소원(pFRPT-EPUNP/JM109, 대한민국 특허 제 0680765호), 티미딘 포스포릴라아제(pFRPT-TMDP/JM109, 대한민국 특허 제 0680765호)를 동일 조건하에 1 ml 씩 반응에 투여하였다. 개별 반응액은 40 ℃ 진탕교반 조건 하에서 2일간 반응하여 고속액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다. 반응 후의 분석은 고속액체크로마토그래피 컬럼 ; Inertsil ODS-3(5μm, 직경 4.6mm, 길이 150mm, GL science사제), 이동상 ; 8% 메탄올 함유 10mM 인산나트륨 완충액(pH8.0), 검출 ; 자외선 254nm 흡광을 사용하여 측정하였다.

3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신(ADA)의 생물전환 반응 전환율은 다음과 같이 계산하였다.

ADA 전환율 ( % )= (생성된 ADA 농도 X 100) ÷ (반응에 투입한 ATMD 농도)

반응을 위한 효소원 및 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 전환율을 하기 표 5에 나타내었다.

[표 5] 3'-아미노-2',3'- 디데옥시아데노신로 전환율

상기 표 5에서 확인되는 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 바실러스 스테아로써모필러스 유래 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 사용하는 경우, 가장 높은 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신(ADA) 전환율이 확인되었다. 즉, 기존에 알려진 대장균 유래의 뉴클레오시드 포스포릴라아제 또는 기타의 포스포릴라아제를 사용하는 것과 대비하여 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신(ADA)로의 우수한 전환능이 확인되었다.

< 실시예 6> 효소원 투입량에 따른 3'-아미노-2',3'- 디데옥시아데노신의 효소 전환 변화 확인

11.2 g의 아데닌 (1.85 M), 20 g의 3'-아미노-3'-데옥시티미딘(1.85 M), 44.8 ml 정제수 및 1 g 인산이수소나트륨(sodium phosphate monobasic, 0.186 M)을 함유하는 기질용액(pH 7.5)에 상기 실시예 3 및 4에서 제조된 pFRPT-BPUNP/JM109 습균체와 pFRPT-BPYNP/JM109 습균체를 하기 표 6과 같이 투입하여 40 ℃ 조건에서 48시간 진탕교반하였다. 상기 실시예 5와 동일하게 반응액을 HPLC로 분석하고 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 전환율을 확인하였다.

그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

[표 6] 3'-아미노-2',3'- 디데옥시아데노신로 전환율

상기 표 6의 결과를 바탕으로, 본 발명자들은 바람직한 효소 투입량은 기질 83 mmol (1.85 M)을 48시간 전환하는데 적합한 pFRPT-BPUNP/JM109와 pFRPT-BPYNP/JM109의 투입량을 각각 1120U과 2240U으로 정하였다.(기질 1mmol 당 각 13.5 U과 27.0U으로 약 1 : 2 비율)

< 실시예 7> 반응 pH에 따른 3'-아미노-2',3'- 디데옥시아데노신의 효소전환의 변화 확인

11.2 g의 아데닌 (1.85 M), 20 g의 3'-아미노-3'-데옥시티미딘(1.85 M), 44.8 ml 정제수 및 1 g 인산이수소나트륨(0.186 M)을 함유하는 기질용액에 3.2 g(112 0U) pFRPT-BPUNP/JM109 습균체, 3.2 g(2240 U)의 pFRPT-BPYNP/JM109 습균체를 혼합 후 pH 7.0~pH 10.0로 pH 조건을 변화하여 40 ℃ 조건에서 48시간 진탕교반하였다. 상기 실시예 5와 동일하게 반응액을 HPLC로 분석하고 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 전환율을 확인하였다.

그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

[표 7] 3'-아미노-2',3'- 디데옥시아데노신로 전환율

상기 표 7에서 확인되는 바와 같이, pH 8.0 및 9.0에서 가장 높은 전환율을 보여, 바람직한 pH가 8.5 내지 9.0임이 확인되었다.

< 실시예 8> 반응온도에 따른 3'-아미노-2',3'- 디데옥시아데노신의 효소전환의 변화 확인

11.2 g의 아데닌 (1.85 M), 20 g의 3'-아미노-3'-데옥시티미딘(1.85 M), 44.8 ml 정제수 및 1 g 인산이수소나트륨(0.186 M)을 함유하는 기질용액(pH 8.8)에 3.2 g(1120 U) pFRPT-BPUNP/JM109 습균체, 3.2 g(2240 U)의 pFRPT-BPYNP/JM109 습균체를 혼합 후 30 ℃, 40 ℃, 50 ℃, 60 ℃로 온도조건을 변화하여 48시간 진탕교반하였다. 상기 실시예 5와 동일하게 반응액을 HPLC로 분석하고 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 전환율을 확인하였다.

그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.

[표 8] 3'-아미노-2',3'- 디데옥시아데노신로 전환율

상기 표 8에서 확인되는 바와 같이, 실험 결과 반응 초기에는 온도가 높을수록 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신로 전환속도가 증가하였으나 시간이 지남에 따라 50 ℃ 이상의 반응조건보다 40 ℃조건에서 우수한 전환율을 나타내었다. 또한 50℃이상의 조건에서는 반응액의 색상이 시간에 따라 갈색 또는 고동색으로 변하고 HPLC 분석 결과 미 반응 아데닌 대비 3'-아미노-3'-데옥시티미딘이 상당량 분해되어있음을 확인하고 3-아미노-2,3-디데옥시리보스-1-인산이 쉽게 갈변함을 확인하였다. 이에 따라 약 40 ℃에서 가장 높은 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신으로의 전환능이 보이는 것이 확인되었다.

< 실시예 9> 인산이수소나트륨 농도에 따른 3'-아미노-2',3'- 디데옥시아데노신의 효소전환의 변화 확인

11.2 g의 아데닌 (1.85 M), 20 g의 3'-아미노-3'-데옥시티미딘(1.85 M)를 44.8 ml을 농도 조건을 변화시킨 인산이수소나트륨 용액(100 mM, 50 mM, 20 mM, 10 mM, 5 mM, 3 mM) 또는 44.8 ml의 정제수에 현탁하고, 3.2 g(1120 U) pFRPT-BPUNP/JM109 습균체, 3.2 g (2240 U)의 pFRPT-BPYNP/JM109 습균체를 혼합 후 40 ℃ 조건에서 48시간 진탕교반하였다. 상기 실시예 5와 동일하게 반응액을 HPLC로 분석하고 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 전환율을 확인하였다.

그 결과를 표 9에 나타내었다.

[표 9] 3'-아미노-2',3'- 디데옥시아데노신로 전환율

상기 표 9에서 확인되는 바와 같이, 3 내지 10 mM의 낮은 인산이수소나트륨의 농도에서 보다 더 우수한 전환율을 보이는 것을 관찰하였다. 즉, 낮은 인산이수소나트륨의 농도에서 우수한 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신 전환율이 확인되었다.

< 실시예 10> 3'-아미노-3'- 데옥시티미딘 및 아데닌의 농도 변화에 따른 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 효소전환의 변화 확인

3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 효소전환 반응액에서 반응기질(3'-아미노-3'-데옥시티미딘 및 아데닌)의 몰 비율을 1:1로 고정하고 기질을 0.1 M, 0.5 M, 1 M, 1.5 M, 2 M 농도가 되도록 투입 후, 각각 44.8 ml의 5 mM 인산이수소나트륨 용액에 현탁하였다. 여기에 pFRPT-BPUNP/JM109 습균체와 pFRPT-BPYNP/JM109 습균체를 기질 1 mmol 당 각각 13.5 U과 27.0 U이 되도록 혼합 후 40 ℃ 조건에서 48시간 진탕교반하였다. 상기 실시예 5와 동일하게 반응액을 HPLC로 분석하고 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 전환율을 확인하였다.

그 결과를 표 10에 나타내었다.

[표 10] 3'-아미노-2',3'- 디데옥시아데노신로 전환율

상기 표 10에서 확인되는 바와 같이, 기질 1M 농도까지는 반응액의 농도가 높을수록 전환율이 상승하였다. 이는 높은 기질 농도에서도 반응이 현저하게 일어나는 것을 보여주는 것으로, 대량생산에 적합한 제조 방법임을 보여준다.

< 실시예 11> 3'-아미노-3'- 데옥시티미딘 및 아데닌의 몰 비율에 따른 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 효소전환의 변화 확인

20 g(1.85 M)의 3'-아미노-3'-데옥시티미딘을 기준으로 아데닌 투입량을 11.2 g(1.85 M, 1 당량), 16.8 g(2.78 M, 1.5 당량)으로 변화시켜 투입 후 각각 44.8 ml의 5 mM 인산이수소나트륨 용액에 현탁하여 3.2 g (1120 U) pFRPT-BPUNP/JM109 습균체, 3.2 g (2240 U)의 pFRPT-BPYNP/JM109 습균체를 혼합 후 40 ℃조건에서 48시간 진탕교반하였다. 상기 실시예 5와 동일하게 반응액을 HPLC로 분석하고 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 전환율을 확인하였다.

그 결과를 표 11에 나타내었다.

[표 11] 3'-아미노-2',3'- 디데옥시아데노신로 전환율

바실러스 스테아로써모필러스 유래 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 사용하여 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 효소전환 하는 경우 3'-아미노-3'-데옥시티미딘 기준 아데닌 당량 변화에 따른 효소전환의 차이가 거의 없었다. 이러한 결과는 기 보고된 반응조건인 3'-아미노-3'-데옥시티미딘과 아데닌의 당량 비를 1:3으로 반응한 조건(G. V. Zaitseva et. al., Nucleosides & Nucleotides, 13(1-3), 819-834 (1994))이나, 2:1로 반응한 조건(U.S. Pat. App. Pub. No. 2007/0065922)처럼 특정 기질의 당량 비율을 높여서 효소 전환율을 향상시키는 것과 차이점이 있다.

즉, 본원 발명의 방법은 몰 비율을 1:1로 정하여 반응 부산물 생성을 최소화하였다.

< 실시예 12> 3'-아미노-2',3'- 디데옥시아데노신의 분리 정제

28 g의 아데닌(1.85 M), 50 g의 3'-아미노-3'-데옥시티미딘(1.85 M)을 112 ml의 5 mM 인산이수소나트륨 용액에 현탁한 후 8 g(2800 U) pFRPT-BPUNP/JM109 습균체, 8 g(5600 U)의 pFRPT-BPYNP/JM109 습균체를 혼합하여 40 ℃조건에서 48시간 진탕교반하였다. 반응액을 HPLC로 분석한 결과 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 전환율은 92.7 %로 확인되었다.

반응 종료 후 500 ml의 0.5 N-가성소다가 녹아있는 메틸알코올과 50 g의 규조토를 가하여 실온에서 1시간 교반 후 감압 여과하여 반응액 내 균체와 티민 일부를 제거하였다. 여액을 부분 농축 후 250 ml의 메틸알코올로 현탁 후 현탁액의 수분을 14~17 %가 되도록 조절 후 65 ℃에서 1시간 교반 및 서냉 후 3시간 동안 4 ℃를 유지하며 냉각 교반 후 감압 여과하여 나머지 티민을 제거하였다. 여액을 완전 농축 후 200 ml의 메틸알코올에 현탁한 후 65 ℃에서 1시간 교반 및 서냉 후 3시간동안 4 ℃를 유지하며 냉각 교반 후 여과한 결과 98.5%의 HPLC 순도를 갖는 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신 51 g(건조 전 무게)을 회수하였다.

회수한 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신 51 g을 50 ml의 정제수와 250 ml의 메틸알코올로 용해한 다음 0.2 μm의 여과지를 통과 후 완전 농축을 실시하였다. 농축 잔사를 200 ml의 메틸알코올에 현탁한 후 65 ℃에서 1시간 교반 및 서냉 후 3시간 동안 4 ℃를 유지하며 냉각 교반 후 감압여과한 결과 99.9 %의 HPLC 순도를 갖는 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신 42.5 g을 회수하였다. 회수한 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신 42.5 g을 55 ℃에서 12시간 진공 건조한 결과 31.5 g(125.9 mmol)의 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 최종 회수하였고 3'-아미노-3'-데옥시티미딘 투입량 기준 무게수율은 63.0 %, 몰 수율은 60.7 %였다. 상기 개별 정제 공정 상 확인된 HPLC 크로마토그램은 도 4에 나타내었다.

< 실시예 13> 3'-아미노-2',3'- 디데옥시아데노신의 대량 생산

3000 L 반응기에 51.52 kg의 아데닌(1.85 M), 92 kg의 3'-아미노-3'-데옥시티미딘(1.85 M), 206 L 정제수 및 0.13 kg 인산이수소나트륨(5 mM)을 함유하는 기질용액에 3.68 kg(5,152 kU) pFRPT-BPUNP/JM109 동결건조균체, 3.68 kg(10,304 kU)의 pFRPT-BPYNP/JM109 동결건조균체를 혼합 후 40 ℃조건에서 48시간 진탕교반하였다. 반응액을 HPLC로 분석한 결과 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 전환율은 90.2 %였다. 반응액에 920 L의 0.5 N-가성소다가 녹아있는 메틸알코올과 92 kg의 규조토를 가하여 실온에서 1시간 교반 후 감압 여과하여 반응액 내 균체와 티민 일부를 제거하였다. 여액을 부분 농축 후 460 L의 메틸알코올로 현탁 후 현탁액의 수분을 14~17 %가 되도록 조절 후 65 ℃에서 1시간 교반 및 서냉 후 3시간동안 4 ℃를 유지하며 냉각 교반 후 감압 여과하여 나머지 티민을 제거하였다. 여액을 완전 농축 후 368 L의 메틸알코올에 현탁한 후 65 ℃에서 1시간 교반 및 서냉 후 3시간 동안 4 ℃를 유지하며 냉각 교반 후 여과한 결과 96.5 %의 HPLC 순도를 갖는 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 회수하였다.

회수한 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 92 L의 정제수와 460 L의 메틸알코올로 용해한 다음 0.2 μm 필터를 통과 후 완전 농축을 실시하였다. 농축 잔사를 368 L의 메틸알코올에 현탁한 후 65 ℃에서 1시간 교반 및 서냉 후 3시간동안 4 ℃를 유지하며 냉각 교반 후 감압 여과하고 55 ℃에서 12시간 진공 건조한 결과 99.5 %의 HPLC 순도를 갖는 58.02 kg(232mol)의 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 최종 회수하였다. 제조가 완료된 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신은 3'-아미노-3'-데옥시티미딘 투입량 기준 무게수율은 63.1 %, 몰 수율 60.8 %였다.

상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 제조 방법이 상업적 대량생산에 적합한 방법임이 확인되었다.

<110> ST Pharm Co., Ltd. <120> Method for Preparing 3'-Amino-2',3'-dideoxyadenosine by Using Nucleoside Phosphorylase Derived from Bacillus <130> P15-184-STP <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Purine nucleoside phosphorylase derived from Bacillus stearothermophilus <400> 1 Met Ser Val His Ile Gly Ala Lys Glu His Glu Ile Ala Asp Lys Ile 1 5 10 15 Leu Leu Pro Gly Asp Pro Leu Arg Ala Lys Tyr Ile Ala Glu Thr Phe 20 25 30 Leu Glu Gly Ala Thr Cys Tyr Asn Gln Val Arg Gly Met Leu Gly Phe 35 40 45 Thr Gly Thr Tyr Lys Gly His Arg Ile Ser Val Gln Gly Thr Gly Met 50 55 60 Gly Val Pro Ser Ile Ser Ile Tyr Ile Thr Glu Leu Met Gln Ser Tyr 65 70 75 80 Asn Val Gln Thr Leu Ile Arg Val Gly Thr Cys Gly Ala Ile Gln Lys 85 90 95 Asp Val Lys Val Arg Asp Val Ile Leu Ala Met Thr Ser Ser Thr Asp 100 105 110 Ser Gln Met Asn Arg Met Thr Phe Gly Gly Ile Asp Tyr Ala Pro Thr 115 120 125 Ala Asn Phe Asp Leu Leu Lys Thr Ala Tyr Glu Ile Gly Lys Glu Lys 130 135 140 Gly Leu Gln Leu Lys Val Gly Ser Val Phe Thr Ala Asp Met Phe Tyr 145 150 155 160 Asn Glu Asn Ala Gln Phe Glu Lys Leu Ala Arg Tyr Gly Val Leu Ala 165 170 175 Val Glu Met Glu Thr Thr Ala Leu Tyr Thr Leu Ala Ala Lys Phe Gly 180 185 190 Arg Lys Ala Leu Ser Val Leu Thr Val Ser Asp His Ile Leu Thr Gly 195 200 205 Glu Glu Thr Thr Ala Glu Glu Arg Gln Thr Thr Phe Asn Glu Met Ile 210 215 220 Glu Val Ala Leu Glu Thr Ala Ile Arg Gln 225 230 <210> 2 <211> 433 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pyrimidine nucleoside phosphorylase derived from Bacillus stearothermophilus <400> 2 Met Arg Met Val Asp Leu Ile Glu Lys Lys Arg Asp Gly His Ala Leu 1 5 10 15 Thr Lys Glu Glu Ile Gln Phe Ile Ile Glu Gly Tyr Thr Lys Gly Asp 20 25 30 Ile Pro Asp Tyr Gln Met Ser Ala Leu Ala Met Ala Ile Phe Phe Arg 35 40 45 Gly Met Asn Glu Glu Glu Thr Ala Glu Leu Thr Met Ala Met Val His 50 55 60 Ser Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ser Arg Ile Glu Gly Ile Lys Val Asp 65 70 75 80 Lys His Ser Thr Gly Gly Val Gly Asp Thr Thr Thr Leu Val Leu Gly 85 90 95 Pro Leu Val Ala Ser Val Gly Val Pro Val Ala Lys Met Ser Gly Arg 100 105 110 Gly Leu Gly His Thr Gly Gly Thr Ile Asp Lys Leu Glu Ser Val Pro 115 120 125 Gly Phe His Val Glu Ile Thr Asn Asp Glu Phe Ile Asp Leu Val Asn 130 135 140 Lys Asn Lys Ile Ala Val Val Gly Gln Ser Gly Asn Leu Thr Pro Ala 145 150 155 160 Asp Lys Lys Leu Tyr Ala Leu Arg Asp Val Thr Ala Thr Val Asn Ser 165 170 175 Ile Pro Leu Ile Ala Ser Ser Ile Met Ser Lys Lys Ile Ala Ala Gly 180 185 190 Ala Asp Ala Ile Val Leu Asp Val Lys Thr Gly Val Gly Ala Phe Met 195 200 205 Lys Asp Leu Asn Asp Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Met Val Asp Ile 210 215 220 Gly Asn Arg Val Gly Arg Lys Thr Met Ala Ile Ile Ser Asp Met Ser 225 230 235 240 Gln Pro Leu Gly Tyr Ala Ile Gly Asn Ala Leu Glu Val Lys Glu Ala 245 250 255 Ile Asp Thr Leu Lys Gly Glu Gly Pro Glu Asp Phe Gln Glu Leu Cys 260 265 270 Leu Val Leu Gly Ser His Met Val Tyr Leu Ala Glu Lys Ala Ser Ser 275 280 285 Leu Glu Glu Ala Arg His Met Leu Glu Lys Ala Met Lys Asp Gly Ser 290 295 300 Ala Leu Gln Thr Phe Lys Thr Phe Leu Ala Ala Gln Gly Gly Asp Ala 305 310 315 320 Ser Val Val Asp Asp Pro Ser Lys Leu Pro Gln Ala Lys Tyr Ile Ile 325 330 335 Glu Leu Glu Ala Lys Glu Asp Gly Tyr Val Ser Glu Ile Val Ala Asp 340 345 350 Ala Val Gly Thr Ala Ala Met Trp Leu Gly Ala Gly Arg Ala Thr Lys 355 360 365 Glu Ser Thr Ile Asp Leu Ala Val Gly Leu Val Leu Arg Lys Lys Val 370 375 380 Gly Asp Ala Val Lys Lys Gly Glu Ser Leu Val Thr Ile Tyr Ser Asn 385 390 395 400 Arg Glu Gln Val Asp Asp Val Lys Gln Lys Leu Tyr Glu Asn Ile Arg 405 410 415 Ile Ser Ala Thr Pro Val Gln Ala Pro Thr Leu Ile Tyr Asp Lys Ile 420 425 430 Ser <210> 3 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Purine nucleoside phosphorylase derived from Bacillus stearothermophilus <400> 3 atgagcgttc atattggtgc aaaagaacac gagattgcag ataaaatttt gcttccagga 60 gatccacttc gcgcaaaata tatcgctgaa acgtttttag agggagctac ttgctataat 120 caagttcgcg gtatgttagg atttacaggt acatataaag gccatcgtat ttccgttcaa 180 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gcggatgcgg tcggaacggc ggcgatgtgg 1080 cttggtgcag ggcgagcgac gaaagaatca acgatcgatt tagctgtcgg tctcgtgctt 1140 cgcaaaaaag tcggcgatgc ggtgaaaaaa ggtgaatcgc tcgttacaat ttacagcaac 1200 cgtgaacaag tggatgatgt aaaacaaaaa ctatatgaaa acattcgtat ttcagcaaca 1260 cctgttcaag ctccaacatt aatttacgat aaaatttcgt aa 1302 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BPUNP forward primer <400> 5 ttaacatatg agaggatcgc atca 24 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BPUNP reverse primer <400> 6 agctctagat tattggcgaa tcgctgtttc 30 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BPYNP forward primer <400> 7 atatcatatg agaatggtcg atttaattga g 31 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BPYNP reverse primer <400> 8 cccaagcttt tacgaaattt tatcgtaaat taatg 35

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) 유래 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) 유래 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 1 M 이상의 농도로 첨가되는 3'-아미노-3'-데옥시티미딘 및 아데닌에 처리하여 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 제조하는 단계를 포함하고,
상기 단계는 30 내지 50 ℃에서 수행되는 것인 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 제조 방법.
삭제
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제1항에 있어서, 상기 3'-아미노-3'-데옥시티미딘 및 아데닌은 1 : 1의 몰비율로 반응에 사용되는 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) 유래 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) 유래 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 유전자 재조합에 의해 대장균에서 과발현된 균체 또는 균체 처리물에 포함된 효소인 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 제조하는 단계 후, 상기 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신을 제조하는 단계의 반응물에 알코올 및 강염기를 첨가하여 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제의 효소원과 반응 부산물을 제거하는 단계를 더 포함하는 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 제조 방법.
제7항에 있어서, 상기 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라아제의 효소원은 균체 또는 균체 처리물에 포함된 효소원이고, 반응 부산물은 티민인 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 제조 방법.
제7항에 있어서, 상기 알코올은 1 내지 4의 탄소수를 가진 저급 알코올이고, 상기 강염기는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘 및 수산화바륨으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 제조 방법.