KR20160030876A

KR20160030876A - 약제학적 활성 성분들로써 뉴클레오시드 유사체들의 생물촉매적 생산

Info

Publication number: KR20160030876A
Application number: KR1020157030620A
Authority: KR
Inventors: 마리타 파스쿠알 길라베르트; 빅토르 마누엘 데론셀르 토마스; 라파엘 몬틸라 아레발로
Original assignee: 플라스미아 바이오텍 에스엘
Priority date: 2013-04-29
Filing date: 2014-04-29
Publication date: 2016-03-21
Also published as: JP2016518838A; EP2992107B1; WO2014177585A2; US20160076070A1; EP2992107A2; WO2014177585A3; CA2905306A1; US10184142B2

Abstract

약제학적 활성 성분들 (APIs) 또는 이의 중간생성물을 생산하는 생물촉매적 공정, 이때 이들 APIs 또는 이들의 중간생성물은 화학식 I의 뉴클레오시드 유사체들 (NAs) 및 이의 중간생성물 또는 프로드럭이며;

이때 전술한 NAs는 약제학적으로 관련 항바이러스 및 항암 약물로써 활성이 있다.

Description

약제학적 활성 성분들로써 뉴클레오시드 유사체들의 생물촉매적 생산{Biocatalytic production of nucleoside analogues as active pharmaceutical ingredients}

발명의 분야

본 발명은 약제학적으로 관련 항바이러스 및 항암 약물, 이의 중간생성물 또는 프로드럭(prodrugs)으로써 뉴클레오시드 유사체들(NAs)의 생산에 유용한 신규한 효소 공정에 관계한다.

발명의 배경

뉴클레오시드 유사체들 (NAs)은 천연 뉴클레오시드와 구조적으로 관련된 합성 화합물들이다. 이들의 구조에 있어서, 뉴클레오시드는 3가지 주요 요소들로 구성된다: (i) 히드록시메틸기, (ii) 헤테로시클릭 질소함유 기본 모이어티, 그리고 (iii) 푸라노오스 링, 몇 가지 경우에서 상기 히드록시메틸기와 상기 염기를 정확한 방향으로 제공하는 스페이서(spacer)로 작용을 하는 것으로 보인다.

NAs는 항바이러스 및 항종양 물질로 광범위하게 이용된다. 이들 분자는 자연적으로 생성되는 뉴클레오시드의 변형이 허용되도록, 헤테로시클릭 염기 및/또는 오탄당 모이어티 상에 보호-탈보호가 포함된 시간-소모적인 다단계 공정을 대개 요하는 상이한 화학적 방법들에 의해 통상적으로 합성되었다 (Boryski J. 2008. Reactions of transglycosylation in the nucleoside chemistry. Curr Org Chem 12:309-325). 이러한 시간 소모적인 다단계 공정은 대개 낮은 수율 및 비용 증가로 이어진다. 또한, 화학적 방법은 보통 정확한 입체 및 구조선택성(regioselectivity)을 가진 산물의 획득 곤란성을 증가시키고, 부차 산물이 발생된다(Condezo, L. A., et al. 2007. Enzymatic synthesis of modified nucleosides, p. 401-423. Biocatalysis in the pharmaceutical and biotechnology industries. CRC Press, Boca Raton, FL, Mikhailopulo, I. A. 2007). 더욱이, 상기 화학적 방법은 고가의 그리고 환경적으로 유해한 화학 시약 및 유기 용매의 사용을 포함한다.

항바이러스 또는 항암 물질로 작용하는 몇 가지 비-천연 뉴클레오시드는 이들의 당 모이어티에 변형을 가지고 있기 때문에, 가령, 산업 규모로 적용시킬 수 있는 약제학적 활성 성분들 (APIs) 또는 이들의 중간생성물의 합성을 개발하기 위하여, 뉴클레오시드 유사체들의 효소 합성을 촉매하는 새롭고 효과적인 산업적 생물촉매의 개발 가능성을 조사하는 것은 흥미로운 일이다.

놀랍게도, 기존의 언급된 화학적 합성 경로의 단점들을 회피할 수 있으며, 50% 이상의 전환(conversion) 및/또는 95% 이상의 아노머 순도를 가진 NAs를 획득할 수 있음을 알았다. 이는 본 발명에서 청구하는 뉴클레오시드 데옥시리보실 전달효소 (NDT 또는 NdT)의 사용에 근거하여 가능하다.

NDT 생물효소적 합성의 장점은 다음과 같다:

(i) 원-포트(One-pot) 합성,

(ii) 단계들의 감소된 수,

(iii) 더 높은 전환 및 수율,

(iv) 효소 단계에서 유기 용매 회피,

(v) 가령, 당에서 히드록실기에 대한 보호/탈보호 전략이 필요하지 않음,

(vi) 온순한 반응 조건: 환경친화적 기술(물 또는 수성 매체, 중성 pH),

(vii) 상당히 우수한 선택성: 입체선택성 - 거울상선택성(enantioselectivity), 화학-위치선택성,

(viii) 부반응(side reaction)이 거의 없거나 또는 없음: 불순물 프로파일 (부산물 함량의 감소),

(ix) 전반적인 폐기물 생성 감소,

(x) 과정 생산성,

(xi) 전반적으로 낮은 생산 단가

발명의 설명

NDT 효소를 이용한 본 발명에서 설명된 과정은 다음과 같이 요약될 수 있다:

좀더 정확하게는 다음과 같다 (이때 Z₁, Z₂, R^S1, R^S2, R^S3, R^S4, R^S5 는 본 명세서에서 정의된 바와 같다):

과정 1. NDTs에 의해 촉매된-반응

본 설명을 목적으로 다음의 용어들은 다음과 같이 더 정의된다.

용어 “뉴클레오시드(nucleoside)”는 헤테로시클릭 염기가 당에 공유 결합된 모든 화합물을 지칭하며, 특히 당에 뉴클레오시드의 바람직한 결합은 헤테로시클릭 염기에서 탄소- 또는 이형원자(전형적으로 질소)에 당에 있는 탄소 원자의 C1'-(글리코시드) 결합이 포함된다. 따라서, 본 내용에서 용어 “뉴클레오시드”는 헤테로시클릭 염기의 글리코시드를 의미한다.

본 명세서에서 더 이용된 바와 같이, 용어 “당”은 모든 탄수화물 및 이의 유도체들을 지칭하며, 이때 특별히 고려되는 유도체들은 당에서 화학기 또는 원자의 결손, 치환 또는 추가를 포함한다. 예를 들면, 특히 고려되는 결손은 2'-데옥시 및/또는 3'-데옥시 당을 포함한다. 특별히 고려되는 치환은 링-산소를 황 또는 메틸렌으로의 대체, 또는 히드록실기는 할로겐, 아미노-, 설퍼히드릴-, 또는 메틸기로의 대체를 포함하며, 그리고 특히 고려되는 추가는 메틸렌 포스페이트기를 포함한다. 더 고려되는 당은 당 유사체들 (가령, 자연적으로 생성되는 당이 아님), 및 특별히 카르보사이클 링 시스템을 또한 포함한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "카르보사이클 링 시스템(carbocyclic ring system)"은 다수의 탄소 원자들이 링을 형성하는 임의의 분자를 말하며, 특히 고려되는 카르보사이클 링 시스템에서, 상기 링은 3, 4, 5, 또는 6개 탄소 원자로부터 형성된다.

용어 “뉴클레오시드”는 자연적으로 생성되지 않는 뉴클레오시드, 자연적으로 생성되는 뉴클레오시드 뿐만 아니라 다른 뉴클레오시드 유사체들을 포함하는 것으로 광범위하게 이용될 수 있다. 뉴클레오시드의 예시적인 예로는 리보스 모이어티가 포함된 리보뉴클레오시드 뿐만 아니라 데옥시리보스 모이어티가 포함된 데옥시리보뉴클레오시드이다. 이러한 뉴클레오시드 염기에 있어서, 자연적으로 생성되는 염기, 이를 테면, 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 및 우라실, 뿐만 아니라 이들의 임의의 변형된 변이체 또는 임의의 가능한 비천연 염기일 수 있다.

본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 “뉴클레오시드 유사체”, “NA” 또는 “NAs”는 모든 뉴클레오시드, 이의 이성체 또는 거울상체 뿐만 아니라 라셈체 또는 이의 거울상체-농축된 혼합물을 지칭하며, 이때 이들은 자연적으로-생성되는 DNA 및 RNA 뉴클레오시드 데옥시시티딘, 데옥시우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시구아노신 그리고 티미딘의 옥시-또는 데옥시-유사체들이다. 바람직하게는, 전술한 NAs는 데옥시시티딘, 데옥시우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시구아노신 또는 티미딘 각각의 대응하는 당모이어티 및/또는 염기 모이어티와 상이한 당 모이어티 및/또는 염기 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드다. 더욱 바람직하게는, 전술한 NAs는 당 모이어티와 염기 모이어티로 구성된 자연적으로 생성되지 않는 뉴클레오시드이며, 이때 전술한 당 모이어티 및 전술한 염기 모이어티중 최소한 하나는 자연적으로-발생되는 DNA 또는 RNA, 더욱 바람직하게는 자연적으로-생성되는 폴리뉴클레오티드에서는 발견되지 않는다. 대안으로, 전술한 NAs는 당이 리보푸라노오스가 아닌 및/또는 헤테로시클릭 염기가 자연적으로 생성되는 염기 (이를 테면, A, G, C, T, I, 등등)가 아닌 뉴클레오시드들이다. 유사하게, 용어 “뉴클레오티드”는 포스페이트기가 당에 결합된, D-뉴클레오시드 또는 L-뉴클레오시드인 뉴클레오시드다.

용어 “한-단계/원-팟(one-step/one-pot)”, “한-단계 원-팟(one-step one-pot)” 또는 “한단계-원팟(one step-one pot)”은 별도의 연속 단계에서 반응이 실행되기 보다는 이용되는 재료들이 단일 용기에서 함께 혼합되고, 반응이 허용되는 단일 단계를 통하여 화학 화합물들을 합성하는 방법을 지칭한다. 이러한 전략은 반응 효율을 개선시키고, 수율을 증가시키고, 시간 및 재원을 절약하는데 이용된다.

용어 “헤테로시클릭 링(heterocyclic ring)” 또는 “헤테로시클릭 염기(heterocyclic base)”는 본 명세서에서 호환되는데, 다수의 원자들이 공유 결합을 통하여 링을 형성하는 임의의 화합물을 지칭하는데, 이때 링은 탄소 원자 이외의 최소한 하나의 원자를 포함한다. 특별히 고려되는 헤테로시클릭 염기는 탄소가 아닌 원자로써 질소, 산소 및 황으로부터 각각 독립적으로 선택된 최소한 1 내지 4개의 이형원자가 포함된 5- 및 6-원(membered) 링 (이를 테면, 이미다졸, 피롤, 트리아졸, 디히드로피리미딘)을 포함한다. 더 고려되는 헤테로사이클은 또다른 링 또는 헤테로사이클에 융합될 수 있고(가령, 공유적으로 결합), 따라서 본 명세서에서 이용된 바와 같이, “융합된 헤테로사이클” 또는 “융합된 헤테로시클릭 염기”로 지칭된다. 특별히 고려되는 융합된 헤테로사이클은 6-원 링에 융합된 5-원 링 (이를 테면, 퓨린, 피롤로[2,3-d]피리미딘), 그리고 또다른 6-원 또는 더 고차의 링에 융합된 6-원 링 (이를 테면, 피리도[4,5-d]피리미딘, 벤조디아제핀)을 포함한다. 이들의 그리고 더 바람직한 헤테로시클릭 염기의 예들은 하기에서 제시된다. 여전히 더 고려되는 헤테로시클릭 염기는 방향족일 수 있거나, 또는 하나 또는 그 이상의 이중 또는 삼중 결합을 포함할 수 있다. 더욱더, 고려되는 헤테로시클릭 염기 및 융합된 헤테로사이클은 하나 또는 그 이상의 위치에서 더 치환될 수 있다. 그리고 링의 임의의 하나는 할로겐, 히드록시, 니트로, 시아노, 카르복실, C1-6알킬, C1-6알콕시, C1-6알콕시C1-6알킬, C1-6알킬카르보닐, 아미노, 모노- 또는 디C1-6알킬아미노, 아지도, 멀캅토, 폴리할로C1-6알킬, 폴리할로C1-6알콕시, 및 C3-7시클로알킬로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택된 하나, 둘 또는 세개의 치환체에 의해 임의선택적으로 치환된다.

용어 “핵염기(nucleobase)”는 자연적으로 생성되는 핵염기 뿐만 아니라 자연적으로 생성되지 않는 핵염기를 포함한다. “자연적으로 생성되지 않는” 것으로 이미 간주된 다양한 핵염기도 후속적으로 자연계에서 발견될 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, “핵염기”는 공지의 퓨린과 피리미딘 헤테로사이클을 포함하고, 헤테로시클릭 유사체들 (이를 테면 N-치환된 헤테로사이클) 및 이의 호변체들을 또한 포함한다. 화학식 A 내지 H 참고. 핵염기의 예시적인 실시예는 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 우라실, 퓨린, 산틴, 2-클로로아데닌, 2-플루오르아데닌, 펜틸 (5-플루오르-2-옥소-1,2, 디히드로피리미딘-4-일)카르바메이트, 시토신 N-알킬 카르바메이트, 시토신 N-알킬에스테르, 5-아자시토신, 5-브로모비닐우라실, 5-플루오르우라실, 5-트리플루오르메틸우라실, 6-메톡시-9H-퓨린-2-아민 및 (R)-3,6,7,8-테트라히드로이미다조[4,5-d][1,3]디아제핀-8-올이다. 용어 “핵염기”는 이들 모든 각각의 실시예들, 뿐만 아니라 이의 유사체들, 호변체들, 그리고 구조이성체를 포괄한다.

용어 “호변체(tautomer)” 또는 “호변체 형(tautomeric form)”이란 낮은 에너지 장벽(low energy barrier)을 통하여 상호전환가능한 상이한 에너지를 가진 구조적 이성질체를 말한다. 예를 들면, 양성자 호변체 (또는 양성자성 호변체로도 알려짐)는 양성자의 상호전환 이동, 이를 테면 케토-에놀 및 이민-에민 이성화(isomerizations)를 포함한다. 원자가(valence) 호변체는 일부 결합 전자의 재편에 의한 상호전환을 포함한다.

용어 “구조이성질체(regioisomer)”는 동일한 분자식을 가지지만, 연결 순서가 상이하게 결합된 원자들을 가진 분자가 되도록 구조적 이성질체 또는 구성적 이성질체를 말한다.

용어 “전환(conversion)”은 출발 물질이 예상된 최종 산물, 부산물 또는 심지어 분해 산물로의 변환 비율이다.

용어 “아노머 순도(anomeric purity)"는 화합물의 특정 아노머의 양을 이 화합물 안에 존재하는 화합물의 총 아노머의 양으로 나누고, 100%를 곱한 것이다.

용어 “2'-플루오르-아라비노 뉴클레오시드-유형”은 언급된 당 앞에 연결된 핵 염기와는 무관하게, 당 모이어티의 2' 위치의 탄소 원자가 2'-아라비노 배열에서 플루오르 원자로 대체된 임의의 뉴클레오시드 유사체를 말한다.

용어 “중간생성물” 또는 “중간생성물들”은 적합한 추가적인 화학 반응에 의해 뉴클레오시드 구조의 제약학적 활성 성분(API)으로 변환될 수 있는 임의의 뉴클레오시드 유사체를 지칭한다. 따라서, 중간생성물은 API 절차로 간주될 수 있는 분자들이다. APIs로 이용되지 못하는 임의의 뉴클레오시드 유사체 유형 화합물들 또는 이들의 중간생성물은 본 발명에서 청구대상이 아니다.

더욱더, 자연적으로-생성되는 DNA 및 RNA 뉴클레오시드 그리고 생물촉매적 과정에 의해 선행 기술에서 공개되었지만, 본 발명의 방법을 이용하여 산업 규모(g/L)로는 생산될 수 없는(가령, 마이크로랩 시범 규모 또는 생산 목적에 유용하지 않는 밀리그램 양의 실험실 규모에서만 생산되는) NAs는 본 발명에서 청구하지 않는데, 이러한 NAs는 APIs로도 작용할 수 없거나 또는 상업적 규모의 생산에 적합하지 않을 수 있기 때문이다.

따라서, 한편으로 요약하자면, NAs의 산업적 생산을 위한 기존 기술에서 이용가능한 화학 공정은 본 발명의 생물촉매적 과정보다 훨씬 더 복잡하다. 다른 한편으로, 뉴클레오시드 합성을 위한 당기술에서 공개된 생물촉매적 과정은 실험 규모로 그리고 자연적으로 생성되는 뉴클레오시드로 제한되며, NAs가 아닌 자연적으로 생성되는 뉴클레오시드, 산업 규모에서 특히, APIs에 제한되지 않는다.

용어 “알킬” 및 “치환안된 알킬”은 본 명세서에서 호환되며, 임의의 C₁-C₂₅ 선형, 분기된, 또는 환형 탄화수소이며, 이때 모든 탄소-탄소 결합은 단일 결합이다.

용어 “알케닐” 및 “치환안된 알케닐”은 본 명세서에서 호환되며, 최소한 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 가진 임의의 C₁-C₂₅ 선형, 분기된, 또는 환형 알킬이다.

더욱이, 용어 “알키닐” 및 “치환안된 알키닐”은 본 명세서에서 호환되며, 최소한 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 가진, 임의의 C₁-C₂₅ 선형, 분기된, 또는 환형 알킬 또는 알케닐이다.

용어 “아릴” 및 “치환안된 아릴”은 본 명세서에서 호환되며, 임의의 방향족 환형 알케닐 또는 알키닐을 지칭하며, 집단으로 또는 집단의 일부로써 페닐 또는 나프탈레닐이며, 각각 할로, 히드록시, 니트로, 시아노, 카르복실, C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알콕시, C₁ _- ₆알콕시C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알킬카르보닐, 아미노, 모노- 또는 디C₁ _- ₆알킬아미노, 아지도, 멀캅토, 폴리할로C₁ _- ₆알킬, 및 폴리할로C₁ _- ₆알콕시로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 치환체에 의해 임의선택적으로 치환된다. 용어 “알카아릴(alkaryl)”은 아릴이 알킬, 알케닐, 또는 알키닐에 공유결합될 때 이용된다.

본 명세서에서 이용된 용어 “치환된”이란 원자 또는 화학기 (이를 테면, H, NH₂, 또는 OH)가 기능기로 대체되는 것을 말하는데, 특별히 고려되는 기능기는 친핵기 (이를 테면, -NH₂, -OH, -SH, -NC, 등등), 친전자기 (이를 테면, C(O)OR, C(X)OH, 등등), 극성기 (이를 테면, -OH), 비-극성기 (이를 테면, 아릴, 알킬, 알케닐, 알키닐, 등등), 이온기 (이를 테면, -NH₃ ⁺), 그리고 할로겐 (이를 테면, -F, -Cl), 및 이의 모든 화학적으로 합당한 조합을 포함한다. 따라서, 용어 “기능기” 및 용어 “치환체”는 본 명세서에서 호환되며, 친핵기 (이를 테면, -NH₂, -OH, -SH, -NC, -CN, 등등), 친전자기 (이를 테면, C(O)OR, C(X)OH, C(할로겐)OR, 등등), 극성기 (이를 테면, -OH), 비-극성기 (이를 테면, 아릴, 알킬, 알케닐, 알키닐, 등등), 이온기 (이를 테면, -NH₃ ⁺), 및 할로겐을 지칭한다.

본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 “헤테로사이클(heterocycle)” 및 “헤테로시클릭 염기(heterocyclic base)”는 본 명세서에서 호환되며, 다수의 원자들이 공유 결합을 통하여 링을 형성하는 임의의 화합물을 지칭하는데, 이때 링은 탄소 원자 이외의 최소한 하나의 원자를 포함한다. 특별히 고려되는 헤테로시클릭 염기는 탄소가 아닌 원자로써 질소, 산소 및 황으로부터 각각 독립적으로 선택된 최소한 1 내지 4개의 이형원자가 포함된 5- 및 6-원(membered) 링 (이를 테면, 이미다졸, 피롤, 트리아졸, 디히드로피리미딘)을 포함한다. 더 고려되는 헤테로사이클은 또다른 링 또는 헤테로사이클에 융합될 수 있고(가령, 공유적으로 결합), 따라서 본 명세서에서 이용된 바와 같이, “융합된 헤테로사이클” 또는 “융합된 헤테로시클릭 염기”로 지칭된다. 특별히 고려되는 융합된 헤테로사이클은 6-원 링에 융합된 5-원 링 (이를 테면, 퓨린, 피롤로[2,3-d]피리미딘), 그리고 또다른 6-원 또는 더 고차의 링에 융합된 6-원 링 (이를 테면, 피리도[4,5-d]피리미딘, 벤조디아제핀)을 포함한다. 이들의 그리고 더 바람직한 헤테로시클릭 염기의 예들은 하기에서 제시된다. 여전히 더 고려되는 헤테로시클릭 염기는 방향족일 수 있거나, 또는 하나 또는 그 이상의 이중 또는 삼중 결합을 포함할 수 있다. 더욱더, 고려되는 헤테로시클릭 염기 및 융합된 헤테로사이클은 하나 또는 그 이상의 위치에서 더 치환될 수 있다. 그리고 링의 임의의 하나는 할로겐, 히드록시, 니트로, 시아노, 카르복실, C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알콕시, C₁ _- ₆알콕시C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알킬카르보닐, 아미노, 모노- 또는 디C₁ _- ₆알킬아미노, 아지도, 멀캅토, 폴리할로C₁ _- ₆알킬, 폴리할로C₁ _- ₆알콕시, 및 C₃ _- ₇시클로알킬로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택된 하나, 둘 또는 세개의 치환체에 의해 임의선택적으로 치환된다.

본 발명에 따른 N-데옥시리보실전달효소 (NDT) 활성을 보유한 효소를 인코드하는 핵산 분자는 다음을 포함한다:

a) 서열 번호:1, 서열 번호:3 또는 서열 번호:5에서 나타낸 뉴클레오티드 서열; 또는

b) 서열 번호:1, 서열 번호:3 또는 서열 번호:5의 보체인 뉴클레오티드 서열; 또는

c) 서열 번호:1, 서열 번호:3 또는 서열 번호:5의 축중(degenerate)인 뉴클레오티드 서열; 또는

d) 높은 엄격성 조건하에 서열 번호:1, 서열 번호:3 또는 서열 번호:5에 혼성화되는, 서열 번호:1, 서열 번호:3 또는 서열 번호:5에 보체에 혼성화되는, 또는 서열 번호:1, 서열 번호:3 또는 서열 번호:5, 또는 이들의 보체로부터 유도된 혼성화 프로브에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열; 또는

e) 서열 번호:1, 서열 번호:3 또는 서열 번호:5에 최소한 80% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 또는

f) 서열 번호:1, 서열 번호:3 또는 서열 번호:5에 최소한 65% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 이때 전술한 서열은 바람직하게는 최소한 NDT 효소를 인코드하는 서열을 인코드하거나 또는 이의 기능적 부분에 보체이며;

g) 서열 번호:2, 서열 번호:4 또는 서열 번호:6에서 선택된 아미노산 서열을 인코드하는 뉴클레오티드 서열.

본 발명의 엄격성 혼성화 조건(stringency hybridization)은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1.1011.104에서 설명된 것과 같다. 이에 따르면, 엄격성 조건하에 혼성화란 1 x SSC 완충액과 0.1 % SDS, 55℃에서, 바람직하게는 62℃에서, 그리고 가장 바람직하게는 68℃에서 1시간, 구체적으로, 0.2 x SSC 완충액 및 0.1 % SDS, 55℃에서, 바람직하게는 62℃에서 그리고 가장 바람직하게는 68℃에서 1 시간 동안 세척 후, 양성 혼성화 신호가 여전히 관찰된다는 의미다.

더욱더, 본 발명의 설명에서, 본 발명은 뉴클레오티드 또는 아미노산 수준에서, 서열 번호: 1, 3 또는 5 (뉴클레오티드) 또는 서열 번호: 2, 4 또는 6 (아미노산)에서 나타낸 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 대하여 최소한 70%의 동일성, 특별히 바람직하게는 최소한 80%의 동일성, 그리고 가장 바람직하게는 최소한 90% 동일성을 가진 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 또한 포괄한다. 동일성 백분율은 다음의 식에 따라 결정된다:

I= (n/L) x 100

이때 I는 동일성 백분율이며, L은 기본 서열 길이가 되며, 그리고 n은 기본 서열에 대하여 한 서열의 뉴클레오티드 또는 아미노산 차이의 수를 나타낸다.

본 발명의 여전히 또다른 주제 내용은 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연계된 상기에서 정의된 핵산 분자의 최소한 하나의 복사체가 포함된 재조합 벡터다. 상기 벡터는 임의의 원핵 또는 진핵 벡터일 수 있다. 원핵 벡터의 예로는 염색체 벡터, 이를 테면 박테리오파아지 (가령, 박테리오파아지 람다) 및 염색체외 벡터, 이를 테면 플라스미드 (예를 들면, Sambrook et al., 상기, Chapter 1-4 참고)이다. 상기 벡터는 또한 진핵 벡터, 가령, 효모 벡터 또는 고등 세포에 적합한 벡터, 가령, 플라스미드 벡터, 바이러스성 벡터 또는 식물 벡터일 수 있다. 적합한 진핵 벡터는 예를 들면, Sambrook et al., 상기, Chapter 16에서 설명된다. 본 발명은 상기에서 설명된 핵산 또는 재조합 벡터로 형질변환된 재조합 세포에 더 관련된다. 상기 세포는 임의의 세포, 가령, 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 원핵 세포, 구체적으로, 대장균(E. coli ) 세포가 특히 바람직하다.

본 설명을 목적으로, 본 발명은 서열 번호: 1-6의 변이체, 또는 전구체, 또는 상동분자(orthologues) 또는 조합을 또한 포괄한다.

본 명세서를 통하여 이용된 용어 "변이체(variant)"는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산에 의해 변경된 각각 핵산의 뉴클레오티드 서열 또는 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 의미한다. 상기 변이체는 "보존적(conservative)" 변화를 가질 수 있으며, 이때 치환된 뉴클레오티드 또는 아미노산은 대체된 뉴클레오티드 또는 아미노산과 유사한 구조적 또는 화학적 성질을 보유한다. 변이체는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 "비-보존적" 변화 또는 결손 및/또는 삽입을 또한 가질 수 있다. 상기 용어는 이 범위 안에 특정 핵산 또는 단백질 또는 폴리펩티드의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 임의의 삽입/결손을 또한 포함한다. "기능적 변이체"는 참조 뉴클레오티드 서열 또는 단백질 또는 폴리펩티드의 기능적 효능을 유지하는 변이체를 의미하는 것으로 이해될 것이다.

본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "보체(complement)" 또는 "상보성(complementary)"이란 20개의 이중-가닥으로된 핵산, 이를 테면, DNA 및 RNA의 각 가닥은 서로 상보적이며, 이들 사이의 염기 쌍은 2개 또는 3개의 수소 결합을 통하여 비-공유적으로 연결된다는 의미일 수 있다. DNA의 경우, 아데닌 (A) 염기는 티민 (T) 염기의 보체이며, 그리고 이의 역도 성립되며; 구아닌 (G) 염기는 시토신 (C) 염기의 보체이며, 그리고 이의 역도 성립된다. RNA의 경우, 아데닌 (A) 염기는 티민 (T) 염기 대신 우라실(I) 염기의 보체인 것을 제외하고 동일하다. DNA와 RNA에서 발견되는 각 염기에 대해 오직 하나의 25개 상보성 염기만 존재함으로, 임의의 단일 가닥에 대하여 상보성 가닥을 재구성할 수 있다.

명세서를 통하여 이용된 용어 "상동분자(orthologue)"는 상이한 종들에서 발견되는 상동 유전자 또는 miRNA 서열로 이해되어야 한다.

본 발명의 목적을 위하여, 용어 “NDT”는 뉴클레오시드 데옥시리보실전달효소 또는 N-데옥시리보실 전달효소 활성을 가진 효소 패밀리에 속하는 생물촉매를 의미한다. 전술한 NDT는 뉴클레오시드 데옥시리보실전달효소 또는 N-데옥시리보실 전달효소 또는 특이적 반응 조건하에 뉴클레오시드 데옥시리보실전달효소 활성을 보유하는 또다른 효소이거나 및/또는 이를 테면 가수분해 반응 보다는 응축 반응을 촉매하도록 변형된 글리코시다제 (가령 역으로 글리코시다제 반응을 실행하기 위하여)와 같이 전술한 효소가 변형되어 뉴클레오시드 데옥시리보실전달효소 활성을 제공하고, 따라서, 뉴클레오시드 데옥시리보실전달효소와 같이 거동할 수 있다.

또한 본 설명을 목적으로, 용어 “약학적 활성 성분(Active Pharmaceutical Ingredient)” 또는 “API”란 인간 또는 동물에서 치료 활성을 보여주는 화합물, 기본적으로 NA를 의미한다. 본 명세서에서 공개된 모든 APIs는 임의의 이성체 형태, 또는 라셈체 또는 이성체의 거울상체-농축된 혼합물로 지칭된다.

약제학적 활성 성분들 (APIs) 또는 이의 중간생성물을 생산하기 위한 생물촉매적 과정을 설명하는데, 이들은 화학식 I의 APIs 또는 이들의 중간생성물, 뉴클레오시드 유사체들 (NAs), D 이성체들이다.

이때,

Z₁은 O, CH₂, S, NH이며;

Z₂는 Z₁과는 독립적으로, O, C, S, N이며;

R^S1은 수소, 메틸, OH, 다음에서 선택된 이의 에테르 또는 에스테르:

n은 0 또는 1이며, 그리고 M은 수소 또는 약제학적으로 수용가능한 반대-이온, 이를 테면 나트륨, 칼륨, 암모늄 또는 알킬암모늄이며;

R^S2는 수소, 할로겐, 바람직하게는 F, OH 또는 이의 에테르 또는 에스테르 잔기, CN, NH₂, SH, C≡CH, N₃이며;

R^S3은 데옥시리보뉴클레오시드로부터 유도된 NA의 경우 수소이거나 또는 NA가 리보뉴클레오시드로부터 유도된 경우 다음에서 선택되며: OH, NH₂, 할로겐 (바람직하게는 F), OCH₃;

R^S4는 수소, OH 또는 이의 에테르 또는 에스테르 잔기, NH₂, 할로겐, 바람직하게는 F이며,

R^S1 및 R^S4가 둘다 OH 잔기의 에테르 또는 에스테르인 경우 이들은 상이하며;

R^S5는 수소, OH 또는 이의 에테르 또는 에스테르 잔기, NH₂ 또는 할로겐, 바람직하게는 F이며;

리보스 모이어티에 결합된 염기는 식 A-H 또는 이들의 호변체 및 구조이성체에서 선택되며:

이때,

R¹은 수소, 메틸, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄, 할로겐, OR¹³, NR¹³R¹⁴, SR¹³이며;

R²는 수소, 메틸, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄, 할로겐, OR¹³, NR¹³R¹⁴, SR¹³이며;

R³은 수소, 메틸, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄이며:

R⁴는 수소, 메틸, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄, COR¹³, CONR¹³R¹⁴, CO₂R¹³, C(S)OR¹³, CH₂-헤테로시클릭 링이며;

R⁵는 수소, 메틸, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄, 임의선택적으로 치환된 알케닐 쇄, 임의선택적으로 치환된 알키닐 쇄, 할로겐, 트리할로알킬, OR¹³, NR¹³R¹⁴, CN, COR¹³, CONR¹³R¹⁴, CO₂R¹³, C(S)OR¹³, OCONR¹³R¹⁴, OCO₂R¹³, OC(S)OR¹³, NHCONR¹³R¹⁴, NHCO₂R¹³, NHC(S)OR¹³, SO₂NR¹³R¹⁴이며;

그리고 다음에서 선택된 독립적으로 R¹, R², R³, R⁴ 또는 R⁵의 임의의 임의선택적으로 치환된 헤테로사이클 또는 임의선택적으로 치환된 아릴이며:

이때

X는 O, S, N-R^B2, Se이며; R^B1은 H, 직쇄 또는 분기된 C₁ _-10 알킬, F, Cl, Br, I, X-R^B2, -C≡C-R^B2, CO₂R^B2이며; R^B2는 H, 직쇄 또는 분기된 C₁ _-5 알킬, 페닐이며;

R⁶은 수소, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄이며;

R⁷은 수소, 할로겐, 트리할로알킬, OR¹³, NR¹³R¹⁴, CN, COR¹³, CONR¹³R¹⁴, CO₂R¹³, C(S)OR¹³이며;

R⁸은 히드록실 또는 아미노, OR¹³, OSO₂R¹³, NR¹³R¹⁴, CN, COR¹³, CONR¹³R¹⁴, CO₂R¹³, C(S)OR¹³이며;

R⁹는 수소, 메틸, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄, 할로겐, OR¹³, NR¹³R¹⁴, COR¹³, CONR¹³R¹⁴, CN, CO₂R¹³, C(S)OR¹³, OCONR¹³R¹⁴, OCO₂R¹³, OC(S)OR¹³, NHCONR¹³R¹⁴, NHCO₂R¹³, NHC(S)OR¹³이며;

R¹⁰ 및 R¹¹은 서로 독립적으로 수소, 메틸, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄이며;

R¹²은 수소, 메틸, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄, 할로겐, OR¹³, NR¹³R¹⁴, CN, COR¹³, CONR¹³R¹⁴, CO₂R¹³, C(S)OR¹³, OCONR¹³R¹⁴, OCO₂R¹³, OC(S)OR¹³, NHCONR¹³R¹⁴, NHCO₂R¹³, NHC(S)OR¹³이며;

R¹³ 및 R¹⁴는 서로 독립적으로 수소, 치환된 또는 치환안된 알킬 쇄, 치환된 또는 치환안된 알케닐 쇄, 치환된 또는 치환안된 알키닐 쇄, 치환된 또는 치환안된 헤테로시클릭 또는 페닐 링이며;

상기 공정은 한-단계/원-팟 반응으로 실행되며, 이때 전술한 반응은 적합한 반응 수성 매체에서, 그리고 적합한 반응 조건하에 뉴클레오시드 데옥시리보실전달효소 (NDT)가 구조식 II의 최소한 하나의 뉴클레오시드, D 이성질체가 포함된 출발물질 혼합물에 추가되는 것이 포함된다.

이때,

Z₁은 O, CH₂, S, NH이며;

Z₂는 Z₁과는 독립적으로, O, C, S, N이며;

R^S1은 수소, 메틸, OH, 다음에서 선택된 이의 에테르 또는 에스테르이며:

리보스 모이어티에 결합된 염기는 헤테로시클릭 링이 포함된 임의의 군으로부터 선택되며;

그리고 NDT 효소에 의해 전달되는 최소한 하나의 자유 핵염기는 다음에서 선택된다:

이때,

R³은 수소, 메틸, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄이며:

그리고 다음에서 선택된 독립적으로 R¹, R², R³, R⁴ 또는 R⁵의 임의의 임의선택적으로 치환된 헤테로사이클 또는 임의선택적으로 치환된 아릴:

이때

R⁶은 수소, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄이며;

R¹³ 및 R¹⁴는 서로 독립적으로 수소, 치환된 또는 치환안된 알킬 쇄, 치환된 또는 치환안된 알케닐 쇄, 치환된 또는 치환안된 알키닐 쇄, 치환된 또는 치환안된 헤테로시클릭 또는 페닐 링이다.

출발 물질의 구조식 II에서 헤테로시클릭 링을 구성하는 염기는 다음에서 선택될 수 있다: 우라실, 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 하이포산틴, 산틴, 티오우라실, 티오구아닌, 9-H-퓨린-2-아민, 7-메틸구아닌, 5-플루오르우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5,6-디히드로우라실, 5-메틸시토신 그리고 5-히드록시메틸시토신, 프테리돈(pteridone), 및 이의 임의의 치환된 유도체. 바람직하게는 출발 물질의 구조식 II에서 헤테로시클릭 링을 구성하는 염기는 다음에서 선택된다: 우라실, 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 하이포산틴, 산틴, 티오우라실, 티오구아닌, 9-H-퓨린-2-아민, 7-메틸구아닌, 5-플루오르우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5,6-디히드로우라실, 5-메틸시토신 및 5-히드록시메틸시토신 그리고 임의의 치환된 이의 유도체들.

더욱더, NDT 효소에 의해 전달되는 자유 핵염기는 바람직하게는 다음에서 선택된다:

전술한 공정의 바람직하게는 구체예에서, Z₂는 C이다. 본 명세서에서 설명된 공정에서, 생산된 APIs 또는 이의 중간생성물은 다음에서 선택된다: 클로파라빈 (Cl-F-araA), 데시타빈 (aza-dCyd), 시타라빈 (ara-C), 비다라빈, 브리부딘(Brivudine), 엔오시타빈 (BH-AC),, 잘시타빈 (ddC), 클라드리빈 (Cl-dAdo), 플루다라빈 (F-araA), 넬에라빈 (MAY), 지도부딘, 플옥시우리딘 (FUDR), β-티미딘, 이독스우리딘 (IdU), 트리플루우리딘 (TFT), 아세두리드(EdU), 리바비린, 디다노신 (ddI) 그리고 펜토스타틴(Pentostatin).

더욱 바람직하게는, 생산된 APIs 또는 이의 중간생성물은 다음에서 선택된다: 클로파라빈(Clofarabine), 시타라빈(Cytarabine), 비다라빈(Vidarabine), 브리부딘(Brivudine), 엔오시타빈(Enocitabine), 잘시타빈(Zalcitabine), 클라드리빈(Cladribine), 플루다라빈(ludarabine) 넬에라빈(elerabine) 지도부딘(Zidovudine), 플옥시우리딘(Floxuridine) 및 펜토스타틴(Pentostatin); 여전히 더욱 바람직하게는 생산된 APIs 또는 이의 중간생성물은 클로파라빈, 시타라빈 및 지도부딘(AZT)에서 선택되며; 그리고 여전히 더욱 바람직하게는 설명된 공정은 클로파라빈, 시타라빈 및 지도부딘의 중간생성물의 산업적 생산을 위하여 특별히 의도된 것이며; 더더욱 바람직하게는 클로파라빈 또는 이의 중간생성물, 더 더욱 바람직하게는 클로파라빈이다.

그러나, 본 발명의 범위를 제한시키는 목적으로, 다음의 NAs는 특별히 청구하지 않는다: CAS No. 2627-62-5, CAS No. 7481-89-2, CAS No. 50-91-9, CAS No. 50-90-8, CAS No. 54-42-2, CAS No. 10356-76-0, CAS No. 2239-64-7, CAS No. 4546-70-7, CAS No. 15176-29-1, CAS No. 70-00-8, CAS No. 838-07-3, CAS No. 10212-20-1, 그러나 중온균(mesophilic) NDT에 의해 중재된 생물촉매적 합성의 경우에만, 이때 상기 열거된 NAs의 파일롯 생산은 산업 규모로 생산을 효율적으로 상향시킬 정도의 충분한 수율을 제공하지 않았다.

본 발명의 설명을 목적으로, NDT 활성을 보유하는 효소가 유래된 유기체는 중온균(mesophiles), 고온균(thermophiles) 또는 초고온균(hypermesophiles)일 수 있다. 중온균(mesophiles 또는 mesophilic)은 18 내지 최대 60℃ 범위의 온도, 40-55℃의 적절한 온도 범위에서 뉴클레오시드 데옥시리보실전달효소 활성을 실행하는 균들이다. 유기체 또는 NDT 효소, 고온균(thermophiles 또는 thermophilic)은 60℃이상 그리고 최대 80℃의 온도 범위에서 뉴클레오시드 데옥시리보실전달효소 활성을 실행할 수 있는 것들이다. 유기체 또는 NDT 효소, 초고온균(hyperthermophiles 또는 hyperthermophilic)은 80℃ 이상, 최대 100℃ 범위의 온도, 최적의 온도 범위 80-95℃에서 뉴클레오시드 데옥시리보실전달효소 활성을 실행할 수 있는 것들이다.

본 발명에서 설명되는 과정을 실행하는 하나 이상의 바람직한 구체예에서, 생산된 API, 또는 이의 중간생성물은 클로파라빈 (과정 2)이다.

과정 2. 뉴클레오시드

데옥시리보실전달효소 (NDT) 활성을 가진 효소를 이용하여 클로파라빈의 합성

클로파라빈의 생산에 적용되는 본 발명의 공정은 선행기술에서 소위 ILEX 과정(Bauta et al, Org.Proc.Res.Dev. 2004, 8, 889-896)이라고 불리는 NA의 화학적 합성에 이용된 산업적 과정과 비교하여 몇 가지 장점을 가진다:

(i) 원-포트(One-pot) 합성,

(ii) 감소된 단계들의 수,

(iii) 더 높은 전환 및 수율,

(iv) 효소 단계에서 유기 용매 회피,

(v) 이를 테면, 당에 있는 히드록실기에 대한 보호/탈보호 전략이 필요하지 않음,

(ix) 전반적인 폐기물 생성 감소,

(x) 과정 생산성

(xi) 전반적으로 낮은 생산 단가

더욱더, 선행 기술에서 이용된 화학 과정보다 본 발명의 생물촉매적 공정의 다른 추가적인 장점들이 있다. 특별히 Bauta et al.,의 화학 공정에서 이용된 유기 용매, 디클로로메탄 (DCM), 아세토니트릴 (ACN), 1,2-디클로로에탄 (DCE), 메탄올, 헵탄, 등이 본 발명의 공정에 없는 것이다. 모든 유기 용매는 환경으로 임의의 공정 폐기물 방출전에 제거되어야만 한다. 본 발명의 과정에 있어서, 본 발명의 단일 단계-원 팟 공정과는 반대로, 최소한 3가지 절차적 단계를 포함하고 있는 한, ILEX 공정의 추가 단점은 공정의 복잡성이다.

본 발명의 공정에 이용된 고유 또는 재조합 효소의 원천은 박테리아 또는 고세균류 (Archaea ) 유기체들이다. 본 발명의 공정에 이용된 뉴클레오시드 데옥시리보실전달효소 활성을 보유한 효소는 예를 들면, 박테리아, 특별히 락토바실러스 (Lactobacillus) 또는 락토코커스 ( Lactococcus ) 종 또는 고세균류 특별히, 다음의 속중 임의의 것으로부터 선택된 미생물로부터 단리될 수 있다: 터모필룸 (Thermofilum); 할로아르쿨라 ( Haloarcula ); 나트로노코커스 ( Natronococcus ); 나트리알바 (Natrialba); 할로비포르마 ( Halobiforma ); 메타노사르시나 ( Methanosarcina ); 메타노메틸로보란스( Methanomethylovorans ); 메타노쿨레우스 ( Methanoculleus ); 메타노스페룰라 ( Methanosphaerula ); 메타노할로비움( Methanohalobium ); 메타노살숨 ( Methanosalsum ) 또는 메타노세타 ( Methanosaeta ).

본 발명의 여전히 또다른 구체예는 공개된 공정에서 고세균류로부터 단리된 핵산 서열 또는 이의 단편들에 의해 인코드된 아미노산 서열이 포함된 재조합 NDT 효소의 사용에 관련된다.

본 명세서에서 함께 설명된 바와 같이, 본 발명의 공정을 실행하기 위한 바람직한 구체예들은 염기 전달 한단계-원팟 반응을 실행하기 위하여 생물촉매로써 NDT 효소의 사용에 근거한다. 바람직하게는 NDT 효소는 60℃이상 그리고 최대 100℃ 범위 온도에서, 더욱 바람직하게는, 본 명세서에서 설명된 적합한 반응 조건에서 핵염기 전달 한단계-원팟 반응을 실행할 수 있는 NDT 효소 활성을 인코드하는 유전자 서열 단편들이 포함된 재조합 유형이다.

본 발명의 공정의 상이한 구체예들을 실행하는데 적합한 조건들은 다음을 포함한다:

a) 18 - 100 ℃의 범위, 바람직하게는 20-100℃, 그리고 더욱 바람직하게는 40 - 100 ℃의 범위, 더더욱 바람직하게는 50 - 100 ℃ 범위의 온도

b) 1-600 h 범위의 반응 시간

c) 1-500 mM 범위의 출발 물질 농도

d) 화학량론적 뉴클레오시드 출발 물질:핵염기는 1:5 내지 5:1의 범위를 가진다.

e) NDT 활성을 보유한 효소 또는 NDT 효소의 양은 0,001-100 mg/ml, 바람직하게는 0.001-10 mg/mL의 범위를 가지며;

f) 반응 매체에 추가되는, 임의선택적으로 유기 용매에 용해된 자유 핵염기,

g) 수성 반응 매체는 또한 임의선택적으로 적합한 유기 용매의 최대 40%까지 포함한다. 바람직하게는 최대 20% 그리고 더욱 바람직하게는 최대 5%까지 포함한다.

반응 매체에 추가되는 또는 기존의 자유 핵염기를 용해시키는데 이용되는 바람직한 유기 용매는 극성 비양자성 용매, 바람직하게는 다음에서 선택된다: 테트라히드로퓨란, 아세토니트릴, 아세톤 또는 디메틸포름아미드(DMF).

본 발명에 따른 공정은 또한 크로마코그래피, 침전, 여과, 농축 또는 결정화에서 선택된 표준 작업 수단에 의해 생산된 NA의 단리 및/또는 정제 단계를 또한 포함한다.

본 명세서의 목적을 위하여, 용어 재조합 효소 또는 재조합 유형 효소는 재조합 DNA로부터 유도된 단백질 또는 효소로 이해되어야 한다. 용어 “재조합 DNA”는 자연에 존재하지 않는 DNA 형태이며, 정상적으로 생성되지 않는 DNA 서열을 함께 복합시켜 만들어진다.

본 발명의 공정은 생산된 API는 클로로파라빈 (과정 2)이며, 출발 물질로 이용된 2'-데옥시리보뉴클레오시드는 2'-플루오르-아라비노퓨라노실-2'-데옥시우리딘이며, NDT 효소에 의해 전달되는 출발 물질로 이용된 핵염기는 2-클로로아데닌이며, 상기 NDT는 락토바실러스 델브루엑키(Lactobacillus delbrueckii)(이전에 락토 바실러스 레치마니 (Lactobacillus leichmannii ))로부터 단리된 자연적으로 생성되는 NDT 효소인 경우를 특히 포괄한다.

본 발명의 공정의 구체예들중 하나에서 생산된 API는 클로로파라빈 (과정 2)이며, 출발 물질로 이용된 2'-데옥시아라비노뉴클레오시드는 임의의 적합한 2'-플루오르-아라비노-유형, 바람직하게는 2'-플루오르-아라비노퓨라노실-2'-데옥시우리딘이며, NDT 효소에 의해 전달되는 출발 물질로 이용된 핵염기는 2-클로로아데닌인 경우가 포괄된다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 생산된 API는 클로로파라빈이며, 출발 물질로 이용된 2'-데옥시아라비노뉴클레오시드는 아라비노퓨라노실-2'-데옥시우리딘이며, NDT 효소에 의해 전달되는 출발 물질로 이용된 핵염기는 시토신이다.

본 발명의 공정의 또다른 구체예에서, 생산된 API는 지도부딘의 합성에서 중간생성물이며, 출발 물질로 이용된 뉴클레오시드는 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신이며, NDT 효소에 의해 전달되는 출발 물질로 이용된 핵염기는 티민이다. 따라서 획득된 지도부딘의 전술한 중간생성물은 일차 아민 모이어티를 포함하며, 이는 추가 아지드화 단계(azidation step), 예를 들면 무기 아지드 또는 아조(azo)-전달 화합물들, 이를 테면 트리플루오르메탄술포닐 아지드 또는 이미다졸-1-술포닐 아지드를 이용하여 지도부딘으로 용이하게 변환될 수 있다.

동일한 발명의 개념의 일부로써, 본 명세서는 상기에서 설명된 공정을 실행할 수 있는 재조합 뉴클레오시드 데옥시리보실전달효소 (NDTs)를 또한 공개한다. 전술한 고유 또는 재조합 NDT 효소는 박테리아, 바람직하게는 락토바실러스 델브루 엑키(Lactobacillus delbrueckii )(이전에 락토바실러스 레치마니(Lactobacillus leichmannii )) 또는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)로부터 선택된 박테리아로부터 단리될 수 있거나; 또는 고세균류, 바람직하게는 다음에서 선택된 것으로부터 단리될 수 있다: 터모필룸 펜덴스 ( Thermofilum pendens ); 할로아르쿨라 시나이렌시스 ( Haloarcula sinaiiensis ); 나트로노코커스 아밀로리티쿠스 ( Natronococcus amylolyticus ); 나트리알바 후룬베이렌시스( Natrialba hulunbeirensis); 할로비포르마 니트라티레두센스 ( Halobiforma nitratireducens ); 메타노사르시나 마제이( Methanosarcina mazei ); 메타노메틸로보란스 홀란디카 ( Methanomethylovorans hollandica ); 메타노쿨레우스 보우르겐시스 ( Methanoculleus bourgensis ); 메타노스페룰라 팔루스트레스( Methanosphaerula palustres ); 메타노할로비움 에베스티가툼 ( Methanohalobium evestigatum ); 메타노살숨 지리네( Methanosalsum zhilinae ) 또는 메타노세타 하룬디나세아( Methanosaeta harundinacea ).

본 발명의 한 가지 바람직하게는 구체예에서, NDT 효소는 다음으로부터 획득된다:

a) 서열 번호:1에 나타낸 락토바실러스 델브루엑키(Lactobacillus delbrueckii)(기존에 락토바실러스 레치마니 (Lactobacillus leichmannii )로 불림)) 뉴클레오티드 인코딩 서열; 또는

b) 서열 번호: 1의 보체가 되는 뉴클레오티드 서열; 또는

c) 서열 번호: 1의 축중인 뉴크렐오티드 서열; 또는

d) 높은 엄격성 조건하에 서열 번호: 1, 서열 번호:1의 보체, 또는 서열 번호: 1, 또는 이들의 보체로부터 유도된 혼성화 프로브; 또는

e) 서열 번호: 1과 최소한 80% 서열 동일성을 보유한 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열; 또는

f) 서열 번호: 1에 최소한 65% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 이때 전술한 서열은 바람직하게는 최소한 NDT 효소를 인코드하는 서열을 인코드하거나 또는 이의 기능적 부분에 보체다.

g) NDT 활성을 보유한 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열, 이때 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호: 2에 나타낸 아미노산 서열에 최소한 80% 동일하며, 더 바람직하게는 서열 번호: 2에 나타낸 아미노산 서열을 인코드하는 뉴클레오티드 서열.

본 발명의 또다른 바람직한 구체예에서, NDT 효소는 다음으로부터 획득된다:

a) 서열 번호: 3에 나타낸 락토코커스 락티스 ( Lactococcus lactis ) 뉴클레오티드 인코딩 서열 또는

b) 서열 번호: 3의 보체가 되는 뉴클레오티드 서열; 또는

c) 서열 번호: 3의 축중인 뉴크렐오티드 서열; 또는

d) 높은 엄격성 조건하에 서열 번호:3, 서열 번호:3의 보체, 또는 서열 번호:3, 또는 이들의 보체로부터 유도된 혼성화 프로브에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열; 또는

e) 서열 번호: 3에 최소한 80% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 또는

f) 서열 번호: 3에 최소한 65% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 이때 전술한 서열은 바람직하게는 최소한 NDT 효소를 인코드하는 서열을 인코드하거나 또는 이의 기능적 부분에 보체다.

g) NDT 활성을 보유한 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열, 이때 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호: 4에 나타낸 아미노산 서열에 최소한 80% 동일하며, 더 바람직하게는 서열 번호: 4에 나타낸 아미노산 서열을 인코드하는 뉴클레오티드 서열.

본 발명의 여전히 다른 바람직한 구체예에서, NDT 효소는 서열 번호: 5에 나타낸 터모필룸 펜덴스 ( Thermofilum pendens ) 로부터 획득된 뉴클레오티드 인코딩 서열 또는

a) 서열 번호: 5의 보체가 되는 뉴클레오티드 서열; 또는

b) 서열 번호: 5의 축중인 뉴크렐오티드 서열; 또는

c) 높은 엄격성 조건하에 서열 번호:5, 서열 번호:5의 보체, 또는 서열 번호:5, 또는 이들의 보체로부터 유도된 혼성화 프로브에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열; 또는

d) 서열 번호: 5에 최소한 80% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 또는

e) 서열 번호: 5에 최소한 65% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 이때 전술한 서열은 바람직하게는 최소한 NDT 효소를 인코드하는 서열을 인코드하거나 또는 이의 기능적 부분에 보체다.

f) NDT 활성을 보유한 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열, 이때 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호: 6에 나타낸 아미노산 서열에 최소한 80% 동일하며, 더 바람직하게는 서열 번호: 6에 나타낸 아미노산 서열을 인코드하는 뉴클레오티드 서열.

단일 발명으로 연계된 개념의 동일선상에서, 본 명세서는 APIs 또는 이의 중간생성물의 생산에서 뉴클레오시드 데옥시리보실전달효소 (NDT)의 이용, 항암 또는 항-바이러스성 약물로써 유용한 APIs 또는 이들의 중간생성물, 뉴클레오시드 유사체들 (NAs)을 공개한다. 더욱 바람직하게는, 이미 언급된 용도는 앞에서 상술된 APIs 또는 이의 중간생성물로써 NAs 및 이의 변이체들의 생산 공정에 의해 획득된다. 특별히, 앞서 언급된 용도와 관련하여, 재조합 뉴클레오시드 데옥시리보실전달효소 (NDTs)는 바람직하게는, APIs의 생산에서, APIs 또는 이들의 중간생성물로써, 특별히 항암 또는 항-바이러스성 약물로써 특별히 유용한 뉴클레오시드 유사체들 (NAs)이다.

이러한 용도에 의해 생산된 APIs 또는 이의 중간생성물은 다음에서 찾을 수 있을 것이다: 클로파라빈 (Cl-F-araA), 데시타빈 (aza-dCyd), 시타라빈 (ara-C), 비다라빈, 브리부딘(Brivudine), 엔오시타빈 (BH-AC), 잘시타빈 (ddC), 클라드리빈 (Cl-dAdo), 플루다라빈 (F-araA), 넬에라빈 (MAY), 지도부딘, 플옥시우리딘 (FUDR), β-티미딘, 이독스우리딘 (IdU), 트리플루우리딘 (TFT), 아세두리드(EdU), 리바비린, 디다노신 (ddI) 그리고 펜토스타틴(Pentostatin).

더욱 바람직하게는, 본 명세서에서 공개된 효소를 사용하여 생산된 APIs 또는 이의 중간생성물은 다음으로부터 선택된다: 클로파라빈(Clofarabine), 시타라빈(Cytarabine), 비다라빈(Vidarabine), 브리부딘(Brivudine), 엔오시타빈(Enocitabine), 잘시타빈(Zalcitabine), 클라드리빈(Cladribine), 플루다라빈(ludarabine) 넬에라빈(elerabine) 지도부딘(Zidovudine), 플옥시우리딘(Floxuridine) 및 펜토스타틴(Pentostatin); 여전히 더욱 바람직하게는 생산된 APIs 또는 이의 중간생성물은 클로파라빈, 시타라빈 및 지도부딘 또는 이의 중간생성물들에서 선택되며; 그리고 여전히 더욱 바람직하게는 설명된 공정은 클로파라빈, 시타라빈 및 지도부딘의 중간생성물의 산업적 생산을 위한 것이며; 더더욱 바람직하게는 클로파라빈 또는 이의 중간생성물, 더 더욱 바람직하게는 클로파라빈의 생산을 위한 것이다.

본 발명에 따라 이용되는 N-데옥시리보실 전달효소 (NDT) 활성을 갖는 효소는 다음에서 선택된 핵산 서열에 의해 인코드된 재조합 NDT 효소를 포함한다: 서열 번호:1, 서열 번호:3 또는 서열 번호:5; 또는

a) 서열 번호:1, 서열 번호:3 또는 서열 번호:5의 보체인 뉴클레오티드 서열; 또는

b) 서열 번호:1, 서열 번호:3 또는 서열 번호:5의 축중(degenerate)인 뉴클레오티드 서열; 또는

c) 높은 엄격성 조건하에 서열 번호:1, 서열 번호:3 또는 서열 번호:5에 혼성화되는, 서열 번호:1, 서열 번호:3 또는 서열 번호:5에 보체에 혼성화되는, 또는 서열 번호:1, 서열 번호:3 또는 서열 번호:5, 또는 이들의 보체로부터 유도된 혼성화 프로브에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열; 또는

d) 서열 번호:1, 서열 번호:3 또는 서열 번호:5에 최소한 80% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 또는

e) 서열 번호:1, 서열 번호:3 또는 서열 번호:5에 최소한 65% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 이때 전술한 서열은 바람직하게는 최소한 NDT 효소를 인코드하는 서열을 인코드하거나 또는 이의 기능적 부분에 보체다.

f) 서열 번호:2, 서열 번호:4 또는 서열 번호:6에서 선택된 아미노산 서열을 인코드하는 뉴클레오티드 서열.

본 발명은 적합한 숙주 안에서 전술한 데옥시리보실전달효소의 발현 또는 과다발현을 지시하는 하나 또는 그 이상의 조절 서열에 작용가능하도록 연계된 뉴클레오시드 데옥시리보실전달효소 (NDT)를 인코드하는 서열이 포함된 재조합 발현 벡터를 또한 포함한다. 본 발명에 따른 바람직한 재조합 발현 벡터는 인코딩 전술한 NDT 효소 활성을 인코드하는 유전자를 운반하고, 발현 또는 과다발현시킨다.

본 발명에 따른 바람직한 재조합 발현 벡터는 다음에서 선택된 핵산을 운반 및 발현 또는 과다발현시킨다: 서열 번호:1, 서열 번호:3 또는 서열 번호:5; 또는

서열 번호:2, 서열 번호:4 또는 서열 번호:6에서 선택된 아미노산 서열을 인코드하는 뉴클레오티드 서열.

본 발명은 재조합 NDT 효소의 생산 또는 약제학적 활성 성분들 (APIs) 또는 중간생성물의 생산을 위하여 전술한 재조합 발현 벡터의 용도를 포괄하는데, APIs 또는 이들의 중간생성물, 뉴클레오시드 유사체들 (NAs)은 항암 또는 항-바이러스성 약물로써 특히 유용하다. 특히 전술한 용도에 의해 생산된 APIs 또는 이의 중간생성물은 다음으로부터 선택된다: 클로파라빈 (Cl-F-araA), 데시타빈 (aza-dCyd), 시타라빈 (ara-C), 비다라빈, 브리부딘(Brivudine), 엔오시타빈 (BH-AC),, 잘시타빈 (ddC), 클라드리빈 (Cl-dAdo), 플루다라빈 (F-araA), 넬에라빈 (MAY), 지도부딘, 플옥시우리딘 (FUDR), β-티미딘, 이독스우리딘 (IdU), 트리플루우리딘 (TFT), 아세두리드(EdU), 리바비린, 디다노신 (ddI) 그리고 펜토스타틴(Pentostatin).

더욱 바람직하게는, 생산된 APIs 또는 이의 중간생성물은 다음에서 선택된다: 클로파라빈(Clofarabine), 시타라빈(Cytarabine), 비다라빈(Vidarabine), 브리부딘(Brivudine), 엔오시타빈(Enocitabine), 잘시타빈(Zalcitabine), 클라드리빈(Cladribine), 플루다라빈(ludarabine) 넬에라빈(elerabine) 지도부딘(Zidovudine), 플옥시우리딘(Floxuridine) 및 펜토스타틴(Pentostatin); 여전히 더욱 바람직하게는 생산된 APIs 또는 이의 중간생성물은 클로파라빈, 시타라빈 및 지도부딘에서 선택되며; 그리고 여전히 더욱 바람직하게는 설명된 발현 벡터는 클로파라빈, 시타라빈 및 지도부딘의 중간생성물의 산업적 생산에 적합하며; 더더욱 바람직하게는 클로파라빈 또는 이의 중간생성물, 더 더욱 바람직하게는 클로파라빈의 생산에 적합하다.

더욱 바람직하게는, APIs 또는 이의 중간생성물의 생산을 위하여 상기 언급된 용도는 이미 상세하게 설명된 생산 공정 및 이의 변이에 의해 획득된다.

본 발명은 또한 특별히 전술한 숙주 세포가 대장균( Escherichia coli )일 때, 이미 설명된 바와 같이, 재조합 발현 벡터가 포함된 숙주 세포를 포괄한다. 동일한 발명의 연계된 단일 개념의 일부로써 재조합 NDTs의 생산을 위하여 이미 설명된 바와 같이, 재조합 발현 벡터가 포함된 숙주 세포의 사용 또한 고려된다. 유사하게, 약제학적 활성 성분들 (APIs) 또는 이의 중간생성물의 생산을 위하여 이미 설명된 바와 같이 재조합 발현 벡터가 포함된 숙주 세포 용도 또한 본 발명의 일부분이며, APIs 또는 이들의 중간생성물, 뉴클레오시드 유사체들 (NAs)은 항암 또는 항-바이러스성 약물로 유용하다. 특히, 이미 언급된 바와 같이, 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 다음으로부터 선택된 APIs 또는 이의 중간생성물의 생산이 이용된다면: 클로파라빈 (Cl-F-araA), 데시타빈 (aza-dCyd), 시타라빈 (ara-C), 비다라빈(araA), 브리부딘(Brivudine), 엔오시타빈 (BH-AC),, 잘시타빈 (ddC), 클라드리빈 (Cl-dAdo), 플루다라빈 (F-araA), 넬에라빈 (MAY), 지도부딘, 플옥시우리딘 (FUDR), β-티미딘, 이독스우리딘 (IdU), 트리플루우리딘 (TFT), 아세두리드(EdU), 리바비린, 디다노신 (ddI) 그리고 펜토스타틴(Pentostatin).

더욱 바람직하게는, 이미 언급된 바와 같이, 재조합 발현 벡터로 형질변환된 본 발명의 숙주 세포를 이용하여 생산된 APIs 또는 이의 중간생성물은 다음으로부터 선택된다: 클로파라빈(Clofarabine), 시타라빈(Cytarabine), 비다라빈(Vidarabine), 브리부딘(Brivudine), 엔오시타빈(Enocitabine), 잘시타빈(Zalcitabine), 클라드리빈(Cladribine), 플루다라빈(ludarabine) 넬에라빈(elerabine) 지도부딘(Zidovudine), 플옥시우리딘(Floxuridine) 및 펜토스타틴(Pentostatin); 여전히 더욱 바람직하게는 생산된 APIs 또는 이의 중간생성물은 클로파라빈, 시타라빈 및 지도부딘에서 선택되며; 그리고 여전히 더욱 바람직하게는 설명된 형질변환된 숙주 세포는 클로파라빈, 시타라빈 및 지도부딘의 중간생성물의 산업적 생산에 적합하며; 더더욱 바람직하게는 클로파라빈 또는 이의 중간생성물, 더 더욱 바람직하게는 클로파라빈의 생산에 적합하다.

더욱 바람직하게는, 이미 언급된 용도는 앞에서 상술된 APIs 또는 이의 중간생성물로써 NAs 및 이의 변이체들의 생산 공정에 의해 획득된다.

실시예 1 락토바실러스 델브루엑키 (Lactobacillus delbrueckii ) subsp . 락 티스(lactis) DSM 20072로부터 NDTs 클로닝 및 발현

클로닝.

락토바실러스 델브루엑키 (Lactobacillus delbrueckii ) subsp . 락티스 ( lactis ) (GenBank 수탁 번호 EGD27012.1)로부터 N-데옥시리보실전달효소를 인코드하는 유전자는 락토바실러스 델브루엑키 (Lactobacillus delbrueckii )subsp. 락티스 ( lactis ) DSM 20072 게놈 DNA로부터 폴리머 쇄 반응(PCR)에 의해 증폭되었다. 상기 유전자는 제한효소 부위 NdeI 및 SalI를 이용하여 발현 벡터: pET22 b(+)의 폴리링커 영역 안으로 클론되었다

이용된 프라이머는 5'-단부에서 적절한 변형을 가지도록 기획되었다 (서열 참고):

Ldndt2 fw: 5'- CATATGCCAAAAAAGACGATCTACTTC -3' (서열 번호:19)

Ldndt2 rv: 5'- GTCGACTTAGTATACGGCACC -3' (서열 번호:20)

뉴클레오시드 2-데옥시리보실전달효소 서열의 대응하는 유전자는 Platinum Taq 효소 (Invitrogen), 상응하는 전방 및 역 올리고뉴클레오티드 (서열 번호:19 및 20)를 이용하여, PCR에 의해 증폭되었다. 증폭된 0.-kb 산물은 pGEM-T 벡터 안으로 삽입되었다. 클론된 영역은 완벽하게 서열화되었고, 데이터 뱅크 서열과 동일하다는 것이 밝혀졌다. 삽입 DNA는 NdeI 및 SalI으로 절단되었고, 그 다음 동일한 제한효소로 절단된 pET-22b(+)의 발현 벡터에 결찰되었다.

결찰 산물은 화학적으로 컴피턴트(competent) 대장균(E. coli ) DH5α 세포 안으로 형질도입되었다. 양성 플라스미드가 선별되었고, 후속적으로 BL21(DE3) 화학으로 컴피턴트한 세포로 형질전환되었다.

락토바실러스 델브루엑키 (Lactobacillus delbrueckii ) subsp. 락티스(lactis)로부터 NDT의 발현 및 정제

상기 재조합 플라스미드를 가지고 있는 대장균(E. coli) 균주는 암피실린(100 μg ml^-1)이 보충된 LB 배지에서 OD₆₀₀ _nm값이 0.5에 이를 때까지 호기적으로 성장되었다. 37°C에서 4 h 동안 대장균 배양물을 0.5 mM 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노시드(IPTG)로 유도시킴으로써 상기 단백질이 과다발현되었다. 4° C, 4,000×g에서 20 분간 원심분리에 의해 박테리아 세포가 수확되었다. 1 리터 배양물로부터 수집된 세포의 경우 20 ml의 인산염 완충된 염수 (PBS 완충액)에 수확된 세포들은 재현택되었다. 상기 세포 현탁액은 초음파파쇄(Branson Sonifier 450)에 의해 용해되었다. 서열 번호: 1의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코드된 서열 번호:2의 아미노산 서열 및 NDT 활성을 보유하는 효소를 얻기 위하여, 13000×g에서 45분 동안 원심분리에 의해 세포 용해물(상청액)이 획득되었다.

실시예 2: L. 락티스(lactis)로부터 NDTs의 클로닝 및 발현.

클로닝.

락토코커스 락티스 ( Lactococcus lactis ) subsp. 락티스 ( lactis ) (GenBank 수탁 번호 AE006284)로부터 N-데옥시리보실전달효소를 인코드하는 유전자는 락토코커스 락티스 ( Lactococcus lactis ) subsp. 락티스( lactis ) 게놈 DNA로부터 폴리머 쇄 반응(PCR)에 의해 증폭되었다. 상기 유전자는 제한효소 부위 NdeI 및 EcoRI를 이용하여 발현 벡터: pET22 b(+)의 폴리링커 영역 안으로 클론되었다

Llac fw:5'-GCCATATGAACAAGTTGTTTAATCAAG-3' (서열 번호:17)

Llac rv:5'-GCGAATTCTACTGGTATTTTCCACTATA-3' (서열 번호:18)

뉴클레오시드 2-데옥시리보실전달효소(NDT) 서열의 대응하는 유전자는 Platinum Taq 효소 (Invitrogen), 상응하는 전방 및 역 올리고뉴클레오티드 (서열 번호:17 및 18)를 이용하여, PCR에 의해 증폭되었다. 증폭된 0.5-kb 산물은 pGEM-T 벡터 안으로 삽입되었다. 클론된 영역은 완벽하게 서열화되었고, 데이터 뱅크 서열과 동일하다는 것이 밝혀졌다. 삽입 DNA는 NdeI 및 EcoRI으로 절단되었고, 그 다음 동일한 제한효소로 절단된 pET-22b(+)의 발현 벡터에 결찰되었다.

락토코커스 락티스 ( Lactococcus lactis ) subsp. 락티스(lactis)로부터 NDT의 발현 및 정제

상기 재조합 플라스미드를 가지고 있는 대장균(E. coli) 균주는 암피실린(100 μg ml^-1)이 보충된 LB 배지에서 OD₆₀₀ _nm값이 0.5에 이를 때까지 호기적으로 성장되었다. 30℃에서 4 h 동안 대장균 배양물을 0.5 mM 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노시드(IPTG)로 유도시킴으로써 상기 단백질이 과다발현되었다. 4℃, 4,000×g에서 20 분간 원심분리에 의해 박테리아 세포가 수확되었다. 1 리터 배양물로부터 수집된 세포의 경우 20 ml의 인산염 완충된 염수 (PBS 완충액)에 수확된 세포들은 재현택되었다. 상기 세포 현탁액은 초음파파쇄(Branson Sonifier 450)에 의해 용해되었다. 13000×g에서 45분 동안 원심분리에 의해 세포 용해물(상청액)이 획득되었다.

실시예 3: T. 펜덴스(T. pendens) 로부터 뉴클레오시드 2- 데옥시리보실전달효소 상동부분 효소의 클로닝 및 발현 .

대장균( Escherichia coli ) NDT의 구축 및 형질변환

클로닝

서열 (서열 번호: 5)은 GenBank (보체 균주)로부터 검색되었고, 이는 터모필룸 펜덴스 ( Thermofilum pendens ) Hrk 5 염색체로부터 유래되었다. Tpen_0017 유전자 좌 (NC_008698, Version: NC_008698.1, Region: 14900…15331)는 터모필룸 펜덴스 ( Thermofilum pendens ) Hrk 5 (DSM 2475) 게놈 DNA로 부터 폴리머 쇄 반응(PCR)에 의해 증폭되었다. 전장의 0017 유전자는 테그 없이 클론되었고, 임의선택적으로 C-His6-테그된 그리고 N-말단 His6-테그된 융합 단백질로 클론되었다.

유전자는 제한효소 부위 NdeI와 EcoRI 또는 NdeI와 XhoI를 이용하여 발현 벡터: pET102/D-TOPO 또는 pET22 b(+)의 폴리링커 영역 안으로 클론되었다.

이용된 프라이머는 5'-말단에서 적절한 변형을 가지도록 기획되었다(서열들 참고):

(서열 번호:7) Tpen_0017_For: 5'-catatgaaggtctacctggcg-3'

(서열 번호:8) Tpen_0017_4Rev: 5'-gaattcttgcatgtcaacgctacc-3'

(서열 번호:9) Tpen_0017_For: 5'-caccatgaaggtctacctggcgg-3'

(서열 번호:10)Tpen_0017_RevI: 5'-tcattgcatgtcaacgctacc-3'

(서열 번호:11) Tpen_0017_ RevII: 5'-ttgcatgtcaacgctacctg-3'

(서열 번호:12) Tpen_0017_Rev: 5'-ctcgagtcattgcatgtcaacg-3'

(서열 번호:13)Tpen_0017_2Rev: 5'-ctcgagttgcatgtcaacgtca-3'

(서열 번호:14) Tpen_0017_3Rev: 5'-gaattctcattgcatgtcaacgtc-3'

(서열 번호:15) Tpen_0017_4Rev: 5'-gaattcttgcatgtcaacgtcacc-3'

(서열 번호:16) Tpen_0017_5Rev: 5'-ggaattccgcttgcatgtcaacgctacc-3'

전방 프라이머는 E. coli 용도에 대한 출발 신호를 조정하도록 기획되었다(GTG에서 ATG로).

Tpen_0017 서열에 대한 대응하는 유전자는 Platinum Taq 효소 (Invitrogen), with 대응하는 전방 및 역 올리고뉴클레오티드 (서열 번호:7 내지 No. 16)와 함께, PCR에 의해 증폭되었다. 증폭된 단편은 pGEM-T Easy에 서브클론되었고, 그 다음 절단되고, 암피실린 저항성 유전자를 나르는 pET22 b(+) 벡터의 폴리링커 영역으로 클론되었다. 클론된 영역은 완벽하게 서열화되었고, 데이터 뱅크 서열과 동일하다는 것이 밝혀졌다. 결찰 산물은 화학적으로 컴피턴트(competent) 대장균(E. coli)TOP 10 세포 (Invitrogen)안으로 형질도입되었다. 양성 플라스미드가 선별되었고, 후속적으로 BL21(DE3) 화학으로 컴피턴트한 세포로 형질전환되었다.

T. 펜덴스(T. pendens)로부터 NDT의 발현 및 정제

상기 재조합 플라스미드를 가지고 있는 대장균(E. coli) 균주는 암피실린(100 μg ml^-1)이 보충된 LB 배지에서 OD₆₀₀ _nm값이 0.5-0.8에 이를 때까지 성장되었다. 37℃에서 4 h 동안 대장균 배양물을 1 mM 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노시드(IPTG)로 유도시킴으로써 상기 단백질이 과다발현되었다. 4℃, 4,000×g에서 20 분간 원심분리에 의해 박테리아 세포가 수확되었다. 1 리터 배양물로부터 수집된 세포의 경우 20 ml의 인산염 완충된 염수 (PBS 완충액)에 수확된 세포들은 재현택되었다. 상기 세포 현탁액은 초음파파쇄(Branson Sonifier 450)에 의해 용해되었다. 13000×g에서 20분 동안 원심분리에 의해 세포 용해물(상청액)이 획득되었다. 추출물(상청액)은 -80 ℃에 보관되었다.

실시예 4: N - 데옥시리보실전달효소 분석

상기 활성 분석은 40℃, 50 mM MES (몰포린에탄술폰산) 완충액 (pH 6.5)에서 실행되었다. 이들 조건하에서, 10 mM 아데닌과 10 mM 2'-데옥시우리딘의 용액은 10분간 항온처리되었다. 그 다음, 상기 효소 (2.04 μg의 정제된 효소 또는 30 μl의 세포 추출물)는 최대 240 μl의 최종 용적으로 추가되었으며, 상기 반응은 5분간 진행되도록 두었다. 얼음조 안에서 240 μL의 차가운 MeOH를 추가함으로써 상기 반응은 중단되었고, 95℃에서 5분간 더 가열되었다. 시료는 2분 동안 9700 rpm에서 원심분리되었고, 상청액은 물을 이용하여 ½로 희석되었다. 희석된 분취액은 0.45 μm 친수성 필터를 통하여 여과되었고, 그 다음 10KDa 한외여과막(Ultrafiltration membrane)을 통하여 여과되었다.

상기 시료는 40℃에서 MeOH/H₂O 구배 용해 조건, 유속 1 ml/min에서 Tracer Excel C18 (Teknokroma, 5 μm, 25 x 0.46 cm)로 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 분석되었다. 탐지는 최소한 254 nm에서 실행되었다.

정량화는 동일한 조건하에서 용리된 2'-데옥시아데노신의 표준 용액에 따라 방출된 염기에서 산출을 통하여 실행되었다. 효소 활성은 다음과 같이 표현된다:

(1) 특이 활성 (Sp act), 단위·mg 단백질^-1(μmoles의 2'-데옥시아데노신·min^-1·mg^-1)

(2) 효소 활성, 단위·ml^-1(μmoles의 2'-데옥시아데노신·min^-1·ml^-1)

이때 1 단위의 효소 활성은 본 명세서에서 설명된 표준 조건하에 분당 1 μmol의 산물을 생산하는데 요구되는 효소의 양으로 정의된다.

실시예 5: 4.5 U/ μmol _araF 에서 NDT 효소를 이용하여 수성 매체에서 클로파라빈 생산

pH 6.5 (42 ml)의 수성 완충액 안에 20 mM 2-클로로아데닌 (0.142 g, 0.84 mmol) 및 20 mM 2'-플루오르-아라비노퓨라노실-2'-데옥시우리딘 (araF) (0.206 g, 0.84 mmol)의 현탁액은 50℃에서 30분 동안 항온조절되었다. 그 다음, NDT 효소 (서열 번호: 2)가 한방울씩 추가되었고(4.5 U/μmol_araF _,0.422 mg/ml), 그리고 상기 반응물은 동일한 조건에서 최소 10일간 50℃에서 교반되었다. 그 다음 상기 현탁액은 핫(hot) 필터되었고, 고체는 세척되고 건조되었다. 상기 수성 여과물은 부분적으로 농축되었고, 냉각되고, 그리고 여과되었다. 회수된 고체는 염기 pH 조건 및 농도에서 부분적으로 침전되도록 방치되었다. 일단 여과되고, 세척된 후, 상기 고체는 적절한 용매, 이를 테면 극성 양성자성 또는 극성 비양성자성 용매와 물 또는 적합한 비극성 용매와 복합되어 임의선택적으로 결정되거나 또는 재결정될 수 있다.

실시예 6: 1.78 U/ μmol _araF 에서 NDT 효소를 이용하여 수성 매체에서 클로파라빈 생산

pH 6.5 (42 ml)의 수성 완충액 안에 50 mM 2-클로로아데닌 (0.356 g, 2.1 mmol) 및 50 mM 2'-플루오르-아라비노퓨라노실-2'-데옥시우리딘 (araF) (0.517 g, 2.1 mmol)의 현택액은 30분간 50℃에서 항온처리되었다. 그 다음, NDT 효소 (서열 번호: 2)가 한방울씩 추가되었고(1.78 U/μmol_araF _,0.422 mg/ml), 그리고 상기 반응물은 동일한 조건에서 최소 10일간 50℃에서 교반되었다. 그 다음 상기 현탁액은 핫(hot) 필터되었고, 고체는 세척되고 건조되었다. 상기 수성 여과물은 부분적으로 농축되었고, 냉각되고, 그리고 여과되었다. 회수된 고체는 염기 pH 조건 및 농도에서 부분적으로 침전되도록 방치되었다. 일단 여과되고, 세척된 후, 상기 고체는 적절한 용매, 이를 테면 극성 양성자성 또는 극성 비양성자성 용매와 물 또는 적합한 비극성 용매와 복합되어 임의선택적으로 결정되거나 또는 재결정될 수 있다.

실시예 8: 0.9 U/ μmol _araF 에서 NDT 효소를 이용하여 유기 용매를 포함하는 수성 완충액에서 클로파라빈 생산

pH 6.5 (42 ml)의 수성 완충액과 5% THF (반응 용적 3 ml)의 혼합물 안에 20 mM 2-클로로아데닌 (10.3 mg, 0.06 mmol) 및 20 mM 2'-플루오르-아라비노퓨라노실-2'-데옥시우리딘 (araF) (14.8 mg, 0.06 mmol)의 현탁액은 50℃에서 30분간 항온처리되었다. 그 다음, NDT 효소 (서열 번호: 2)가 한방울씩 추가되었고(0.9 U/μmol_araF,0.088 mg/ml), 그리고 상기 반응물은 동일한 조건에서 최소 5일간 50℃에서 교반되었다. 그 다음 상기 현탁액은 핫(hot) 필터되었고, 고체는 세척되고 건조되었다. 상기 수성 여과물은 부분적으로 농축되었고, 냉각되고, 그리고 여과되었다. 회수된 고체는 염기 pH 조건 및 농도에서 부분적으로 침전되도록 방치되었다. 일단 여과되고, 세척된 후, 상기 고체는 적절한 용매, 이를 테면 극성 양성자성 또는 극성 비양성자성 용매와 물 또는 적합한 비극성 용매와 복합되어 임의선택적으로 결정되거나 또는 재결정될 수 있다.

실시예 9. 0.9 U/ μmol _araF 에서 NDT 효소를 이용하여 수성 매체에서 클로파라빈 생산

pH 6.5 (42 ml)의 수성 완충액 안에 100 mM 2-클로로아데닌 (0.712 g, 4.2 mmol) 및 100 mM 2'-플루오르-아라비노퓨라노실-2'-데옥시우리딘 (araF) (1.034 g, 4.2 mmol)의 현택액은 50℃에서 30분 동안 항온처리되었다. 그 다음, NDT 효소 (서열 번호: 2)가 한방울씩 추가되었고(0.9 U/μmol_araF _,0.088 mg/ml), 그리고 상기 반응물은 동일한 조건에서 최소 5일간 50℃에서 교반되었다. 그 다음 상기 현탁액은 핫(hot) 필터되었고, 고체는 세척되고 건조되었다. 상기 수성 여과물은 부분적으로 농축되었고, 냉각되고, 그리고 여과되었다. 회수된 고체는 염기 pH 조건 및 농도에서 부분적으로 침전되도록 방치되었다. 일단 여과되고, 세척된 후, 상기 고체는 적절한 용매, 이를 테면 극성 양성자성 또는 극성 비양성자성 용매와 물 또는 적합한 비극성 용매와 복합되어 임의선택적으로 결정되거나 또는 재결정될 수 있다.

실시예 10: 12 .8 U/ μmol _araF 에서 NDT 효소를 이용하여 클로파라빈 생산

pH 6.5 (2L)의 수성 완충액 안에 10 mM 2-클로로아데닌 (3.47 g, 20.1 mmol) 및 10 mM 2'-플루오르-아라비노퓨라노실-2'-데옥시우리딘 (araF) (5.0 g, 20.1 mmol)의 현탁액은 50℃에서 30분 동안 항온처리되었다. 그 다음, NDT 효소 (서열 번호: 2)가 한방울씩 추가되었고(12.8 U/μmol_araF, 0.642 mg/ml), 그리고 상기 반응물은 동일한 조건에서 최소 10일간 50℃에서 교반되었다. 그 다음 상기 현탁액은 핫(hot) 필터되었고, 고체는 세척되고 건조되었다. 상기 수성 여과물은 부분적으로 농축되었고, 냉각되고, 그리고 여과되었다. 회수된 고체는 부분적으로 침전되고, 농축되도록 두었다. 일단 여과되고, 세척된 후, 상기 고체는 적절한 용매, 이를 테면 극성 양성자성 또는 극성 비양성자성 용매와 물 또는 적합한 비극성 용매와 복합되어 임의선택적으로 결정되거나 또는 재결정되었다.

실시예 11: 1.2 U/ μmol _araF 에서 NDT 효소를 이용하여 클로파라빈 생산

pH 6.5 (0.35L)의 수성 완충액 안에 50 mM 2-클로로아데닌 (3.03 g, 17.9 mmol) 및 50 mM 2'-플루오르-아라비노퓨라노실-2'-데옥시우리딘 (araF) (4.4 g, 17.9 mmol)의 현탁액은 50℃에서 30분 동안 항온처리되었다. 그 다음, NDT 효소 (서열 번호: 2)가 한방울씩 추가되었고(1.2 U/μmol_araF, 0.37 mg/ml), 그리고 상기 반응물은 동일한 조건에서 최소 4일간 50℃에서 교반되었다. 그 다음 상기 현탁액은 핫(hot) 필터되었고, 고체는 세척되고 건조되었다. 상기 수성 여과물은 부분적으로 농축되었고, 냉각되고, 그리고 여과되었다. 회수된 고체는 부분적으로 침전되고, 농축되도록 두었다. 일단 여과되고, 세척된 후, 상기 고체는 적절한 용매, 이를 테면 극성 양성자성 또는 극성 비양성자성 용매와 물 또는 적합한 비극성 용매와 복합되어 임의선택적으로 결정되거나 또는 재결정되었다.

실시예 12: 9 U/ μmol _araF 에서 NDT 효소를 이용하여 클로파라빈 생산

pH 6.5 (42 ml)의 수성 완충액 안에 10 mM 2-클로로아데닌 (0.06 g, 0.35 mmol) 및 10 mM 2'-플루오르-아라비노퓨라노실-2'-데옥시우리딘 (araF) (0.09 g, 0.35 mmol)의 현탁액은 30분간 50℃에서 항온처리되었다. 그 다음, NDT 효소 (서열 번호: 2)가 한방울씩 추가되었고(9U/μmol_araF), 그리고 상기 반응물은 동일한 조건에서 최소 1일간 50℃에서 교반되었다. 그 다음 상기 현탁액은 핫(hot) 필터되었고, 고체는 세척되고 건조되었다. 상기 수성 여과물은 부분적으로 농축되었고, 냉각되고, 그리고 여과되었다. 회수된 고체는 부분적으로 침전되고, 농축되도록 두었다. 일단 여과되고, 세척된 후, 상기 고체는 적절한 용매, 이를 테면 극성 양성자성 또는 극성 비양성자성 용매와 물 또는 적합한 비극성 용매와 복합되어 임의선택적으로 결정되거나 또는 재결정되었다.

실시예 13: 1.1U / μmol _araF 에서 NDT 효소를 이용하여 클로파라빈 생산

암모늄 함유 수성 Tris-HCl 완충액 안에서 5 mM 2-클로로아데닌 및 5 mM 2'-플루오르-아라비노퓨라노실-2'-데옥시우리딘 (araF)의 현탁액은 25분간 25℃에서 항온처리되었다. 그 다음, NDT 효소 (서열 번호: 4)가 한방울씩 추가되었고(1.1 U/μmol_araF), 그리고 상기 반응물은 동일한 조건에서 최소 4일간 25℃에서 교반되었다. 그 다음 상기 현탁액은 핫(hot) 필터되었고, 고체는 세척되고 건조되었다. 상기 수성 여과물은 부분적으로 농축되었고, 냉각되고, 그리고 여과되었다. 회수된 고체는 부분적으로 침전되고, 농축되도록 두었다. 일단 여과되고, 세척된 후, 상기 고체는 적절한 용매, 이를 테면 극성 양성자성 또는 극성 비양성자성 용매와 물 또는 적합한 비극성 용매와 복합되어 임의선택적으로 결정되거나 또는 재결정되었다.

실시예 14. 0.06 U/ μmol _araF 에서 NDT 효소를 이용하여 지도부딘 중간생성물의 생산

수성 50 mM MES 완충액 안에서 1 mM 티민 및 1 mM 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 현탁액은 50 ℃에서 20분간 항온처리되었다. 그 다음 NDT 효소 (서열 번호: 2)가 한방울씩 추가되었고(0.06 mg/μmol_염기), 그리고 상기 반응물은 동일한 조건에서 최소 1일간 50℃에서 교반되었다. 그 다음 상기 현탁액은 핫(hot) 필터되었고, 고체는 세척되고 건조되었다. 상기 수성 여과물은 부분적으로 농축되었고, 냉각되고, 그리고 여과되었다. 회수된 고체는 부분적으로 침전되고, 농축되도록 두었다. 일단 여과되고, 세척된 후, 상기 고체는 적절한 용매, 이를 테면 극성 양성자성 또는 극성 비양성자성 용매와 물 또는 적합한 비극성 용매와 복합되어 임의선택적으로 결정되거나 또는 재결정되었다.

실시예 15: 0.14 U/ μmol _araF 에서 NDT 효소와 60 mM 티민을 이용하여 지도부딘 중간생성물의 생산

수성 50 mM MES 완충액 안에서 60 mM 티민 및 60 mM 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 현탁액은 50 ℃에서 20분간 항온처리되었다. 그 다음 NDT 효소 (서열 번호: 2)가 한방울씩 추가되었고(0.14 mg/μmol_염기), 그리고 상기 반응물은 동일한 조건에서 최소 1일간 50℃에서 교반되었다. 그 다음 상기 현탁액은 핫(hot) 필터되었고, 고체는 세척되고 건조되었다. 상기 수성 여과물은 부분적으로 농축되었고, 냉각되고, 그리고 여과되었다. 회수된 고체는 부분적으로 침전되고, 농축되도록 두었다. 일단 여과되고, 세척된 후, 상기 고체는 적절한 용매, 이를 테면 극성 양성자성 또는 극성 비양성자성 용매와 물 또는 적합한 비극성 용매와 복합되어 임의선택적으로 결정되거나 또는 재결정되었다.

실시예 16: 0.07 U/ μmol _araF 에서 NDT 효소를 이용하여 지도부딘 중간생성물의 생산

수성 50 mM MES 완충액 안에서 100 mM 티민 및 100 mM 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 현탁액은 50 ℃에서 20분간 항온처리되었다. 그 다음 NDT 효소 (서열 번호: 2)가 한방울씩 추가되었고(0.07 mg/μmol_염기), 그리고 상기 반응물은 동일한 조건에서 최소 1일간 50℃에서 교반되었다. 그 다음 상기 현탁액은 핫(hot) 필터되었고, 고체는 세척되고 건조되었다. 상기 수성 여과물은 부분적으로 농축되었고, 냉각되고, 그리고 여과되었다. 회수된 고체는 부분적으로 침전되고, 농축되도록 두었다. 일단 여과되고, 세척된 후, 상기 고체는 적절한 용매, 이를 테면 극성 양성자성 또는 극성 비양성자성 용매와 물 또는 적합한 비극성 용매와 복합되어 임의선택적으로 결정되거나 또는 재결정되었다.

실시예 17: 0.14 U/ μmol _araF 에서 NDT 효소와 80 mM 티민을 이용하여 지도부딘 중간생성물의 생산

수성 50 mM MES 완충액 안에서 80 mM 티민 및 80 mM 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 현탁액은 50 ℃에서 20분간 항온처리되었다. 그 다음 NDT 효소 (서열 번호: 2)가 한방울씩 추가되었고(0.14 mg/μmol_염기), 그리고 상기 반응물은 동일한 조건에서 최소 1일간 50℃에서 교반되었다. 그 다음 상기 현탁액은 핫(hot) 필터되었고, 고체는 세척되고 건조되었다. 상기 수성 여과물은 부분적으로 농축되었고, 냉각되고, 그리고 여과되었다. 회수된 고체는 부분적으로 침전되고, 농축되도록 두었다. 일단 여과되고, 세척된 후, 상기 고체는 적절한 용매, 이를 테면 극성 양성자성 또는 극성 비양성자성 용매와 물 또는 적합한 비극성 용매와 복합되어 임의선택적으로 결정되거나 또는 재결정되었다.

실시예 18: 0.085U / μmol _araF 에서 NDT 효소를 이용하여 시타라빈 생산

수성 50 mM MES 완충액 안에서 1 mM 시토신 및 1 mM 1-(B-D-아라비노퓨라노실)우라실의 현탁액은 50℃에서 30분간 항온처리되었다. 그 다음, NDT 효소 (서열 번호: 2)가 한방울씩 추가되었고(0.085 mg/μmol). 그리고 상기 반응물은 동일한 조건에서 최소 1일간 50℃에서 교반되었다 그 다음 상기 현탁액은 핫(hot) 필터되었고, 고체는 세척되고 건조되었다. 상기 수성 여과물은 부분적으로 농축되었고, 냉각되고, 그리고 여과되었다. 회수된 고체는 부분적으로 침전되고, 농축되도록 두었다. 일단 여과되고, 세척된 후, 상기 고체는 적절한 용매, 이를 테면 극성 양성자성 또는 극성 비양성자성 용매와 물 또는 적합한 비극성 용매와 복합되어 임의선택적으로 결정되거나 또는 재결정되었다.

SEQUENCE LISTING <110> Plasmia Biotech, S.L <120> Biocatalytic production of nucleoside analogues as active pharmaceutical ingredients <130> PCT-06815 <160> 20 <170> BiSSAP 1.3 <210> 1 <211> 474 <212> DNA <213> Lactobacillus delbrueckii (formerly called Lactobacillus leichmannii). <400> 1 atgccaaaaa agacgatcta cttcggtgcc ggctggttca ctgaccgcca aaacaaagcc 60 tacaaggaag ccatggaagc cctcaaggaa aacccaacga ttgacctgga aaacagctac 120 gttcccctgg acaaccagta caagggtatc cgggttgatg aacacccgga atacctgcat 180 gacaaggttt gggctacggc cacctacaac aacgacttga acgggatcaa gaccaacgac 240 atcatgctgg gtgtctacat ccctgacgaa gaagacgtcg gcctgggcat ggaactgggt 300 tacgccttga gccaaggcaa gtacgtcctt ttggtcatcc cggacgaaga ctacggcaag 360 ccgatcaacc tcatgagctg gggcgtcagc gacaacgtga tcaagatgag ccagctgaag 420 gacttcaact tcaacaagcc gcgcttcgac ttctacgaag gtgccgtata ctaa 474 <210> 2 <211> 157 <212> PRT <213> Lactobacillus delbrueckii (formerly called Lactobacillus leichmannii). <400> 2 Met Pro Lys Lys Thr Ile Tyr Phe Gly Ala Gly Trp Phe Thr Asp Arg 1 5 10 15 Gln Asn Lys Ala Tyr Lys Glu Ala Met Glu Ala Leu Lys Glu Asn Pro 20 25 30 Thr Ile Asp Leu Glu Asn Ser Tyr Val Pro Leu Asp Asn Gln Tyr Lys 35 40 45 Gly Ile Arg Val Asp Glu His Pro Glu Tyr Leu His Asp Lys Val Trp 50 55 60 Ala Thr Ala Thr Tyr Asn Asn Asp Leu Asn Gly Ile Lys Thr Asn Asp 65 70 75 80 Ile Met Leu Gly Val Tyr Ile Pro Asp Glu Glu Asp Val Gly Leu Gly 85 90 95 Met Glu Leu Gly Tyr Ala Leu Ser Gln Gly Lys Tyr Val Leu Leu Val 100 105 110 Ile Pro Asp Glu Asp Tyr Gly Lys Pro Ile Asn Leu Met Ser Trp Gly 115 120 125 Val Ser Asp Asn Val Ile Lys Met Ser Gln Leu Lys Asp Phe Asn Phe 130 135 140 Asn Lys Pro Arg Phe Asp Phe Tyr Glu Gly Ala Val Tyr 145 150 155 <210> 3 <211> 480 <212> DNA <213> Lactococcus lactis subsp. lactis <400> 3 ttgaacaagt tgtttaatca agcagttaac gtttaccttg ccgcaccatt ttttagtgaa 60 agtcaaataa aaaaagttga acttttagaa aatgcacttt caaaaaataa aacagtagca 120 aactttttta gcccaatgag atgtcaacat cctgaatctt taccacaaga agttgaagct 180 tttacccctg aatgggccaa agcgacaatg gaaaatgatg taaatgaggt aaataaagca 240 gatatcatcg ttgcaattgt tgatttcgat catcaagata ctgattctgg aacagcttgg 300 gagcttggct acgccatcgc tttagaaaaa ccaacctatc ttattcgttt tgaagatact 360 attccagcaa atataatgct cactgagcga aatagagctt tcttcaccca gattgaacaa 420 gttgaagaat atgatttttt agagtctaaa ctaatcccat atagtggaaa ataccagtag 480 <210> 4 <211> 159 <212> PRT <213> Lactococcus lactis subsp. lactis <400> 4 Met Asn Lys Leu Phe Asn Gln Ala Val Asn Val Tyr Leu Ala Ala Pro 1 5 10 15 Phe Phe Ser Glu Ser Gln Ile Lys Lys Val Glu Leu Leu Glu Asn Ala 20 25 30 Leu Ser Lys Asn Lys Thr Val Ala Asn Phe Phe Ser Pro Met Arg Cys 35 40 45 Gln His Pro Glu Ser Leu Pro Gln Glu Val Glu Ala Phe Thr Pro Glu 50 55 60 Trp Ala Lys Ala Thr Met Glu Asn Asp Val Asn Glu Val Asn Lys Ala 65 70 75 80 Asp Ile Ile Val Ala Ile Val Asp Phe Asp His Gln Asp Thr Asp Ser 85 90 95 Gly Thr Ala Trp Glu Leu Gly Tyr Ala Ile Ala Leu Glu Lys Pro Thr 100 105 110 Tyr Leu Ile Arg Phe Glu Asp Thr Ile Pro Ala Asn Ile Met Leu Thr 115 120 125 Glu Arg Asn Arg Ala Phe Phe Thr Gln Ile Glu Gln Val Glu Glu Tyr 130 135 140 Asp Phe Leu Glu Ser Lys Leu Ile Pro Tyr Ser Gly Lys Tyr Gln 145 150 155 <210> 5 <211> 432 <212> DNA <213> Thermofilum pendens Hrk 5 <400> 5 gtgaaggtct acctggcggc tccgatgagg ggtgaccgta gcgcgctggc aaacgtgaag 60 aagctgttgc aagccctgga ggagaggggg tacgtcgtgt tgacgaagca cgtagcggac 120 gacgtgctcg acgtggagaa gggtatgacg cctagagagg tcttcgagag ggatataagg 180 ttgctggaag aggcggacgt cctggtggcg gaggtatcgt acccgagcct cggcgtgggc 240 ttcgagatag cgtactttct gctgaggggg aagccggtga tagccctggc cttgcgcgag 300 aggctggaat cggtatccgc gatgataagg ggtataacgt gggagaactt caggctggta 360 gcctactcgg acgtcgacga ggcaatagaa aaattagaca gcatgttgcc aggtagcgtt 420 gacatgcaat ga 432 <210> 6 <211> 143 <212> PRT <213> Thermofilum pendens Hrk 5 <400> 6 Met Lys Val Tyr Leu Ala Ala Pro Met Arg Gly Asp Arg Ser Ala Leu 1 5 10 15 Ala Asn Val Lys Lys Leu Leu Gln Ala Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val 20 25 30 Val Leu Thr Lys His Val Ala Asp Asp Val Leu Asp Val Glu Lys Gly 35 40 45 Met Thr Pro Arg Glu Val Phe Glu Arg Asp Ile Arg Leu Leu Glu Glu 50 55 60 Ala Asp Val Leu Val Ala Glu Val Ser Tyr Pro Ser Leu Gly Val Gly 65 70 75 80 Phe Glu Ile Ala Tyr Phe Leu Leu Arg Gly Lys Pro Val Ile Ala Leu 85 90 95 Ala Leu Arg Glu Arg Leu Glu Ser Val Ser Ala Met Ile Arg Gly Ile 100 105 110 Thr Trp Glu Asn Phe Arg Leu Val Ala Tyr Ser Asp Val Asp Glu Ala 115 120 125 Ile Glu Lys Leu Asp Ser Met Leu Pro Gly Ser Val Asp Met Gln 130 135 140 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 7 catatgaagg tctacctggc g 21 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 8 gaattcttgc atgtcaacgc tacc 24 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 9 caccatgaag gtctacctgg cgg 23 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 10 tcattgcatg tcaacgctac c 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 11 ttgcatgtca acgctacctg 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 12 ctcgagtcat tgcatgtcaa cg 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 13 ctcgagttgc atgtcaacgt ca 22 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 14 gaattctcat tgcatgtcaa cgtc 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 15 gaattcttgc atgtcaacgt cacc 24 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 16 ggaattccgc ttgcatgtca acgctacc 28 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 17 gccatatgaa caagttgttt aatcaag 27 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 18 gcgaattcta ctggtatttt ccactata 28 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 19 catatgccaa aaaagacgat ctacttc 27 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 20 gtcgacttag tatacggcac c 21

Claims

화학식 I의 APIs 또는 이들의 중간생성물, 뉴클레오시드 유사체들 (NAs), D 이성체들인, 약제학적 활성 성분들 (APIs) 또는 이의 중간생성물을 생산하기 위한 생물촉매적 과정에 있어서,

이때,
Z₁은 O, CH₂, S, NH이며;
Z₂(R^S2)(R^S5)은 Z₁과 독립적으로 O, C(R^S2)(R^S5), S(R^S2)(R^S5), S(R^S2), S(R^S5), SO, SO₂, N(R^S2)(R^S5), N(R^S2), N(R^S5)이며;
R^S1은 수소, 메틸, OH, 다음에서 선택된 이의 에테르 또는 에스테르이며:

n은 0 또는 1이며, 그리고 M은 수소 또는 약제학적으로 수용가능한 반대-이온, 이를 테면 나트륨, 칼륨, 암모늄 또는 알킬암모늄이며;
R^S2는 수소, 할로겐, 바람직하게는 F, OH 또는 이의 에테르 또는 에스테르 잔기, CN, NH₂, SH, C≡CH, N₃이며;
R^S3은 데옥시리보뉴클레오시드로부터 유도된 NA의 경우 수소이거나 또는 NA가 리보뉴클레오시드로부터 유도된 경우 다음에서 선택되며: OH, NH₂, 할로겐 (바람직하게는 F), OCH₃;
R^S4는 수소, OH 또는 이의 에테르 또는 에스테르 잔기, NH₂ 또는 할로겐, 바람직하게는 F이며,
R^S1 및 R^S4가 둘다 OH의 에테르 또는 에스테르인 경우 이들은 상이하며;
R^S5는 수소, OH 또는 이의 에테르 또는 에스테르 잔기, NH₂ 또는 할로겐, 바람직하게는 F이며;
리보스 모이어티에 결합된 염기는 식 A-H 또는 이들의 호변체 및 구조이성체에서 선택되며:

이때,
R¹은 수소, 메틸, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄, 할로겐, OR¹³, NR¹³R¹⁴, SR¹³이며;
R²는 수소, 메틸, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄, 할로겐, OR¹³, NR¹³R¹⁴, SR¹³이며;
R³은 수소, 메틸, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄, 할로겐, OR¹³, NR¹³R¹⁴, SR¹³이며;
R⁴는 수소, 메틸, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄, COR¹³, CONR¹³R¹⁴, CO₂R¹³, C(S)OR¹³, CH₂-헤테로시클릭 링이며;
R⁵는 수소, 메틸, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄, 임의선택적으로 치환된 알케닐 쇄, 임의선택적으로 치환된 알키닐 쇄, 할로겐, 트리할로알킬, OR¹³, NR¹³R¹⁴, CN, COR¹³, CONR¹³R¹⁴, CO₂R¹³, C(S)OR¹³, OCONR¹³R¹⁴, OCO₂R¹³, OC(S)OR¹³, NHCONR¹³R¹⁴, NHCO₂R¹³, NHC(S)OR¹³, SO₂NR¹³R¹⁴이며;
그리고 다음에서 선택된 독립적으로 R¹, R², R³, R⁴ 또는 R⁵의 임의의 임의선택적으로 치환된 헤테로사이클 또는 임의선택적으로 치환된 아릴:

이때
X는 O, S, N-R^B2, Se이며; R^B1은 H, 직쇄 또는 분기된 C₁ _-10 알킬, F, Cl, Br, I, X-R^B2, -C≡C-R^B2, CO₂R^B2이며; R^B2는 H, 직쇄 또는 분기된 C₁ _-5 알킬, 페닐이며;
R⁶은 수소, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄이며;
R⁷은 수소, 할로겐, 트리할로알킬, OR¹³, NR¹³R¹⁴, CN, COR¹³, CONR¹³R¹⁴, CO₂R¹³, C(S)OR¹³이며;
R⁸은 히드록실 또는 아미노, OR¹³, OSO₂R¹³, NR¹³R¹⁴, CN, COR¹³, CONR¹³R¹⁴, CO₂R¹³, C(S)OR¹³이며;
R⁹는 수소, 메틸, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄, 할로겐, OR¹³, NR¹³R¹⁴, COR¹³, CONR¹³R¹⁴, CN, CO₂R¹³, C(S)OR¹³, OCONR¹³R¹⁴, OCO₂R¹³, OC(S)OR¹³, NHCONR¹³R¹⁴, NHCO₂R¹³, NHC(S)OR¹³이며;
R¹⁰ 및 R¹¹은 서로 독립적으로 수소, 메틸, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄이며;
R¹²은 수소, 메틸, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄, 할로겐, OR¹³, NR¹³R¹⁴, CN, COR¹³, CONR¹³R¹⁴, CO₂R¹³, C(S)OR¹³, OCONR¹³R¹⁴, OCO₂R¹³, OC(S)OR¹³, NHCONR¹³R¹⁴, NHCO₂R¹³, NHC(S)OR¹³이며;
R¹³ 및 R¹⁴는 서로 독립적으로 수소, 치환된 또는 치환안된 알킬 쇄, 치환된 또는 치환안된 알케닐 쇄, 치환된 또는 치환안된 알키닐 쇄, 치환된 또는 치환안된 페닐 링, 치환된 또는 치환안된 헤테로시클릭 링이며;
상기 공정은 바람직하게는 한-단계/원-팟 반응으로 실행되며, 이때 전술한 반응은 적합한 반응 수성 매체에서, 그리고 적합한 반응 조건하에 뉴클레오시드 데옥시리보실전달효소 (NDT) 활성을 보유한 효소가 구조식 II의 최소한 하나의 뉴클레오시드, D 이성질체가 포함된 출발 물질 혼합물에 추가되는 것이 포함하는 공정.

이때,
Z₁은 O, CH₂, S, NH이며;
Z₂(R^S2)(R^S5)는 Z₁과 독립적으로 O, C(R^S2)(R^S5), S(R^S2)(R^S5), S(R^S2), S(R^S5), SO, SO₂, N(R^S2)(R^S5), N(R^S2), N(R^S5)이며;
R^S1은 수소, 메틸, OH, 다음에서 선택된 이의 에테르 또는 에스테르이며:

n은 0 또는 1이며, 그리고 M은 수소 또는 약제학적으로 수용가능한 반대-이온, 이를 테면 나트륨, 칼륨, 암모늄 또는 알킬암모늄이며;
R^S2는 수소, 할로겐, 바람직하게는 F, OH 또는 이의 에테르 또는 에스테르 잔기, CN, NH₂, SH, C≡CH,N₃이며;
R^S3은 데옥시리보뉴클레오시드로부터 유도된 NA의 경우 수소이거나 또는 NA가 리보뉴클로에시드로부터 유도된 경우 다음에서 선택되며: OH, NH₂, 할로겐 (바람직하게는 F), OCH₃;
R^S4는 수소, OH 또는 이의 에테르 또는 에스테르 잔기, NH₂ 또는 할로겐, 바람직하게는 F이며,
R^S1 및 R^S4가 둘다 OH 잔기의 에테르 또는 에스테르인 경우 이들은 상이하며;
R^S5는 수소, OH 또는 이의 에테르 또는 에스테르 잔기, NH₂ 또는 할로겐, 바람직하게는 F이며;
리보스 모이어티에 결합된 염기는 임의의 헤테로시클릭 링으로부터 선택되며;
그리고 NDT 활성을 보유한 효소에 의해 전달되는 최소한 하나의 자유 핵염기는 A´-H´ 또는 이들의 호변체 및 이의 구조이성질체로부터 선택되며:

이때,
R¹은 수소, 메틸, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄, 할로겐, OR¹³, NR¹³R¹⁴, SR¹³이며;
R²는 수소, 메틸, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄, 할로겐, OR¹³, NR¹³R¹⁴, SR¹³이며;
R³은 수소, 메틸, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄, 할로겐, OR¹³, NR¹³R¹⁴, SR¹³이며;
R⁴는 수소, 메틸, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄, COR¹³, CONR¹³R¹⁴, CO₂R¹³, C(S)OR¹³, CH₂-헤테로시클릭 링이며;
R⁵는 수소, 메틸, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄, 임의선택적으로 치환된 알케닐 쇄, 임의선택적으로 치환된 알키닐 쇄, 할로겐, 트리할로알킬, OR¹³, NR¹³R¹⁴, CN, COR¹³, CONR¹³R¹⁴, CO₂R¹³, C(S)OR¹³, OCONR¹³R¹⁴, OCO₂R¹³, OC(S)OR¹³, NHCONR¹³R¹⁴, NHCO₂R¹³, NHC(S)OR¹³, SO₂NR¹³R¹⁴이며;
그리고 다음에서 선택된 독립적으로 R¹, R², R³, R⁴ 또는 R⁵의 임의의 임의선택적으로 치환된 헤테로사이클 또는 임의선택적으로 치환된 아릴:

이때
X는 O, S, N-R^B2, Se이며; R^B1은 H, 직쇄 또는 분기된 C₁ _-10 알킬, F, Cl, Br, I, X-R^B2, -C≡C-R^B2, CO₂R^B2이며; R^B2는 H, 직쇄 또는 분기된 C₁ _-5 알킬, 페닐이며;
R⁶은 수소, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄이며;
R⁷은 수소, 할로겐, 트리할로알킬, OR¹³, NR¹³R¹⁴, CN, COR¹³, CONR¹³R¹⁴, CO₂R¹³, C(S)OR¹³이며;
R⁸은 히드록실 또는 아미노, OR¹³, OSO₂R¹³, NR¹³R¹⁴, CN, COR¹³, CONR¹³R¹⁴, CO₂R¹³, C(S)OR¹³이며;
R⁹는 수소, 메틸, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄, 할로겐, OR¹³, NR¹³R¹⁴, COR¹³, CONR¹³R¹⁴, CN, CO₂R¹³, C(S)OR¹³, OCONR¹³R¹⁴, OCO₂R¹³, OC(S)OR¹³, NHCONR¹³R¹⁴, NHCO₂R¹³, NHC(S)OR¹³이며;
R¹⁰ 및 R¹¹은 서로 독립적으로 수소, 메틸, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄이며;
R¹²은 수소, 메틸, 임의선택적으로 치환된 알킬 쇄, 할로겐, OR¹³, NR¹³R¹⁴, CN, COR¹³, CONR¹³R¹⁴, CO₂R¹³, C(S)OR¹³, OCONR¹³R¹⁴, OCO₂R¹³, OC(S)OR¹³, NHCONR¹³R¹⁴, NHCO₂R¹³, NHC(S)OR¹³이며;
R¹³ 및 R¹⁴는 서로 독립적으로 수소, 치환된 또는 치환안된 알킬 쇄, 치환된 또는 치환안된 알케닐 쇄, 치환된 또는 치환안된 알키닐 쇄, 치환된 또는 치환안된 페닐 링, 치환된 또는 치환안된 헤테로시클릭 링이다.
청구항 1에 있어서, 이때 NDT 활성을 보유한 효소에 의해 전달되는 최소한 하나의 자유 핵염기는 다음에서 선택되는, 공정:
청구항 1에 있어서 이때 생산된 APIs 또는 이의 중간생성물은 다음에서 선택되는, 공정: 클로파라빈 (Cl-F-araA), 데시타빈 (aza-dCyd), 시타라빈 (ara-C), 비다라빈, 브리부딘(Brivudine), 엔오시타빈 (BH-AC),, 잘시타빈 (ddC), 클라드리빈 (Cl-dAdo), 플루다라빈 (F-araA), 넬에라빈 (MAY), 지도부딘, 플옥시우리딘 (FUDR), β-티미딘, 이독스우리딘 (IdU), 트리플루우리딘 (TFT), 아세두리드(EdU), 리바비린, 디다노신 (ddI) 그리고 펜토스타틴(Pentostatin).
청구항 3에 있어서, 이때 생산된 APIs 또는 이의 중간생성물는 다음에서 선택되는 공정: 클로파라빈(Clofarabine), 시타라빈(Cytarabine), 비다라빈(Vidarabine), 브리부딘(Brivudine), 에노시타빈(Enocitabine), 잘시타빈(Zalcitabine), 클라드리빈(Cladribine), 플루다라빈(Fludarabine), 네레라빈(Nelerabine), 지도부딘(Zidovudine), 플록스우리딘( Floxuridine) 그리고 펜토스타틴(Pentostatin).
청구항 3에 있어서, 이때 생산된 APIs 또는 이의 중간생성물은 클로파라빈, 시타라빈 및 지도부딘에서 선택되는 공정.
청구항 1에 있어서 이때 생산된 APIs 또는 이의 중간생성물은 클로파라빈인 공정.
청구항 1 내지 6중 임의의 항에 있어서, 이때 NDT 활성을 갖는 효소는 락토바실러스 델브루엑키(Lactobacillus delbrueckii )(기존에 락토바실러스 레치마니(Lactobacillus leichmannii))로부터 단리된 NDT인, 공정.
청구항 1 내지 6중 임의의 항에 있어서 이때 NDT 활성을 갖는 효소는 락토코 커스 락티스(Lactococcus lactis)로부터 단리된 NDT인, 공정.
청구항 7에 있어서 이때 상기 NDT는 다음으로부터 단리되는 공정:
a) 서열 번호: 1에 나타낸 락토바실러스 델브루엑키 (Lactobacillus delbrueckii)(기존에 락토바실러스 레치마니 (Lactobacillus leichmannii )) 뉴클레오티드 서열; 또는
b) 서열 번호: 1의 보체가 되는 뉴클레오티드 서열; 또는
c) 서열 번호: 1의 축중인 뉴크렐오티드 서열; 또는
d) 높은 엄격성 조건하에 서열 번호:1, 서열 번호:1의 보체, 또는 서열 번호:1, 또는 이들의 보체로부터 유도된 혼성화 프로브에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열; 또는
e) 서열 번호: 1에 최소한 80% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 또는
f) 서열 번호: 1에 최소한 65% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 이때 전술한 서열은 바람직하게는 최소한 NDT 효소를 인코드하는 서열을 인코드하거나 또는 이의 기능적 부분에 보체다.
g) NDT 활성을 보유한 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열, 이때 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호: 2에 나타낸 아미노산 서열에 최소한 80% 동일하다.
청구항 8에 있어서 이때 상기 NDT는 다음으로부터 단리되는 공정:
a) 서열 번호: 3에 나타낸 락토코커스 락티스 ( Lactococcus lactis ) 뉴클레오티드 서열 또는
b) 서열 번호: 3의 보체가 되는 뉴클레오티드 서열; 또는
c) 서열 번호: 3의 축중인 뉴크렐오티드 서열; 또는
d) 높은 엄격성 조건하에 서열 번호:3, 서열 번호:3의 보체, 또는 서열 번호:3, 또는 이들의 보체로부터 유도된 혼성화 프로브에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열; 또는
e) 서열 번호: 3에 최소한 80% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 또는
f) 서열 번호: 3에 최소한 65% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 이때 전술한 서열은 바람직하게는 최소한 NDT 효소를 인코드하는 서열을 인코드하거나 또는 이의 기능적 부분에 보체이며;
g) NDT 활성을 보유한 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열, 이때 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호: 4에 나타낸 아미노산 서열에 최소한 80% 동일하다.
청구항 1 내지 10중 임의의 공정에 따른 APIs 또는 이의 중간생성물의 생산에서 뉴클레오시드 데옥시리보실전달효소 활성을 갖는 재조합 효소의 용도에 있어서, APIs 또는 이들의 중간생성물, 뉴클레오시드 유사체들 (NAs)는 항암 또는 항-바이러스성 약물에 특히 유용하며, 이때 전술한 재조합 효소는 다음에서 선택된 서열이 포함된 핵산 서열에 의해 인코드되는 것을 특징으로 하는 용도: 서열 번호:1 또는 서열 번호:3;
a) 서열 번호:1 또는 서열 번호:3의 보체인 뉴클레오티드 서열; 또는
b) 서열 번호:1, 또는 서열 번호:3의 축중(degenerate)인 뉴클레오티드 서열; 또는
c) 높은 엄격성 조건하에 서열 번호:1, 또는 서열 번호:3에 혼성화되는, 서열 번호:1, 또는 서열 번호:3에 보체에 혼성화되는, 또는 서열 번호:1 또는 서열 번호:3, 또는 이들의 보체로부터 유도된 혼성화 프로브에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열; 또는
d) 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 3에 최소한 80% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 또는
e) 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 3에 최소한 65% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 이때 전술한 서열은 바람직하게는 최소한 NDT 효소를 인코드하는 서열을 인코드하거나 또는 이의 기능적 부분에 보체이며;
f) 서열 번호:2 또는 서열 번호:4에서 선택된 아미노산 서열을 인코드하는 뉴클레오티드 서열.
적합한 숙주 안에서 전술한 데옥시리보실전달효소의 발현 또는 과다발현을 지시하는 하나 또는 그 이상의 조절 서열에 작용가능하도록 연계된 천연 또는 재조합 뉴클레오시드 데옥시리보실전달효소 (NDT)를 인코드하는 서열이 포함된 재조합 발현 벡터에 있어서, 이때 전술한 재조합 발현 벡터는 다음에서 선택된 핵산 서열을 운반하고, 발현 또는 과다발현시키는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터: 서열 번호:1 또는 서열 번호:3;
a) 서열 번호:1 또는 서열 번호:3의 보체인 뉴클레오티드 서열; 또는
b) 서열 번호:1, 또는 서열 번호:3의 축중(degenerate)인 뉴클레오티드 서열; 또는
c) 높은 엄격성 조건하에 서열 번호:1, 또는 서열 번호:3에 혼성화되는, 서열 번호:1, 또는 서열 번호:3에 보체에 혼성화되는, 또는 서열 번호:1 또는 서열 번호:3, 또는 이들의 보체로부터 유도된 혼성화 프로브에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열; 또는
d) 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 3에 최소한 80% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 또는
e) 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 3에 최소한 65% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 이때 전술한 서열은 바람직하게는 최소한 NDT 효소를 인코드하는 서열을 인코드하거나 또는 이의 기능적 부분에 보체이며;
f) 서열 번호:2 또는 서열 번호:4에서 선택된 아미노산 서열을 인코드하는 뉴클레오티드 서열.
청구항 12에 있어서, 항암 또는 항-바이러스성 약물로써 특히 유용한 APIs 또는 이들의 중간생성물, 뉴클레오시드 유사체들 (NAs)인, 약제학적 활성 성분들 (APIs) 또는 이의 중간생성물의 생산을 위한 재조합 발현 벡터의 용도.
청구항 12의 제조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
NDT 활성을 보유한 재조합 효소의 생산에 청구항 14에 따른 숙주 세포의 용도.