ES2249293T3

ES2249293T3 - Secuencias de nucleotidos para el gen tal.

Info

Publication number: ES2249293T3
Application number: ES00956165T
Authority: ES
Inventors: L. K. Dunican; Ashling Mccormack; Cliona Stapelton; Kevin Burke; Bettina Mockel
Original assignee: Degussa GmbH; National University of Ireland
Current assignee: Evonik Operations GmbH; National University of Ireland
Priority date: 1999-07-09
Filing date: 2000-07-05
Publication date: 2006-04-01
Anticipated expiration: 2020-07-05
Also published as: DE60022612D1; WO2001004325A1; KR20010086395A; PL346500A1; DE60022612T2; ES2249293T5; US6797509B1; PL202843B1; ID29968A; KR100731524B1; US7901913B2; DE60022612T3; EP1109915A1; JP2003504066A; US20110117611A1; AU768599B2; US20040214219A1; CA2348448A1; BRPI0006915B8; SK3022001A3

Abstract

Un polinucleótido de la bacteria coryneform que codifica un polipéptido que tiene la actividad enzimática de una transaldolasa, dicho polinucleótido siendo seleccionado de entre: (a) el polinucleótido, que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de amino ácidos que es idéntica en una extensión de al menos el 90% a la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO. 2, (b) el polinucleótido que es complementario al polinucleótido de (a).

Description

Secuencias de nucleótidos para el gen TAL.

La invención proporciona secuencias de nucleótidos que codifican para el gen tal y un proceso para la preparación fermentativa de amino ácidos, en particular L-lisina, L-treonina, L-isoleucina y L-triptofano, usando bacterias coryneform en las cuales el gen tal es amplificado.

Arte anterior

Los amino ácidos, en particular la L-lisina, son usados en la medicina humana y en la industria farmacéutica, pero en particular en la nutrición animal.

Es conocido que los amino ácidos son preparados por fermentación a partir de cepas de bacterias coryneform, en particular la Corynebacterium glutamicum. Debido a su gran importancia, el trabajo es constantemente retomado para mejorar el proceso de preparación. Las mejoras al proceso pueden relacionarse con las medidas de fermentación, tales como por ejemplo la agitación y el suministro de oxígeno, o la composición del medio nutriente, tal como por ejemplo la concentración de azúcar durante la fermentación, o el trabajo hasta la conformación del producto por ejemplo por cromatografía de intercambio iónico, o las propiedades de rendimiento intrínsecas del propio microorganismo.

Métodos de mutagénesis, selección y selección de mutante son usados para mejorar las propiedades de rendimiento de estos microorganismos. Las cepas que son resistentes a los antimetabolitos, tales como por ejemplo, el análogo a la lisina S-(2-aminoetil)-cisteína, o que son auxotróficas para los metabolitos de importancia regulatoria y producen L-amino ácidos, tales como por ejemplo L-lisina, son obtenidas de esta forma.

Los métodos de la técnica de ADN recombinante han sido también empleados durante algunos años para mejorar la clase de las cepas Corynebacterium que producen amino ácidos, amplificando los genes de biosíntesis de amino ácidos individuales e investigando el efecto sobre la producción de amino ácidos.

Artículos para revisión en este contexto son encontrados, entre otros, en Kinoshita ("Bacteria de ácido glutámico", en Biology of Industrial Microorganisms, Demain y Solomon (Eds.), Benjamín Cummings, London, UK, 1985, 115-142), Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), Eggeling (Amino Acids 6:261-272 (1994)), Jetten y Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995)) y Sahm y otros (Annuals of the New York Academy of Sciece 782, 25-39 (1996)).

La importancia del ciclo de la fosfato pentosa para la biosíntesis y la producción de amino ácidos, en particular la L-lisina, por la bacteria coryneform es el tema de numerosos esfuerzos entre los expertos.

Así Oishi y Aida (Agricultural and Biological Chemistry 29, 83-89 (1965)) reportan sobre la "derivación de la hexosa monofosfato" de la Brevibacterium ammoniagenes. Sugimoto y Shio (Agricultural and Biological Chemistry 51, 101-108 (1987)) reportan sobre la regulación de la glucosa 6-fosfato dehidrogenasa en la Brevibacterium flavum.

Objeto de la invención

Los inventores tuvieron el objetivo de proporcionar nuevas medidas para mejorar la preparación fermentativa de amino ácidos, en particular la L-lisina, L-treonina, L-isoleucina y L-triptofano.

Descripción de la invención

Los amino ácidos, en particular la L-lisina, son usados en medicina humana, en la industria farmacéutica y en particular en la nutrición animal. Por lo tanto existe un interés general en proporcionar nuevos procesos mejorados para la preparación de amino ácidos, en particular la L-lisina.

Cuando la L-lisina o lisina son mencionados en lo adelante, no sólo la base sino también las sales, tales como por ejemplo el monohidrocloruro de lisina o el sulfato de lisina, son también incluidos.

La invención proporciona:

1): Un polinucleótido a partir de la bacteria coryneform que codifica un polipéptido que tiene la actividad enzimática de una transaldolasa, dicho polinucleótido siendo seleccionado de entre:

(a): el polinucleótido, el cual codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de amino ácido que es idéntica en una extensión de al menos el 90% a la secuencia de amino ácido de SEQ ID NO. 2,

(b): el polinucléotico el cual es complementario al polinucleótido de (a).

2): El polinucleótido de acuerdo a 1), donde dicho polinucleótido es idéntico en una extensión de al menos el 95% a la secuencia de amino ácido de SEQ ID NO: 2.

3): Un polinucleótido de acuerdo a cualquiera de las secuencias de nucleótidos 1) o 2) como la mostrada en SEQ ID NO: 3.

4): Un polinucleótido de acuerdo a cualquiera de 1) a 3), donde el polinucléotido es un ARN.

5): Un polinucleótido de acuerdo a cualquiera de 1) a 4) el cual codifica para un polipéptido que tiene la secuencia de amino ácidos como la mostrada en SEQ ID NO: 2.

6): El polinucleótido de acuerdo a cualquiera de 1) a 5), dicho polinucleótido siendo seleccionado entre:

(a): la secuencia de nucleótidos como la mostrada en SEQ ID NO: 3,

(b): la secuencia de nucleótidos como la mostrada en SEQ ID NO: 1,

(c): un fragmento de SEQ ID NO: 1,

(d): una secuencia de nucleótido la cual corresponde a la secuencia (a) a (c) dentro del rango de la degeneración del código genético, y

(e): una secuencia de nucleótido que tiene mutaciones del mismo sentido de las funciones neutrales en (a) a (c).

7): El polinucleótido de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1) a 6), donde dicha bacteria coryneform es Corynebacterium glutamicum.

8): El polinucleótido de acuerdo a 3), el cual codifica un polipéptido que tiene actividad transaldolasa y el cual está contenido en el plásmido pSUZ1, depositado en la cepa DSM 5715 bajo el número DSM 13263.

9): Un polipéptido que tiene la secuencia de amino ácido de SEQ ID NO: 2 y que tiene actividad enzimática transaldolasa.

10): El polipéptido de acuerdo a 9), donde dicho polipéptido tiene la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO: 2 incluyendo intercambios de amino ácidos conservativos seleccionados del grupo que consiste en el intercambio de glicina por alanina o intercambio de ácido aspártico por ácido glutámico.

11): Un vector recombinante que contiene el polinucleótido aislado de acuerdo a cualquiera de 1) a 6).

12): El vector recombinante de acuerdo a 11), donde dicho vector es pSUZ1 depositado en la cepa 5715 bajo el número DSM 13263.

13): Una bacteria coryneform transformada con el vector de acuerdo a 11).

14): Una bacteria coryneform recombinante que tiene una actividad intracelular incrementada de una transaldolasa, donde dicha actividad intracelular incrementada es lograda por la sobre expresión del polinucleótido de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1) a 6).

15): Un proceso para la preparación de L-amino ácidos, el cual comprende los siguientes pasos

a): fermentación de la bacteria de la reivindicación 14 en un medio para de esta forma producir dicho L-amino ácido,

b): acumulación de dicho L-amino ácido en el medio o en las células de dicha bacteria y

c): aislamiento de dicho L-amino ácido.

16): El proceso de acuerdo a 14), donde dicho L-amino ácido es seleccionado del grupo que consiste de L-lisina, L-treonine, L-isoleucina o L-triptofano.

La descripción también proporciona polinucleótidos que comprenden sustancialmente una secuencia de polinucleótidos, los cuales son obtenidos mediante la selección por medio de la hibridación de una biblioteca del gen correspondiente, la cual comprende el gen completo con la secuencia de nucleótidos correspondiente a SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 3, con una sonda que comprende la secuencia del polinucleótido mencionado, de acuerdo a

SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 3 o un fragmento de la misma, y aislamiento de la secuencia de ADN mencionada.

Las secuencias de polinucleótidos de acuerdo a la descripción son apropiadas como sondas de hibridación para el ARN, cADN y ADN, con vistas a aislar, en toda la longitud, el cADN que codifica para la transaldolasa y aislar aquellos cADN o genes que tienen una alta similitud de secuencia con aquella del gen de la transaldolasa.

Las secuencias de polinucleótidos de acuerdo a la descripción son además apropiadas como cebadores para la preparación de ADN de genes que codifican para la transaldolasa mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Tales oligonucleótidos que sirven como sondas o cebadores comprenden al menos 30, preferiblemente al menos 20, especialmente de manera preferible al menos 15 nucleótidos sucesivos. Los oligonucleótidos que tienen una longitud de al menos 40 o 50 nucleótidos son también apropiados.

"Aislado" significa separado de su medio natural.

"Polinucleótido" en general se refiere a polirribonucleótidos y polideoxirribonucleótidos, siendo posible que estos sean ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado.

"Polipéptidos" es entendido como péptidos o proteínas que comprenden dos o más amino ácidos enlazados por medio de enlaces peptídicos.

Los polipéptidos de acuerdo a la invención incluyen un polipéptido de acuerdo a la SEQ ID NO. 2 o SEQ ID NO. 4, y tienen la actividad biológica de la transaldolasa, y también aquellos que son idénticos en una extensión de al menos el 90% al 95% al polipéptido de acuerdo a la SEQ ID NO. 2 o SEQ ID NO. 4, y tienen la actividad mencionada.

La invención además proporciona un proceso para la preparación fermentativa de amino ácidos, en particular L-lisina, L-treonina, L-isoleucina y L-triptofano, usando bacterias coryneform las cuales en particular ya producen un amino ácido, y en las cuales las secuencias de nucleótidos que codifican para el gen tal son amplificadas, en particular sobre expresadas.

El término "amplificación" en este contexto describe el incremento en la actividad intracelular de una o más enzimas en un microorganismo que son codificadas por el ADN correspondiente, por ejemplo incrementando el número de copias del gen o de los genes, usando un promotor potente o usando un gen que codifica para una enzima correspondiente que tiene una alta actividad, y opcionalmente combinando estas medidas.

Los microorganismos que proporciona la presente invención pueden preparar L-amino ácidos, en particular L-lisina, a partir de glucosa, sucrosa, lactosa, fructosa, maltosa, melasas, almidón, celulosa o a partir de glicerol y etanol. Ellos pueden ser representativos de la bacteria coryneform, en particular del género de la Corynebacterium. Del género de la Corynebacterium, pueden ser mencionada en particular la especie Corynebacterium glutamicum, la cual es conocida entre los expertos por su capacidad para producir L-amino ácidos.

Cepas apropiadas del género Corynebacterium, en particular de la especie Corynebacterium glutamicum, son, por ejemplo, las cepas de tipo salvaje conocidas

: Corynebacterium glutamicum ATCC13032

: Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806

: Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870

: Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539

: Corynebacterium melassecola ATCC17965

: Brevibacterium flavum ATCC14067

: Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 y

: Brevibacterium divaricatum ATCC14020

y mutantes que producen L-lisina o cepas preparadas de las mismas, tales como, por ejemplo

: Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709

: Brevibacterium flavum FERM-P 1708

: Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712

: Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463

: Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 y

: Corynebacterium glutamicum ATCC13032

: Corynebacterium glutamicum DM58-1

: Corynebacterium glutamicum DSM12866

y mutantes que producen L-treonina o cepas preparadas de las mismas, tales como, por ejemplo

: Corynebacterium glutamicum ATCC21649

: Brevibacterium flavum BB69

: Brevibacterium flavum DSM5399

: Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 269

: Brevibacterium lactofermentum TBB-10

y mutantes que producen L-isoleucina o cepas preparadas de las mismas, tales como, por ejemplo

: Corynebacterium glutamicum ATCC 14309

: Corynebacterium glutamicum ATCC 14310

: Corynebacterium glutamicum ATCC 14311

: Corynebacterium glutamicum ATCC 15168

: Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6871

y mutantes que producen L-triptofan o cepas preparadas de las mismas, tales como, por ejemplo

: Corynebacterium glutamicum ATCC21850 y

: Corynebacterium glutamicum KY9218 (pKW9901)

Los inventores tuvieron éxito en el aislamiento del nuevo gen tal de C. glutamicum el cual codifica para la transaldolasa (EC 2.2.1.2)

Para aislar el gen tal o también otros genes de C. glutamicum, una biblioteca de genes de este microorganismo es primero establecida en E. coli. El establecimiento de bibliotecas de genes es descrito en los libros de textos y manuales generalmente conocidos. El libro de texto de Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie [Genes y Clones, Una Introducción a la Ingeniería Genética] (Verlag Chemie, Weinheim, Alemania, 1990) o el manual de Sambrook y otros: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) puede ser mencionado como un ejemplo. Una biblioteca de genes bien conocida es aquella de la cepa W3110 K-12 de E. coli establecida en vectores \lambda por Kohara y otros (Cell 50, 495-508 (1987)). Bathe y otros (Molecular and General Genetics, 252:255-265, 1996) describen una biblioteca de genes de C. glutamicum ATCC13032, la cual fue establecida con la ayuda del vector cósmido SuperCos I (Wahl y otros, 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84:2160-2164) en la cepa NM554 K-12 de E. coli (Raleigh y otros, 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575). Börmann y otros (Molecular Microbiology 6(3), 317-326 (1992)) a su vez describen una biblioteca de genes de C. glutamicum ATCC13032 usando el cósmido pHC79 (Hohn y Collins, Gene 11, 291-298 (1980)). O'Donohue (Análisis Molecular y Clonación de Cuatro Genes Biosintéticos de Amino Acidos Comunes Aromáticos a partir de Corynebacterium glutamicum. Ph. D. Thesis, National University of Ireland, Galway, 1997) describe la clonación de genes de C. glutamicum usando el sistema de expresión Zap \lambda descrito por Short y otros (Nucleic Acids Research, 16: 7583). Para preparar una biblioteca de genes de C. glutamicum en E. coli es también posible usar plásmidos tales como pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)) o pUC9 (Vieira y otros, 1982, Gene, 19:259-268). Hospederos apropiados son, en particular, aquellas cepas de E. coli las cuales son defectivas de recombinación y restricción. Un ejemplo de estas es la cepa DH5\alphamcr, la cual ha sido descrita por Grant y otros (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649). Los fragmentos largos de ADN clonados con la ayuda de cósmidos pueden entonces a su vez ser subclonados y subsiguientemente secuenciados en los vectores comunes los cuales son apropiados para secuenciar, tal como es descrito por ejemplo por Sanger y otros (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74:5463-5467,
1977).

Las secuencias de ADN obtenidas pueden entonces ser investigadas con algoritmos o programas de análisis de secuencia conocidos, tales como por ejemplo aquel de Staden (Nucleic Acids Research 14, 217-232(1986)), el programa GCG de Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74-97 (1998)) el algoritmo FASTA de Pearson y Lipman (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 85, 2444-2448 (1988)) o el algoritmo BLAST de Altschul y otros (Nature Genetics 6, 119-129 (1994)) y comparado con los registros de secuencias que existen en los bancos de datos accesibles al público. Los bancos de datos para las secuencias de nucleótidos que son accesibles al público son, por ejemplo, aquel del Laboratorio de Biología Molecular Europeo (EMBL, Heidelberg, Alemania) aquel del Centro Nacional para Información Biotecnológica (NCBI, Bethesda, MD, USA).

La invención proporciona la nueva secuencia de ADN a partir de C. glutamicum la cual contiene la sección de ADN que codifica para el gen tal, mostrado por la SEQ ID NO 1 y SED ID NO 3. La secuencia de amino ácidos de la proteína correspondiente además ha sido derivada de la presente secuencia de ADN usando los métodos descritos anteriormente. La secuencia de amino ácidos resultante del producto del gen tal es mostrada en SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 4.

Una biblioteca de genes producida de la manera descrita anteriormente puede además ser investigada por hibridación con sondas de nucleótidos de secuencia conocida, tales como, por ejemplo, el gen zwf (JP-A-09224661). El ADN clonado de los clones que exhiben una reacción positiva en la hibridación es secuenciado a su vez para dar por otra parte la secuencia de nucleótido conocida de la sonda empleada y por otra parte las secuencias de ADN nuevas adyacentes.

Las secuencias de ADN que codifican las cuales resultan de la SEQ ID NO 3 por la degeneración del código genético son también un constituyente de la invención. Intercambios de amino ácidos conservativos, tales como por ejemplo intercambio de glicina por alanina o de ácido aspártico por ácido glutámico en proteínas, son además conocidos entre los expertos como "mutaciones del mismo sentido" las cuales no conllevan a un cambio fundamental en la actividad de la proteína, es decir son de función neutral. Es además conocido que cambios en el terminal N o C de una proteína no pueden deteriorar sustancialmente la función de la misma e incluso pueden estabilizarla. Información en este contexto puede ser encontrada por el experto, entre otros, en Ben-Bassat y otros (Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987)), en O'Regan y otros (Gene 77:237-251 (1989)), en Sahin-Toth y otros (Protein Sciences 3:240-247 (1994)), en Hochuli y otros (Bio/Technology 6:1321-1325 (1988)) y en los libros de textos de genética y biología molecular. Las secuencias de amino ácidos que resultan de una manera correspondiente a partir de la SEQ ID NO 2 o SEQ ID NO 4 son también un constituyente de la invención.

Finalmente, las secuencias de ADN que son preparadas por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores que resultan de la SEQ ID NO 3 son un constituyente de la descripción. Tales oligonucleótidos típicamente tienen una longitud de al menos 15 nucleótidos.

Instrucciones para identificar las secuencias de ADN por medio de la hibridación pueden ser encontradas por el experto, entre otros, en el manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" de Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993) y en Liebl y otros (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260). Instrucciones para la amplificación de las secuencias de ADN con la ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) pueden ser encontradas por el experto, entre otros, en el manual de Gait: Oligonukleotide synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) y en Newton y Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania, 1994).

Los inventores han encontrado que las bacterias coryneform producen amino ácidos en una manera mejorada después de la sobre expresión del gen tal.

Para lograr una sobre expresión, el número de copias de los genes correspondientes puede ser incrementada, o la región de regulación y el promotor o el sitio de enlace del ribosoma aguas arriba del gen estructural puede ser mutado. Los casetes de expresión que son incorporados aguas arriba del gen estructural actúan de la misma manera. Mediante los promotores inducibles, es adicionalmente posible incrementar la expresión en el curso de la producción fermentativa de L-amino ácidos. La expresión es de esta forma mejorada por medio de la prolongación de la vida de m-ARN. Además, la actividad enzimática es también incrementada previniendo la degradación de la proteína de la enzima. Los genes o el gen construido pueden tanto estar presentes en plásmidos con un número de copias variable, o pueden ser integrados y amplificados en el cromosoma. Alternativamente, una sobre expresión de los genes en cuestión puede además ser lograda cambiando la composición del medio y el procedimiento de cultivo.

Las instrucciones en este contexto pueden ser encontradas por el experto, entre otros, en Martin y otros (Bio/
Technology 5, 137-146 (1987)), en Guerrero y otros (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya y Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), en Eikmanns y otros (Gene 102, 93-98 (1991)), en la Descripción de la Patente Europea EPS 0 472 869, en la Patente US 4,601,893, en Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), en Reinscheid y otros (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), en LaBarre y otros (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en la Solicitud de Patente WO 96/15246, en Malumbres y otros (Gene 134, 15-24 (1993)), en la Descripción Japonesa a disposición del público JP-A-10-229891, en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), en Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996)) y en los libros de textos de genética y biología molecular conocidos.

A modo de ejemplo, el gen tal de acuerdo a la invención fue sobre expresado con la ayuda de plásmidos.

Plásmidos adecuados son aquellos que son replicados en bacterias coryneform. Numerosos vectores plásmidos conocidos, tales como por ejemplo pZ1 (Menkel y otros, Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKEx1 (Eikmanns y otros, Gene 102:93-98 (1991)) o pHS2-1 (Sonnen y otros, Gene 107:69-74 (1991)) están basados en el plásmido críptico pHM1519, pBL1 o pGA1. Otros vectores plásmidos, tales como por ejemplo aquellos
basados en pCG4 (US-A 4,489,160), o pNG2 (Serwold-Davis y otros, FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), o pAG1 (US-A 5,158,891), pueden ser usados de la misma manera.

Los vectores plásmidos que son además apropiados son también aquellos con la ayuda de los cuales el proceso de la amplificación del gen por integración en los cromosomas puede ser usado, como ha sido descrito, por ejemplo, por Reinscheid y otros (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) para la duplicación o la amplificación del operon hom-thrB. En este método, el gen completo es clonado en un vector plásmido que puede replicarse en un hospedero (típicamente E. coli), pero no en C. glutamicum. Posibles vectores son, por ejemplo, pSUP301 (Simon y otros, Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob o pK19mob (Schäfer y otros, Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994)). Journal of Biological Chemistry 269:32678-84; US-A 5,487,993), pCR®Blunt (Invitrogen, Groningen, Holanda; Bernard y otros, Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), pEM1 (Schrumpf y otros, 1991, Journal of Bacteriology 173:4510-4516) o pBGS8 (Spratt y otros, 1986, Gene 41: 337-342). El vector plásmido que contiene el gen a ser amplificado es entonces transferido dentro de la cepa deseada de C. glutamicum por conjugación o transformación. El método de conjugación es descrito, por ejemplo, por Schäfer y otros (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)). Métodos para la transformación son descritos, por ejemplo, por Thierbach y otros (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican y Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) y Tauch y otros (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)). Después de la recombinación homóloga por medio de un evento de "cruzamiento", la cepa resultante contiene al menos dos copias del gen en cuestión.

Un ejemplo de un vector plásmido, con la ayuda del cual el proceso de amplificación por integración puede ser llevado a cabo es pSUZ1, el cual es mostrado en la Figura 1. El plásmido pSUZ1 consiste del vector pBGS8 de la E. coli descrito por Spratt y otros (Gene 41: 337-342 (1986)), en el cual el gen tal ha sido incorporado.

En adición, puede ser ventajoso para la producción de amino ácidos amplificar o sobre expresar una o más enzimas de la ruta de la biosíntesis particular, de la glicólisis, de la anaplerosis, de la exportación de amino ácidos o de la ruta de la fosfato pentosa, en adición al gen tal.

Así, por ejemplo, para la preparación de L-lisina, uno o más genes seleccionados del grupo que consiste de

\bullet: el gen dapA que codifica para la dihidrodipicolinato sintasa (EP-B 0 197 335),

\bullet: el gen lysC que codifica para una aspartato cinasa resistente a la regeneración (Kalinowski y otros (1990), Molecular and General Genetics 224: 317-324),

\bullet: el gen gap que codifica para la gliceraldehído 3-fosfato dehidrogenasa (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086),

\bullet: el gen pyc que codifica para la piruvato carboxilasa (DE-A-198 31 609),

\bullet: el gen mqo que codifica para la malato-quinona oxidoreductasa (Molenaar y otros, European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)),

\bullet: el gen tkt que codifica para la transcetolasa (número de acceso AB023377 del banco de datos de los Laboratorios de Biología Molecular Europeos (EMBL, Heidelberg, Alemania)),

\bullet: el gen gnd que codifica para la 6-fosfogluconato dehidrogenasa (JP-A-9-224662),

\bullet: el gen zwf que codifica para la glucosa 6-fosfato dehidrogenasa (JP-A-9-224661),

\bullet: el gen lysE que codifica para una proteína para la exportación de lisina (DE-A-195 48 222),

\bullet: el gen zwa1 (DE 199 59 328.0; DSM 13115),

\bullet: el gen eno que codifica para la enolasa (DE: 19947791.4),

\bullet: el gen devB,

\bullet: el gen opcA (DSM 13264)

pueden ser amplificados, preferiblemente sobre expresados, al mismo tiempo.

Así, para la preparación de L-treonina, uno o más genes seleccionados del grupo que consiste de

\bullet: al mismo tiempo el gen hom que codifica para la homoserina dehidrogenasa (Peoples y otros, Molecular Microbiology 2, 63-72 (1988)) o el alelo hom^{dr} que codifica para una homoserina dehidrogenasa "resistente a la regeneración" (Archer y otros, gene 107, 53-59 (1991)),

\bullet: el gen gap que codifica para la glicerolaldehido 3-fosfato dehidrogenasa (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086),

\bullet: el gen lysE que codifica para la exportación de lisina (DE-A-195 48 222),

\bullet: el gen zwa1 (DE 199 59 328.0; DSM 13115),

\bullet: el gen eno que codifica para la enolasa (DE: 19947791.4),

\bullet: el gen devB,

\bullet: el gen opcA (DSM 13264)

pueden ser amplificados, preferiblemente sobre expresados, al mismo tiempo.

Así, por ejemplo, para la preparación de L-treonina, uno más genes seleccionados del grupo que consiste de

\bullet: el gen mqo que codifica para la malato quinona oxidoreductasa (Molenaar y otros, European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)),

\bullet: el gen thrE que codifica para la exportación de treonina (DE 199 41 478.5; DSM 12840),

\bullet: el gen zwa1 (DE 199 59 328.0; DSM 13115),

\bullet: el gen eno que codifica para la enolasa (DE: 19947791.4),

\bullet: el gen devB,

\bullet: el gen opcA (DSM 13264)

pueden ser amplificados, preferiblemente sobre expresados, al mismo tiempo.

Puede ser además ventajoso para la producción de amino ácidos atenuar

\bullet: el gen pck que codifica para la fosfoenol piruvato carboxicinasa (DE 199 50 409.1, DSM 13047) y/o

\bullet: el gen pgi que codifica para la glucosa 6-fosfato isomerasa (US 09/396,478, DSM 12969), o

\bullet: el gen poxB que codifica para la piruvato oxidasa (DE 199 51 975.7; DSM 13114), o

\bullet: el gen zwa2 (DE: 199 59 327.2; DSM 13113)

al mismo tiempo, en adición a la amplificación del gen tal.

En adición a la sobre expresión del gen tal puede ser ventajoso además para la producción de amino ácidos eliminar reacciones colaterales indeseadas (Nakayama: "Reproducción de Micro-organismos que producen amino ácidos", en: Overproduction of Microbial Products, Kurumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londres, UK, 1982).

Los microorganismos preparados de acuerdo a la invención pueden ser cultivados continuamente o discontinuamente en el proceso por lotes (cultivo por lotes) o en el lote alimentado (proceso de alimentación) o procesos por lotes alimentados repetidos (proceso de alimentación repetitivo) para el propósito de la producción de L-amino ácidos. Un resumen de los métodos de cultivo conocidos son descritos en el libro de texto de Chmiel (BioprozeBtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Tecnología de los Bioprocesos 1. Introducción a la Tecnología de los Bioprocesos] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactores y Equipamiento periférico] (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

El medio de cultivo a ser usado debe satisfacer los requisitos de las cepas particulares de una manera apropiada. Descripciones del medio de cultivo para varios microorganismos están contenidas en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" de la American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981). Azúcares y carbohidratos, tales como por ejemplo glucosa, sucrosa, lactosa, fructosa, maltosa, melasas, almidón y celulosa, aceites y grasas, tales como por ejemplo aceite de soya, aceite de girasol, aceite de maní y grasa de coco, ácidos grasos, tales como por ejemplo ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes, tales como por ejemplo glicerol y etanol, y ácidos orgánicos, tales como por ejemplo ácido acético, pueden ser usados como fuente de carbono. Estas sustancias pueden ser usadas individualmente o como una mezcla. Compuestos orgánicos que contienen nitrógeno, tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor de maíz fermentado, harina del fríjol de soya y urea, o compuestos inorgánicos, tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio, pueden ser usados como la fuente de nitrógeno. Las fuentes de nitrógeno pueden ser usadas individualmente o como una mezcla. El ácido fosfórico, fosfato de dihidrógeno potasio o fosfato de hidrógeno dipotasio o las sales que contienen sodio correspondientes pueden ser usadas como la fuente de fósforo. El medio de cultivo debe además comprender sales de metales, tales como por ejemplo sulfato de magnesio o sulfato de hierro, los cuales son necesarios para el crecimiento. Finalmente, las sustancias de crecimiento esenciales, tales como amino ácidos y vitaminas, pueden ser empleadas en adición a las sustancias antes mencionadas. Precursores adecuados pueden además ser adicionados al medio de cultivo. Las sustancias de partida mencionadas pueden ser adicionadas al medio de cultivo en la forma de un lote simple, o pueden ser alimentadas durante el cultivo en una forma apropiada.

Compuestos básicos, tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o amoníaco acuoso, o compuestos ácidos, tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico, pueden ser empleados de una manera apropiada para controlar el pH del cultivo. Antiespumantes, tales como por ejemplo ésteres de poliglicol de ácidos grasos, pueden ser empleados para controlar el desarrollo de la espuma. Sustancias apropiadas que tienen una acción selectiva, tales como por ejemplo antibióticos, pueden ser adicionados al medio para mantener la estabilidad de los plásmidos. Para mantener las condiciones aeróbicas, oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno, tales como por ejemplo aire, son introducidas en el cultivo. La temperatura del cultivo es usualmente de 20ºC a 45ºC, y preferiblemente de 25ºC a 40ºC. El cultivo es continuado hasta que un máximo de L-amino ácidos se ha formado. Esta meta es usualmente lograda en el rango de 10 horas a 160 horas.

Los análisis de L-amino ácidos pueden ser llevados a cabo por cromatografía de intercambio aniónico con una derivación de ninhidrina subsiguiente, como es descrito por Spackman y otros (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190).

Los siguientes microorganismos han sido depositados en el Deutsche Sammlung für Mikrorganismen und
Zellkulturen (DSMZ = Colección Alemana de Cultivos de Células y Microorganismos, Braunschweig, Alemania) de acuerdo con el Tratado de Budapest:

\bullet: Escherichia coli JM109/pSUZ1 como DSM 13263

La SEQ ID NO 1 también contiene el nuevo gen devB. El proceso de acuerdo a la invención es usado para la preparación fermentativa de amino ácidos.

Las siguientes figuras son anexadas:

La Figura 1

Mapa del plásmido pSUZ1

Las abreviaturas y designaciones usadas tienen el siguiente significado:

lacZ:: segmentos del fragmento del gen lacZ\alpha

kan r:: resistencia a la kanamicina

tal:: gen transaldolasa

ori:: origen de replicación del plásmido pBGS8

Bc1I:: Sitio de escisión de la enzima de restricción Bc1I

EcoRI:: Sitio de escisión de la enzima de restricción EcoRI

HindIII:: Sitio de escisión de la enzima de restricción HindIII

PstI:: Sitio de escisión de la enzima de restricción PstI

SacI:: Sitio de escisión de la enzima de restricción SacI

Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustrarán adicionalmente esta invención. Las técnicas de la biología molecular, por ejemplo el aislamiento del ADN plásmido, el tratamiento de la enzima de restricción, ligaciones, transformaciones estándar de la Escherichia coli etc usadas son, (a menos que se indique lo contrario), descritas por Sambrook y otros, (Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratories, USA).

Ejemplo 1 Preparación de una biblioteca del gen cósmido genómico a partir de la Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

El ADN cromosomal de la Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 fue aislado como es descrito por Tauch y otros (1995, Plasmid 33:168-179) y parcialmente escindido con la enzima de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del producto Sau3AI, Código no. 27-0913-02). Los fragmentos de ADN fueron desfoforilatados con fosfatasa alcalina de camarón (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania, Descripción del Producto SAP, Código no. 1758250). El ADN del vector cósmido SuperCos1 (Wahl y otros (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84:2160-2164), obtenido de Stratagene (La Jolla, USA, Descripción del Producto Kit del Vector Cósmido SuperCos1, Código no. 251301), fue escindido con una enzima de restricción XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto XbaI, Código no. 27-0948-02) e igualmente desfosforilatado con fosfatasa alcalina de camarón. El ADN cósmido fue entonces escindido con la enzima de restricción BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto BamHI, Código no. 27-0868-04). El ADN cósmido tratado de esta manera fue mezclado con el ADN ATCC13032 tratado y el lote fue tratado con ligasa ADN T4 (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto Ligasa-ADN-T4, Código no. 27-0870-04). La mezcla de ligación fue entonces empacada en fagos con la ayuda de Extractos de Empaque Gigapack II XL (Stratagene, La Jolla, USA, Descripción del Producto Extractos de Empaque Gigapack II XL, Código no. 200217). Para la infección de la cepa NM554 de E.coli (Raleigh y otros 1988, Nucleic Acid Research 16:1563-1575) las células fueron recogidas en 10 mM de MgSO_{4} y mezcladas con una alícuota de la suspensión del fago. La infección y titulado de la biblioteca del cósmido fueron llevadas a cabo como es descrito por Sambrook y otros (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), las células siendo depositadas en agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) con 100 \mug/ml de ampicillina. Después de la incubación toda la noche a 37ºC, clones individuales recombinantes fueron seleccionados.

Ejemplo 2 Aislamiento y secuenciación del gen tal

El ADN cósmido de una colonia individual fue aislado con un Kit Qiaprep Spin Miniprep (Producto No. 27106, Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo a las instrucciones del fabricante y parcialmente escindida con la enzima de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto Sau3AI, Producto No. 27-0913-02). Los fragmentos de ADN fueron desfosforilatados con fosfatasa alcalina de camarón (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania, Descripción del Producto SAP, Producto No. 1758250). Después de la separación mediante electroforesis en gel, los fragmentos cósmidos en un rango de tamaño de 1500 a 2000 bp fueron aislados con el Kit de Extracción en Gel QiaExII (Producto No. 20021, Qiagen, Hilden, Alemania). El ADN del vector de secuenciación pZero-1, obtenido de Invitrogen (Groningen, Holanda, Descripción del producto Kit de Clonación Zero Background, Producto No. K2500-01) fue escindido con la enzima de restricción BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto BamHI, Producto No. 27-0868-04). La ligación de los fragmentos cósmidos en el vector de secuenciación pZero-1 fue llevado a cabo como es descrito por Sambrook y otros (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), la mezcla de ADN siendo incubada toda la noche con ligasa T4 (Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania). Esta mezcla de ligación fue entonces electroporada (Tauch y otros 1994, FEMS Microbiol Letters, 123:343-7) en la cepa DH5\alphaMCR de E. coli (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87:4645-4649) y depositada sobre agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) con 50 \mug/ml de zeocina. La preparación del plásmido de los clones recombinantes fue llevada a cabo con Biorobot 9600 (Producto No. 900200, Qiagen, Hilden, Alemania). La secuenciación fue llevada a cabo por el método de detención de la cadena de dideoxi de Sanger y otros (1977, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 74:5463-5467) con modificaciones de acuerdo a Zimmermann y otros (1990, Nucleic Acids Research, 18:1067). El "Kit de Secuenciación del Ciclo Terminador de RR dRodamina" de PE Applied Biosystems (Producto No. 403044, Weiterstadt, Alemania) fue usado. La separación por electroforesis en gel y el análisis de la reacción de secuenciación fueron llevados a cabo en un gel de "Acrilamida/Bisacrilamida de Rotiforesis NF" (29:1) (Producto No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Alemania) con el secuenciador "ABI Prism 377" de PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Alemania).

Los datos de la secuencia primaria obtenidos fueron luego procesados usando el paquete de programa Staden (1986, Nucleic Acid Research, 14:217-231) versión 97-0. Las secuencias individuales del pZero1 derivativas fueron reunidas en una secuencia contigua. El análisis asistido por computadora de la región que codifica fue preparado con el programa XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231). Análisis adicionales fueron llevados a cabo con el "programa de búsqueda BLAST" (Altschul y otros, 1997, Nucleic Acids Reseach, 25:3389-3402), contra el banco de datos no redundante del "National Center for Biotecnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, USA).

La secuencia de nucleótidos resultante es mostrada en SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 3.

Ejemplo 3 Clonación del gen tal

La PCR fue usada para amplificar los fragmentos de ADN que contienen el gen tal completo de C. glutamicum 13032 y que flanquean las regiones aguas arriba y aguas abajo. Reacciones PCR fueron llevadas a cabo usando cebadores de oligonucleótidos designados a partir de la secuencia determinada en los Ejemplos 1 y 2. El ADN genómico fue aislado a partir de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 de acuerdo a Heery y Dunican (Applied and Environmental Microbiology 59: 791-799 (1993)) y usado como patrón. Los cebadores tal usados fueron:

: cebador directo.: 5' GGT ACA AAG GGT CTT AAG 3'C

: cebador reverso.: 5' GAT TTC ATG TCG CCG TTA 3'

Los Parámetros PCR fueron como sigue:

: 35 ciclos

: 95ºC por 3 minutos

: 94ºC por 1 minuto

: 47ºC por 1 minuto

: 72ºC por 45 segundos

: 2.0 mM MgCl_{2}

: aproximadamente 150-200 ng del patrón de ADN.

El producto PCR obtenido fue clonado en el vector pGEM-T comercialmente disponible adquirido de Promega Corp. (pGEM-T Easy Vector System 1, cat. no. A1360, Promega UK, Southampton, UK) usando la cepa JM109 de E. coli (Yanisch-Perron y otros, Gene, 33: 103-119 (1985)) como un hospedero. El gen tal completo fue subsiguientemente aislado del vector T pGEM en un fragmento de Eco RI y clonado en el sitio EcoRI lacZ\alpha del vector pBGS8 de E. coli (Spratt y otros, Gene 41(2-3): 337-342 (1986)). Las enzimas de restricción usadas fueron obtenidas de Boehringer Mannheim UK Ltd. (Bell Lane, Lewes East Sussex BN7 1LG, UK) y usada de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La JM109 de E. coli fue entonces transformada con esta mezcla de ligación y fueron seleccionados electrotransformantes en agar Luria suplementado con isopropil-tiogalactopiranosida (IPTG), 5-bromo-4-cloro-3-indolil-galactopiranosida (XGAL) y kanamicina a concentraciones de 1mM, 0.02% y 50 mg/l respectivamente. Las placas fueron incubadas durante 12 horas a 37ºC. El ADN plásmido fue aislado de un transformante, caracterizado por el análisis de enzima de restricción usando Eco RI. Esta nueva construcción fue designada pSUZ 1.

Ejemplo 4 Preparación de la cepa Corynebacterium glutamicum DSM5715::pSUZ1

La cepa DSM5715 fue transformada con el plásmido pSUZ1 usando el método de electroporación descrito por Liebl y otros, (FEMS Microbiology Letters, 53:299-303 (1989)). La selección de los transformantes tuvo lugar en agar LBHIS comprendiendo 18.5 g/l de caldo de cerebro-corazón, 0.5M de sorbitol, 5 g/l de Bacto-triptona, 2.5 g/l de extracto de Bacto-levadura, 5 g/l de NaCl y 18 g/l de Bacto-agar, los que habían sido suplementados con 25 mg/l de kanamicina. La incubación fue llevada a cabo por 2 días a 33ºC.

Ya que el vector pSUZ1 no puede replicarse en la cepa DSM5715, solamente los clones que no muestran resistencia a la kanamicina impartida por la integración de pSUZ1 fueron capaces de crecer.

El integrante resultante fue llamado DSM5715::pSUZ1.

Ejemplo 5 Preparación de lisina

La cepa DSM5715/pSUZ1 de C. glutamicum obtenida en el Ejemplo 4 fue cultivada en un medio nutriente apropiado para la producción de L-lisina y el contenido de la L-lisina en el cultivo sobrenadante fue determinado.

Para esto, la cepa fue primero incubada sobre una placa de agar con el antibiótico correspondiente (agar cerebro-corazón con kanamicina (25 mg/l)) por 24 horas a 33ºC. Comenzando a partir de este cultivo en placa de agar, un precultivo fue sembrado (10 ml del medio en un matraz cónico de 100 ml). El medio completo CgIII fue usado como el medio para el precultivo.

\vskip1.000000\baselineskip

Medio Cg III:
NaCl	2.5 g/l
Bacto-Peptona	10 g/l
Extracto de Bacto-Levadura	10 g/l
Glucosa (puesta en autoclave separadamente)	2% (p/v)
El pH fue llevado a pH 7.4.

\vskip1.000000\baselineskip

Kanamicina (25 mg/l) fue adicionada a esto. El precultivo fue incubado durante 16 horas a 33ºC a 240 rpm en una batidora. El cultivo principal fue sembrado a partir de este precultivo de manera que el OD inicial (660 nm) del cultivo principal fue 0.1. El medio MM fue usado para el cultivo principal.

\vskip1.000000\baselineskip

Medio MM
CSL (licor de maíz fermentado)	5 g/l
MOPS (ácido morfolinopropanosulfónico)	20 g/l
Glucosa (en autoclave separadamente)	50 g/l
(NH_{4})_{2}SO_{4}	25 g/l
KH_{2}PO_{4}	0.1 g/l
MgSO_{4} * 7 H_{2}O	1.0 g/l
CaCl_{2} * 2 H_{2}O	10 mg/l
FeSO_{4} * 7 H_{2}O	10 mg/l
MnSO_{4} * H_{2}O	5.0 mg/l
Biotina (estéril-filtrada)	0.3 mg/l
Tiamina * HCl (estéril-filtrada)	0.2 mg/l
L-Leucina	0.1 g/l
CaCO_{3}	25 g/l

\vskip1.000000\baselineskip

El CSL, MOPS y la solución de la sal fueron llevados a pH 7 con amoníaco acuoso y puestos en autoclave. El sustrato estéril y las soluciones de vitamina fueron luego adicionadas, así como el CaCO_{3} puesto en autoclave en estado seco.

El cultivo es llevado a cabo en un volumen de 10 ml en un matraz cónico de 100 ml con bafles. Kanamicina
(25 \mug/l) fue adicionada. El cultivo fue llevado a cabo a 33ºC y 80% de humedad atmosférica.

Después de 24 y 48 horas, el OD fue determinado a una longitud de onda de medición de 660 nm con un Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich). La cantidad de lisina formada fue determinada con un analizador de amino ácidos de Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por cromatografía de intercambio iónico y derivación post-columna con detección de ninidrina.

El resultado del experimento es mostrado en la Tabla 1.

TABLA 1

Cepa	Tiempo, horas	Lisina HCl
		g/l
DSM5715	24	8.1
DSM5715::pSUZ1	24	8.6
DSM5715	48	14.7
DSM5715::pSUZ1	48	15.4

Claims

1. Un polinucleótido de la bacteria coryneform que codifica un polipéptido que tiene la actividad enzimática de una transaldolasa, dicho polinucleótido siendo seleccionado de entre:

(a): el polinucleótido, que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de amino ácidos que es idéntica en una extensión de al menos el 90% a la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO. 2,

(b): el polinucleótido que es complementario al polinucleótido de (a).

2. El polinucleótido de la reivindicación 1, donde dicho polinucleótido es idéntico en una extensión de al menos el 95% a la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO: 2.

3. Un polinucleótido de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 que tiene la secuencia de nucleótido mostrada en SEQ ID NO: 3.

4. Un polinucleótido de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el polinucleótido es un ARN.

5. Un polinucleótido de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que codifica para un polipéptido que tiene la secuencia de amino ácidos mostrada en SEQ ID NO: 2.

6. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, dicho polinucleótido siendo seleccionado entre:

(a): la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 3,

(b): la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1,

(c): un fragmento de SEQ ID NO: 1,

(d): una secuencia de nucleótidos que corresponden con la secuencia (a) a (c) dentro del rango de la degeneración del código genético, y

(e): una secuencia de nucleótidos que tiene mutaciones del mismo sentido de las funciones neutrales en (a) a (c).

7. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicha bacteria coryneform es Corynebacterium glutamicum.

8. El polinucleótido de la reivindicación 3, que codifica un polipéptido que tiene actividad transaldolasa y el cual está contenido en el plásmido pSUZ1, depositado en la cepa DSM 5715 bajo el número DSM 13263.

9. El polipéptido que tiene la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO: 2 y tiene una actividad enzimática de la transaldolasa.

10. El polipéptido de la reivindicación 9, donde dicho polipéptido tiene la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO: 2 incluyendo intercambios de amino ácidos conservativos seleccionados del grupo que consiste en el intercambio de glicina por alanina o intercambio de ácido aspártico por ácido glutámico.

11. Un vector recombinante que contiene el polinucleótido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

12. El vector recombinante de acuerdo a la reivindicación 11, donde dicho vector es pSUZ1 depositado en la cepa 5715 bajo el número DSM 13263.

13. Una bacteria coryneform transformada con el vector de la reivindicación 11.

14. Una bacteria coryneform recombinante que tiene una actividad intracelular incrementada de una transaldolasa, donde dicha actividad intracelular es lograda por la sobre expresión del polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

15. Un proceso para la preparación de L-amino ácidos, el cual comprende los siguientes pasos:

a): fermentación de la bacteria de la reivindicación 14 en un medio para producir dicho L-amino ácido,

c): aislamiento de dicho L-amino ácido.

\newpage

16. El proceso de la reivindicación 14, donde dicho L-amino ácido es seleccionado del grupo que consiste de L-lisina, L-treonina, L-isoleucina o L-triptofano.

17. El proceso de la reivindicación 13, donde dicho L-amino ácido es L-lisina, y donde uno o más genes seleccionados del grupo que consiste de

a): el gen dapA que codifica para la dihidrodipicolinato sintasa,

b): el gen lysC que codifica para una aspartato cinasa resistente a la regeneración,

c): el gen gap que codifica para la gliceraldehído 3-fosfato dehidrogenasa,

d): el gen pyc que codifica para la piruvato carboxilasa,

e): el gen mqo que codifica para la malato-quinona oxidoreductasa,

f): el gen tkt que codifica para la transcetolasa,

g): el gen gnd que codifica para la 6-fosfogluconato dehidrogenasa,

h): el gen zwf que codifica para la glucosa 6-fosfato dehidrogenasa,

i): el gen lysE que codifica para una proteína para la exportación de lisina,

j): el gen eno que codifica para la enolasa,

es o son sobre expresados al mismo tiempo.

18. El proceso de la reivindicación 13, donde dicho L-amino ácido es L-treonina, y donde uno o más genes seleccionados del grupo que consiste de

a): el gen hom que codifica para la homoserina dehidrogenasa del alelo hom^{dr} que codifica para una homoserina dehidrogenasa "resistente a la regeneración",

b): el gen gap que codifica para la gliceraldehído 3-fosfato dehidrogenasa,

c): el gen pyc que codifica para la piruvato carboxilasa,

d): el gen mqo que codifica para la malato-quinona oxidoreductasa,

e): el gen tkt que codifica para la transcetolasa,

f): el gen gnd que codifica para la 6-fosfogluconato dehidrogenasa,

g): el gen zwf que codifica para la glucosa 6-fosfato dehidrogenasa,

h): el gen thrE que codifica para una proteína para la exportación de treonina,

i): el gen eno que codifica para la enolasa,

es o son sobre expresados al mismo tiempo.

19. El proceso de la reivindicación 13 en el que uno o más genes seleccionados del grupo que consiste de

a): el gen pck que codifica para la fosfoenol piruvato carboxicinasa

b): el gen pgi que codifica para la glucosa 6-fosfato isomerasa

c): el gen poxB que codifica para la piruvato oxidasa

es o son atenuados al mismo tiempo.