DE69133559T2

DE69133559T2 - Direkte Klonierung von PCR amplifizierten Nucleinsäuren

Info

Publication number: DE69133559T2
Application number: DE69133559T
Authority: DE
Inventors: Corinna San Diego Hernstadt; Joseph M. Carlsbad Fernandez; David A. Middleton Mead; Lloyd Madison Smith
Original assignee: Invitrogen Corp
Current assignee: Life Technologies Corp
Priority date: 1990-09-27
Filing date: 1991-09-27
Publication date: 2007-11-22
Anticipated expiration: 2011-09-28
Also published as: DE69133389D1; EP0550693A1; EP1396540B1; DE69119083T2; EP1790723A3; DE69133559D1; DE69133389T2; US5487993A; EP0738779A3; US5827657A; EP0550693A4; WO1992006189A1; DE69119083D1; EP1790723A2; EP0738779A2; EP1396540A3; EP1396540A2; AU8871891A; EP0738779B1; EP0550693B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Klonierung von Nukleinsäuren. Insbesondere betrifft die Erfindung ein vereinfachtes Verfahren zur direkten Klonierung mittels Polymerase erzeugter Nukleinsäuren in Vektoren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Innerhalb der kurzen Zeitdauer, seitdem ausführbare PCR-Techniken zur Amplifikation von Nukleinsäurematerial zur Verfügung stehen, sind viele Anwendungsbereiche entwickelt worden. Beispielsweise hat die PCR zahlreiche Anwendungsbereiche in der Forschung gefunden, wie bei der Bestimmung genetischer Mutationen, bei der Herstellung Matrizen-modifizierter Sequenzen unter Verwendung fehlgepaarter Primer-Sequenzen, und bei der Herstellung ausreichender Mengen genetischen Materials zur direkten Sequenzierung. Die PCR ist ebenfalls bei vielen medizinischen und rechtlichen Problemen angewendet worden, bei denen sie in solchen Bereichen wie der Diagnose von monogenen Erkrankungen, der Analyse von biologischen Beweismitteln, etc., eingesetzt worden ist. Weitere Anwendungen der PCR-Amplifikation werden in einer Reihe von Artikeln diskutiert. Vgl. z.B. PCR Technology, H.A. Ehrlich, Hrsg., Stockman Press, 1989. Zweifellos werden zukünftig noch sehr viel mehr Anwendungsformen gefunden werden.
Bei der PCR werden spezifische Nukleinsäure-Zielsequenzen durch eine Kettenreaktion transkribiert, bei der ein zu einem bestimmten Abschnitt einer Nukleinsäure-Matrize komplementäres Primer-Molekül verwendet wird, um ein Extensionsprodukt des Primers zu bilden. Jedes Primer-Extension-Produkt anneliert in spezifischer Weise an ein komplementäres Primer-Molekül, und die resultierende, mit einem Primer versehene Matrize (template) wirkt als ein Substrat für eine weitere Extensionsreaktion.
Diese Schritte werden vielfach wiederholt, vorzugs-weise unter Anwendung eines automatisierten zyklischen Verfahrens, wodurch das Nukleinsäure-Ausgangsmaterial exponentiell amplifiziert wird. Die PCR ist besonders geeignet zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen, die anfänglich nur in sehr kleinen Mengen vorhanden sind. Verfahren zur Durchführung der PCR sind umfangreich beschrieben worden. Vgl. z.B. US-Patent Nrn. 4,683,195 und 4,683,202 von Mullis et al.
Neuerdings wird die PCR durchgeführt unter Anwendung eines automatisierten Wechsels zwischen Denaturierung, Annelierung eines Oligonukleotid-Primers an eine genetische Matrize, und Primer-Extension unter Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase, z.B. dem aus dem Bakterium Thermus Aquaticus isolierten Taq-Enzym. Vgl. z.B. US-Patent 4,889,818 von Gelfand et al.
Während die PCR alleine für bestimmte Anwendungen wie z.B. für die direkte Sequenzierung zufriedenstellend sein kann, ist es häufig erwünscht, einen Klon von PCR-amplifizierten Produkten zur weiteren Analyse, Modifikation oder zur Synthese von Sonden zu erhalten. Beispielsweise weisen eine Reihe von mRNA-Spezies polymorphe Transkripte auf. Nach molekularer Klonierung der PCR-Amplifikationsprodukte kann alternatives Spleißen der mRNA-Spezies zum Erhalt multipler Transkripte unzweideutig sequenziert werden (Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8998-9002 (1988)). Die Klonierung von mittels PCR erzeugter Proben zur Herstellung von cDNA-Bibliotheken kann ebenfalls erwünscht sein. Im allgemeinen kann von einer Vorgehensweise, bei der PCR-Produkte kloniert werden, erwartet werden, daß gegenüber der alleinigen Anwendung der PCR ein kleinerer Satz von Produkten erzeugt wird, wodurch der mit der direkten Sequenzierung von PCR-Produkten zusammenhängende Hintergrund reduziert wird.
Bei dem bekanntesten Verfahren zur Klonierung von PCR-Produkten werden die Enden von Primer-Molekülen mit flankierenden Restriktionsstellen versehen. Der PCR-Zyklus wird ausgeführt, und die amplifizierte DNA wird anschließend gereinigt, mit (einer) geeigneten Endonuklease(n) geschnitten und mit einer kompatiblen Vektor-Präparation ligiert. Demgemäß erfordern typische PCR-Klonierungsverfahren die Herstellung von PCR-Primer-Molekülen, an die zusätzliche Basensequenzen mit einer bevorzugten Restriktions-Erkennungssequenz angefügt sind. Ferner können diese Verfahren zu einer nicht beabsichtigten internen Restriktion von nicht-charakterisierten oder polymorphen Sequenzen' führen. Derartige Beschränkungen der vorhergehenden Verfahren kommen zu den Kosten und der Komplexität der routinemäßigen Klonierung von PCR-Produkten hinzu.
Kürzlich ist berichtet worden, daß die Taq-Polymerase die nicht unter Verwendung einer Matrize erfolgte Addition von einzelnen Desoxyadenosinmonophosphat (dAMP)-Resten an die 3'-Termini von glattendigen DNA-Duplexformen katalysiert (J.M. Clark, Nucl. Acids Res. 20:9677-9686 (1989)). Demgemäß erzeugt die Taq-Polymerase (und andere thermostabile Polymerasen) auf natürliche Weise Restriktions-ähnliche Termini an DNA-Fragmenten. Da diese überhängenden Reste jedoch weitläufig als mit den meisten Vorgehensweisen zur molekularen Klonierung inkompatibel angesehen werden, werden die Reste routinemäßig mit Nuklearen wie 51, Klenow und T4 entfernt, um glatte Enden zu erzeugen.
In Anbetracht der vorhergehenden Überlegungen ist ein Verfahren zur direkten Klonierung von terminale 3'-dAMP-Reste enthaltenden PCR-Produkten in geeignete Plasmide erwünscht. Ein derartiges Verfahren würde das Erfordernis der Herstellung von Primern mit Restriktions-Erkennungssequenzen und das Erfordernis einer Restriktion zur Herstellung des PCR-Produkts zur Klonierung eliminieren.
Zusätzlich würde ein derartiges Verfahren vorzugsweise die direkte Klonierung von PCR-Produkten ohne einen zwischengeschalteten Reinigungsschritt erlauben.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Klonierung eines Polymerasekettenreaktion (PCR)-amplifizierten Nukleinsäuremoleküls, bei dem man:

a) ein DNA-Zielsegment einer PCR-Amplifikation unterzieht, sodass eine Mehrzahl von doppelsträngigen Nukleinsäuren gebildet wird, die das Segment umfassen, wobei jede doppelsträngige Nukleinsäure einen einzelnen überhängenden 3'-dAMP-Rest aufweist;
b) eine Population von rekombinanten Nukleinsäuremolekülen erzeugt, wobei die Population die doppelsträngigen Produkt-Nukleinsäuremoleküle und mindestens ein lineares Nukleinsäuremolekül umfaßt, wobei das mindestens eine lineare Nukleinsäuremolekül einen einzelnen 3'-überhängenden Rest an mindestens einem Terminus umfaßt, wobei der Rest ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Inosinenthaltenden Rest und einem Uracil-enthaltenden Rest; und
c) eine geeignete Wirtszelle mit der Population von rekombinanten Nukleinsäuremolekülen transformiert.

Gemäß eines noch weiteren Aspekts betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Klonierung eines Polymerasekettenreaktion (PCR)-amplifizierten Nukleinsäuremoleküls, bei dem man:

a) ein DNA-Zielsegment einer PCR-Amplifikation unterzieht, sodass eine Mehrzahl von doppelsträngigen Nukleinsäuren gebildet wird, die das Segment umfassen, wobei jede doppelsträngige Nukleinsäure einen einzelnen überhängenden 3'-dAMP-Rest aufweist;
b) eine Population von rekombinanten Nukleinsäuremolekülen erzeugt, wobei die Population die doppelsträngigen Produkt-Nukleinsäuremoleküle und mindestens ein lineares Nukleinsäuremolekül umfaßt, das einen einzelnen 3'-überhängenden Rest umfaßt, der kein dGMP-Rest, kein dAMP-Rest und kein dCMP-Rest ist; und
c) eine geeignete Wirtszelle mit der Population von rekombinanten Nukleinsäuremolekülen transformiert.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Ziel-DNA-Segment ein Gen. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird eine geeignete Wirtszelllinie mit dem Gen transformiert, und das Gen wird unter vorbestimmten Reaktionsbedingungen gehalten, welche die Expression des Gens erlauben.
Die vorliegende Erfindung bietet demgemäß neue Verfahren und damit zusammenhängende Plasmide und Kits zur direkten Klonierung rekombinanter DNA-Moleküle von Polynukleotiden, die terminale 3'-Desoxy-AMP-Reste aufweisen, wie solchen, die durch PCR-Amplifikation gebildet werden. Es können amplifizierte Nukleinsäuren aus genomischer DNA, cDNA, oder rekombinanten Vektoren, die DNA-Inserts besitzen, wie A-Phagen, Cosmide und YACS, eingesetzt werden. Die vorliegenden Klonierungsverfahren erlauben über die Zelltransformation die Herstellung großer Mengen an genetischem Material, wodurch die direkte Sequenzierung langer Nukleotidsequenzen ausführbar wird.
Die durch die vorliegende Erfindung erhaltenen Sequenzinformationen sind aufgrund spezifischerer Ligationsreaktionen und einer reduzierten Anzahl von Restriktionsfragmenten zuverlässiger als solche, die zuvor anhand der direkten Sequenzierung von PCR-Amplifikationsprodukten erhältlich waren. Derartige Verfahren sind insbesondere geeignet bei der Klonierung von cDNA. Durch die vorliegenden Verfahren werden ferner verbesserte Matrizen zur Synthese von Sonden, die bei der genetischen Kartierung und bei der Klonierung geeignet sind, sowie Kopien kritischer diagnostischer Proben bereitgestellt, wie z.B. bei der Erstellung genetischer Fingerabdrücke. Ferner werden derzeitige PCR-Protokolle durch die vorliegende Erfindung kostengünstiger und einfacher, da das Erfordernis der Synthese von Primer-Sequenzen mit spezifischen Erkennungssequenzen als auch das Erfordernis damit zusammenhängender Restriktionen beseitigt werden.
KURE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A zeigt einen beispielhaften Klonierungsvektor, der erfindungsgemäß hergestellt wurde. Die Genkarten des Wirtsvektors (pT7T319U) und des klonierten Vektors (pTA12) sind dargestellt.
1B zeigt eine repräsentative DNA-Sequenz von Plasmiden, die erfindungsgemäß hergestellt worden sind. Die Plasmide werden mit zwei XcmI-Restriktionsschnittstellen zwischen HindIII- und EcoRI-Stellen bereitgestellt. Ferner sind das Ergebnis der Spaltung mit XcmI sowie das Ergebnis der Ligation mit einem 3'-dAMP-PCR-amplifizierten Produkt dargestellt.
2A ist ein Diagramm, welches die Herstellung eines Vektors zeigt, der 2 HphI-Schnittstellen enthält.
Der Vektor ist gegenüber Kanamycin resistent und besitzt ein Farbindikatorsystem (β-Galaktosidase).
2B zeigt eine repräsentative DNA-Sequenz von Plasmiden, die derart hergestellt sind, daß sie auf beiden Seiten einer EcoRV-Erkennungsstelle eine HphI-Restriktionsschnittstelle umfassen. Eine HphI-Schnittstelle ist im Wirtsvektor vorhanden, während die zweite HphI-Schnittstelle durch ein insertiertes Oligonukleotid bereitgestellt wird. Ferner sind das Ergebnis eines Verdaus mit HphI sowie das Ergebnis der Ligation mit Nukleinsäuren mit terminalen 3'-dAMP dargestellt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
A. Definitionen
Basenpaar (bp):
eine Partnerschaft von Adenin (A) und Thymin (T), oder von Cytosin (C) und Guanin (G) in einem doppelsträngigen DNA-Molekül. In einer RNA ist Thymin durch Uracil (U) substituiert. Basenpaare werden als "komplementär" bezeichnet, wenn deren Basen sich normal paaren, wenn ein DNA- oder RNA-Molekül eine doppelsträngige Konfiguration annimmt.
Komplementäre Nukleotidsequenz:
eine Sequenz von Nukleotiden in einem einzelsträngigen DNA- oder RNA-Molekül, die ausreichend komplementär zu einem anderen Einzelstrang ist, um in spezifischer Weise (nicht zufällig) mit ihr unter nachfolgender Wasserstoffbindung zu hybridisieren.
Konserviert:
eine Nukleotidsequenz ist mit Bezug auf eine vorher ausgewählte (Bezugs-)Sequenz konserviert, wenn sie nicht zufällig mit einem exakten Komplement der vorher ausgewählten Sequenz hybridisiert.
Duplex-DNA:
ein doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das zwei Stränge von im wesentlichen komplementären Polynukleotiden umfaßt, welche durch eine oder mehrere Wasserstoffbrücken zwischen jeder der in einem Basenpaar der Duplexform vorhandenen komplementären Basen zusammengehalten werden. Da die ein Basenpaar bildenden Nukleotide entweder eine Ribonukleotidbase oder eine Desoxyribonukleotidbase sein können, bezieht sich der Begriff "Duplex-DNA" entweder auf eine zwei DNA-Stränge (das DNA) umfassende DNA-DNA-Duplexform oder auf eine RNA-DNA-Duplexform, die einen DNA- und einen RNA-Strang umfaßt.
Gen:
eine Nukleinsäure, deren Nukleotidsequenz für ein RNA-, DNA- oder Polypeptidmolekül kodiert. Gene können ununterbrochene Sequenzen von Nukleotiden sein, oder sie können solche intervenierenden Segmente wie Introns, Promotor-Regionen, Spleißstellen und repetitive Sequenzen einschließen. Ein Gen kann entweder in RNA- oder DNA-Form vorliegen.
Hybridisierung:
die Paarung von komplementären Nukleotidsequenzen (Nukleinsäuresträngen) zur Bildung einer Duplex-, Heteroduplex- oder Komplexform, welche mehr als zwei einzelsträngige Nukleinsäuren enthält, durch Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen/unter komplementären Basenpaaren.
Die Hybridisierung ist eine spezifische, d.h. nicht zufällige Interaktion zwischen/unter komplementären Polynukleotiden, die kompetitiv inhibiert werden kann.
Hybridisierungsprodukt:
das Produkt (auch mit "Hybrid" oder '"Duplexform" bezeichnet) bildet sich, wenn ein Polynukleotid mit einer einzel- oder doppelsträngigen Nukleinsäure hybridisiert. Wenn ein Polynukleotid mit einer doppelsträngigen Nukleinsäure hybridisiert, wird das gebildete Hybridisierungsprodukt als Tripelhelix oder als tripelsträngiges Nukleinsäuremolekül bezeichnet (Moser et al., Science, 238:645-650 (1987)).
Nukleotid:
eine monomere DNA- oder RNA-Einheit, die aus einem Zuckerrest (Pentose), einer Phosphatgruppe und einer stickstoffhaltigen heterocyclischen Base besteht. Die Base ist mit dem Zuckerrest über den glykosidischen Kohlenstoff (1'-Kohlenstoff der Pentose) verknüpft, und diese Kombination aus Base und Zucker ist ein Nukleosid. Wenn das Nukleosid eine Phosphatgruppe enthält, die an die 3'- oder 5'-Position der Pentose gebunden ist, wird es als Nukleotid bezeichnet. Eine Sequenz von in funktionsfähiger Weise verknüpften Nukleotiden wird vorliegend typischerweise als "Basensequenz" oder "Nukleotidsequenz" bzw. mit deren grammatikalischen Äquivalenten bezeichnet, und wird vorliegend anhand einer Formel dargestellt, deren Orientierung von links nach rechts in der üblichen Richtung vom 5'-Terminus zum 3'-Terminus angegeben ist.
Nukleotidanalag:
ein Purin- oder Pyrimidin-Nukleotid, das sich hinsichtlich seiner Struktur von einer A-, T-, G-, C- oder U-Base unterscheidet, das aber hinreichend ähnlich ist, um das normale Nukleotid in einem Nukleinsäuremolekül zu substituieren.
Inosin (I) ist ein Nukleotidanalog, das mit jedem der anderen Nukleotide A, T, G, G oder U Wasserstoffbrücken ausbilden kann. Ferner sind methylierte Basen bekannt, die bei einer Nukleinsäure-Hybridisierung beteiligt sein können.
Polynukleotid:
ein Polymer aus einzel- oder doppelsträngigen Nukleotiden. Vorliegend schließen der Begriff "Polynukleotid" und dessen grammatikalische Äquivalente die volle Bandbreite von Nukleinsäuren ein. Typischerweise bezieht sich ein Polynukleotid auf ein Nukleinsäuremolekül, das aus einem linearen Strang von zwei oder mehreren Desoxyribonukleotiden und/oder Ribonukleotiden aufgebaut ist. Die exakte Größe ist von vielen Faktoren abhängig, welche ihrerseits von den tatsächlichen Anwendungsbedingungen abhängen, wie im Stand der Technik hinreichend bekannt ist. Die erfindungsgemäßen Polynukleotide schließen Primer, Sonden, RNA/DNA-Segmente, Oligonukleotide (relativ kurze Polynukleotide), Gene, Vektoren, Plasmide und dergleichen ein.
Primer:
ein Polynukleotid, entweder aus einem Restriktionsansatz einer Nukleinsäure gereinigt oder synthetisch hergestellt, das in der Lage ist, als Initiationspunkt der Synthese zu wirken, wenn Bedingungen vorliegen, bei denen die Synthese eines zu einem Nukleinsäurestrang als Matrize komplementären Primer-Extension-Produkts induziert wird, d.h. in Anwesenheit von Nukleotiden und einem Mittel zur Polymerisation, wie DNA-Polymerase, reverse Transkriptase und dergleichen, unter geeigneten Temperatur- und pH-Reaktionsbedingungen.
Rekombinantes DNA (rDNA)-Molekül:
ein durch funktionsfähige Verknüpfung einer Nukleinsäuresequenz wie einem Gen mit einer erfindungsgemäßen Sequenz eines DNA-Moleküls hergestelltes DNA-Molekül.
Demgemäß ist ein rekombinantes DNA-Molekül ein DNA-Hybridmolekül, welches mindestens zwei Nukleotidsequenzen umfaßt, die in der Natur normalerweise nicht zusammen angetroffen werden. rDNAs, die keinen gemeinsamen biologischen Ursprung aufweisen, d.h. evolutionär unterschiedlich sind, werden als "heterolog" bezeichnet.
Vektor:
ein DNA-Molekül, welches in der Lage ist, sich in einer Zelle autonom zu replizieren, und mit welchem ein DNA-Segment wie z.B. ein Gen oder ein Polynukleotid in funktionsfähiger Weise verknüpft werden kann, um eine Replikation des angefügten Segments zu gewährleisten. Vektoren, die in der Lage sind, die Expression von Genen zu steuern, welche für ein oder mehrere Proteine kodieren, werden vorliegend als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Besonders wichtige Vektoren erlauben die Klonierung von cDNA (komplementäre DNA) aus mRNAs unter Verwendung von reverser Transkriptase.
B. DNA-Segmente
In lebenden Organismen steht die Aminosäuresequenz eines Proteins oder Polypeptids über den genetischen Kode in direktem Zusammenhang mit der Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Sequenz des Strukturgens, das für das Protein kodiert. Demgemäß kann ein Strukturgen durch die Aminosäuresequenz, d.h. Protein oder Polypeptid, definiert werden, für die es kodiert.
Ein wichtiges und bekanntes Merkmal des genetischen Kodes ist seine Redundanz. Dies bedeutet, daß für die meisten der zur Herstellung von Proteinen verwendeten Aminosäuren mehr als ein kodierendes Nukleotid-Triplett (Kodon) kodieren oder einen bestimmten Aminosäurerest bestimmen kann.
Demgemäß kann eine Reihe von unterschiedlichen Nukleotidsequenzen für eine bestimmte Aminosäuresequenz kodieren. Derartige Nukleotidsequenzen werden als funktionell äquivalent betrachtet, da sie in allen Organismen zur Produktion derselben Aminosäuresequenz führen. Gelegentlich kann eine methylierte Variante eines Purins oder Pyrimidins in eine gegebene Nukleotidsequenz eingebaut werden. Solche Methylierungen beeinflussen die Kodierungseigenschaften jedoch in keiner Weise. Eine erfindungsgemäße DNA-Zielsequenz umfaßt nicht mehr als etwa 2000 Nukleotid-Basenpaare und kann ein Strukturgen einschließen. Gewöhnlich liegt die DNA-Sequenz in Form einer ununterbrochenen, linearen Abfolge von Kodons vor, bei der jedes Kodon für einen Aminosäurerest kodiert, d.h., daß die DNA-Sequenz keine Introns enthält.
C. PCR-Primer
Erfindungsgemäß wird die nachfolgend beschriebene PCR-Technik angewendet, um größere Mengen einer Ziel-Nukleotidsequenz zu erzeugen. Bei der PCR-Technik werden zur Initiation der Primer-Elongationsreaktion Primer-Moleküle eingesetzt. Der Primer muß ausreichend lang sein, um die Synthese von Extensionsprodukten in Gegenwart der Polymerisationsmittel zu starten. Die exakten Längen der Primer sind von vielen Faktoren abhängig, einschließlich der Temperatur und der Quelle des Primers. Beispielsweise enthält ein Polynukleotid-Primer in Abhängigkeit der Komplexität der Matrizen-Sequenz typischerweise 15 bis 25 oder mehr Nukleotide, obgleich er weniger Nukleotide enthalten kann. Es ist berichtet worden, daß eine Verwendung von 8 Nukleotiden in einem Polynukleotid-Primer effektiv ist (Studier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6917-6921 (1989)). Kurze Primer-Moleküle benötigen im allgemeinen niedrigere Temperaturen, um mit einer Matrize ausreichend stabile Hybridisierungskomplexe zur Initiation der Primer-Extension zu bilden.
Die vorliegend verwendeten Primer werden so ausgewählt, daß sie "im wesentlichen" komplementär zu den verschiedenen Strängen einer jeden zu synthetisierenden oder zu amplifizierenden spezifischen Sequenz sind. Folglich muß der Primer an seinem 3'-Terminus eine Nukleotidsequenz enthalten, die ausreichend komplementär ist, um mit ihrem entsprechenden Matrizen-Strang in nicht zufälliger Weise zu hybridisieren. Demgemäß kann es sein, daß die Primer-Sequenz nicht die exakte Sequenz der Matrize widerspiegelt. Beispielsweise kann an das 5'-Ende des Primers ein nicht komplementäres Polynukleotid angefügt werden, wobei der Rest der Primer-Sequenz im wesentlichen komplementär zu dem Strang ist. Derartige nicht komplementäre Polynukleotide könnten für eine Stelle zur Proteinbindung kodieren oder einfach eingesetzt werden, um den Leserahmen der Kodons einzustellen. Alternativ können in den Primer nicht komplementäre Basen oder längere Sequenzen unter der Voraussetzung eingeführt werden, daß die Primer-Sequenz hinreichend komplementär zu der Sequenz des Matrizen-Strangs ist, um eine nicht zufällige Hybridisierung herbeizuführen, so daß unter Bedingungen zur Synthese von Polynukleotiden ein Extensionsprodukt gebildet werden kann.
Sommer et al., Nucl. Acid. Res., 17:6749 (1989), berichten, daß Primer, die an ihrem 3'-Ende eine exakte Paarung über nur drei Nukleotide aufweisen, in der Lage sind, die Primer-Extensionsprodukte in spezifischer Weise zu initiieren, obgleich es zu einer weniger unspezifischen Hybridisierung kommt, wenn der Primer an seinem 3'-Ende mehr Nukleotide aufweist, die zu der Matrizen-Sequenz exakt komplementär sind. Demgemäß muß ein im wesentlichen komplementärer Primer, wie er vorliegend verwendet wird, an seinem 3'-Ende mindestens drei Nukleotide enthalten, die zu der Matrizen-Sequenz exakt komplementär sind.
Ein im wesentlichen komplementärer Primer umfaßt an seinem 3'-Ende vorzugsweise mindestens 10 Nukleotide, noch bevorzugter mindestens 18 Nukleotide, und am meisten bevorzugt mindestens 24 Nukleotide mit der vorgenannten Komplementarität. Noch bevorzugter sind Primer, deren gesamte Nukleotidsequenz zu der Matrizen-Sequenz exakt komplementär ist.
Die Auswahl der Nukleotidsequenz eines Primers ist abhängig von Faktoren wie dem Abstand zwischen der Region auf der Nukleinsäure, die für die gewünschte spezifische Nukleinsäuresequenz, welche in einer interessierenden Nukleinsäure vorhanden ist, kodiert, und ihrer Hybridisierungsstelle auf der Nukleinsäure in Bezug zu irgendeinem zweiten zu verwendenden Primer.
Der Primer wird für eine maximale Effizienz vorzugsweise in einzelsträngiger Form bereitgestellt, er kann alternativ aber auch doppelsträngig sein. Wenn der Primer doppelsträngig ist, wird er zunächst zur Auftrennung seiner Stränge behandelt, bevor er zur Herstellung von Extensionsprodukten eingesetzt wird. Vorzugsweise ist der Primer ein Polydesoxyribonukleotid.
Polynukleotide können nach einer Vielzahl von Verfahren hergestellt werden, einschließlich chemischer de novo-Synthese und Ableitung von Nukleinsäurefragmenten von nativen Nukleinsäuresequenzen, die als Gene oder Teile von Genen in einem Genom, Plasmid oder einem anderen Vektor vorkommen, wie durch Restriktionsendonuklease-Verdau von größeren doppelsträngigen Nukleinsäuren und Strangtrennung oder durch enzymatische Synthese unter Verwendung einer Nukleinsäure-Matrize.
Die chemische de novo-Synthese eines Polynukleotids kann unter Anwendung eines beliebigen geeigneten Verfahrens durchgeführt werden, wie z.B. den Phosphortriester- oder Phosphordiester-Verfahren. Vgl. Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90 (1979); US-Patent Nr. 4,356,270; Itakura et al., Ann. Rev. Biochem., 53:323-356 (1989); und Brown et al., Meth. Enzymol., 68:109 (1979).
Die Ableitung eines Polynukleotids von Nukleinsäuren beinhaltet die Klonierung einer Nukleinsäure in einem geeigneten Wirt mittels eines Klonierungsvektors, die Replikation des Vektors und somit die Vervielfachung der Menge an klonierter Nukleinsäure, und die anschließende Isolierung von Subfragmenten der klonierten Nukleinsäuren. Zur Beschreibung der Subklonierung von Nukleinsäurefragmenten, vgl. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 390-401 (1982); und vgl. US-Patente Nrn. 4,416,988 und 4,403,036.
D. Hybridisierung
Nach den vorliegenden Verfahren zu hybridisierende Matrizen-Nukleinsäuresequenzen können in einer beliebigen Nukleinsäurehaltigen Probe vorhanden sein, solange die Probe in einer Form vorliegt, welche im Hinblick auf Reinheit und Konzentration mit der Nukleinsäure-Hybridisierungsreaktion kompatibel ist.
Die Isolierung von Nukleinsäuren in einem für Hybridisierungszwecke geeigneten Ausmaß ist allgemein bekannt und kann in unterschiedlicher Weise erfolgen. Beispielsweise können Nukleinsäuren aus einer Vielzahl von Nukleinsäure-haltigen Proben einschließlich Körpergewebe, wie Haut, Muskel, Haar und dergleichen, und Körperflüssigkeiten wie Blut, Plasma, Urin, Amnionflüssigkeiten, Cerebrospinalflüssigkeiten und dergleichen, isoliert werden. Vgl. z.B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982); und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons (1987).
Die Hybridisierungsreaktionsmischung wird für einen Zeitraum unter Hybridisierungsbedingungen gehalten, der ausreicht, damit der Primer mit komplementären Nukleinsäuresequenzen, die in der Probe vorhanden sind, unter Bildung eines Hybridisierungsprodukts, d.h. eines Komplexes, der Primer- und Matrizen-Nukleinsäurestränge enthält, hybridisiert.
Sofern der Begriff "Hybridisierungsbedingungen" und seine grammatikalischen Äquivalente im Zusammenhang mit einem Zeitraum der Beibehaltung verwendet werden, verweisen sie darauf, dass die Hybridisierungsreaktionsmischung im Zusammenhang mit den Konzentrationen von Reaktanten und begleitenden Reagenzien in der Mischung Zeit-, Temperatur- und pH-Bedingungen unterzogen wird, die ausreichen, um dem Primer das Annealing mit der Matrizen-Sequenz zu erlauben, wobei typischerweise eine Nukleinsäure in Duplexform gebildet wird. Derartige Zeit-, Temperatur- und pH-Bedingungen, die zur Herbeiführung der Hybridisierung erforderlich sind, hängen bekanntermaßen von der Länge des zu hybridisierenden Primers, dem Ausmaß der Komplementarität zwischen dem Primer und der Matrize, dem Guanosin- und Cytidin-Gehalt des Polynukleotids, der erwünschten Stringenz der Hybridisierung, und der Anwesenheit von Salzen oder zusätzlichen Reagenzien in der Hybridisierungsreaktionsmischung ab, durch die die Kinetiken der Hybridisierung beeinflußt werden. Verfahren zur Optimierung von Hybridisierungsbedingungen für eine gegebene Hybridisierungsreaktionsmischung sind im Stand der Technik hinreichend bekannt.
Typische Hybridisierungsbedingungen schließen die Verwendung von Lösungen ein, die auf pH-Werte zwischen 4 und 9 gepuffert sind, und werden bei Temperaturen von 18 °C bis 75 °C, vorzugsweise etwa 37 °C bis etwa 65 °C, noch bevorzugter bei etwa 54 °C, und für einen Zeitraum von 0,5 Sekunden bis 24 Stunden, vorzugsweise für 2 Minuten durchgeführt.
Die Hybridisierung kann bekanntermaßen in einem homogenen oder heterogenen Format durchgeführt werden. Die homogene Hybridisierungsreaktion erfolgt vollständig in Lösung, in der sowohl die Primer- als auch die Matrizen-Sequenzen, die hybridisiert werden sollen, in löslicher Form in Lösung vorhanden. sind. Eine heterogene Reaktion beinhaltet die Verwendung einer in dem Reaktionsmedium unlöslichen Matrix, an die entweder der Primer oder die Matrize gebunden ist.
Ebenfalls bevorzugt sind die homogenen Hybridisierungsreaktionen, wie sie bei einer reversen Transkription von isolierter mRNA oder viraler RNA zur Bildung einer cDNA, bei der Didesoxy-Sequenzierung und bei anderen Verfahren unter Anwendung von Primer-Extension-Reaktionen verwendet werden, bei denen die Primer-Hybridisierung einen ersten Schritt darstellt. Besonders bevorzugt ist die homogene Hybridisierungsreaktion, bei der die Matrize über eine Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert wird.
Wenn die Nukleinsäure, die eine Matrizen-Sequenz enthält, in doppelsträngiger (ds) Form vorliegt, ist es bevorzugt, die dsDNA zunächst z.B. durch Erhitzen oder Alkali-Behandlung zu denaturieren, bevor die Hybridisierungsreaktion durchgeführt wird. Die Denaturierung der dsDNA kann vor dem Vermischen mit einem zu hybridisierenden Primer erfolgen, oder sie kann nach der Vermischung der dsDNA mit dem Primer durchgeführt werden. Wenn der Primer selbst in Form eines doppelsträngigen Moleküls bereitgestellt wird, kann auch er vor dem Beimischen denaturiert werden, oder er kann gleichzeitig mit der dSDNA denaturiert werden, welche die Matrize enthält.
E. Primer-Extension-Reaktionen
Die mit einem Primer versehene Matrize kann verwendet werden, um einen Nukleinsäurestrang mit einer Nukleotidsequenz, die zu der Matrize komplementär ist, d.h. ein Matrizen-Komplement, herzustellen.
Wenn die Matrize, dessen Komplement hergestellt werden soll, in Form einer doppelsträngigen Nukleinsäure vorliegt, wird sie zunächst gewöhnlich durch Schmelzen zu Einzelsträngen wie ssDNR denaturiert. Die Nukleinsäure wird anschließend einer (ersten) Primer-Extension-Reaktion zugeführt, indem die Nukleinsäure mit einem (ersten) Primer zur Polynukleotidsynthese behandelt (kontaktiert) wird, der als Teil seiner Nukleotidsequenz eine Sequenz aufweist, die als im wesentlichen komplementär zu einem Bereich der Sequenz der Matrize ausgewählt ist. Der Primer ist in der Lage, eine Primer-Extension-Reaktion zu initiieren, indem er mit einer spezifischen Nukleotidsequenz hybridisiert, vorzugsweise über eine Länge von mindestens etwa 8 Nukleotiden und noch bevorzugter über eine Länge von mindestens etwa 20 Nukleotiden. Dies geschieht durch Vermischen einer wirksamen Menge des Primers mit der Matrizen-Nukleinsäure und einer wirksamen Menge von Nukleotid-Reaktanten, um eine Primer-Extension-Reaktionsmischung zu bilden. Die Mischung wird für einen Zeitraum unter Bedingungen zur Synthese von Polynukleotiden gehalten, welche typischerweise vorbestimmt ist und zur Bildung eines Primer-Extension-Reaktionsprodukts ausreicht.
Die Primer-Extensionsreaktion wird unter Anwendung irgendeines geeigneten Verfahrens durchgeführt. Im allgemeinen sind Bedingungen zur Synthese von Polynukleotiden solche, bei denen die Reaktion in einer gepufferten wäßrigen Lösung abläuft, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7-9, noch bevorzugter bei einem pH-Wert von etwa 8.
Vorzugsweise wird ein molarer Überschuß (für genomische Nukleinsäure gewöhnlich etwa 10⁶:1 Primer: Matrize) des Primers mit dem Puffer vermischt, welcher den Matrizen-Strang enthält. Ein großer molarer Überschuß wird bevorzugt, um die Effizienz des Verfahrens zu verbessern. Im Falle von Polynukleotid-Primern mit einer Länge von etwa 20 bis 25 Nukleotiden liegt ein typisches Verhältnis im Bereich von 50 ng zu 1 μg, vorzugsweise 250 ng, Primer pro 100 ng bis 500 ng genomischer Säuger-DNA oder pro 10 bis 50 ng Plasmid-DNA.
Die Desoxyribonukleotidtriphosphate (dNTPs) dATP, dCTP, dGTP und dTTP werden der Primer-Extension-Reaktionsmischung ebenfalls in Mengen beigemischt, die angemessen sind, um die Synthese der Primer-Extension-Produkte zu unterstützen, wobei diese von der Größe und Anzahl der zu synthetisierenden Produkte abhängen. Die resultierende Lösung wird für etwa 1 bis 10 Minuten, vorzugsweise für 1 bis 4 Minuten auf etwa 90 °C-100 °C erhitzt. Nach diesem Erhitzen läßt man die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen, die für die Primer-Hybridisierung bevorzugt wird. Zu der abgekühlten Mischung wird ein geeignetes Mittel zur Induktion oder zur Katalyse der Primer-Extension gegeben, und man läßt die Reaktion unter bekannten Bedingungen ablaufen. Die Synthesereaktion kann bei Raumtemperatur bis zu einer Temperatur erfolgen, oberhalb derer das Induktionsmittel nicht mehr effizient arbeitet. Demgemäß liegt die Temperatur im Falle der Verwendung einer DNA-Polymerase als Induktionsmittel gewöhnlich nicht höher als etwa 40 °C, sofern die Polymerase nicht hitzestabil ist.
Das Induktionsmittel kann irgendeine Verbindung oder irgendein System sein, das zur Synthese von Primer-Extension-Produkten führt, einschließlich Enzyme. Geeignete Enzyme für diesen Zweck schließen z.B. E. coli DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment der E. coli DNA-Polymerase I, T4-DNA-Polymerase, T7-DNA-Polymerase, rekombinante modifizierte T7-DNA-Polymerase, ande re verfügbare DNA-Polymerasen, reverse Transkriptase, und andere Enzyme ein, einschließlich hitzestabile Enzyme, die eine Kombination der Nukleotide in der korrekten Weise derart vereinfachen, daß die zu jedem Nukleinsäurestrang komplementären Primer-Extension-Produkte gebildet werden.
Hitzestabile (thermophile) DNA-Polymerasen sind besonders bevorzugt, da sie in der am meisten bevorzugten Ausführungsform, bei der die PCR in einer einzigen Lösung durchgeführt und die Temperatursteuerung zyklisch erfolgt, stabil sind. Repräsentative hitzestabile Polymerasen sind DNA-Polymerasen, die aus Bacillus stearothermophilus (BioRad, Richmond, CA), Thermus thermophilus (FINZYME, ATCC #27634), Thermus species (ATCC #31674), Thermus aquaticus-Stamm TV 1151B (ATCC #25105), Sulfolobus acidocaldarius, beschrieben von Bukhrashuili et al., Biochem. Biophys. Acta. 1008:102-107 (1989), und von Elie et al., Biochem. Biophys. Acta. 951:261-267 (1988), Thermus filiformis (ATCC #43280), isoliert sind, sowie die aus Thermus flavus isolierte Polymerase (Molecular Biology Resources, Milwaukee, WI), und "Vent"-Polymerasen (New England Biolabs, Beverly, MA). Besonders bevorzugt sind die Taq-DNA-Polymerasen, die aus einer Vielzahl von Quellen einschließlich Perkin-Elmer Cetus (Norwalk, CT), Promega (Madison, WI) und Stratagene (La Jolla, CA) erhältlich sind, und die AmpliTaq^TM-DNA-Polymerase, eine von Perkin-Elmer Cetus erhältliche rekombinante Taq-DNA-Polymerase.
In einer bevorzugten Ausführungsform dient die ausgewählte Polymerase als eine 3'-terminale Transferase, welche in der Lage ist, eine doppelsträngige Nukleinsäure mit einem einzelnen, überhängenden Nukleotidrest zu versehen. Nach einer am meisten bevorzugten Ausführungsform wird einer nicht mit einer Matrize versehenen Nukleinsäure durch die Transferase ein 3'-Adenosinrest angefügt, wie es durch die Taq-Polymerase geschieht.
In alternativen Ausführungsformen werden durch die Transferase andere Nukleoside angefügt, z.B. Guanosin, Cytidin, Thymidin.
Durch die vorliegende Erfindung wird jegliches Nukleinsäuresegment in Betracht gezogen, das von einer Polymerase entweder in vitro oder in vivo gebildet worden ist. Jede Polymerase, die in der Lage ist, eine doppelsträngige Nukleinsäure mit einem vorstehenden 3'-terminalen AMP zu produzieren, wodurch dessen Einführung in einen erfindungsgemäßen Vektor erleichtert wird, ist für die Ausführung der Erfindung geeignet. Besonders bevorzugt sind DNA-abhängige DNA-Polymerasen und RNA-abhängige DNA-Polymerasen. DNA-abhängige DNA-Polymerasen umfassen die Taq-Polymerase.
Im allgemeinen wird die Synthese am 3'-Ende eines jeden Primers initiiert und schreitet in 5'-Richtung entlang des Matrizen-Strangs fort, bis die Synthese, bei der Moleküle verschiedener Längen produziert werden, beendet wird. Es können jedoch bei Anwendung desselben, oben beschriebenen Verfahrens Induktionsmittel zugegen werden, welche die Synthese am 5'-Ende initiieren und in der obigen Richtung voranschreiten lassen.
Das Primer-Extension-Reaktionsprodukt kann anschließend einer zweiten Primer-Extension-Reaktion zugeführt werden, indem es mit einem zweiten Primer zur Polynukleotidsynthese behandelt wird, welcher eine voreselektierte Nukleotidsequenz aufweist. Der zweite Primer ist in der Lage, die zweite Reaktion zu initiieren, indem er mit einer in dem ersten Produkt gefundenen Nukleotidsequenz hybridisiert, das vorzugsweise eine Länge von mindestens etwa 8 Nukleotiden und noch bevorzugter eine Länge von mindestens etwa 20 Nukleotiden aufweist. Dies erfolgt durch Vermischen des zweiten Primers, vorzugsweise einer vorbestimmten Menge davon, mit dem ersten Produkt, vorzugsweise mit einer vorbestimmten Menge davon, um eine zweite Primer-Extension-Reaktionsmischung zu bilden.
Die Mischung wird unter Bedingungen zur Polynukleotidsynthese für einen Zeitraum gehalten, welcher typischerweise vorbestimmt ist und zur Bildung eines zweiten Primer-Extension-Reaktionsprodukts ausreicht.
In bevorzugten Strategien sind die ersten und zweiten Primer-Extension-Reaktionen die ersten und zweiten Primer-Extension-Reaktionen in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
Die PCR wird durchgeführt, indem die oben beschriebenen ersten und zweiten Primer-Extension-Reaktionen zyklisch, d.h. sequentiell in einer Mischung durchgeführt werden, wobei jeder Zyklus eine Polynukleotidsynthese und eine nachfolgende Denaturierung der gebildeten doppelsträngigen Polynukleotide umfaßt. Verfahren und Systeme zur Amplifikation einer spezifischen Nukleinsäuresequenz sind beschrieben in den US-Patenten Nr. 4,683,195 und Nr. 4,683,202 von Mullis et al., und den Lehren in PCR Technology. Ehrlich, Hrsg., Stockton Press (1989), Faloona et al., Methods in Enzymol., 155:335-350 (1987), und Polymerase Chain Reaction, Ehrlich et al., Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratories Press (1989).
F. PCR-Zyklus
Die PCR erfolgt durch zyklische Abfolge der folgenden Schritte in einer Mischung: 1) Denaturierungsschritt zur Bildung einzelsträngiger Matrizen, 2) Hybridisierungsschritt zur Hybridisierung eines Primers mit ss-Matrize, und 3) Primer-Extension-Schritte zur Bildung des verlängerten Produkts. Die PCR wird in der obigen Sequenz (Zyklus) durchgeführt, indem die Temperatur der PCR-Mischung nacheinander jeweils so verändert wird, daß sie mit jedem Schritt kompatibel ist.
Die Reaktionsbedingungen für die Primer-Extension beinhalten das Halten der Reaktionsmischung für einen Zeitraum und bei einer Temperatur, die zur Herbeiführung einer DNA-Polymerase-vermittelten Primer-Extension zur Bildung von Primer-Extension-Produkten ausreichen, wie im Stand der Technik bekannt ist. Die Bedingungen zur Durchführung einer Primer-Extension sind hinreichend bekannt. In einem PCR-Format wird das Halten rasch durchgeführt, um zahlreiche Zyklen zu ermöglichen, in etwa 1 Sekunde bis 5 Minuten, vorzugsweise etwa 1,5 Minuten, und bei etwa 40 °C bis 75 °C, vorzugsweise bei etwa 72 °C. Die Durchführung mindestens eines PCR-Zyklus führt zur Bildung amplifizierter Nukleinsäureprodukte. Die PCR erfolgt typischerweise über mindestens 15 Zyklen, wobei etwa 20 bis 40 Zyklen bevorzugt sind.
Die Hybridisierungsbedingungen wurden zuvor beschrieben und sind zur Anwendung im PCR-Format geeignet. Es wird jedoch bevorzugt, und es bietet sich an, die Hybridisierung in kurzen Zeiträumen durchzuführen, 5 Sekunden bis 12 Minuten, vorzugsweise in 2 Minuten, und im Temperaturbereich von 30 °C bis 75 °C, vorzugsweise bei etwa 40 °C bis 65 °C, und noch stärker bevorzugt bei etwa 54 °C.
G. Nachweis des PCR-Produkts
Der Nachweis eines amplifizierten Nukleinsäureprodukts kann anhand einer Vielzahl bekannter Techniken durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das amplifizierte Produkt auf der Grundlage des Molekulargewichts mittels Gelelektrophorese aufgetrennt, und die aufgetrennten Produkte werden anschließend durch Verwendung von Nukleinsäure-spezifischen Farbstoffen sichtbar gemacht, die es erlauben, die einzelnen Spezies der im Gel vorhandenen aufgetrennten amplifizierten Produkte zu beobachten.
Obgleich zahlreiche Nukleinsäure-spezifische Farbstoffe existieren und zur Sichtbarmachung der elektrophoretisch aufgetrennten Nukleinsäuren geeignet wären, wird Ethidiumbromid bevorzugt.
Alternative Verfahren, die zum Nachweis des amplifizierten Nukleinsäureprodukts geeignet sind, schließen auf eine Hybridisierung basierende Nachweismittel ein, bei denen eine markierte Polynukleotidsonde eingesetzt wird, welche in der Lage ist, mit dem amplifizierten Produkt zu hybridisieren. Beispiele derartiger Nachweismittel schließen eine Southern-Blot-Analyse, eine Ribonuklease-Schutzanalyse unter Verwendung von in vitro markierten Polyribonukleotidsonden, sowie ähnliche Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren mit spezifischen Nukleotidsequenzen ein. Vgl, z.B. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987.
Bei einem Ansatz zum Nachweis der Gegenwart einer spezifischen Nukleinsäuresequenz schließen die in der Primer-Extension verwendeten Desoxyribonukleotidtriphosphate (dNTPs) einen Marker oder eine nachweisbare Gruppe ein, wodurch ein Primer-Extension-Produkt nachweisbar wird. Typischerweise umfassen derartige Marker radioaktive Atome, chemisch modifizierte Nukleotidbasen und dergleichen.
In funktionsfähiger Weise mit einem dNTP verknüpfte oder ein Teil desselben bildende radioaktive Elemente bieten brauchbare Mittel zur Vereinfachung des Nachweises eines DNA-Primer-Extension-Produkts. Ein typisches radioaktives Element produziert β-Strahlen. Elemente, die β-Strahlen emittieren, wie ³H, ¹⁴C, ³²P und ³⁵S repräsentieren eine Klasse von radioaktiven Markerelementen, die β-Strahlen erzeugen.
Alternativen zu radioaktiv markierten dNTPs sind dNTPs, die derart chemisch modifiziert sind, daß sie Metall-Komplexbildner, Biotin enthaltende Gruppen, fluoreszierende Verbindungen und dergleichen enthalten.
Ein geeigneter Metall-Komplexbildner ist eine durch ein Lanthanidmetall und β-Diketonatliganden gebildete Lanthanid-Chelatverbindung, wobei das Lanthanid derart über eine chelatbildende Verbindung wie einem EDTA-Analog an die Nukleinsäure oder an das Polynukleotid gebunden ist, daß ein fluoreszierender Lanthanidkomplex gebildet wird. Vgl. US-Patente Nr. 4,374,120 und Nr. 4,569,790 und die veröffentlichten internationalen Patentanmeldungen Nr. EP 0 139 675 und Nr. WO87/02708.
Biotin- oder Acridinester-markierte Oligonukleotide und deren Verwendung in Polynukleotiden sind beschrieben worden. Vgl. US-Patent Nr. 4,707,404, veröffentlichte internationale Patentanmeldung EP 0 212 951 und europäisches Patent Nr. 0087636. Geeignete fluoreszierende Markerverbindungen umfassen Fluorescein, Rhodamin, Texas Red, NBD und dergleichen.
Ein in einer Nukleinsäure vorhandener markierter Nukleotidrest sorgt für eine Markierung der Nukleinsäure als solche, welche demgemäß gegenüber anderen in einer zu analysierenden Probe vorhandenen Nukleinsäuren unterscheidbar ist. Der Nachweis des Vorhandenseins des Markers in der Nukleinsäure und damit der Gegenwart der spezifischen Nukleinsäuresequenz beinhaltet typischerweise die Trennung der Nukleinsäure von jeglichen markierten dNTPs, die nicht als Teil eines Primer-Extension-Reaktionsprodukts vorliegen.
Techniken zur Trennung einzelsträngiger Polynukleotide wie einer nicht-hybridisierten markierten Polynukleotidsonde von DNA-Duplexformen sind hinreichend bekannt und beinhalten typischerweise die Trennung von einzelsträngigen und doppelsträngigen Nukleinsäuren auf der Grundlage ihrer chemischen Eigenschaften. Häufiger beinhalten Techniken zur Trennung die Anwendung eines heterogenen Hybridisierungsformats, bei dem die nicht-hybridisierte Sonde typischerweise durch Waschen von der DNA-Duplexform getrennt wird, welche an einer unlöslichen Matrix gebunden ist. Beispielhaft ist die Southern-Blotting-Technik, bei der die Matrix eine Nitrocellulosefolie und der Marker ³²P sind. Southern, J. Mol. Biol., 98:503 (1975).
Nach einem weiteren Ansatz zum Nachweis des Vorhandenseins einer DNA-Duplexform, wobei der vorliegend angewendete für eine bevorzugte Ausführungsform beispielhaft ist, wird die DNA-Duplexform wie vorliegend beschrieben amplifiziert, und das resultierende amplifizierte Nukleinsäureprodukt wird nachgewiesen.
Zahlreiche Anwendungsformen des auf der PCR basierenden Verfahrens zur Amplifikation, die für einen Fachmann leicht erkennbar sind, werden in Betracht gezogen. Beispielsweise kann die Klonierung von mRNA durch reverse Transkription zur Herstellung einer cDNA durch eine auf der PCR basierenden Amplifikation der gebildeten cDNA sensitiver gestaltet werden. Insofern, als die Sequenzierung einer Nukleinsäure mit PCR-amplifizierter Nukleinsäure durchgeführt werden kann, kann die vorliegende Erfindung angewendet werden, um eine Sequenzierung amplifizierter Nukleinsäuren zu verbessern.
H. Rekombinante DNA-Moleküle
Es ist bekannt, daß die Auswahl eines Vektors, mit dem eine erfindungsgemäße DNA-Zielsequenz in funktionsfähiger Weise verknüpft wird, von den erwünschten funktionellen Eigenschaften (wie z.B. Proteinexpression) sowie von der zu transformierenden Wirtszelle abhängt. Diese Beschränkungen sind der Herstellung rekombinanter DNA-Moleküle immanent. Ein von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogener Vektor ist jedoch zumindest in der Lage, die Replikation und vorzugsweise auch die Expression eines in funktionsfähiger Weise mit dem Vektor verknüpften Gens zu steuern.
In bevorzugten Ausführungsformen schließt ein von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogener Vektor ein prokaryontisches Replikon ein, d.h. eine DNA-Sequenz mit der Fähigkeit zur direkten autonomen Replikation und der extrachromosomalen Beibehaltung des rekombinanten DNA-Moleküls in einer prokaryontischen Wirtszelle, wie einer bakteriellen Wirtszelle, die damit transformiert ist. Derartige Replikons sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Zusätzlich können solche Ausführungsformen, die ein prokaryontisches Replikon umfassen, auch ein Gen umfassen, dessen Expression einem damit transformierten bakteriellen Wirt eine Wirkstoffresistenz verleiht. Typische bakterielle Wirkstoffresistenz-Gene sind solche, die Resistenz gegenüber Ampicillin, Tetracyclin oder Kanamycin verleihen.
Solche Vektoren, die ein prokaryontisches Replikon umfassen, können ferner einen prokaryontischen Promotor umfassen, der in der Lage ist, die Expression (Transkription und Translation) des damit transformierten Gens zu steuern. Ein Promotor ist ein Expressions-Kontrollelement, welches durch eine DNR-Sequenz gebildet wird, die das Binden einer RNA-Polymerase erlaubt und die Transkription ermöglicht.
Mit bakteriellen Wirten kompatible Promotor-Sequenzen werden typischerweise in Plasmidvektoren bereitgestellt, die Restriktionsschnittstellen enthalten, welche für die Insertion eines erfindungsgemäßen PCR-Produktmoleküls geeignet sind. Typische derartige Vektorplasmide sind pUC8, pUC9, pBR322 und pBR329, erhältlich von Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA) und pPL, pKK223, pTZ18U, pTZ19U und pT7T319U, erhältlich von Pharmacia (Piscataway, NJ).
Zur Bildung der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Moleküle können auch Expressionsvektoren eingesetzt werden, die mit eukaryontischen Zellen kompatibel sind, vorzugsweise solche, die mit Vertebratenzellen kompatibel sind. Expressionsvektoren für eukaryontische Zellen sind im Stand der Technik hinreichend bekannt und aus mehreren kommerziellen Quellen erhältlich. Typischerweise werden solche derartige Vektoren bereitgestellt, die geeignete Restriktionsstellen zur Insertion des gewünschten Gens enthalten. Typische derartige Vektoren sind pSVL und pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-l/pML2d (International Biotechnologies, InC.), und pTDT1 (ATCC #31255).
In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die zur Herstellung der rekombinanten DNA-Moleküle verwendeten Expressionsvektoren für eukaryontische Zellen einen Selektionsmarker, der in einer Eukaryontenzelle wirksam ist, vorzugsweise einen Wirkstoffresistenz-Selektionsmarker. Ein bevorzugter Wirkstoffresistenz-Marker ist das Gen, dessen Expression zur Neomycinresistenz führt, d.h. das Neomycinphosphotransferase (neo)-Gen. Southern et al., J. Mol. Appl. Genet., 1:327-341 (1982).
Die Verwendung von retroviralen Expressionsvektoren zur Bildung der erfindungsgemäßen rDNAs wird ebenfalls in Betracht gezogen. Der vorliegend verwendete Begriff "retroviraler Expressionsvektor" bezieht sich auf ein DNA-Molekül, welches eine Promotor-Sequenz umfasst, die von der Region langer termi naler Wiederholungen (LTR) eines retroviralen Genoms abgeleitet ist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Expressionsvektor typischerweise ein retroviraler Expressionsvektor, der vorzugsweise in Eukaryontenzellen Replikations-inkompetent ist. Die Herstellung und Verwendung von retroviralen Vektoren ist von Sorge et al., Mol. Cell. Biol., 4:730-1737 (1984) beschrieben worden.
In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt der ausgewählte Vektor in seiner linearisierten Form kohäsive Termini, die zu den Termini komplementär sind, die durch die bei der PCR-Amplifikation verwendete Polymerase, z.B. Taq-Polymerase, erzeugt wurden. Demgemäß ist eine geeignete Vektorzubereitung zur direkten Klonierung 3'-dAMP-terminaler PCR-Produkte ein Plasmid, welches in seiner linearisierten Form einzelne, überhängende 3'-dTMP-Termini aufweist. (Bei dem dTMP-Rest kann dessen Monophosphatgruppe an das 3'-Ende oder, noch bevorzugter, an das 5'-Ende des Thymidinnukleosids angeheftet sein.) Da Thymin zu sich selbst nicht komplementär ist, werden die verwendeten 3'-dTMP-terminalen Vektoren von größeren Plasmiden abgeleitet, welche ein entfernbares verknüpfendes Fragment umfassen, das die beiden 3'-dTMP-Gruppen verbindet, bis die Bildung des linearisierten Vektors gewünscht wird. Die Herstellung des linearisierten Vektors erfolgt durch Restriktion des größeren Plasmids an den gewünschten dTMP-Stellen unter Verwendung der vorliegend beschriebenen Restriktionsenzyme nach bekannten Verfahren und nach den Angaben des Herstellers geeigneter Enzyme.
Die vorliegende Erfindung kann angewendet werden, um ein cDNA-Fragment in einen Vektor zu insertieren. Vorzugsweise wird die cDNA in den Vektor in spezifischer Orientierung eingeführt.
Dies kann erfolgen, indem ein Primer-Polynukleotid eingesetzt wird, welches eine Spaltstelle wie eine Schnittstelle für eine Restriktionsendonuklease enthält, um die Abspaltung des vorstehenden 3'-AMPs von einem Ende der cDNA zu ermöglichen. Diese Schnittstelle für eine Restriktionsendonuklease wird genutzt, um dieses mit der Restriktionsendonuklease abgespaltene Ende der cDNA in den Vektor einzuführen. Das andere Ende der cDNA wird in den Vektor unter Nutzung des auf jenem Ende der cDNA vorhandenen vorstehenden 3'-AMPs eingeführt, um eine Insertion in einen erfindungsgemäßen Vektor mit einem vorstehenden 5'-TMP zu erleichtern. Diese Vorgehensweise ermöglicht die Einführung der cDNA in einen Vektor in einer bestimmten Orientierung, wodurch die Expression der klonierten DNA erleichtert wird.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Primer, der die zur Insertion einer cDNA in einen Vektor verwendete Spaltstelle enthält, ein Polymerase-Kettenreaktion-Primer. Vorzugsweise ist die Spaltstelle im zweiten Primer, der bei der Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt wird, nicht enthalten. Ein Vektor kann ein Expressionsvektor, ein Klonierungsvektor, ein Shuttle-Vektor und dergleichen sein.
Bei einer am meisten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Restriktionsenzym verwendet, welches in der Lage ist, einzelne, überhängende 3'-dTMP-Termini zu erzeugen. Es sind jedoch nur ein paar Restriktionsenzyme bekannt, die zur Herstellung derartiger Termini in Plasmiden angegeben werden können, d.h. HphI, MboII und XcmI (New England Biolabs). Darüber hinaus zeigen zwei dieser Enzyme (MboII und XcmI) geringe Ligationseffizienzen (< 20 %). Ferner finden zwei Enzyme (HphI und MboII) offenbar in nahezu jedem bekannten Plasmid Erkennungssequenzen, z.B. spalten beide das Plasmid pUC19 an 7 Stellen, wodurch viele unerwünschte Fragmente entstehen.
Daher kann es erwünscht sein, die obigen Enzyme bei bestimmten Anwendungen hinsichtlich ihrer Aktivitäten und Ligationseffizienzen zu untersuchen. Diese Verfahren sind den Fachleuten auf dem Gebiet hinreichend bekannt und werden durch die nachfolgend beschriebenen Beispiele veranschaulicht.
Eine Vielzahl von Verfahren sind entwickelt worden, um DNA über komplementäre kohäsive Termini in funktionsfähiger Weise mit Vektoren zu verknüpfen. Beispielsweise können komplementäre homo- oder heteropolymere Bereiche an die Enden der dAMP-terminalen verknüpfenden Fragmente angefügt werden, die aus dem Vektor mit einem Restriktionsenzym entfernt werden können, wenn es erwünscht ist, die durch die PCR erzeugten 3'-dAMP-terminalen Produkte zu ligieren, Demgemäß ist der Vektor mit dem entfernbaren Fragment über verbindende Sequenzen und durch Wasserstoffbrücken zwischen den komplementären Enden des Vektors und der verknüpfenden Sequenz und zwischen den verknüpfenden Sequenzen und dem entfernbaren Fragment kovalent verbunden.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform besitzt das als Vektor ausgewählte Plasmid EcoRI- und HindIII-Restriktionschnittstellen, durch die eine DNA-Sequenz insertiert werden kann, die an ihren Termini komplementäre Reste aufweist, welche eine Restriktion mit EcoRI und HindIII erlauben. Die interne Region des Fragments wird zwei oder mehrere Restriktionsschnittstellen aufweisen, die von den Enzymen XcmI, HphI oder MboII, oder einer Kombination derselben, erkannt werden, so daß für eine nachfolgende Verbindung mit 3'-dAMP-terminalen DNA-Segmenten 3'-terminale dTMP-Reste erzeugt werden können. Eine Restriktion der geeigneten Erkennungssequenzen führt zu einem entfernbaren DNA-Fragment und einem linearisierten Plasmid. Das kleinere DNA-Fragment kann durch bekannte Techniken der Geltrennung entfernt werden.
Synthetische Linker, die eine Vielzahl von Restriktionsschnittstellen enthalten, sind bei einer Reihe von Anbietern erhältlich, einschließlich International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT. Die Gebrauchsanweisungen können von dem Anbieter bezogen werden. Polynukleotidsequenzen, die die entfernbaren Fragmente und/oder die verknüpfenden Sequenzen umfassen, werden vorzugsweise durch direkte Synthesetechniken hergestellt, wie sie z.B. zur Herstellung von PCR-Primer-Molekülen beschrieben sind.
Die 3'-dAMP-Nukleinsäuren werden mit linearen DNA-Molekülen in einer Mischung davon kombiniert, und es wird eine Ligase zugegeben, um die Ligation der Komponenten herbeizuführen. Unter Anwendung bekannter Verfahren und Bedingungen kann jede im Handel erhältliche Ligase zur effektiven Durchführung der Ligationsreaktion eingesetzt werden. Eine bevorzugte Ligase ist die T4 DNA-Ligase.
Volumen-Ausschlußmittel können ebenfalls eingesetzt werden, um die Ligationsreaktion zu beschleunigen. Solche Mittel können jedoch in einigen Fällen exzessive intramolekulare Ringbildungen verursachen.
Ferner wird besonders in Betracht gezogen, daß bestimmte Nukleinsäuren, deren Klonierung erwünscht ist, nur über einen terminalen 3'-dAMP-Rest pro Duplex verfügen. Diese Situation kann sich aus der unvollständigen Reaktion einer PCR-Polymerase, z.B. Taq, mit einem amplifizierten Produkt ergeben. Eine derartige Eventualität wird jedoch erfindungsgemäß erwartet, und daher erlaubt die vorliegende Erfindung in einigen Fällen die direkte Klonierung von monoligierten (linearen) Rekombinanten, solange die zur Klonierung vorgesehene Nukleinsäure mindestens an einen terminalen 3'-dTMP-Rest bindet, der von dem Vektor präsentiert wird.
Zusätzlich wird es in diesen Fällen normalerweise wahrscheinlich zu meiner Transformation von Zellen mit monoligierten rekombinanten DNA-Molekülen kommen, wobei die Ligation am zweiten 3'-dTMP-Terminus intrazellulär erfolgt.
I. Transformation von Zellen
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner das Einführen der rekombinanten DNA-Moleküle in Wirtszellen durch ein Verfahren, welches gewöhnlich als Transformation oder Transfektion bezeichnet wird. Die Wirtszelle kann entweder prokaryontisch oder eukaryontisch sein. Bakterielle Zellen sind bevorzugte prokaryontische Wirtszellen und gehören typischerweise einem E. coli-Stamm an, wie z.B. dem Stamm DH1αF. Bevorzugte eukaryontische Wirtszellen schließen Hefe- und Säugerzellen und vorzugsweise Vertebratenzellen ein, wie solche von einer Fibroblasten-Zellinie der Maus, der Ratte, des Affen oder des Menschen. Bevorzugte eukaryontische Wirtszellen schließen Ovarial (CHO)-Zellen des Chinesischen Hamsters, erhältlich von der ATCC als CCL61, sowie die embryonalen Zellen der NIH-Swiss-Maus NIH/3T3 ein, die von der ATCC als CRL 1658 erhältlich sind. Ein bevorzugtes Verfahren zur Herbeiführung der Transformation ist die Elektroporation.
Die Transformation geeigneter Wirtszellen mit einem rekombinanten DNA-Molekül erfolgt anhand bekannter Verfahren, die typischerweise von dem verwendeten Vektortyp abhängen. Hinsichtlich der Transformation prokaryontischer Wirtszellen, s. z.B. Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 69:2110 (1972); und Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982). Hinsichtlich der Transformation von Vertebratenzellen mit rDNAs enthaltenden retroviralen Vektoren, s. z.B. Sorge et al., Mol. Cell. Biol., 4:1730-1737 (1984); Graham et al., Virology, 52:456 (1973); und Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:1373-1376 (1979).
J. Assays für rekombinante Vektoren
Erfolgreich transformierte Zellen, d.h. Zellen, die ein erfindungsgemäßes rekombinantes DNA-Molekül enthalten, können anhand bekannter Techniken identifiziert werden. Beispielsweise können Zellen, die aus der Einführung einer erfindungsgemäßen rDNA resultieren, kloniert werden, um monoklonale Kolonien zu bilden. Zellen aus diesen Kolonien können geerntet und lysiert werden, und ihr DNA-Gehalt kann auf Anwesenheit der rDNA untersucht werden, indem ein Verfahren eingesetzt wird, wie es von Southern, J. Mol, Biol. 98:503 (1975), oder von Berent et al., Biotech., 3:208 (1985), beschrieben ist.
Zusätzlich zum direkten Nachweis der Anwesenheit von rDNA kann eine erfolgreiche Transformation durch bekannte immunologische Verfahren bestätigt werden, wenn die rDNA in der Lage ist, die Expression eines bestimmten Polypeptids zu steuern. Beispielsweise produzieren Zellen, die erfolgreich mit einer entsprechenden rDNA transformiert sind und einen Expressionsvektor enthalten, ein Polypeptid, welches eine charakteristische Antigenität aufweist. Die Proben einer Kultur, die Zellen enthält, von denen angenommen wird, daß sie transformiert sind, werden geerntet und hinsichtlich der Untersuchung eines bestimmten Polypeptids einem Assay zugeführt, wobei Antikörper verwendet werden, die für das Polypeptidantigen spezifisch sind, wie solche, die von einer geeigneten Hybridomzelle produziert werden.
Demgemäß zieht die vorliegende Erfindung zusätzlich zu den transformierten Wirtszellen eine Kultur solcher Zellen, vorzugsweise eine monoklonale (klonal homogene) Kultur, oder eine Kultur in einem Nährmedium, die von einer monoklonalen Kultur abgeleitet ist, in Betracht. Nährmedien, die zur Kultivierung transformierter Wirtszellen geeignet sind, sind im Stand der Technik bekannt und können von verschiedenen kommerziellen Anbietern bezogen werden. In Ausführungsformen, bei denen die Wirtszelle eine Säugerzelle ist, wird vorzugsweise "serumfreies" Medium verwendet.
Das vorliegende Verfahren umfaßt eine Kultur, die ein Nährmedium umfaßt, welche Wirtszellen enthält, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert sind, das in der Lage ist, ein für ein bestimmtes Polypeptid kodierendes Gen zu exprimieren. Die Kultur wird für einen Zeitraum gehalten, der ausreicht, damit die transformierten Zellen das gewünschte Polypeptid exprimieren können. Das exprimierte Polypeptid wird anschließend aus der Kultur gewonnen.
Die Verfahren zur Gewinnung eines exprimierten Polypeptids aus einer Kultur sind bekannt und schließen eine Fraktionierung des das Polypeptid enthaltenden Anteils der Kultur unter Anwendung bekannter biochemischer Techniken ein. Beispielsweise können die Verfahren der Gelfiltration, Gelchromatographie, Ultrafiltration, Elektrophorese, Ionenaustausch, Affinitätschromatographie und dergleichen, wie solche, die zur Fraktionierung von Proteinen bekannt sind, eingesetzt werden, um die in der Kultur gefundenen exprimierten Proteine zu isolieren. Zusätzlich können immunchemische Verfahren wie Immunaffinität, Immunabsorption und dergleichen unter Anwendung bekannter Methoden durchgeführt werden.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der E. coli-Phänotyp Lac Z' blau/weiß eingesetzt, um einen sichtbaren Nachweis einer effektiven Kolorierung zu ermöglichen.
Um dieses Nachweisverfahren anzuwenden, werden phasengleich zum Leserahmen von Lac Z' Restriktionsstellen erzeugt. Demgemäß unterbricht ein in dieses Indikatorgen eingeführtes DNA-Fragment die normale Translation des Proteins β-Galaktosidase, wodurch auf Kulturmedium, welches den chromogenen Farbstoff XGAL enthält, Kolonien mit weißem Phänotyp entstehen.
Bevorzugte Ausführungsformen enthalten Antibiotikaresistenzgene wie das Ampicillinresistenzgen oder Kanamycinresistenzgene. Während diese besonderen Kanamycinresistenzgene bevorzugt sind, können andere äquivalente Gene und Plasmide wie die Gene in dem von Pharmacia vertriebenen Kanamycinresistenzgen-Block, oder das Kanamycinresistenzplasmid pMON 530 und dergleichen geeignet sein.
K. Zusammensetzungen und Kits
Viele der im Rahmen der vorliegenden Beschreibung, angesprochenen Verbindungen und Gruppen (z.B. Nukleinsäuren) können eine Reihe von Formen, insbesondere variabel protonierte Formen, annehmen, die jeweils im Gleichgewicht zueinander stehen. Der ausgebildete Praktiker wird erkennen, daß eine Bezugnahme auf eine Form einer Verbindung oder Gruppe vorliegend sämtliche Formen davon einschließen soll, die miteinander im Gleichgewicht stehen.
Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung bedeutet "μM" mikromolar, "μl" bedeutet Mikroliter und "μg" bedeutet Mikrogramm.
Die als Wirtsvektoren dienenden Zusammensetzungen können in Form eines Kits verpackt werden. Der vorliegend verwendete Begriff "Packung" bezieht sich auf eine in einem System gewöhnlich verwendete feste Matrix oder ein festes Material, welches in der Lage ist, innerhalb bestimmter Grenzen eine oder mehre re der in einem erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendenden Reaktionsteilnehmer zu halten. Derartige Materialien schließen Glas- und Kunststoff- (z.B. Polyethylen, Polypropylen und Polycarbonat) Flaschen, Röhrchen, Papier, mit Kunststoff und Kunststoffolien laminierte Hüllen und dergleichen ein. Demgemäß kann eine Packung beispielsweise ein Glasröhrchen sein, das verwendet wird, um die angemessenen Mengen an Polynukleotid-Primer(n), Plasmiden, Restriktionsenzyme(n), DNA-Polymerase, DNA-Ligase, oder eine Kombination davon zu enthalten. Ein zur Durchführung mindestens eines Klonierungsprogramms ausreichendes Aliquot einer jeden Komponente wird in jedem Behälter bereitgestellt.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Vektor in funktionsfähiger Weise mit einem Marker wie z.B. einem Indikatorgen verknüpft, wodurch Mittel zum Nachweis eines in ein Ziel-Plasmid eingeführten DNA-Segments bereitgestellt werden. Bevorzugte Marker sind im Stand der Technik bekannt und schließen die zuvor diskutierten ein, insbesondere den sichtbaren Lac Z'-Marker. Andere selektierbare Marker können verwendet werden und sind auf dem Gebiet bekannt.
Zur Herstellung eines Matrizen-Komplements oder zur Amplifikation oder zum Nachweis einer spezifischen Nukleinsäuresequenz unter Anwendung der Methodik einer Primer-Extension geeignete Kits umfassen typischerweise in getrennten Behältern dNTPs, wobei N Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin ist, sowie andere ähnliche Agenzien zur Durchführung von Primer-Extension-Reaktionen.
Die Reagensspezies, Anzeigemittel oder Reagenzien für die Primer-Extension eines beliebigen vorliegend beschriebenen Systems, können in Lösung wie in Form einer flüssigen Dispersion oder als im wesentlichen trockenes Pulver bereitgestellt werden, z.B. können die Plasmide in lyophilisierter Form bereit gestellt werden. Wenn die Reagensspezies oder das Anzeigemittel ein Enzym ist, kann auch das Substrat des Enzyms in einer getrennten Packung eines Systems bereitgestellt werden. Ein fester Träger und ein oder mehrere Puffer können ebenfalls als getrennt verpackte Elemente in dieses System eingeschlossen werden.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgend beschriebenen spezifischen Beispiele und durch die anhängenden Ansprüche näher erläutert.
BEISPIEL 1
Herstellung modifizierter Plasmide
Die zur Vektorherstellung ausgewählten Ausgangsplasmide gehörten zur Varietät pT7T319U (Mead et al., Protein Engineering, 1:67-74, (1986)), welches ein Derivat von pTZ19U ist und bei Pharmacia LKB bezogen werden kann.
Komplementäre Einzelstränge von Nukleinsäuren wurden mit Hilfe eines automatischen DNA-Synthesizers "Gene Assembler" von Pharmacia synthetisiert, wobei die vom Hersteller empfohlenen Bedingungen angewendet wurden. Man ließ die einzelsträngigen Sequenzen hybridisieren, wodurch eine komplementäre asymmetrische DNA-Duplexform mit der in 1 dargestellten Nukleotidsequenz entstand. Dieses Oligonukleotid erlaubt die Spaltung durch XcmI an zwei Stellen (zwischen den Resten 18 und 19 der oberen Kette und zwischen den Resten 14 und 15 der unteren Kette) unter Bildung eines einzelnen, überhängenden dTMP-Terminus am 3'-Ende eines jeden Strangs.
Die oben hergestellten Plasmide pT7T319U und Oligonukleatide wurden getrennt mit HindIII- und EcoRI-Restriktionsenzymen behandelt, wobei die von dem Anbieter der Enzyme, New England Biolabs, empfohlenen Reaktionsbedingungen angewendet wurden. Die bei pT7T319U vorhandenen Restriktionsstellen wurden so ausgewählt, daß der Lac Z'-Leserahmen der Plasmide durch irgendein darin befindliches Insert unterbrochen werden würde, wodurch ein visueller Nachweis unter Anwendung des bekannten blau/weißen Phänotyps von β-Galaktosidase ermöglicht wird.
Die linearisierten Plasmide wurden durch Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel von den zwischen den EcoRI- und HindIII-Schnittstellen freigesetzten Fragmenten getrennt, und die linearisierten Plasmide wurden durch Elektroelution aus dem Gel entfernt. In ähnlicher Weise erfolgte die Trennung der zentralen Sequenz des Oligonukleotids von seinen durch EcoRI und HindIII freigesetzten flankierenden Segmenten.
Die gereinigten linearisierten Plasmide und Oligonukleotide wurden im Verhältnis 1:1 bis 1:3 vermischt und mit T4 DNA-Ligase (New England Biolabs, Beverly, MA) unter den vom Hersteller angegebenen Reaktionsbedingungen ligiert. Die auf diese Weise gebildeten rekombinanten Plasmide werden vorliegend als pTA12 bezeichnet. In 1A sind die Genkartierungen des Wirtsplasmids und des pTA12-Plasmids dargestellt.
BEISPIEL 2
Herstellung des Klonierungsvektors
Gemäß Beispiel 1 hergestellte pTA12-Plasmide wurden mit XcmI nach dem vom Hersteller, New England Biolabs, empfohlenen Verfahren gespalten. Das kleine Fragment zwischen den beiden XcmI-Restriktionsschnittstellen (s. 1B) wurde von dem großen Wirtsfragment durch Elektrophorese in einem 1%igen Agarosegel und nachfolgender Elektroelution, oder, in einigen Fällen, durch differentielle Präzipitation mit Isopropanol, getrennt.
Das als pTA12-L bezeichnete isolierte linearisierte pTA12 wurde in getrennten Ansätzen mit jedem der folgenden ungereinigten PCR-Amplifikationsprodukte ligiert: (1) ribosomale RNA-Gene, amplifiziert von genomischer DNA von Sarcophaga bullata, (2) ribosomale RNA-Gene, amplifiziert von genomischer DNA von Vairimorpha necatrix, und (3) dem Gen für die schwere Myosinkette, amplifiziert von genomischer DNA von Caenorhabditis elegans.
Die bei der Herstellung der PCR-amplifizierten Nukleinsäuren verwendeten Primer waren die folgenden:

C. elegans CCTGGGCGACGAACCAGTAA CGCCACCAAGGGAGACCAGG
S. bullata CTGGTTGATCCTGCCAG GGTTACCTTGTTACGACTT
V. necatrix GGAGGAAAAGAAACTAAC TTGGAGACCTGCTGCGG

Die Ligationsreaktionen erfolgten unter Verwendung von T4-DNA-Ligase unter den folgenden Bedingungen:

25 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,8)
10 mM MgCl₂
1 mM DTT
1 mM ATP
50-100 ng Vektor-DNA (gelgereinigter, XcmI-gespaltener pTA12)
1-9 μl PCR-Reaktionsprodukte (ungereinigt)
1 μl T4-DNA-Ligase (New England Biolabs)

Jede Reaktionsmischung wurde 16 bis 24 Stunden lang auf 16 °C gehalten. Die gebildeten Reaktionsprodukte wurden verwendet, um Zellen für einen Assay hinsichtlich der Klonierungseffizienz gemäß nachfolgender Beschreibung zu transformieren, wobei die Ergebnisse in Tabelle 1 dargestellt sind.
BEISPIEL 3
Transformation und Assay von XcmI-erzeugten Vektoren
Ungefähr 10 μl einer jeden gemäß Beispiel 2 hergestellten Ligationsmischung wurden einzeln verwendet, um kompetente Zellen des E. coli-Stamms DH1αF zu transformieren. Die transformierten Zellen wurden anschließend auf XGAL-enthaltendem Medium ausplattiert.
Die Anzahl an blauen und weißen Kolonien wurde aufgezeichnet, und ausgewählte weiße Kolonien wurden hinsichtlich insertierter DNA-Fragmente analysiert, indem kleine Mengen der Plasmid-DNA gereinigt und mit dem geeigneten Restriktionsenzym geschnitten wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Insgesamt 120 weiße Kolonien wurden auf die Anwesenheit von Inserts analysiert, und 108 (90 %) enthielten Fragmente, die den ursprünglichen PCR-Produkten entsprachen.
Das aus den obigen Experimenten erhaltene Verhältnis zwischen weißen und blauen Kolonien liegt im Bereich von 0,01 bis 0,15. Die berechneten Klonierungseffizienzen betrugen ungefähr 1-5 × 10⁴ Kolonien/μg PCR-Produkt. Es wurden optimale Klonierungseffizienzen von ungefähr 12 % weißen/Gesamtzahl von Kolonien unter Verwendung von kompetenten Zellen erhalten, die in der Lage sind, 10⁸ Zellen/μg Superhelix-DNA zu ergeben.
Die in Tabelle 1 dargestellten Ergebnisse bieten mehrere wichtige Beobachtungen. Erstens zeigen die Ergebnisse der Ligation von glattendigem pTZ18U, geschnitten mit SmaI, und glattendigem M13mp18, geschnitten mit AluI, daß die gewählten Ligationsbedingungen für eine Ligation günstig sind. Zweitens ergibt ein Vergleich der Klonierungseffizienzen von S. bullata- und C. elegans-PCR-Produkten mit XcmI-gespaltenen pTA12 (T-verlängert)-Plasmiden gegenüber den Klonierungseffizienzen von SmaI-gespaltenen pTZ18U (glatt)-Plasmiden eine sehr viel höhe re Klonierungseffizienz mit den T-verlängerten Plasmiden. Drittens zeigen selbst die mit XcmI-gespaltenen pTA12-Plasmide gute Klonierungseffizienzen mit glattendigen Fragmenten, z.B. M13mp18/AluI.
BEISPIEL 4
Assay HphI-erzeugter Vektoren
Rekombinante Vektoren, die zwei HphI-Restriktionsstellen umfassen, wurden unter Anwendung von Techniken hergestellt, die denjenigen zur Konstruktion der oben beschriebenen XcmI-Vektoren ähnlich sind.
pTA112 wurde in der nachfolgend beschriebenen Weise von PHSS6 (2A) abgeleitet, welcher in Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83:735-739 (1986) beschrieben ist. Das Plasmid pH 556 wurde mit der Restriktionsendonuklease NotI gespalten. Das das Kanamycinresistenzgen und den Replikationsursprung enthaltende Fragment wurde isoliert.
Ein die pUC19-Polylinker-Region und das β-Galaktosidase-Gen enthaltendes HaeIII-Fragment wurde aus pUC19 durch Restriktionsverdau mit HaeIII isoliert. NotI-Linker (New England Biolabs) wurden mit dem HaeIII-Fragment ligiert. Nach Entfernung der extra NotI-Linker durch Restriktionsendonuklease-Verdau wurde dieses β-Galaktosidase enthaltende Fragment durch Ligation in das das Kanamycinresistenzgen enthaltende Fragment insertiert, welches oben zur Herstellung von pH SS6* (2A) isoliert worden war.
Das pH SS6* wurde unter Verwendung der Oligo-Primer und unter Anwendung der in PCR Protocols, Academic Press, New York (1990), beschriebenen Vorgehensweise zur standardisierten Mutagenese durch Polymerasekettenreaktion behandelt, um die im Kanamycinresistenzgen vorhandene HphI-Schnittstelle zu entfernen. Diese Vorgehensweise zur Mutagenese führte zu pTA (2A).
Der Polylinker von pTA wurde durch den in 2B dargestellten HphI enthaltenden Polylinker ersetzt, indem pTA mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und EcoRI gespalten und mit dem HphI enthaltenden Polylinker ligiert wurde, um pTA112 zu ergeben. pTA112 wurde mit HphI linearisiert, und das resultierende große Fragment wurde gereinigt und als pTA112-L bezeichnet.
Die cDNA-Fragmente wurden durch PCR-Amplifikation von MS2-RNA erzeugt, welches von Boehringer Mannheim (Mannheim, West-Deutschland) bezogen wurde. Die Herstellung von cDNA-Matrizen der RNA erfolgte nach dem von U. Gülder et al. beschriebenen Verfahren, Gene, 25:263 (1983). Die cDNA-Vorläufer wurden über PCR unter Verwendung vorwärts gerichteter und reverser Primer, die den terminalen Sequenzen der cDNA-Fragmente entsprachen, amplifiziert. Die Primer wurden auf einem "Gene Assembler" von Pharmacia synthetisiert. Der vorwärts gerichtete Primer hatte die Sequenz 5'-CCTTAGGTTCTGGTRATGAC-3', und der reverse Primer hatte die Sequenz 5'-GGGTGCAATCTCACTGGGAC-3'.
Die Bedingungen für die PCR-Amplifikation entsprachen den vom Hersteller empfohlenen und waren:

100 ng Plasmid (900 bp MS2)
0,2 μg Primer (vorwärts/revers)
1 μl 25 mM dNTP's
5 μl 10 × PCR-Puffer
50 μl Gesamtvolumen

Zyklen:

(1) 94 °C, 1 min; 55 °C, 2 min; 72 °C, 3 min
(2) 72 °C, 7 min;
(3) 25 °C, 10 min.

Die Fragmente wurden mittels PCR unter Verwendung von drei unterschiedlichen Polymerasen amplifiziert: (1) "Taq"-Polymerase, isoliert aus Thermus aquaticus und erhalten von Perkin-Elmer Cetus, (2) "Vent"-Polymerase, vertrieben von New England Biolabs, und (3) der thermophilen Polymerase "Thermo", isoliert aus Thermus flavus und erhalten von Molecular Biology Resources. Diese ungereinigten PCR-Produkte wurden mit einem HphI-Analog von pTA12, nachfolgend bezeichnet mit pTA112, ligiert, wobei entsprechend der obigen Beschreibung für von XcmI erkannte Plasmide vorgegangen wurde. Die Nukleotidsequenz für das synthetisch hergestellte Oligonukleotid mit EcoRI- und BcoRV-Termini sowie das Ergebnis der Spaltung mit HphI und der Ligation mit 3'-dAMP-PCR-Produkten sind in 2 dargestellt.
Die in Tabelle 2 dargestellten Ergebnisse ermöglichen einen Vergleich der Klonierungseffizienzen für HphI-gespaltene (T-verlängerte) pTA112-Plasmide und glattendige Kontrollplasmide (pTA112, gespalten mit EcoRV) unter Verwendung von ungereinigtem, PCR-amplifiziertem MS2, das mit drei verschiedenen Polymerasen erzeugt worden war.
Demgemäß zeigen mit HphI-gespaltene Plasmide mit jeder untersuchten Polymerase und über einen 3fachen Bereich des PCR-Produkt-Verhältnisses eine Klonierungseffizienz von nahezu 100 %. In äußerst signifikanter Weise zeigen die Reaktion von T-verlängerten (mit HphI gespaltenen) Plasmiden und von glattendigen (mit EcoRV gespaltenen) Plasmiden von Taq-erzeugter MS2-Produkten, daß die d-AMP-terminalen MS2-Produkte mehr als 10-fach effizienter in die T-verlängerten Plasmide kloniert werden, als es unter Verwendung glattendiger Vektoren der Fall ist.
BEISPIEL 5
Repräsentativer Kit

Ein zur Verwendung bei der direkten Klonierung von DNA-Segmenten mit terminalen 3'-dAMP-Resten repräsentativer Kit schließt eine oder mehrere, und vorzugsweise sämtliche der folgenden Komponenten in getrennten Behältern ein:

Behälter 1:	Beschreibung
Komponente Bezeichnung
TA1	Steriles Wasser: 1 ml
TA2	10 × Ligationspuffer: 100 μl
TA3	Ligationsfertiger Klonierungsvektor: 1,1 μg
	(lyophilisierter pTA112-L oder pTA12-L)
TA4	1 × Tris-EDTA-Puffer: 100 μl
TA5	T4 DNA-Ligase: 22 μl
TA6	Kontrollvektor: 1 μg/10 μl Tris-EDTA
TA7	Vorwärts gerichteter Primer: (0,2 μg/μl): 5 μl
TA8	Reverser Primer: (0,2 μg/μl): 5 μl
TA9	10 × PCR-Puffer: 100 μl
TA10	25 mM dNTPs (Desoxynukleosidtriphosphate)
TA11	0,5 M BME
TA12	Plasmid pUC18 in Superhelix-Form (Kontrolle):10 μl
Behälter 2:
TA13	21 Aliquots von kompetenten E. coli-Zellen (Stämme JM109 oder NM522 sind bevorzugt) von jeweils 50 μl
TA14	SOC-Medium zur Kultivierung der Zellen etwa 20 ml (p A.2 von Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press (1989))

Der obige Kit beinhaltet ausreichend Reagenzien zur Durchführung von 20 Klonierungsreaktionen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Kit mindestens die Komponenten TA3, TA6, TA7 und TA8.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Kit mindestens die Komponenten TA3, TA4, TA6, TA7, TA8, TA13 und TA14.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Kit mindestens die Komponenten TA3 und TA13.
Obgleich die vorliegende Erfindung durch Veranschaulichung und Beispiele zum Zwecke der Klarheit und des Verständnisses detailliert beschrieben worden ist, ist es offensichtlich, daß bestimmte Modifikationen ausgeführt werden können, die vom Schutzumfang der anhängenden Ansprüche umfaßt werden.

Claims

Verfahren zur Klonierung eines Polymerasekettenreaktion (PCR)-amplifizierten Nukleinsäuremoleküls, bei dem man a) ein DNA-Zielsegment einer PCR-Amplifikation unterzieht, sodass eine Mehrzahl von doppelsträngigen Nukleinsäuren gebildet wird, die das Segment umfassen, wobei jede doppelsträngige Nukleinsäure einen einzelnen überhängenden 3'-dAMP-Rest aufweist; b) eine Population von rekombinanten Nukleinsäuremolekülen erzeugt, wobei die Population die doppelsträngigen Produkt-Nukleinsäuremoleküle und mindestens ein lineares Nukleinsäuremolekül umfaßt, wobei das mindestens eine lineare Nukleinsäuremolekül einen einzelnen 3'-überhängenden Rest an mindestens einem Terminus umfaßt, wobei der Rest ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Inosin-enthaltenden Rest und einem Uracil-enthaltenden Rest; und c) eine geeignete Wirtszelle mit der Population von rekombinanten Nukleinsäuremolekülen transformiert.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Inosin-enthaltende Rest ein dIMP-Rest ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Uracil-enthaltende Rest ein dUMP-Rest ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Population von. Nukleinsäuremolekülen vor der Transformation in die Wirtszelle in einen oder in mehrere Vektoren eingebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem der eine oder die mehreren Vektoren Expressionsvektoren sind.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Wirtszelle eine prokaryontische Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die prokaryontische Zelle eine bakterielle Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die bakterielle Zelle eine E. coli-Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch l, bei dem die Wirtszelle eine eukaryontische Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die eukaryontische Zelle eine Hefezelle oder eine Säugetierzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die Säugetierzelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Mauszelle, einer Rattenzelle, einer Hamsterzelle, einer Affenzelle und einer menschlichen Zelle.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die Säugetierzelle eine etablierte Säugetier-Zelllinie ist.
Verfahren zur Klonierung eines mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifizierten Nukleinsäuremoleküls, bei dem man a) ein DNA-Zielsegment einer PCR-Amplifikation unterzieht, sodass eine Mehrzahl von doppelsträngigen Nukleinsäuren gebildet werden, die das Segment umfassen, wobei jede doppelsträngige Nukleinsäure einen einzelnen überhängenden 3'-dAMP-Rest aufweist; b) eine Population von rekombinanten Nukleinsäuremolekülen erzeugt, wobei die Population die doppelsträngigen Produkt-Nukleinsäuremoleküle und mindestens ein lineares Nukleinsäuremolekül umfaßt, das einen einzelnen 3'-überhängenden Rest umfaßt, der kein dGMP-Rest, kein dAMP-Rest und kein dCMP-Rest ist; und c) eine geeignete Wirtszelle mit der Population von rekombinanten Nukleinsäuremolekülen transformiert.
Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die Population von Nukleinsäuremolekülen vor der Transformation in die Wirtszelle in einen in einen oder in mehrere Vektoren eingebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 14, bei dem der eine oder die mehreren Vektoren Expressionsvektoren sind.
Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die Wirtszelle eine prokaryontische Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die prokaryontische Zelle eine bakterielle Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 17, bei dem die bakterielle Zelle eine E. coli-Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die Wirtszelle eine eukaryontische Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 19, bei dem die eukaryontische Zelle eine Hefezelle oder eine Säugetierzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 20, bei dem die Säugetierzelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Mauszelle, einer Rattenzelle, einer Hamsterzelle, einer Affenzelle und einer menschlichen Zelle.
Verfahren nach Anspruch 20, bei dem die Säugetierzelle eine etablierte Säugetier-Zelllinie ist.