DE69627189T2

DE69627189T2 - Verfahren zum nachweis und zur entfernung von mutantsequenzen, die während enzymatischer amplifikation entstehen

Info

Publication number: DE69627189T2
Application number: DE69627189T
Authority: DE
Inventors: L. Paul MODRICH; E. Jane SMITH
Original assignee: University of Durham; Duke University
Current assignee: University of Durham; Duke University
Priority date: 1995-12-15
Filing date: 1996-12-13
Publication date: 2004-02-05
Anticipated expiration: 2016-12-14
Also published as: CA2240346C; JP2000501615A; EP0870060B1; EP0870060A1; WO1997021837A1; ATE236270T1; DE69627189D1; CA2240346A1; US5922539A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Detektion und Entfernung von Mutantsequenzen in DNA-Molekülen, welche das Produkt von enzymatischer Amplifikation sind.
Hintergrund der Erfindung
Es folgt eine Erörterung des relevanten Fachgebiets, wobei von keinem Teil davon zugelassen wird, Stand der Technik gegenüber den beigefügten Patentansprüchen zu sein.
DNA-Polymerase-Fehler, welche während PCR-Amplifikation auftreten, führen zur Gegenwart von Mutationen im amplifizierten bzw. verstärkten Produkt. Dieses Problem kann besonders akut bei Taq-DNA-Polymerase sein, welcher eine Korrekturlese- bzw. Proofreading-Exonuklease fehlt, und welche eine Basensubstitutions-Fehlerrate in der Größenordnung von 1/10⁴ bis 1/10⁵ unter PCR-Bedingungen polymerisierten Nukleotiden aufweist (Eckert und Kunkel, Nucleic Acids Res., 18: 3739, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res., 19: 4967, 1991; Saiki et al., Science, 239: 487; 1988; Tindall und Kunkel, Biochemistry, 27: 6008, 1988). Die Bedeutung von Fehlerraten dieser Größe ist von Keohavong und Thilly hervorgehoben worden (Keohavong und Thilly, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 9253, 1989), welche bemerkten, daß bei einer Fehleinbaurate von 2/10⁴ eine 10⁶-fache (Zwanzig-Cyclen-)Amplifikation einer 100 Basenpaare großen Sequenz zu einer Population von Produktmolekülen führt, von denen jedes eine 80%ige Wahrscheinlichkeit besitzt, irgendwo in seiner Sequenz eine Mutation aufzuweisen (Keohavong und Thilly, siehe oben). Die Häufigkeit von Polymerasefehlern während einer PCR kann aus den Gleichungen 1 und 6 von Luria und Delbrück (Luria, S.E., & Delbrück, M., Genetics 28: 491-511, 1943) abgeschätzt werden als
f = 2lNa (Gleichung 1)
worin f die erwartete Fraktion von Produktmolekülen ist, welche eine Mutation irgendwo in ihrer Sequenz enthalten, 1 die Länge des amplifizierten Segmentes in by ist, N die Anzahl von Cyclen ist, und a die Fehlerrate für die Polymerase ist, ausgedrückt pro eingebautem Nukleotid. Diesem Problem ist zu einem gewissen Ausmaß durch die Identifizierung der thermostabilen Pfu- und Tli (Vent^TM)-DNA-Polymerasen abgeholfen worden, welche eine Proofreading-Aktivität aufweisen und eine zwei- bis zehnfache Verbesserung der Genauigkeit bzw. Zuverlässigkeit im Verhältnis zu Taq aufzeigen (Lundberg et al., Gene, 108: 1, 1991; Mattila et al., siehe oben). Angesichts dessen jedoch, daß die Wahrscheinlichkeit eines Polymerase-Fehleinbau-Ereignisses pro Cyclus ebenfalls proportional zur Größe der zu amplifizierenden Sequenz ist, bleiben polymerasegenerierte Mutationen ein bedeutendes Problem für die umfangreiche Amplifikation von Sequenzen im Kilobasenbereich.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Detektion und die Entfernung von mutanten Sequenzen in DNA-Molekülen, welche das Produkt einer enzymatischen Amplifikation sind. Sie basiert auf der Verwendung von Mismatch-Repair-Reaktionen, wie der MutHLS-Reaktion von E. coli, welche verantwortlich für die Initiierung der bakteriellen methyl-gerichteten Mismatch-Reparatur ist. Die Anwesenheit eines Mismatch bzw. einer Fehlpaarung innerhalb von DNA-Molekülen bedingt eine Spaltung an einer GATC-Sequenz, lokalisiert in der Nähe der Fehlpaarung, in einer Reaktion, welche von Mutti, MutL, Muts und ATP abhängt (Au et al., J. Biol. Chem., 267: 12142, 1992). Hemimethyliertes GATC wird auf dem unmethylierten Strang geschnitten. Von GATC-Methylierung freie Heteroduplex-DNAs unterliegen berichtetermaßen einer durch Mismatch bedingten Einzel- und Doppelstrangspaltung an derartigen Stellen, wobei die letztere Reaktion nach längerer Inkubation oder bei erhöhten Konzentrationen der MutH-, MutL- und Muts-Proteine ersichtlich wird (Au et al., siehe oben) (Siehe 1). In der vorliegenden Erfindung wird Einzel- oder Doppelstrangspaltung verwendet, um die Anwesenheit von Mutanten zu detektieren, welche das Ergebnis von enzymatischer Amplifikation sind. Die Doppelstrang-Spaltungsreaktion kann auch ausgenutzt werden, um mutante Sequenzen aus einer Population von amplifizierten Molekülen zu entfernen.
Die vorliegende Erfindung ist auf enzymatisch amplifizierte Populationen von DNA-Molekülen anwendbar. Derartige Verfahren schließen die Polymerasekettenreaktion (PCR) und die reverse Transkription/Polymerasekettenreaktion (RT/PCR) ein.
Wenn die vorliegende Erfindung für die Entfernung von Mutationen, welche das Ergebnis von enzymatischer Amplifikation sind, verwendet werden soll, wird eine Sequenz von Interesse während N Cyclen amplifiziert (z. B. durch PCR), wobei N so gewählt wird, daß die erwartete mutante Fraktion (abgeschätzt aus der Wiedergabegenauigkeit der verwendeten Polymerase und der Größe der zu amplifizierenden Sequenz gemäß Gleichung 1, oder experimentell abgeschätzt; wie nachstehend ausführlich geschildert) nach den untenstehend dargelegten Kriterien angemessen klein ist. Die anschließende Denaturierung und Reassoziierung einer amplifizierten Population von Molekülen, enthaltend eine kleine mutante Fraktion, führt zur Hybridisierung der großen Mehrheit von mutanten Strängen mit einem Wildtyp-Produkt. Durch Denaturieren und Reassoziieren auf diese Weise hergestelltes Material wird einer Doppelstrang-Spaltungsreaktion unterzogen, z. B. unter Verwendung der MutHLS-Spaltungsreaktion von E. coli (siehe 2), mit einer vorherigen Entfernung von PCR-Primern und dNTPs, wie notwendig (z. B. durch Gelfiltration). Die ungespaltene Fraktion besteht aus Molekülen, welche Mismatch-frei und somit stark hinsichtlich mutationsfreier Sequenzen angereichert sind. Vorausge setzt, daß N Cyclen ausreichend Material für eine Analyse ergeben, kann die ungespaltene Fraktion von gespaltenen, mutationshaltigen Fragmenten durch Größenauftrennung getrennt werden (z. B. durch Elektrophorese durch Polyacrylamid- oder Agarosegele unter nicht-denaturierenden Bedingungen).
Da ein PCR-Fehler, im Prinzip, an jedweder Position in einer Sequenz, welche einer Amplifikation unterzogen wird, stattfinden kann, besteht die Mutanten-Fraktion eines amplifizierten Produkts erwartetermaßen aus einer Population verschiedener Mutationen (die Begriffe Mutation oder Mutant, wie in diesem Abschnitt verwendet, beziehen sich auf PCR-generierte Sequenzänderungen). Diese Population wird mögliche eingeführte Basenpaaränderungen, welche an jeder Position in der Sequenz, welche einer Amplifikation unterzogen wird, auftreten können, repräsentieren. Deshalb werden diejenigen Produktmoleküle, enthaltend eine besondere Mutation (z. B. diejenige, resultierend aus einem Polymerasefehler an einem besonderen Basenpaar) typischerweise nur eine sehr kleine Fraktion der gesamten Mutantenpopulation repräsentieren. Somit wird die Denaturierung und Reassoziierung eines PCR-Produktes an sich selbst, sogar bei einer relativ hohen Mutantenfraktion (z. B. 50%), dazu führen, daß die große Mehrheit eines besonderen Mutantenstranges entweder an einen nicht-mutanten Strang oder an einen Strang hybridisien, welcher eine andere Mutation enthält. Die erstgenannte Klasse von Hybridmolekül wird einen Mismatch enthalten, und die letztere zwei oder mehr Fehlpaarungen, und beide Klassen von Hybrid werden empfindlich gegenüber einem Angriff durch Mutti, MutL und Muts sein. Somit werden beide Klassen einer Eliminierung der darin enthaltenen, mutanten Sequenzen durch das obenstehend beschriebene Verfahren unterworfen werden. Da das methyl-gerichtete Reparatursystem von E. coli die C-C-Fehlpaarung nicht zu verarbeiten scheint (Su, S.-S., Lahue, R.S., Au, K.G. und Modrich, P., J. Biol. Chem., 263: 68299–6835, 1988; Lahue, R.S., Au, K.G. und Modrich, P., Science, 245: 160–164, 1989), wird dieses Verfahren diejenigen Sequenzen nicht entfernen, in welchen das entsprechende Hybridmolekül nur eine C-C-Fehlpaarung enthält.
Unter bestimmten Bedingungen kann es wünschenswert sein, die Anzahl von Cyclen einzugrenzen, um einen kleineren Mutanten-Anteil (z. B. 10%) zu erhalten. Bestimmte Typen von Amplifikationsreaktion unterliegen potentiell dem Auftreten eines "Jackpots" einer bestimmten Sequenzänderung (Luria, S.E. & Delbruck, J., Genetics, 28: 491–511, 1943). Beispielsweise wird während einer Einzelmolekül-PCR (z. B. Amplifikationsreaktionen, welche mit nur einem oder einigen wenigen Molekülen an Matrize starten) das Auftreten einer besonderen PCRinduzierten Sequenzänderung während eines frühen Cyclus zu einer hohen Fraktion einer besonderen Mutation im letztendlichen Produkt führen, weil die mutante Sequenz während der nachfolgenden Cyclen exponentiell amplifiziert bzw. vermehrt wird.
Das Verfahren zur Entfernung von PCR-induzierten mutanten Sequenzen, welches hierin beschrieben wird, ist nicht auf Amplifikationsprodukte eingeschränkt, welche aus haploiden Genomen abgeleitet sind. Die Vorgehensweise kann auch mit PCR-Produkten angewandt werden, welche von diploiden Genomen abgeleitet sind, sogar wenn die Ursprungszellen möglicherweise für eine oder mehrere Sequenzunterschiede innerhalb der Region von Interesse heterozygot sind (z. B. Allele A und a). Die Amplifikation von A-Sequenzen aus einer Aa- Heterozygote ergibt erwartetermaßen A- und a-Produkte in nahezu molarer Äquivalenz plus PCR-generierten mutanten Sequenzen, welche von jedem Allel abstammen. Zusätzlich zu Hybridmolekülen, welche mutante Sequenzen enthalten, ergibt eine Denaturierung und Reassoziierung dieses Produktes erwartetermaßen Heteroduplexe mit den Strang-Genotypen A : A, a : a, A : a und a : A bei den erwarteten Verhältnissen von 1 : 1 : 1 : 1. Wie Hybridmoleküle, enthaltend PCRinduzierte Mutationen, werden auch die Heteroduplexe A : a und a : A einer MutH-, MutL- und MutS-abhängigen durch Mismatch bedingten Doppelstrangspaltung unterliegen. Allerdings werden die gewünschten Produkte (A : A- und a : a-Duplex-DNAs, welche erwartetermaßen etwas weniger als die Hälfte des Gesamtproduktes repräsentieren) fehlpaarungsfrei und gegen den Angriff durch diese Aktivitäten beständig sein:
Wenn die ursprünglichen N Cyclen der PCR nicht ausreichend Material für die physikalische Isolierung der mutationsfreien Population nach MutHLS-Spaltung ergeben, und eine weitere Amplifikation erfoderlich ist, beinhaltet die Erfindung zwei alternative Vorgehensweisen, um mutante Sequenzen zu behandeln, so daß polymerase-generierte Fehler nicht bei einer weiteren Amplifikation weitergegeben bzw. vermehrt werden. Die Vorgehensweisen beruhen auf der Inaktivierung der Primeraktivität von Spaltungsprodukten oder der Entfernung von Spaltungsprodukten durch ein enzymatisches Vorgehen unter Verwendung einer Kombination von Exonukleasen.
Die MutHLS-vermittelte Spaltung an GATC-Sequenzen findet 5' zu dem G(↓, GpApTpC) statt; somit besitzen Doppelstrangprodukte, welche durch diese Reaktion hergestellt werden, einen vier Nukleotide langen 5'-Überhang, analog zu demjenigen, der durch viele Restriktionsendonukleasen hergestellt wird. Die Inkubation von MutHLS-Reaktionsprodukten mit Didesoxyguanosin-5'-triphosphat und einer DNA-Polymerase, fähig zur Anfügung des Didesoxynukleosids an die 3'-Termini, hergestellt durch die Mismatch-bedingte Spaltung, wird die Priming-Aktivität in anschließenden PCR-Cyclen inaktivieren. Obwohl mutante Sequenzen in der Population bleiben werden, werden sie eher in einer linearen als einer exponentiellen Weise in anschließenden PCR-Cyclen amplifizieren. Andere Organismen können eine Endonuklease mit unterschiedlicher Spaltungsspezifität als Mutti verwenden und würden somit die Verwendung eines von Didesoxyguanosin-5'-triphosphat verschiedenen Didesoxynukleosid-5'-triphosphates notwendig machen.
Ein alternatives enzymatisches Vorgehen entfernt Mismatch-Repair-Reaktions-Spaltungsprodukte, enthaltend mutante Sequenzen, auf physikalische Weise. Dieses Verfahren basiert auf der hohen Spezifität bestimmter Exonukleasen, wie λ-Exonuklease, für Duplex-DNA mit 5'-Phosphoryltermini (Little, J. Biol. Chem., 242: 679, 1967). Die anfänglichen N Cyclen der PCR-Amplifikation werden mit Primern durchgeführt, welche 5'-Hydroxyltermini enthalten. Nach der Amplifikation werden denaturierte und reassoziierte Produkte mit Mismatch-Repair-Enzymen, wie Mutti, MutL und Muts, wie obenstehend beschrieben behandelt. Da die GATC-Spaltung von Mismatch-enthaltenden Molekülen zu Produkten mit 5'-Phosphoryltermini führt, wird ein Strang jedes Doppelstrang-Spaltungsproduktes somit empfindlich gegenüber einer Hydrolyse durch λ-Exonuklease gemacht. Die Verwendung von Primern mit 5'-Hydroxyltermini verhindert den Exonuklease-Angriff auf nicht-gespaltene Produkte. Der verbleibende Einzelstrang wird dann durch Hydrolyse mit Einzelstrang-spezifischer Exonuklease entfernt, wie Exonuklease I (Lehman und Nussbaum, J. Biol. Chem., 339: 2628, 1964). Nach Inaktivierung oder Entfernung der zwei Exonukleaseaktivitäten (beispielsweise durch Phenolextraktion) kann die mutationsfreie Fraktion weiteren PCR-Runden unterzogen werden, wobei ein anschließender MutHLS-Spaltungsschritt eingesetzt wird, um mutante Sequenzen zu entfernen.
Die Erfindung beinhaltet auch ein Verfahren zur direkten Abschätzung der Fraktion von PCR-Produktmolekülen, welche eine polymerase-induzierte Mutation enthalten. Nach Denaturieren und Reassoziieren und anschließender Spaltung mit Mismatch-Repair-Enzymen, wie MutHLS, werden gespaltene und ungespaltene DNA-Duplexe z. B. durch Gelelektrophorese getrennt, und die relative Menge an in jeder Fraktion vorhandenen DNA-Duplexen wird durch für DNA-Quantifizierung verwendete Standardtechniken bestimmt. Das Ausmaß der MutHLS-Spaltung an diesem Punkt liefert eine direkte Schätzung der Fraktion von PCR-Produktmolekülen, welche eine oder mehrere polymerase-induzierte Mutationen enthalten.
Die Verfahren der beanspruchten Erfindung erfordern die Gegenwart einer Sequenz, welche einer Mismatch-bedingten endonukleolytischen Spaltung unterliegt, wie eine dGATC-Stelle, in der zu analysierenden Sequenz, so daß eine endonukleolytische Spaltung stattfinden kann. Wenn eine derartige Stelle nicht in der Region, welche amplifiziert wird, existiert, kann eine Sequenz, welche einer Mismatch-bedingten endonukleolytischen Spaltung unterliegt, unter Verwendung eines Primers, der diese Sequenz enthält, eingeführt werden. Somit beinhaltet die Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur Detektion oder Entfernung von Fehlern in Sequenzen, welche keine Sequenz enthalten, welche einer Mismatch-bedingten, endonukleolytischen Spaltung unterliegt. Moleküle ohne dGATC-Stellen können mit MutHLS-Spaltung gescreent oder entfernt werden durch Einführung einer dGATC-Stelle in den für die Amplifikation verwendeten Primer. Der Anmelder hat festgestellt, daß dGATC-Stellen 50–100 by vom Ende eines Moleküls ausreichend für ein Mutations-Screening sind. Von GATC verschiedene Sequenzen, welche einer Mismatch-bedingten endonukleolytischen Spaltung durch Mismatch-Repair-Enzyme aus anderen Organismen unterliegen, können ebenfalls in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Andere Organismen, einschließlich des Menschen, besitzen bekanntermaßen Systeme zur Erkennung und Reparatur von DNA-Fehlpaarungen, welche, wie es der Fachmann richtig einschätzen wird, Proteine umfassen, die funktionell homolog zu den MutHLS-Proteinen von E. coli sind, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Somit beinhaltet die Erfindung, in einem ersten Aspekt, ein Verfahren zur Entfernung von DNA-Molekülen, welche eine oder mehrere polymerase-generierte Mutationen enthalten, in einer Population von enzymatisch amplifizierten DNA-Duplexen. Das Verfahren umfaßt das Denaturieren und Reassoziieren der Population von DNA- Duplexen, das Kontaktieren der reassoziierten DNA- Duplexe mit einem Mismatch-Reparatursystem, so daß jeder Strang in DNA-Duplexen, enthaltend einen Basenpaar-Mismatch, geschnitten wird, und das Trennen der geschnittenen DNA- Duplexe von den angeschnittenen DNA-Duplexen.
Mit "polymerase-generierten Mutationen" wird ein Fehleinbau eines Nukleotids durch eine DNA-Polymerase während des Verlaufs der DNA-Amplifikation gemeint, so daß eine unkorrekte Paarung zwischen den Basen von zwei Nukleotiden, lokalisiert auf komplementären DNA-Strängen, d. h. Basenpaare, welche nicht A : T oder G : C sind, oder die Gegenwart von 1, 2 oder 3 extra-ungepaarten, aneinandergrenzenden Nukleotiden auf einem Strang (eine Insertions/Deletions-Mismatch), erzeugt werden.
Mit "enzymatisch amplifizierte DNA-Duplexe" wird DNA gemeint, welche durch eine enzymatische Amplifikationsreaktion amplifiziert worden ist. Beispiele derartiger Reaktionen schließen die Polymerasekettenreaktion und Reaktionen, verwendend reverse Transkription und anschließende DNA-Amplifikation von einer oder mehreren exprimierten RNA-Sequenzen, ein.
Mit "Denaturieren und Reassoziieren" sind Verfahren gemeint, welche dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, durch welche die Wasserstoffbrückenbindung von DNA-Duplexmolekülen sequenziell unterbrochen wird und sich dann erneut bilden gelassen wird. Bevorzugte Verfahren zur Denaturierung und Reassoziierung schließen eine Erhöhung der Temperatur, gefolgt von einer Senkung der Temperatur, und eine Erhöhung des pH-Wertes (z. B. pH 13), gefolgt von Neutralisieren und Assoziieren bei einer angemessenen Temperatur, ein. Alternative Verfahren schließen die Verwendung von Enzymen, wie RNase H, in einer RT/PCR-Technologie ein.
Mit "Fehlpaarungsreparatur- bzw. Mismatch-Repair-System" werden Proteine gemeint, welche eine GATC-Endonuklease, wie E. coli-MutH oder ein funktionell homologes Protein zu E. coli-MutH (das Protein kann an einer von GATC verschiedenen Stelle schneiden), ein Fehlpaarungs-Erkennungsprotein, wie E. coli-MutS oder ein funktionell zu E. coli-MutS homologes Protein, und Proteine, welche bei der Aktivierung der GATC-Endonuklease teilnehmen, wie E. coli-MutL oder ein zu E. coli-MutL funktionell homologes Protein, und notwendige Cofaktoren, wie MgCl₂ und ATP, einschließen.
Mit "Trennen" ist die Isolierung der gespaltenen Moleküle von ungespaltenen Molekülen durch Verfahren gemeint, welche eine physikalische Trennung erzielen, wie Elektrophorese oder HPLC.
In bevorzugten Ausführungsformen erfolgt das Verfahren zur Trennung durch Elektrophorese durch ein Gel; das Fehlpaarungs-Reparatursystem umfaßt Komponenten des methyl-gerichteten Mismatch-Repair-Systems von E. coli und schließt die MutS-, MutL-, und MutH-Proteine ein.
Mit "Elektrophorese durch ein Gel" wird das Verfahren der Größenfraktionierung durch elektrophoretische Mobilität gemeint, ein Verfahren, welches dem Fachmann auf dem Gebiet. gut bekannt ist. Gelelektrophorese kann entweder konventionell oder durch Puls-Feld erfolgen.
Die "Komponenten des methyl-gerichteten Mismatch-Repair-Systems von E. coli" schließen die Proteine Mutti, MutL und Muts und die Cofaktoren MgCl₂ und ATP ein.
In einem zweiten Aspekt beinhaltet die Erfindung ein Verfahren zur Entfernung von DNA-Molekülen, enthaltend eine oder mehrere polymerase-generierte Mutationen in einer Population von DNA-Duplexen, welche enzymatisch unter Verwendung von Primern amplifiziert wurden, welche 5'-Hydroxyltermini enthalten. Das Verfahren umfaßt das Denaturieren und Reassoziieren der Population von DNA-Duplexen, das Kontaktieren der reassoziierten DNA-Duplexe mit einem Mismatch-Repair-System, so daß jeder Strang in den DNA-Duplexen, enthaltend eine Basenpaar-Fehlpaarung, geschnitten wird, so daß 5'-Phosphat-Termini erzeugt werden, und ferner das Kontaktieren der Population von reassoziierten DNA-Duplizes mit Exonukleasen, so daß die DNA-Duplexe, enthaltend eine Basenpaar-Fehlpaarung, enzymatisch abgebaut werden.
Die Verwendung von Primern mit 5'-Hydroxyltermini verhindert den Exonukleaseangriff an Stellen, welche von Spaltungsstellen verschieden sind, die durch das Mismatch-Repair-System erzeugt werden. Primer werden typischerweise mit derartigen 5'-Hydroxyltermini erzeugt.
Mit "Exonukleasen" wird eine Kombination einer Exonuklease gemeint xxx, welche präferenziell Duplex-DNA abbaut und auch eine Präferenz für 5'-Phosphat aufweist, wie λ-Exonuklease, sowie eine Einzelstrang-spezifische Exonuklease, wie Exonuklease I.
Mit "enzymatisch abbaubar" wird der Abbau zu einzelnen Nukleotiden oder Dinukleotiden gemeint.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Mismatch-Repair-System Komponenten des methyl-gerichteten Mismatch-Repair-Systems von E. coli und beinhaltet die MutS-, MutL- und MutH-Proteine.
In einem dritten Aspekt beinhaltet die Erfindung ein Verfahren, durch welches DNA-Moleküle, welche eine oder mehrere polymerase-generierte Mutationen enthalten, in einer Population von enzymatisch amplifizierten DNA-Duplexen für eine weitere Amplifikation unempfänglich bzw. inert gemacht werden. Das Verfahren umfaßt das Denaturieren und Reassoziieren der Population von DNA-Duplexen, das Kontaktieren der reassoziierten DNA-Duplexe mit einem Mismatch-Repair-System, so daß jeder Strang in DNA-Duplexen, enthaltend eine Basenpaar-Fehlpaarung, geschnitten wird, und ferner das Kontaktieren der geschnittenen DNA-Duplexe mit Didesoxynukleosid-5'-triphosphat und einer DNA-Polymerase, fähig zur Anfügung eines Didesoxynukleosid-5'-monophosphat-Restes an durch Mismatch-bedingte Spaltung hergestellte 3'-Termini.
Mit "inert bzw. unempfänglich für weitere Amplifikation" wird die Unfähigkeit gemeint, einer weiteren exponentiellen Amplifikation unterworfen zu sein, da bei den gespaltenen DNA-Molekülen ein kettenterminierendes Nukleotid eingebunden ist, welches unfähig zur Unterstützung einer weiteren Verlängerung ist.
Mit "Didesoxynukleosid-5'-triphosphat" wird ein Nukleosid-5'-triphosphat gemeint, bei welchem die 3'-Hydroxylgruppe durch einen Wasserstoff. ersetzt ist, so daß ein kettenterminierendes Analog resultiert. Dieses Analog wird das Wachstum einer neuen DNA-Kette blockie ren, da ihm ein 3'-Hydroxyl fehlt, welches zur Bildung einer Phosphodiester-Bindung notwendig ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Mismatch-Repair-System Komponenten des methyl-gerichteten Mismatch-Repair-Systems von E. coli und schließt die MutS-, MutL- und MutH-Proteine ein, und das Didesoxynukleosid-5'-triphosphat ist Didesoxyguanosin-5'-triphosphat.
In einem vierten Aspekt beinhaltet die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Fraktion einer enzymatisch amplifizierten DNA-Population, welche polymerase-generierte Mutationen enthält. Das Verfahren umfaßt das Denaturieren und Reassoziieren der Population von DNA-Duplexen, das Inkontaktbringen der reassoziierten DNA-Duplexe mit einem Mismatch-Repair-System, so daß mindestens ein Strang in den DNA-Duplexen, enthaltend eine Basenpaar-Fehlpaarung, gespalten wird, das Trennen der gespaltenen DNA-Duplexe von ungespaltenen DNA-Duplexen und das Bestimmen der Fraktion von gespaltenen DNA-Duplexen im Verhältnis zu ungespaltenen DNA-Duplexen als eine Anzeige der Fraktion von enzymatisch amplifizierter DNA, welche polymerase-generierte Mutationen enthält.
Mit "mindestens ein Strang wird gespalten" wird gemeint, daß ein endonukleolytischer Schnitt in einen oder beide Stränge eines DNA-Moleküls, enthaltend einen Basenpaar-Mismatch, eingeführt wird. Die Länge der Inkubation und die Konzentration der Mismatch-Repair-Enzyme bestimmen, ob ein oder zwei endonukleolytische Schnitte eingeführt werden.
Mit "Trennen der geschnittenen DNA-Duplexe von angeschnittenen DNA-Duplexen" wird die physikalische Trennung der zwei Klassen von Molekülen gemeint, und Elektrophorese unter denaturierenden Bedingungen ist eingeschlossen.
Mit "Bestimmen der Fraktion von gespaltenen DNA-Duplexen relativ zu ungespaltenen DNA-Duplexen" wird das Detektieren und Quantifizieren von DNA, nach Trennen der gespaltenen und ungespaltenen Moleküle gemeint, so daß die relativen Mengen in jeder Fraktion bestimmt werden können. Die Detektion und Quantifizierung von DNA kann durch Verfahren, welche dem Fachmann auf dem Gebiet vertraut sind, unter Verwendung bekannter Markierungs-Färbungs- und Quantifizierungs-Techniken für Nukleinsäuren ausgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Mismatch-Repair-System Komponenten des methyl-gerichteten Mismatch-Repair-Systems von E. coli und beinhaltet die MutS-, MutL- und MutH-Proteine.
In einem fünften Aspekt beinhaltet die Erfindung ein Verfahren zum Detektieren der Anwesenheit von DNA-Polymerase-generierten Mutationen in einer Population enzymatisch amplifizierter DNA-Duplexe. Das Verfahren umfaßt das Denaturieren und Reassozüeren der Population von DNA-Duplexen, das Inkontaktbringen der reassoziierten DNA-Duplexe mit einem Mismatch-Repair-System unter Bedingungen, so daß ein Duplex, enthaltend eine polymerase-generierte Mutation, durch die Einführung eines endonukleolytischen Schnittes in mindestens einem Strang des Duplex modifiziert wird, und das Detektieren des Produktes des endonukleolytischen Schnitts als Hinweis auf das Vorhandensein von polymerase-generierten Mutationen.
Das endonukleolytische Schnitt- oder Spaltungs-Produkt kann durch jedwedes Verfahren nachgewiesen werden, welches einen Unterschied zwischen dem Schnittprodukt und einem unmodifizierten Molekül detektiert. Derartige Verfahren schließen diejenigen ein, welche Unterschiede in der Größe oder elektrophoretischen Beweglichkeit detektieren.
In bevorzugten Ausführungsformen erfolgt die Detektion des Produkts des endonukleolytischen Schnitts durch eine veränderte elektrophoretische Mobilität unter denaturierenden Bedingungen; das Mismatch-Repair-System umfaßt Komponenten des methyl-gerichteten Mismatch-Repair-Systems von E. coli und beinhaltet die MutS-, MutL- und MutH-Proteine.
Mit "veränderte elektrophoretische Beweglichkeit" ist die Beweglichkeit auf einem Gel gemeint, welche unterschiedlich von oder relativ zu einem unmodifizierten, d. h. ungeschnittenen Molekül ist.
Denaturierende Bedingungen sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und beinhalten die Verwendung von Harnstoff.
In einem sechsten Aspekt beinhaltet die Erfindung ein Verfahren zum Detektieren der Anwesenheit von DNA-Polymerase-generierten Mutationen in einer Population von enzymatisch amplifizierten DNA-Duplexen, hergestellt aus DNA-Duplexen, denen eine Sequenz fehlt, die einem durch Mismatch bedingten endonukleolytischen Schnitt unterworfen ist. Das Verfahren umfaßt die Schritte des enzymatischen Amplifizierens einer Population von DNA-Molekülen unter Verwendung von Primern, enthaltend eine Sequenz, die einem durch Mismatch bedingten endonukleolytischen Schnitt unterworfen ist, des Denaturierens und Reassoziierens der Population von DNA-Duplexen, des Inkontaktbringens der reassoziierten DNA-Duplexe mit einem Mismatch-Repair-System unter Bedingungen, so daß ein endonukleolytischer Schnitt in mindestens einem Strang eines Duplex, welcher eine polymerase-generierte Mutation enthält, eingeführt wird, und des Nachweisens des Produktes des endonukleolytischen Schnitts als Hinweis auf das Vorhandensein von polymerase-generierten Mutationen.
Mit "Primer, welche eine Sequenz enthalten, die einem durch Mismatch bedingten endonukleolytischen Schnitt unterworfen ist" sind Primer gemeint, welche manipuliert wurden, um eine Sequenz zu enthalten, welche spezifisch in Antwort auf das Vorhandensein eines Mismatchs durch Komponenten eines Mismatch-Repair-Systems geschnitten wird. Primer mit derartigen Stellen können durch Standard-Klonierungstechniken, welche dem Fachmann bekannt sind, konstruiert werden.
Die Erfindung beinhaltet ebenfalls die Verwendung von Primern, enthaltend eine Sequenz, unterworfen einem durch Mismatch bedingten endonukleolytischen Schnitt, für die Entfernung von DNA-Molekülen, welche eine oder mehrere polymerase-generierte Mutationen enthalten, in einer Population von enzymatisch amplifizierten DNA-Duplexen, hergestellt aus DNA-Duplexen, denen eine Sequenz fehlt, die einem durch Mismatch bedingten endonukleolytischen Schnitt unterliegt. Das Verfahren umfaßt die Schritte des enzymatischen Amplifizierens einer Population von DNA-Molekülen unter Verwendung von Primern, enthaltend eine Sequenz, unterworfen einem durch Mismatch bedingten endonukleolytischen Schnitt, des Denaturierens und Reassoziierens der Population von DNA-Duplexen, des Inkontaktbringens der reassoziierten DNA-Duplexe mit einem Mismatch-Repair-System unter Bedingungen, so daß jeder Strang in einem DNA-Duplex, enthaltend eine polymerase-generierte Mutation, geschnitten wird, und des Trennens der geschnittenen DNA-Duplexe von ungeschnittenen DNA-Duplexen.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Sequenz, welche einem endonukleolytischen Schnitt unterliegt, eine d(GATC)-Stelle; die Detektion des Produktes des endonukleolytischen Schnitts erfolgt durch veränderte elektrophoretische Beweglichkeit unter denaturierenden Bedingungen; das Mismatch-Repair-System umfaßt Komponenten des methyl-gerichteten Mismatch-Repair-Systems von E. coli und beinhaltet die MutS-, MutL- und MutH-Proteine.
In einem siebten Aspekt beinhaltet die Erfindung verschiedene Kits zur Detektion, Entfernung oder zum Unempfänglichmachen-gegen-weitere-Amplifizierung von DNA-Molekülen, welche eine oder mehrere polymerase-generierte Mutationen enthalten, in einer Population von enzymatisch amplifizierten DNA-Duplexen. Ein derartiges Kit, nützlich zum Amplifizieren von DNA-Molekülen und zum Entfernen von DNA-Molekülen, enthaltend eine oder mehrere polymerase-generierte Mutationen, in einer Population von enzymatisch amplifizierten DNA-Duplexen, umfaßt Primer mit 5'-Hydroxylenden, Komponenten eines Mismatch-Repair-Systems und Exonukleasen. Ein anderes Kit zur Entfernung von DNA-Molekülen, enthaltend eine oder mehrere polymerase-generierte Mutationen, in einer Population von enzymatisch amplifizierten DNA-Duplexen umfaßt Komponenten eines Mismatch-Repair-Systems und Exonukleasen. Die Erfindung beinhaltet desweiteren ein Kit zum Unempfänglichmachen von DNA-Molekülen, enthaltend eine oder mehrere polymerase-generierte Mutationen, in einer Population von enzymatisch amplifizierten DNA-Duplexen, gegen eine weitere Amplifikation, umfassend Komponenten eines Mismatch-Repair-Systems, ein Didesoxynukleosid-5'-triphosphat und eine DNA-Polymerase. Ein anderes Kit ist nützlich zur Amplifizierung von DNA-Molekülen, denen eine Sequenz fehlt, welche einem durch Mismatch bedingten endonukleolytischen Schnitt unterliegt, und zum Detektieren oder Entfernen von DNA-Molekülen, enthaltend eine oder mehrere polymerase-generierte Mutationen, aus dieser Population enzymatisch amplifizierter DNA-Duplexe. Dieses Kit umfaßt Primer, enthaltend eine Sequenz, welche einem durch Mismatch bedingten endonukleolytischen Schnitt unterliegt, und Komponenten eines Mismatch-Repair-Systems.
Die vorliegende Erfindung bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Verfahren, welche zum Detektieren und/oder Eliminieren von polymerase-induzierten Mutationen in Amplifikationsreaktionen angewandt werden.
Die Verlässlichkeit und Anwendbarkeit von molekularen Methoden zur Mutationsdetektion waren technischen Beschränkungen, hohen Hintergrundsignalspiegeln für perfekt gepaarte DNA-Sequenzen und dem Versagen, alle Mutationen nachzuweisen, unterworfen. Verfahren, welche sich lediglich auf die differentielle Auflösung von DNA-Fragmenten in Polyacrylamidgelen verlassen, unterliegen strengen Größenbeschränkungen. Chemische Vorgehensweisen zur Mutationsdetektion unterliegen einer Hintergrund-Reaktivität mit perfekt gepaarten Sequenzen. Enzymatische Verfahren haben sich als weniger robust hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Mutationen erwiesen und unterliegen in manchen Fällen Hintergrund signalen mit perfekt gepaarter DNA. Mismatch-Repair-Systeme, wie die MutHLS-abhängige d(GATC)-Spaltungsreaktion, umgehen viele dieser Einschränkungen, da sie ausschließlich hinsichtlich des Vorhandenseins von Mismatches bzw. Fehlpaarungen empfindlich sind und einen hohen Grad an Genauigkeit aufweisen.
Polymerasen mit hoher Effizienz und/oder Proofreading-Kapazität bzw. Korrekturlesevermögen sind hinsichtlich ihrer Fähigkeit beschränkt, die Anzahl von polymerase-generierten Fehlern zu verringern, da die Wahrscheinlichkeit eines Polymerase-Fehleinbau-Ereignisses ebenso ansteigt wie die Zahl von Amplifikationscyclen und proportional zu der Größe der zu amplifizierenden Sequenz ist. Im Unterschied dazu unterliegen die Verfahren der vorliegenden Erfindung diesen Einschränkungen nicht, da sie nach dem Amplifikationsereignis angewandt werden. Darüber hinaus sollten, da diese Verfahren auf der Verwendung äußerst empfindlicher und genauer Fehlpaarungs-Erkennungsproteine beruhen, die meisten Fehler detektiert und eliminiert werden, ungeachtet der Anzahl von Cyclen oder der Größe der amplifizierten Sequenz. Die bemerkenswerte Ausnahme besteht in den C-C-Fehlpaarungen, welche von dem methylgerichteten System von E. coli nicht erkannt werden.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen davon und aus den Patentansprüchen offensichtlich werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
Die 1 ist eine schematische Repräsentation der MutHLS-Doppelstrang-Spaltungsreaktion.
Die 2 ist eine schematische Wiedergabe der Denaturierung und Reassoziierung einer enzymatisch amplifizierten Population, gefolgt von der MutHLS-Doppelstrang-Spaltungsreaktion von Molekülen, welche einen Basenpaar-Mismatch enthalten.
Die 3A ist eine graphische Wiedergabe der Ergebnisse der MutHLS-Spaltung von 1169 by großen Phage f1-Gen VII-Homohybriden, erhalten nach 10, 20 oder 30 Zyklen der PCR-Amplifikation unter Verwendung von Pfu-Polymerase. Die x-Achse repräsentiert die Anzahl von PCR-Zyklen. Die y-Achse repräsentiert die gespaltenen Homohybride (%). Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung für vier unabhängige Experimente.
Die 3B repräsentiert die Ergebnisse der MutHLS-Spaltung von 1360 by großen LacI-Homohybriden, erhalten nach 25 Zyklen Amplifikation unter Verwendung von Taq-, Vent- oder Pfu-Polymerasen. Die x-Achse zeigt den Typ der verwendeten Polymerase. Die y-Achse repräsentiert die geschnitten Homohybride (%). Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung für vier unabhängige Experimente.
Die 4 ist eine graphische Wiedergabe der Abhängigkeit der MutHLS-Spaltung von der dNTP-Pool-Zusammensetzung und der während der Amplifikation verwendeten Polymerase. Die x-Achse zeigt das dGTP-Pool-Ungleichgewicht. Die y-Achse repräsentiert die gespaltenen Homohybride (%). Die verwendeten Polymerasen waren: Pfu (⧫), Vent (•) und Taq (∎).
Die 5A ist eine schematische Wiedergabe eine Heterohybrids, enthaltend einen Basenpaar-Mismatch und eine eingeführte dGATC-Stelle. Die Lokalisierung der Einzelnukleotid-Insertion/Deletion-Mutation ist angezeigt, wie auch die d(GATC)-Stelle, welche durch etwa 1000 by getrennt sind.
Die 5B ist eine graphische Wiedergabe der Abhängigkeit der Effizienz der MutHLS-Spaltung eines Heterohybrids von der Distanz zwischen der dGATC-Stelle und dem proximalen DNA-Ende. Die x-Achse repräsentiert die Distanz in Basenpaaren. Die y-Achse repräsentiert die d(GATC)-Spaltung (%).
Die 6 ist eine schematische Wiedergabe der experimentellen Auslegung zur Bewertung der Effizienz der MutHLS-Behandlung zur Entfernung von Sequenzen, enthaltend polymeraseinduzierte Mutationen, welche während des Verfahrens der PCR auftreten.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung beinhaltet Verfahren zur Detektion und Entfernung von Mutationen, welche ein Ergebnis von Polymerasefehlern sind, welche während enzymatischer Amplifikation von Nukleinsäuren auftreten. Die Verfahren basieren auf der Verwendung von Komponenten von Mismatch-Repair-Systemen. Die Komponenten und die Verwendung derartiger Systeme wird umfassend beschrieben in "Methods of Analysis and Manipulation of DNA Utilizing Mismatch Repair Systems", WO 95/12688, was hierin in seiner Gesamtheit durch den Bezug darauf einbezogen ist. In den meisten Fällen werden Sequenzen durch Techniken amplifiziert, welche dem Fachmann auf dem Gebiet vor der Anmeldung der beanspruchten Verfahren vertraut waren.
PCR-Amplifizierung von DNA
PCR-Reaktionen wurden durchgeführt, um Substrate zur Verwendung in den Experimenten, welche in den Beispielen 1–3 beschrieben sind, zu erzeugen. Die verwendeten PCR-Primer sind in den spezifischen Beispielen angegeben. Es sei denn es ist anderweitig vermerkt, enthielten die Reaktionen (100 μl) 20 mM Tris-HCl (pH 8,2), 10 mM KCl, 6 mM (NH₄)₂SO₄, 4 mM MgCl₂, 0,1% Triton X-100, 10 μg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 1 mM von jedem Desoxyribonukleosid-5'-triphosphat (dNTP) (Pharmacia Biotech), 100 pmol jedes Primers, 5 μg T4-Gen 32-Protein (Boehringer Mannheim), 100 ng Matrizen-DNA und 2,5 Units native Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene). Reaktionen, in denen synthetische Produkte gleichmäßig markiert wurden, enthielten auch 70 μCi von [α³²P]dTTP (3000 Ci/mmol, DuPont/New England Nuclear). Reaktionen in welchen die synthetischen Produkte endmarkiert wurden, enthielten 100 pmol des passenden Primers, markiert mit T4-Polynukleotidkinase (Amersham) und [Y³²]ATP (3000 Ci/mmol, DuPont/New England Nuclear), wie beschrieben (Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratroy Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). PCR-Reaktionen (15 Zyklen) wurden unter Verwendung eines Perlon Elmer Gene Amp 96000-Thermocyclers mit Inkubationen bei 94°C während 15 s, 60°C während 15 s und 72°C während 90 s, 3 min, 4 min oder 6 min für die Amplifikation von 400 bp, 1,3 kb, 1,7 kb bzw. 2,5 kb großen Sequenzen durchgeführt.
PCR-Reaktionen, in denen Pfu-, Vent- (New Englang Biolabs) und Taq- (Amersham) Polymerasen verglichen wurden, verwendeten Pufferbedingungen, welche vom Hersteller empfohlen wurden. Die Reaktionen enthielten 1X Puffer, geliefert mit jeder Polymerase, sowie 200 μM von jedem dNTP, 100 pmol von jedem Primer, 5 μg T4-Gen 32-Protein, 15 ng Matrizen-DNA und 2,5 Units Polymerase. Das Volumen jeder Reaktion belief sich auf 100 μl. Reaktionen, in denen DNA gleichmäßig markiert war, enthielten 80 μCi von [α³²P]dTTP. Die Reaktionen schritten 25 Zyklen lang voran, wobei jeder Zyklus aus 15 s bei 94°C, 15 s bei 55°C und 30 s bei 72°C bestand.
Um die Einschleppung von kontaminierender DNA in PCR-Reaktionen zu verhindern, wurden Puffer-Komponenten täglich frisch hergestellt und Reaktionen wurden in einer Laminarstömungs-Abzughaube unter Verwendung von Filterpipettenspitzen zusammengegeben. Die Produkte wurden mit Phenol und Ether extrahiert, mit Ethanol gefällt und durch ein Ethidiumbromid-Dot-Verfahren quantifiziert. Proben (0,5 ml einer passenden Verdünnung) und DNAs von bekannter Konzentration wurden zu 8 μl von 1 μg/ml Ethidiumbromid zugesetzt und auf Kunststoff-Deckband aufgetropft. Ultraviolett-induzierte Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines gekühlten CCD-Imagers von Photometrics gemessen. Die Konzentration von PCR-Produkten wurde durch Vergleichen mit der Fluoreszenz der Standards bestimmt.
MutHLS-Reaktionen
MutHLS-Reaktionen wurden wie folgend in Experimenten, beschrieben in den Beispielen 1-3, durchgeführt. Denaturierungs/Reassoziierungs-Reaktionen (20 μl) enthielten 2,5 μg unmarkiertes PCR-Produkt, 0,5 μg gleichförmig ³²P-markiertes PCR-Produkt, 10 mM NaCl, 1 mM EDTA und 50 mM Hepes-KOH (pH 8,0). Frisch hergestelltes 10 N NaOH (0,6 μl) wurde zu einer Endkonzentration von 300 mM zugesetzt, und die Mischung wurden 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wurde durch die Zugabe von Essigsäure zu einer Endkonzentration von 300 mM, KCl zu 100 mM und Kaliumphosphat (pH 7,4) zu 100 mM neutralisiert, und die DNA 30 min lang bei 65°C hybridisiert, gefolgt von 30 min bei 37°C. Die Reaktionen wurden dann an eine Silicamatrix-Zentrifugiersäule (Pierce Xtreme DNA Reinigungssäulen) gebunden und mit dH₂O eluiert, um PCR-Primer, dNTPs und Salze zu entfernen.
Die Reaktionen (10 μl) (Au et al., siehe oben) enthielten 50 mM Hepes-K0H (pH 8,0), 20 mM KCl, 4 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 50 μg/ml BSA, 2 mM ATP, ungefähr 10 000 cpm PCR-DNA (50–200 ng), 250 ng MutS (Su et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 5057, 1986), 600 ng MutL (Grilley et al., J. Biol. Chem., 264: 1000, 1989) und 0,9 ng Mutti (Welsh et al., J. Biol. Chem., 262: 15624, 1987). DNA und Pufferkomponenten wurden 8 min lang bei 37°C vorinkubiert, die Reaktionen initiiert durch Zusetzen einer vorgemischten Lösung von Mutti, MutL und Muts, und die Inkubation wurde 15 min lang bei 37°C fortgesetzt; um Einzelstrang-Spaltungsprodukte zu erzeugen. Nach Zugabe von 0,5 μl 0,5 M EDTA und 20 μl entionisiertem Formamid, enthaltend 0,05 % Bromphenolblau und 0,05% Xylencyanol, wurden die DNA-Produkte durch Elektrophorese durch 6%iges Polyacrylamid in 89 mM Tris, 89 mM Borsäure, 2 mm EDTA (End-pH von 8,5) und 8 M Harnstoff analysiert. DNA-Spezies wurden durch Autoradiographie visualisiert und unter Verwendung eines Molecular Dynamics Phosphorimager quantifiziert.
Beispiel 1: Polymerasefehler während der Amplifikation sind verantwortlich für d(GATC)-Spaltung von Homohybrid-Produkten
Um zu bestimmen, ob die beobachtete MutS-abhängige d(GATC)-Spaltung von Homohybriden auf einem Schaden, aufgetreten während der DNA-Präparation, oder auf genetischer Variation, eingeführt während PCR-Amplifikation, beruhte, wurde die Abhängigkeit des Spiegels einer derartigen Spaltung von den PCR-Reaktionsbedingungen untersucht.
Phage-fl-Gen VII-Sequenzen von 1169 by wurden aus den Plasmidmatrizen von Ivey-Hoyle et al. (Ivey-Hoyle et al., J. Mol. Biol., 224: 1039, 1992) während 10, 20 oder 30 Zyklen unter Verwendung von Pfu-Polymerase amplifiziert. Wildtyp-lacl-Sequenzen von 1360 by Länge wurden aus den Plasmid-Klonen von Matteson et al. (Matteson et al., Nucleic Acids Res., 19: 3499, 1991) während 25 Zyklen unter Verwendung von Pfu-, Vent- oder Taq-Polymerasen amplifiziert. Sowohl lacl- als auch Phage-f1-Gen VII-Sequenzen wurden amplifiziert, wobei als Vorwärtsprimer CAGAACTTTAAAAGTGCTCAT (SEQ ID NO: 1) verwendet wurde, und als Rückwärts-Primer ATGCAGCAACGAGACGTCACG (SEQ ID NO: 2) verwendet wurde. Die PCR-Produkte bestanden aus den Genfragmenten von Interesse sowie umgebender Vektorsequenz. Sowohl Phage-fl-Gen-VII-Sequenzen als. auch lacl-Homohybridmoleküle wurden durch einen Denaturierungs- und Reassozierungs-Schritt hergestellt.
Die Fraktion der amplifizierten Phage-fl-Gen-VII-Homohybride, welche von MutH-geschnitten wurde, stieg mit der Anzahl der Zyklen an (siehe 3A), ein Befund, konsistent mit entweder Zyklus-abhängigem DNA-Schaden oder Polymerase-induzierten Mutationen. Allerdings wurde ebenfalls festgestellt, daß der Grad der Homohybrid-Spaltung von der für die PCR-Amplifikation verwendeten Polymerase abhängt. So war die Spaltung von amplifizierten lacI-Homohybriden am höchsten, wenn Taq-Polymerase für die Amplifikation verwendet wurde, intermediär mit Vent-Polymerase und am niedrigsten mit Pfu-Polymerase (siehe 3B). Diese Ergebnisse sind parallel zu den Fehlerraten für diese Enzyme, mit der geringsten Wiedergabegenauigkeit von Taq-Polymerase aufgrund der Abwesenheit einer 3'- nach 5'-editierenden Exonuklease (Lundberg et al., siehe oben; Mattila et al., siehe oben; Tindall et al., siehe oben). Obwohl ein geringer Spiegel an Matrizen-Beschädigung, assoziiert mit dem Thermocyclieren, nicht ausgeschlossen werden kann, weisen diese Befunde darauf hin, daß der Großteil des Homohybrid-Hintergrundsignals auf Polymerasefehler zurückzuführen ist, welche während der Amplifikation auftreten.
Beispiel 2: Verwendui von dNTP-Pool-Ungleichgewicht während PCR-Amplifikation zur Bestimmung der Detektierbarkeit von Nukleotid-Substitutionsfehlern
Ein dNTP-Pool-Ungleichgewicht führt zu einer erhöhten Fehlerrate während einer in vitro-Synthese durch DNA-Polymerasen (Kunkel et al., J. Biol. Chem., 254: 5718, 1979; Fersht, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4946, 1979). Diese Beobachtung wurde ausgenutzt, um die Nützlichkeit der MutHLS-Reaktion zur Detektion von PCR-Fehlern zu testen. Für diese Experimente wurden Wildtyp-lacI-Sequenzen von 1360 by Länge während 15 Zyklen unter Verwendung von Pfu-, Vent- oder Taq-Polymerasen unter Bedingungen eines dGTP-Pool-Ungleichgewichts amplifiziert. Wildtyp-lacI-Sequenzen wurden aus den Plasmidklonen von Matteson et al. (Matteson et al., Nucleic Acid Res., 19: 3499, 1991) amplifiziert, wobei als Vorwärtsprimer CAGAACTTTAAAAGTGCTCAT (SEQ ID NO: 1) und als Rückwärtsprimer ATGCAGCAACGAGACGTCACG (SEQ ID NO: 2) verwendet wurden. Die PCR-Produkte bestanden aus den Genfragmenten von Interesse sowie umgebender Vektorsequenz. Unter äquimolaren Bedingungen war jedes dNTP bei 1 mM vorhanden. Die Konzentration von dGTP betrug 2 mM in allen anderen Reaktionen, und die Konzentrationen der anderen drei dNTPs betrugen jeweils 667 μM, 200 μM und 20 μM. Die PCR-Produkte wurden denaturiert und reassoziiert, einer MutHLS-Spaltung unterzogen, und die Produkte wurden analysiert, wie früher beschrieben. Wie in der 4 gezeigt, war die d(GATC)-Spaltung von Homohybriden abhängig von dem dGTP-Konzentrationsungleichgewicht. Aus der Amplifikation unter Verwendung von Taq-Polymerase abgeleitete Homohybride wurden zu einem größeren Ausmaß der MutHLSabhängigen d(GATC)-Spaltung unterzogen als Homohybride, welche unter den gleichen Bedingungen unter Verwendung von Pfu- und Vent-Polymerasen amplifiziert wurden. Vernachlässigbares PCR-Produkt wurde in Reaktionen erhalten, welche Taq-Polymerase verwendeten, in welchen dGTP in einem 100-fachen molaren Überschuß gegenüber den anderen dNTPs vorhanden war. Da dem Enzym eine 3'-Exonukleaseaktivität fehlt, induzieren hohe Spiegel von fehleingebauten dNTPs eine Kettentermination (Innis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 9436, 1988). In gleicher Weise wurden Homohybride, amplifiziert unter Verwendung von Vent-Polymerase, zu einem größeren Ausmaß geschnitten als Homohybride, amplifiziert unter Verwendung von Pfu-Polymerase (siehe 4). Polymerase-Fehleinbau-Fehler sind deshalb leicht durch MutSabhängige d(GATC)-Spaltung nachweisbar.
Beispiel 3: Abhängigkeit der Effizienz der Spaltung durch aktiviertes MutH von dem Abstand zwischen einer d(GATC)Stelle und dem Ende einer DNA-Heterohybrids
Obwohl hochempfindlich für fehlgepaarte Basenpaare, kann die MutHLS-Reaktion nur für ein Mutations-Screening verwendet werden, wenn die Sequenz von Interesse eine d(GATC)-Stelle enthält. Um die Durchführbarkeit der Einführung einer d(GATC)-Stelle in einen PCR-Primer zu bestimmen, um Sequenzen, denen eine derartige Stelle fehlt, zu screenen, haben wir die Abhängigkeit der Reaktion von dem Abstand einer d(GATC)-Stelle zu einem DNA-Ende ausgewertet (Siehe 5A). Heterohybride wurden hergestellt nach Amplifikation der replikativen Form des Phagen f1MR21 und f1MR22 (der ein Extranukleotid relativ zum Phagen f1MR21 enthält) während 15 Zyklen unter Verwendung von geschachtelten bzw. "nested" Rückwärts-PCR-Primern GATAAGAGGTCATTTTTGCGG (SEQ ID NO: 3) (1470 by PCR-Produkt); A-GACCGGAAGCAAACTCCAAC (SEQ ID NO: 4) (1528 by PCR-Produkt); GCCCGAAA-GACTTCAAATATC (SEQ ID NO: 5) (1578 by PCR-Produkt); TTATAGTCAGAAGCA-AAGCGG (SEQ ID NO: 6) (1624 by PCR-Produkt); GGATAGCGTCCAATACTGCGG (SEQ ID NO: 7) (1743 by PCR-Produkt); ATCATAACCCTCGTTTACCAG (SEQ ID NO: 8) (1845 by PCR-Produkt) und des gleichen Vorwärtsprimers CCAGCAAGGCCGATAGTTTGA (SEQ ID NO: 9). Der Phage f1MR22 wurde konstruiert durch die Insertion eines synthetischen Oligonukleotid-Duplex (Parsons et al., Cell, 75: 1227, 1993) in die replikative Form des Phagen flMR1 (Su et al., siehe oben). Die PCR-Produkte wurden amplifiziert, und Heterohybride wurden hergestellt durch Denaturieren und Reassozüeren einer Mischung von PCR-Produkten, erhalten aus der mutanten und Wildtyp-DNA. Heterohybride wurden einer MutHLS-Reaktion unterzogen und analysiert, wie früher beschrieben. Die Maximum-Spaltung, welche mit diesen Heterohybriden beobachtet wurde, betrug 20%, was vielleicht die große (1000 bp) Distanz zwischen der Mutation und der d(GATC)-Stelle widerspiegelt. Wie in 5B gezeigt, stieg die Effizienz von Mismatch-bedingter Spaltung mit wachsender Distanz der d(GATC)-Stelle zum proximalen Ende im Bereich von 50–150 bp, wobei bei der letztgenannten Distanz ein Maximum erreicht wird. Diese Ergebnisse legen nahe, daß ein PCR-Primer mit einer d(GATC)-Stelle, 50-100 Nukleotide von einem Ende entfernt, sich als ausreichend für den Zweck der Amplifikation und des anschließenden Mutations-Screening unter Verwendung von Mutti, MutL und Muts erweisen wird.
Beispiel 4: Entfernen von Molekülen, welche eine polymerase-generierte Mutation enthalten, unter Verwendung der MutHLS-Reaktion, gefolgt von Gel-Elektrophorese
Eine Population von Molekülen, welche enzymatisch amplifiziert worden ist, wird Denaturierungs/Reassozierungs-Reaktionen unterworfen. Eine Lösung von amplifiziertem Produkt (20 μl) wird hergestellt, wobei sie eine Konzentration von 10 mM NaCl, 1 mM EDTA und 50 mm Hepes-KOH (pH 8,0) aufweist. Frisch hergestellte 10 N NaOH wird zu einer Endkonzentration von 300 mM zugesetzt, und die Mischung wird 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wird neutralisiert durch Zugabe von Essigsäure zu einer Endkonzentration von 300 mM, KCl zu 100 mM und Kaliumphosphat (pH 7,4) 100 mM, und die DNA wird 30 Minuten lang bei 65°C hybridisiert, gefolgt von 30 Minuten bei 37°C. Die Reaktionen werden dann an eine Silicamatrix-Zentrifugiersäule (Pierce Xtreme DNA-Reinigungssäulen) gebunden und mit dH₂O eluiert, um PCR-Primer, dNTPs und Salze zu entfernen.
MutHLS-Reaktionen werden ausgeführt (10 μl) oder hinsichtlich des Volumens eingestellt, wie notwendig, enthaltend 50 mM Hepes-K0H (pH 8,0), 20 mM KCl, 4 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 50 mg/ml BSA, 2 mM ATP, PCR-DNA (50–200 ng), 500 ng MutS, 1200 ng MutL und 1,8 ng Mutti. DNA und Puffer-Komponenten werden 8 Minuten lang bei 37°C vorinkubiert, die Reaktionen werden durch Zusetzen einer vorgemischten Lösung von Mutti, MutL und Muts initiiert, und die Inkubation wird 45 Minuten lang bei 37°C fortgesetzt. Die Reaktionen werden mit zusätzlichem Muts (500 ng), MutL (1200 ng) und Mutti (1,8 ng) ergänzt und weitere 45 min lang bei 37°C inkubiert. Doppelstrang-Spaltungsprodukte werden erzeugt.
Nach Ablöschen der Reaktion mit EDTA (6 mM Endkonzentration) und SDS (0,1 Endkonzentration) kann die ungespaltene Fraktion, angereichert hinsichtlich mutationsfreier Sequenz, durch Elektrophorese durch nicht-denaturierende Agarose- oder Polyacrylamid-Gele, abhängig von der DNA-Größe, isoliert werden. Das gewünschte Fragment kann aus dem Gel durch im Fachgebiet gutbekannte Verfahren isoliert werden (Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc.).
Beispiel 5: Unempfänglichmachen von Molekülen enthaltend eine polymerase-generierte Mutation, gegen weitere Amplifikation
Eine Population von DNA-Molekülen wird enzymatisch amplifiziert und einer Denaturierung und Reassoziierung und MutHLS-Doppelstrang-Spaltung unterzogen, wie in Beispiel 4. DNA-Produkte (etwa 250 ng) werden in einer 50 μl-Reaktion, enthaltend 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 50 μg/ml BSA, 25 μM jedes Didesoxynukleosid-5'triphosphats (ddGTP, ddATP, ddCTP und ddTTP) und eine Unit von Exonuklease-freier Klenow-DNA-Polymerase, 3 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von EDTA zu 20 mM abgelöscht, und mit Phenol und dann Ether extrahiert. Nach Entfernen von nicht-eingebauten ddNTPs unter Verwendung einer Silicamatrix-Zentrifugiersäule (siehe Beispiel 4) kann die resultierende Population von DNA-Molekülen dann zusätzlichen PCR-Runden unterzogen werden, wie erforderlich.
Beispiel 6: Entfernung von Molekülen enthaltend eine polymerase-generierte Mutation, unter Anwendung der MutHLS-Reaktion, gefolgt von enzymatischem Abbau
Eine Population von DNA-Molekülen wird enzymatisch amplifiziert unter Verwendung von Primern mit 5'-OH-Termini, und sie werden einer Denaturierung und Reassozüerung und MutHLS-Doppelstrang-Spaltung wie in Beispiel 4 unterzogen. Die DNA-Produkte (50 ng) werden dann in 100 μl-Reaktionen, enthaltend 67 mM Glycin-NaOH (pH 9,4), 25 mM MgCl₂, 50 μg/ml BSA und 2,5 Units lambda-Exonuklease, 60 min lang bei 37°C inkubiert. Dann wird Exonuklease I (0,1 Unit) zugesetzt und die Reaktion weitere 30 Minuten bei 37°C fortgesetzt. Die Reaktionen werden durch Zugeben von EDTA zu 20 mM terminiert und die Reaktionen werden zur Entfernung der Exonukleasen mit Phenol und dann Ether extrahiert. Die Population wird dann weiteren Amplifikationsrunden unterzogen, wie erforderlich.
Beispiel 7: Bestimmen der Fraktion einer enzymatisch amplifizierten DNA-Population, welche eine polymerase-generierte Mutation enthält
Spezifische Primer, PCR-Zyklen und Bedingungen und die verwendete Polymerase werden von der spezifischen, zu amplifizierenden Sequenz und den Zielen des Amplifikations-Vorgehens, basierend auf Techniken und Verfahren, welche dem Fachmann vertraut sind, bestimmt. MutHLS-Reaktionen (Einzel- oder Doppelstrangspaltung), Trennung von gespaltenen und ungespaltenen Molekülen und die Quantifizierung können wie früher beschrieben durchgeführt werden. Andere Markierungs-, Visualisierungs- und Quantifizierungstechniken, welche mit Nukleinsäuren angewandt werden, welche dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, wie Fluoreszenz-Markierung und Färben mit Ethidiumbromid, sind zur Verwendung in diesem Aspekt der Erfindung geeignet.
Beispiel 8: Bestimmen der Effizienz der MutHLS-Behandlung zur Entfernung von mutationshaltigen Molekülen aus PCR-Produkt-Pools
Die Genome von filamentösen Bakteriophagen sind vollständig aus essentiellen Genen aufgebaut; allerdings existiert eine nicht-codierende Region zwischen den Genen II und N, in welche Fremd-DNA inseriert werden kann. Diese Region enthält ein cis-wirksames Signal für die Verpackung und Orientierung von DNA innerhalb von Bakteriophagenpartikeln, Stellen für die Initiation und Termination der DNA-Synthese und ein Signal für die p-unabhängige Termination der Transkription. Das Vorhandensein von Fremd-DNA-Segmenten innerhalb dieser Region kann die cis-wirksamen Elemente, welche die Replikation steuern, unterbrechen bzw. zerstören. Alle filamentösen Phagenvektoren in der üblichen Anwendung enthalten deshalb Mutationen in den Genen II oder V, welche eine derartige Zerstörung kompensieren.
Messing und seine Mitarbeiter (Messing, 7., New M13 Vectors for Cloning, Methods Enzymol., 101: 20–78, 1983) erzeugten eine Reihe von Bakteriophage-Ml3-lac-Hybridvektoren durch Insertion der regulatorischen Sequenzen und der codierenden Information für die ersten 146 Aminosäuren des E. coli β-Galactosidase-Gens (lacZ) in die intergenische Region zwischen den Genen II und N von M13. Die Wirtszellen für diese M13-Hybridphagen enthalten ein F'-Plasmid mit einem β-Galactosidase-Gen, welches aufgrund der Tatsache defekt ist, daß es für ein enzymatisch inaktives Polypeptid, dem die Aminosäuren 11-41 fehlen, codiert. Das, in mit einem M13-lac-Hybridvektor infizierten Zellen hergestellte, aminoterminale Fragment von β-Galactosidase assoziierte mit dem mangelhaften Wirts-Polypeptid unter Bildung eines enzymatisch aktiven Proteins (dies wird als α-Komplementation bezeichnet). Dies hat die Entwicklung eines Farbtests gestattet, um Vektoren zu unterscheiden, welche ein funktionelles, im Gegensatz zu einem genetisch inaktiven, β-Galactosidase-Genfragment aufweisen. Bei Ausplattierung auf Wirte, welche das passende F'-Episom tragen, werden Vektoren, codierend für das Wildtyp-β-Galactosidase-Genfragment, blaue Plaques bilden, wenn das Medium den Inducer IPTG und das chromogene β-Galactosidase-Substrat X-GAL enthält. Im Gegensatz dazu blockiert die Zerstö rung der Phagen-lacZ-Region durch Mutation oder Insertion von Fremd-DNA-Blöcken die α-Komplementation und führt zu blaßblauen oder farblosen Plaques.
Dieses Prinzip ist für die Entwicklung eines Assays zur Bewertung der Replikations-Wiedergabetreue von DNA-Polymerasen ausgenutzt worden (Benenek, K., und Kunkel, T.A., Analysing Fidelity of DNA Polymerases, Methods Enzymol. 262: 217–232, 1995). In diesem Verfahren wurde ein M13-Substrat konstruiert, welches eine Einzelstrang-Lücke enthielt, überspannend die Phagen-lacZ-Sequenz. Die Lücke wurde dann durch eine Polymerase von Interesse aufgefüllt, die Reaktionsprodukte in E. coli-Wirtszellen, welche α-Komplementation unterstützen, eingeführt, und es wurde in Gegenwart von X-GAL und IPTG ausplattiert. Wenn die lückenfillende DNA-Synthese fehlerfrei ist, wird das hergestellte β-Galactosidase-Peptid die mangelhafte β-Galactosidase des Wirtes komplementieren, und X-GAL wird in diesen Zellen hydrolysiert werden, wodurch blaue Plaques erzeugt werden. Blaßblaue oder klare Plaques werden erzeugt, wenn Fehler, welche während der lückenfillenden Reaktion gemacht wurden, zur Herstellung eines β-Galactosidase-Polypeptids von veränderter Aminosäuresequenz führen, welches zur Komplementation unfähig ist.
Eine Variation dieses Wiedergabegenauigkeits-Assays wurde angewandt, um die Effizienz der MutHLS-Behandlung zur Entfernung von Sequenzen, enthaltend polymeraseinduzierte Mutationen, welche während des Verfahrens der PCR auftreten, zu bewerten. Wie in der 6 dargestellt, wurde eine Region von M13mp18, überspannend das β-Galactosidase-Genfragment, unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert und die Produkte wurden denaturiert und reassoziiert. Dann wurde die MutHLS-Behandlung angewandt, um beide Stränge von Molekülen zu spalten, welche Punktmutationen oder kleine Insertionen und Deletionen enthielten, wobei Doppelstrangbrüche in derartigen Molekülen erzeugt wurden. Dann wurden Vollängenprodukte isoliert und in ein M13mp18-Molekül ligiert, aus welchem die Region, entsprechend zu dem PCR-Produkt, entfernt worden war, wodurch das Wildtyp-M13mp18-Fragment durch das entsprechende PCR-Produkt ersetzt wurde. Die Ligationsprodukte wurden dann in E. coli-Zellen transfiziert und in Gegenwart von IPTG, X-GAL und eines passenden Wirtsstamms ausplattiert. Das Vorhandensein von dunkelblauen Plaques weist auf Klone hin, enthaltend Wildtyp-β-Galactosidase-Genfragmente, und Blaßblaue oder klare Plaques weisen auf Klone hin, enthaltend Mutationen in dem β-Galactosidase-Gen. Der Anteil der blaßblauen und klaren Plaques zu den Gesamtplaques in den mit MutHLS behandelten Molekülen, verglichen zum entsprechenden Anteil in unbehandelten Molekülen, zeigt den Grad der Reduktion des Vorhandenseins von mutanten Sequenzen an.
PCR-Amplifikafion von DNAs
Ein 1611 Basenpaare (bp) großes Fragment von M13mp18 würde amplifiziert, welches das 390 by große β-Galactosidase Gen-Segement von Interesse überdeckte. In Hinsicht auf die virale Strangsequenz ist eine DraIII-Stelle 256 by vom 5'-Ende des PCR-Produkts lokalisiert, und eine BglII-Stelle ist 134 by vom 3'-Ende des PCR-Produktes lokalisiert (siehe 6). PCR-Reaktionen (100 μl) enthielten 50 mM KCI, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2 mM MgCl₂, 200 μM jedes dNTPs (Pharmacia), 100 pmol jedes Primers (21 Nukleotide lang mit 5'-OH-Termini; Oligos Etc., Guliford, CT), 5 μg T4-Gen32-Protein (Boehringer Mannheim), 50 ng Matrizen-DNA (M13mp18) und 2,5 Units AmpliTaq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer). Die Sequenz des Vorwärts-Primers war 5'-TTA TAC GTG CTC GTC AAA GCA-3' (SEQ ID NO: 10), entsprechend dem Nukleotiden 5458-5478 in M13mp18, und die Sequenz des Rückwärts-Primers war 5' AAT GCC TGA GTA ATG TGT AGG-3' (SEQ ID NO: 11), entsprechend den Nukleotiden 7048-7069 von M13mp18. Die Reaktionen (30 Zyklen) wurden unter Verwendung eines Perkin Elmer Gene Amp 9600-Thermocyclers mit Inkubationen bei 94°C während 15 s, 60°C während 15 s und 72°C während 1 min durchgeführt. Die Produkte wurden unmittelbar im Anschluß an die Amplifikation denaturiert und reassoziiert durch Erwärmen auf 95°C während 1 min und Inkubation bei 65°C während 60 min, gefolgt von Inkubation bei 37°C während 30 min. Dann wurde EDTA zu 20 mM zugesetzt und die Reaktionen wurden mit Phenol extrahiert, gefolgt von Bindung an eine Silicamatrix-Zentrifugiersäule (Pierce Xtreme DNA-Reinigungssäulen), und es wurde mit destilliertem H₂O eluiert, um PCR-Primer, dNTPs und Salze zu entfernen. Die Produkte wurden wie folgend mittels eines Ethidiumbromid-Dot-Verfahrens quantifiziert: Proben (2,0 μl einer passenden Verdünnung) und DNAs von bekannter Konzentration wurden zu 8 μl von 1 μg/ml Ethidiumbromid zugegeben und auf Kunststoff-Band aufgetropft. Die UVinduzierte Fluoreszenz wurde unter Verwendung einer gekühlten Ladungs-gekoppelten Imager-Vorrichtung von Photometrics gemessen. Die Konzentration der PCR-Produkte wurde durch Vergleich mit der Fluoreszenz der Standard bestimmt.
MutHLS-Reaktionen
Reaktionen (50 μl insgesamt) wurden wie folgend zusammengegeben: 20 μl 125 mM HEPES (pH 8,0), 50 mM KCl, 2,5 mM Dithiothreitol (DTT), 125 μg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 5 mM ATP, 10 mM MgCl₂ und 1 μg PCR-DNA wurden 8 min bei 37°C präinkubiert. Die Reaktionen wurden dann initiiert durch Zusetzen von 30 μl einer vorgemischten Lösung von 5 μg Muts (Su, S.-S., und Modrich, P., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83, 5057–5061, 1986), 12 μg MutL (Grilley M., Welsh, K.M., Su, S.-S. & Modrich, P., 7. Biol. Chem., 264: 1000–1004, 1989) und 18 ng MutH (Welsh, K.M., Lu, A.-L., Clark, S., & Modrich, P., J. Biol. Chem., 262: 15624–15629, 1987) in 20 mM Kaliumphosphat (pH 7,4), 50 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT und 1 mg/ml BSA. Die Inkubation wurde 45 min lang bei 37°C fortgesetzt. Zusätzliche 30 μl einer vorgemischten Lösung von 5 μg Muts, 12 μg MutL und 18 ng MutH im selben Puffer, wie obenstehend beschrieben, wurden dann zugegeben, ebenso wie 3 μl einer 10x-Pufferlösung, enthaltend 500 mM HEPES (pH 8,0), 200 mM KCl, 10 mM DTT, 20 mM ATP und 40 mM MgCl₂. Die Inkubation wurde 45 min lang bei 37°C fortgesetzt. Zusätzliche 30 μl einer vorgemischten Lösung von 5 μg Muts, 12 μg MutL und 18 ng MutH im selben Puffer, wie obenstehend beschrieben, wurden dann zugegeben, ebenso wie 3 μl einer 10x-Pufferlösung, enthaltend 500 mM HEPES (pH 8,0), 200 mM KCI, 10 mM DTT, 20 mM ATP und 40 mM MgCl₂. Die Inkubation wurde 45 min lang bei 37°C fortgesetzt. Die Reaktionen wurden durch Zusetzen von EDTA zu 10 mM beendet und mit Phenol extrahiert, gefolgt von Extraktion mit Ether. DNA wurde dann an eine Qiagen-Säule (QIAquick-Zentrifugiersäule) gebunden und mit destilliertem H₂O eluiert, um die DNA zu konzentrieren und Proteine, Salze und alle andere Reaktionskomponenten zu entfernen.
Restriktionsverdau und Gel-Reinigung
Nach MutHLS-Behandlung wurde die DNA mit DraIII und BglII in einer 20 μl-Reaktion verdaut, enthaltend 1 μg DNA, 100 μM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 100 μg/ml Rinderserumalbumin, 4 Units BglII (New England Biolabs) und 10 Units Dra III (Amersham). Die Reaktionskomponenten wurden 2 h lang bei 37°C inkubiert, und die Reaktion wurde durch Zusetzen von EDTA zu 10 mM beendet. Die Produkte wurden mit Ethanol gefällt, gefolgt von Elektrophorese durch 1%ige Agarose in 40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA (End-pH 7,5). Die Vollängenbande (entsprechend dem DraIII/BglII-Fragment von M13mp18) wurde unter Verwendung eines GeneClean-Kits (Bio 101) gemäß den Empfehlungen des Herstellers gewonnen. Die gewonnene DNA wurde unter Verwendung des obenstehend beschriebenen Ethidiumbromid-Dot-Verfahrens quantifiziert.
Ligationsreaktionen
Das PCR-Produkt, entsprechend dem DraIII/BglII-Fragment von N13mp18, gewonnen nach MutHLS-Behandlung, DraIII/BglII-Verdau und Gelreinigung, wurde in ein M13mp18-Derivat ligiert, in welchem das DraIII/BglII-Fragment entfernt worden war. Die Ligationsreaktionen (20 μl) enthielten 50 ng PCR-DNA-Fragment, 50 ng M13mp18 (ohne das DraIII/BglII-Fragment), 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 66 μM ATP und 0,5 Weiss-Units T4-DNA-Ligase. Die Reaktionen wurden 12-16 Stunden lang bei 16°C inkubiert.
Transfektionen
Ligations-Reaktionsprodukte wurden in XL2-Blue-Ultracompetent-Zellen (Stratagene) unter Befolgen des beigefügten Protokolls transfiziert. Ein Aliquot (50 μl) der Transfektionsreaktion wurde in ein Röhrchen bei 49°C zugesetzt, welches 4 ml Luria-Bertani-Weichagar, 4 mg X-GAL (Amersham) und 800 μg IPTG (Amersham) enthielt. Dann wurden 200 μl einer log-Phasen-Kultur von XLI-Blue zugesetzt. Die Weichagarmischung wurde auf eine Luria-Bertani-Platte gegossen und verfestigen gelassen. Die Platten wurden 12–16 Stunden lang bei 37°C inkubiert, und dann wurden 3 000 bis 12 000 Plaques gemäß der Farbe als Mutant oder Wildtyp bewertet.
Die mit drei unabhängigen Proben von PCR-amplifizierter DNA erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 1 zusammengefaßt. Wie obenstehend bemerkt, weisen dunkelblaue Plaques auf die Gegenwart eines Klons hin, der ein Wildtyp-β-Galactosidase-Genfragment enthält, und blaßblaue oder klare Fragmente weisen auf die Gegenwart eines Klons hin, der eine Mutation irgendwo innerhalb dieser Region enthält. Dieser Assay detektiert Einzelbasensubstitutions-Mutationen an 114 Positionen innerhalb des 390 by großen (3-Galactosidase-Fragmentes sowie Einzelnukleotid-Leserahmenverschiebungen an 150 Positionen (Eckert, K.A., und Kunkel, T.A., Nucl. Acids Res., 18: 3739–3744, 1990). Wie in der Tabelle 1 gezeigt, verringerte die MutHLS-Doppelstrangspaltungsreaktion das Vorkommen von mutanten Plaques um 88–93%.
Tabelle 1
Mutanten-Frequenz = 100 × [Anzahl von Mutanten-Plaques/Gesamtzahl von Plaques]
Andere Ausführungsformen finden sich innerhalb der nachfolgenden Patentansprüche.
SEQUENZAUFLISTUNG
(1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER: Modrich, Paul L. Smith, Jane E.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Verfahren zur Verwendung von Mismatch-Repair-Systemen zum Nachweis und zur Entfernung von Mutantsequenzen, die während enzymatischer Amplifikation entstehen
(iii) ANZAHL VON SEQUENZEN: 11
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Lyon & Lyon
(B) STRASSE: 633 West Fifth Street Suite 4700
(C) STADT: Los Angeles
(D) STAAT: Californien
(E) LAND: U.S.A.
(F) PLZ (ZIP): 90071–2066
(v) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) MEDIUMTYP: 3,5"-Diskette, 1,44 MB Speicherkapazität
(B) COMPUTER: IBM-Kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: IBM-P.C.-DOS 5.0
(D) SOFTWARE: Word Perfect 5.1
(vi) DATEN DER VORLIEGENDEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: wird noch zugewiesen
(B) EINREICHUNGSDATUM:
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(vii) FRÜHERE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: 60/008 673
(B) EINREICHUNGSDATUM: 15. Dezember 1995
(viii) ANWALT/VERTRETER-INFORMATION:
(A) NAME: Warburg, Richard J.
(B) REGISTRIERUNGS-NUMMER: 32 327
(C) REFERENZ/AKTENDECKEL-NUMMER:223/147
(ix) TELEKOMMUNIKATIONS-INFORMATION:
(A) TELEFON: (213) 489–1600
(B) TELEFAX: (213) 955–0440
(C) TELEX: 67-3510

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 1:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ II Nr.: 1:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 2:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
s(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ II Nr.: 2:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 3:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 3:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 4:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 4:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 5:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 5:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 6:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 6:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 7:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) TYP: – Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 7:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 8:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 8:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 9:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 9:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 10:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 10:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 11:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare ,
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 11:

Claims

Verfahren zur Entfernung von DNA-Molekülen, enthaltend eine oder mehrere polymerase-generierte Mutationen, aus einer Population von DNA-Duplexen, die unter Verwendung von Primern, enthaltend 5'-Hydroxyenden, enzymatisch verstärkt wurden, umfassend die Schritte: Denaturieren und Reassozüeren genannter Population von DNA-Duplexen, Inkontaktbringen genannter reassoziierter DNA-Duplexe mit einem Mismatch-Repair-System, welches eine GATC-Endonuclease umfasst, sodass jeder Strang in DNA-Duplexen, enthaltend ein Basenpaar-Mismatch, geschnitten wird, und weiterhin Inkontaktbringen genannter Population reassoziierter DNA-Duplexe mit Exonucleasen, sodass genannte DNA-Duplexe, welche einen Basenpaar-Mismatch enthalten, enzymatisch abgebaut werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei genanntes Mismatch-Repair-System Komponenten des methyl-gerichteten Mismatch-Repair-Systems von E. coli umfasst und die MutS-, MutL- und MutH-Proteine beinhaltet.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei genannte Exonucleasen eine Exonuclease, welche vorzugsweise auf Duplexe mit einem 5'-Phosphat wirkt, und eine Exonuclease, welche Einzelstrang-DNA abbaut, umfassen.
Verfahren zur Detektion der Anwesenheit von DNA-Polymerase generierten Mutationen aus einer Population enzymatisch verstärkter DNA-Duplexe, wobei genannte verstärkte DNA-Duplexe aus DNA-Duplexen produziert sind, denen eine Sequenz fehlt, die einem durch Mismatch bedingten endonucleolytischen Schnitt unterworfen ist, und das Verfahren durch die Schritte charakterisiert ist: enzymatisches Verstärken einer Population von DNA-Molekülen unter Verwendung von Primern, welche eine Sequenz enthalten, enthaltend eine GATC-Stelle, die einem durch Mismatch bedingten endonucleolytischen Schnitt unterworfen ist, und weiterhin umfassend: Denaturieren und Reassozüeren genannter Population von DNA-Duplexen, Inkontaktbringen genannter reassoziierter DNA-Duplexe mit einem Mismatch-Repair-System, welches eine GATC-Endonuclease umfasst, unter Bedingungen, sodass in mindestens einem Strang eines Duplex, welcher eine polymera se-generierte Mutation enthält, ein endonucleolytischer Schnitt eingeführt wird, und Detektion des Produktes von genanntem endonucleolytischen Schnitt, als Hinweis auf das Vorhandenseins polymerase-generierter Mutationen.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei genannte Sequenz, die einem durch Mismatch bedingten endonucleolytischen Schnitt unterworfen ist, eine d(GATC)-Stelle ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Detektion des Produktes von genanntem endonucleolytischen Schnitt durch abgewandelte elektrophoretische Mobilität unter denaturierenden Bedingungen erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei genanntes Mismatch-Repair-System Komponenten des methyl-gerichteten Mismatch-Repair-Systems von E. coli umfasst und die MutS-, MutL- und MutH-Proteine beinhaltet.
Kit zur Amplifizierung von DNA-Molekülen, denen eine Sequenz fehlt, die einem durch Mismatch bedingten endonucleolytischen Schnitt unterliegt, und Detektion oder Entfernung von DNA-Molekülen, welche eine oder mehrere polymerase-generierte Mutationen besitzen, aus einer Population enzymatisch amplifizierter DNA-Duplexe, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: Primer, enthaltend eine Sequenz, enthaltend eine GATC-Stelle, unterworfen einem durch Mismatch bedingten endonucleolytischen Schnitt, und weiterhin umfassend: Komponenten eines Mismatch-Repair-Systems, welches GATC-Endonuclease umfasst.
Kit zur Entfernung von DNA-Molekülen, enthaltend eine oder mehrere polymerase-generierte Mutationen, aus einer Population enzymatisch verstärkter DNA-Duplexe, umfassend: Komponenten eines Mismatch-Repair-Systems, welches eine GATC-Endonuclease umfasst, und eine Exonuclease, welche vorzugsweise auf Duplexe mit einem 5'-Phosphat wirkt, bevorzugt Lambda-Exonuclease, und eine Exonuclease, welche einzelsträngige DNA abbaut, vorzugsweise Exonuclease I.
Verfahren zur Entfernung von DNA-Molekülen, enthaltend eine oder mehrere polymerase-generierte Mutationen, aus einer Population enzymatisch amplifizierter DNA-Duplexe, wobei genannte amplifizierte DNA-Duplexe aus DNA-Duplexen erzeugt sind, welchen eine Sequenz fehlt, die einem durch Mismatch bedingten endonucleolytischen Schnitt unterworfen ist, und das Verfahren durch den Schritt der enzymatischen Amplifizierung einer Population von DNA-Molekülen charakterisiert ist, unter Verwendung von Primern, die eine Sequenz enthalten, enthaltend eine GATC-Stelle, unterworfen einem durch Mismatch bedingten endonucleolytischen Schnitt, und weiterhin umfassend: Denaturieren und Reassozüeren genannter Population von DNA-Duplexen, Inkontaktbringen genannter reassoziierter DNA-Duplexe mit einem Mismatch-Repair-System, enthaltend eine GATC-Endonuclease, unter Bedingungen, sodass jeder Strang in einem DNA-Duplex geschnitten wird, der polymerase-generierte Mutationen enthält, und Trennung genannter geschnittener DNA-Duplexe von ungeschnittenen DNA-Duplexen.