DE60317693T2

DE60317693T2 - Methode und verwendung von thermostabilen rna-ligasen

Info

Publication number: DE60317693T2
Application number: DE60317693T
Authority: DE
Inventors: Arnthor Aevarsson; Olafur H. Fridjonsson; Thorarinn Blondal; Sigurlaug Skirnisdottir; Sigridur Hjorleifsdottir; Gudmundur Oli Hreggvidsson; Jakob Kristjansson
Original assignee: Prokaria Ltd
Current assignee: Epicentre Technologies Corp
Priority date: 2002-09-20
Filing date: 2003-09-19
Publication date: 2008-10-30
Anticipated expiration: 2023-09-20
Also published as: EP1546355B1; WO2004027056A2; EP1546355A2; DE60317693D1; WO2004027056A3; AU2003260945A8; AU2003260945A1; US20040058330A1

Description

Hintergrund der Erfindung
T4-infizierte Zellen enthalten reichlich RNA-Ligase, die mit hohen Ausbeuten gereinigt worden ist. Die RNA-Ligase des Bakteriophagen T4 katalysiert die ATP-abhängige Ligation eines 5'-phosphorylterminierten Nukleinsäuredonors (d. h. RNA oder DNA) mit einem 3'hydroxylterminierten Nukleinsäureakzeptor. Die Reaktion kann entweder intramolekular oder intermolekular sein, d. h. das Enzym katalysiert die Bildung von zirkulärer DNA/RNA, linearer DNA/RNA-Dimere und von RNA-DNA- bzw. DNA-RNA-Blockcopolymeren. Die Verwendung eines 5'-phosphat-, 3'-hydroxylterminierten Akzeptors und eines 5'-phosphat-, 3'-phosphatterminierten Donors begrenzt die Reaktion auf ein besonderes Produkt. Die RNA-Ligase kann daher ein wichtiges Hilfsmittel bei der Synthese von DNA einer definierten Sequenz sein (McCoy und Gumport, Biochemistry 19: 635–642 (1980), Sugion, A. et al., J. Biol. Chem. 252: 1732–1738 (1977)).
Die praktische Verwendung der T4-RNA-Ligase wurde vielfach aufgezeigt. Es wurden verschiedene ligationsverankerte PCR-Amplifikationsverfahren entwickelt, bei denen ein Anker definierter Sequenz direkt mit einzelsträngiger DNA ligiert wird (im Anschluss an einer Primerverlängerung, z. B. First-Strand-cDNA). Das aus der PCR resultierende Produkt wird amplifiziert, indem Primer verwendet werden, die sowohl für die relevante DNA als auch für den Anker spezifisch sind (Apte, A. N. and P. D. Siebert, BioTechniques. 15: 890–893 (1993); Troutt, A. B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 9823–9825 (1992); Zhang, X. H. and V. L. Chiang, Nucleic Acids Res. 24: 990–991 (1996)). Darüber hinaus wurde T4-RNA-Ligase bei der Fluoreszenz-, Isotopen- oder Biotinmarkierung des 5'-Endes einzelsträngiger DNA-/RNA-Moleküle (Kinoshita Y. et al., Nucleic Acid Res. 25: 3747–3748 (1997)), der Synthese von zirkulären Hammerhead-Ribozymen (Wang, L. and D. E. Ruffner, Nucleic Acids Res 26: 2502–2504 (1998)), der Synthese von Dinukleosidpolyphosphaten (Atencia, E. A. et al., Eur. J. Biochem. 261: 802–811 (1999)) und für die Herstellung von zusammengesetzten Primern (Kaluz, S., et al., BioTechniques, 19: 182–186 (1995)) verwendet.
Die Verwendung thermostabiler Enzyme hat das Gebiet der DNA-Rekombinationstechnologie revolutioniert. Thermostabile Enzyme, vor allen Dingen DNA-Polymerasen, die bei der Amplifikation von DNA verwendet werden, sind für die Forschungsindustrie heute enorm wichtig. Darüber hinaus werden thermophile Enzyme auch in kommerziellem Umfeld eingesetzt (z. B. werden Proteasen und Lipasen in Waschpulver und hydrolytische Enzyme zum Bleichen verwendet). Die Identifizierung neuer thermophiler Enzyme wird die DNA-Forschung in Zukunft weiter vereinfachen und zur Verbesserung kommerzieller enzymbasierter Produkte beitragen (Wang, T. et al., J. Biol. Chem. 278: 29454–29462 (2003)).
Die RNA-Ligaseaktivität wurde ursprünglich als Aktivität identifiziert, die durch Infektion von E. coli durch Bakteriophagen der T-Even-Gruppe induziert wird (Silber, R. et al., Proc, Natl. Acad. USA, 69: 3009–3013 (1972)). Die RNA-Ligase des Bakteriophagen T4 ist das Produkt von Gen 63 (Snopek, T. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 3355–3359 (1977)) und die am besten charakterisierte RNA-Ligase unter den sehr wenigen bekannten homologen RNA-Ligasen.
Die Eigenschaften der RNA-Ligase des Bakteriophagen T4 sind ausführlich untersucht worden, einschließlich ihrer Fähigkeit zur Katalysierung von Reaktionen mit verschiedenen Substraten (zur Übersicht siehe Gumport and Uhlenbeck in „Gene Amplification and Analysis", Vol. II: Analysis of Nucleic Acid Structure by Enzymatic Methods, Chirikjian and Papas, Hrsg., Elsevier North Holland, Inc. (1980)). Allgemein katalysiert die RNA-Ligase von T4 die ATP-abhängige Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen einem 3'-Hydroxyl-Nukleinsäureakzeptor und einem 5'-Phosphat-Nukleinsäuredonor. Die T4-RNA-Ligase kann einzelsträngige Nukleinsäuren als Substrate verwenden und benötigt keinen komplementären Vorlagenstrang, um Donorphosphate zu Akzeptorhydroxylen auszurichten.
5'-Phosphorylierte Oligonukleotide sind geeignete Donoren für die ATP-abhängige T4-RNA-Ligasereaktion, aber der minimale Donor ist ein Nukleosid-3',5'-biphosphat (pNp). Geeignete minimale Akzeptormoleküle für die T4-RNA-Ligasereaktion sind Trinukleosidbiphosphate.
Die T4-RNA-Ligase wird in Gegenwart von ATP adenyliert, wobei eine kovalente Bindung zwischen AMP und einem Lysylrest gebildet wird. Die Adenylgruppe kann dann von dem Enzym auf das 5'-Phosphat einer Nukleinsäure übertragen werden. Die T4-RNA-Ligase kann ATP-Analoge akzeptieren und Nukleinsäuresubstrate mit dem Nukleotidanalog adenylieren. Darüber hinaus kann die T4-RNA-Ligase eine Klasse von Reaktionen katalysieren, die kein ATP benötigen. Das Enzym kann ein breites Spektrum von ADP-Derivaten als Substrat akzeptieren und verknüpft die Extraeinheit des ADP-Derivats unter Eliminierung von AMP mit einem Nukleinsäureakzeptor. Beispiele für ADP-Derivate dieser Art umfassen ADP-Riboflavin und ADP-Hexylaminbiotin (siehe weiter Gumport and Uhlenbeck, in „Gene Amplification and Analysis", Vol. II: Analysis of Nucleic Acid Structure by Enzymatic Methods, Chirikjian and Papas, Hrsg., Elsevier North Holland, Inc. (1980)).
Die T4-RNA-Ligase hat für RNA größere Affinität als für DNA. Obgleich RNA und DNA als Donoren gleich reaktiv sind, ist DNA ein ineffizienterer Akzeptor als RNA. Die Effizienz der RNA-Ligasereaktion wird auch von der Nukleotidzusammensetzung des Akzeptors beeinflusst, und Oligo(A) scheint als effizientester Akzeptor zu fungieren. RNA-Moleküle sind gute Akzeptoren für die T4-RNA-Ligase.
Das 5'-Phosphat der tRNA^Phe der Hefe ist ein sehr schlechter Donor für die T4-RNA-Ligase, was darauf hindeutet, dass sekundäre oder tertiäre Strukturen in dem RNA-Donormolekül die Ligasereaktion hemmen. Dagegen sind DNA-Restriktionsfragmente gute Donoren, und es sind wenige Unterschiede zwischen DNA-Restriktionsfragmenten mit gestaffelten (staggered) oder stumpfen 5'-Enden festzustellen. Andererseits hat das Vorhandensein einer Sekundärstruktur eines RNA-Akzeptormoleküls wenig Einfluss auf die Reaktion. Die 5'-Cap (m⁷G^5' ppp-^5'), die sich üblicherweise durch Addition von methyliertem Guanosin an das 5'-Ende eukaryotischer mRNA bildet, ist weder Akzeptor noch Donor für die T4-RNA-Ligasereaktion (Gumport and Uhlenbeck in „Gene Amplification and Analysis", Vol. II: Analysis of Nucleic Acid Structure by Enzymatic Methods, Chirikjian und Papas, Hrsg., Elsevier North Holland, Inc. (1980)).
Die T4-RNA-Ligase ist ein vielseitiges Enzym mit neuen Eigenschaften, deren Entdeckung noch nicht abgeschlossen ist. Wie kürzlich festgestellt wurde, ist die T4-RNA-Ligase in der Lage, neben der bereits charakterisierten Reaktion zwischen einem 5'-Phosphatdonor und einem 3'-Hydroxylakzeptor auch die Reaktion zwischen einem 3'-Phosphatdonor und einem 5'-Hydroxylakzeptor zu katalysieren ( US-Patent Nr. 6,329,177 ). Die T4-RNA-Ligase verfügt außerdem über vorlagen (template)-vermittelte DNA-Ligaseaktivität. Wie berichtet wurde, kann die T4-RNA-Ligase DNA-Strangenden, die mit RNA hybridisiert sind, noch effizienter ligieren als T4-DNA-Ligase ( US-Patent Nr. 6,368,801 ).
Es sind Enzyme identifiziert worden, die RNA-Ligaseaktivität aufweisen, aber offensichtlich nicht mit der T4-RNA-Ligase und anderen homologen Proteinen in der kleinen Familie der viralen RNA-Ligasen verwandt sind. Diese Enzyme weisen relativ strenge Substratspezifität auf, wohingegen die Aktivität der T4-RNA-Ligase die allgemeinste bekannte RNA-Verknüpfungsaktivität darstellt.
Die RNA-Ligasen der Bakteriophagen der T-Even-Gruppe scheinen zu einer sehr kleinen Familie von homologen Enzymen zu gehören. Wahrscheinlich handelt es sich dabei jedoch um eine Unterfamilie einer viel größeren Unterfamilie von Ligasen, der DNA-Ligasen und mRNA-Capping-Enzyme angehören (Shuman, S. and B. Schwer, Mol. Microbiol., 17: 405–410 (1995); Timson, D. J., et al., Mut. Res., 460: 301–318 (2000)). Bis vor kurzem stammten die einzigen eindeutig identifizierbaren Verwandten der T4-RNA-Ligase, die durch Sequenzvergleich (z. B. mit der BLAST-Software) gefunden wurden, aus dem Bakteriophagen RB69 und dem Kernpolyheder-Virus Autographa californica. Wie in vorherigen Patentanmeldungen beschrieben ist (US-Patentanmeldung Nr. 09/585,858; PCT-Anmeldung Nr. PCT/IB00/00893 ; Europäische Anmeldung Nr. 00938977.6 ), identifizierte die Entdeckung eines Bakteriophagen aus dem thermophilen Bakterienwirt Rhodothermus marinus und die anschließende Genomsequenzierung eine neue RNA-Ligase, die der Aminosäuresequenz des prognostizierten Genproduktes eines bestimmten offenen Leserasters zufolge zu der T4-RNA-Ligase homolog ist. Entsprechend scheinen diese Ligasen eine Familie viraler RNA-Ligasen zu bilden, die derzeit nur Ligasen des Bakteriophagen T4 (und andere Bakteriophagen der T-Even-Gruppe durch Analogie), des Bakteriophagen RB69, des Kernpolyheder-Virus Autographa californica und die Ligasen der vorliegenden Erfindung der Bakteriophagen RM378 und TS2126 umfasst. Die Ligasen der vorliegenden Erfindung sind die einzigen bekannten Mitglieder der Familie thermophiler Herkunft.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung betrifft thermostabile RNA-Ligasen, die von thermophilen Mikroorganismen wie beispielsweise Bakterien, Archaea abgeleitet sind, sowie von Bakteriophagen, die thermophile Bakterien infizieren, und deren Verwendung bei verschiedenen Anwendungen, einschließlich Nukleotidmarkierung, Oligonukleotidsynthese, Gensynthese, Genamplifikation und Amplifikation der mRNA-Synthese aus cDNA. Die Veröffentlichung betrifft RNA-Ligase-Isolate aus Bakteriophagen, welche die thermophilen Bakterien Rhodothermus marinus und Thermus scotoductus infizieren. Diese thermophilen RNA-Ligasen können die T4-RNA-Ligase bei Verfahren ersetzen, bei denen die T4-RNA-Ligase zum Einsatz kommt.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren des Ligierens eines Nukleotids oder Nukleotidanalogs oder einer Nukleinsäure, welche Nukleotide oder Nukleotidanaloga enthalten, mit einem anderen Nukleotid oder Nukleotidanalog oder einer Nukleinsäure, welche Nukleotide oder Nukleotidanaloga enthalten, wobei das Verfahren das Kontaktieren der Nukleotide, Nukleotidanaloga oder Nukleinsäuren mit einer isolierten thermostabilen RNA-Ligase umfasst, wobei die Ligase eine Ligationsreaktion der Nukleotide, Nukleotidanaloga oder Nukleinsäuren katalysiert, wobei die Ligation bei einer Temperatur von mindestens 50°C durchgeführt wird. Die thermostabile RNA-Ligase kann aus einem thermostabilen Bakteriophagen stammen; bei den Nukleinsäuren kann es sich um RNA oder DNA handeln; die RNA oder DNA kann einzelsträngig sein, und die Nukleotidanaloga enthalten modifizierte Basen, modifizierte Zucker und/oder modifizierte Phosphatgruppen. Die RNA-Ligase ist aus der Gruppe ausgewählt, die Folgende umfasst: eine RNA-Ligase, die aus einem Bakteriophagen erhalten wird, der ein thermophiles Bakterium infiziert; ein Polypeptid, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr: 2 oder SEQ ID Nr: 4 aufweist; ein von einer Nukleinsäure kodiertes Polypeptid, welches die Sequenz von SEQ ID Nr: 1 oder SEQ ID Nr: 3 aufweist; ein Polypeptid, das eine Sequenzidentität von mindestens 30% zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr: 2 oder SEQ ID Nr: 4 aufweist, und ein Fragment oder Derivat davon.
Es ist ein Verfahren zum Ausbilden einer Phosphodiesterbindung zwischen einem 3'-Hydroxylnukleinsäureakzeptor und einem 5'-Phosphatnukleinsäuredonor beschrieben, welches umfasst: Kontaktieren eines 3'-Hydroxylnukleinsureakzeptors und eines 5'-Phosphatnukleinsäuredonors mit einer thermostabilen RNA-Ligase, wobei zwischen den Nukleinsäuren eine Phosphodiesterbindung gebildet wird.
Es ist ein Verfahren zum Synthetisieren eines Oligonukleotidpolymers durch sich wiederholende Zyklen des Kombinierens eines Oligonukleotidprimers und eines blockierten Oligonukleotids beschrieben, welches umfasst: a) Kombinieren des Oligonukleotidprimers und eines am 3'- oder 5'-Ende blockierten Oligonukleotids in Gegenwart einer thermostabilen RNA-Ligase, wodurch ein verlängerter Primer mit einem blockierten 3'- oder 5'-Ende gebildet wird; b) enzymatisches Entfernen der blockierten Phosphatgruppe am 3'- oder 5'-Ende oder enzymatisches Hinzufügen einer Phosphatgruppe an das 5'-Ende des verlängerten Primers; und c) Wiederholen von a) und b), wobei der verlängerte Primer von b) als Primer für a) verwendet wird, wobei ein Oligonukleotidpolymer gebildet wird. Das gebildete Oligonukleotidpolymer umfasst ein Gen oder einen Teil eines Gens, das ein Polypeptid kodiert.
Die Veröffentlichung betrifft des Weiteren ein Verfahren zum Synthetisieren eines rekombinanten Genproduktes, welches umfasst: Bereitstellen einer Anordnung immobilisierter Oligonukleotide, umfassend vorbestimmte Bereiche auf einer Fläche eines festen Trägers, wobei auf jedem Bereich Kopien eines Oligonukleotids immobilisiert sind, Hybridisieren erster einzelsträngiger terminaler Regionen von ersten zu ligierenden Nukleinsäuresträngen an die immobilisierten Oligonukleotide, und Ligieren des hybridisierten ersten Endes einer ersten Nukleinsäure und einer zweiten Nukleinsäure mit einer thermostabilen RNA-Ligase.
Die Veröffentlichung betrifft außerdem ein Verfahren zum Feststellen von Nukleinsäuren, welches umfasst: Kontaktieren einer ersten Sonde, einer zweiten Sonde, einer Nukleinsäurezielprobe und einer thermostabilen RNA, wobei die erste Sonde und die zweite Sonde derart an die Nukleinsäurezielprobe hybridisieren, dass das 5'-Ende der ersten Sonde und das 3'-Ende der zweiten Sonde benachbart sind und ligiert werden können, und Inkubieren der ersten Sonde, der zweiten Sonde, der Zielprobe und der RNA-Ligase unter Bedingungen, welche die Hybridisierung der Sonden an die Zielsequenz fördern und die Ligation der Sonden fördern, wenn die Zielsequenz in der Zielprobe vorhanden ist. Mindestens das 5'-terminale Nukleotid der ersten Sonde und das 3'-terminale Nukleotid der zweiten Sonde sind Desoxyribonukleotide.
Die Veröffentlichung betrifft außerdem ein Verfahren zum Amplifizieren von Nukleinsäuren, umfassend: a) Kontaktieren einer eine Nukleinsäure enthaltenden Probe, wobei die Probe einen Pool von mRNA mit einem Poly-A-Schwanz umfasst, mit i) einem Oligonukleotid mit einem 5'-Ende und einem 3'-Ende, das eine OligodT-Sequenz am 3'-Ende aufweist, eine von einer RNA-Polymerase erkannte Promotorsequenz am 5'-Ende aufweist und bei dem sich zwischen der Oligo-dT-Sequenz und der Promotorsequenz eine Transkriptionsinitiationsregion befindet, wobei das Oligonukleotid am 3'-Ende blockiert ist, um eine Verlängerung zu verhindern, ii) einem Enzym mit reverser Transkriptionsaktivität, das eine doppelsträngige Promotor-Primer-Sequenz ausbildet, iii) mindestens einem Enzym mit RNase-H-Aktivität, iv) einem Enzym mit RNA-Polymeraseaktivität und v) ausreichenden Mengen von dNTPs und rNTPs; b) Halten des resultierenden Reaktionsgemisches für eine ausreichende Zeitdauer unter geeigneten Bedingungen für enzymatische Aktivität, so dass in Abwesenheit von cDNA-Zwischenstufen eine Antisense-RNA gebildet wird; c) Kontaktieren der vielen Kopien von RNA mit i) einer thermostabilen RNA-Ligase, ii) einem doppelsträngigen DNA-Komplex, der eine doppelsträngige DNA-Promotorsequenz aufweist, wobei jeder Strang ein 5'-Ende und ein 3'-Ende aufweist, die Promotorsequenz von einer RNA-Polymerase erkannt werden kann, wobei ein Strang des Komplexes eine RNA-Strecke aufweist, die an dessen 5'-Ende angebracht ist, iii) einem Enzym mit RNA-Polymeraseaktivität und iv) ausreichenden Mengen von dNTPs und rNTPs; und d) Halten des resultierenden Reaktionsgemisches für eine ausreichende Zeitdauer unter geeigneten Bedingungen, damit die enzymatischen Prozesse stattfinden können.
Die Veröffentlichung betrifft ein Verfahren zum selektiven Isolieren von zellulärer Gesamt-mRNA, welches umfasst: Kontaktieren eines Zelllysats, welches zelluläre Gesamt-mRNA und nicht isolierte Ribosomen mit einer thermostabilen RNA-Ligase unter Bedingungen, bei denen die Ligase einen 3'-Marker der zellulären Gesamt-mRNA hinzufügt, um modifizierte zelluläre Gesamt-mRNA zu bilden, und Isolieren der modifizierten zellulären Gesamt-mRNA.
Die Veröffentlichung betrifft auch ein Verfahren zum Synthetisieren einer Wiederholungsregion eines Oligonukleotids mit einer definierten Sequenz, wobei die Wiederholungsregion ein wiederholtes Nukleotid aufweist, das mehr als einmal in Aufeinanderfolge auftritt, umfassend: a) Ligieren eines Oligonukleotidprimers an ein 3'-phosphatblockiertes wiederholtes Nukleotid, um einen 3'-phosphatblockierten Primer zu bilden; b) Entfernen der 3'-Phosphatblockierungsgruppe von dem 3'-phosphatblockierten Primer unter Verwendung eines 3'-Phosphataseenzyms, wodurch ein entblockter Primer hergestellt wird, ohne dass die 3'-Phosphatblockierungsgruppe von nicht umgesetztem 3'-phosphatblockiertem wiederholtem Nukleotid entfernt wird; und c) Wiederholen von Schritt (a) und (b) unter Verwendung von nicht umgesetztem 3'-phosphatblockiertem wiederholtem Nukleotid von Schritt (b) als 3'-phosphatblockiertes wiederholtes Nukleotid von Schritt (a) und dem entblockten Primerprodukt von Schritt (b) als dem Oligonukleotidprimer von Schritt (a) ohne vorherige Trennung des nicht umgesetzten 3'-phosphatblockierten wiederholten Nukleotids von dem entblockten Primerprodukt, wobei die Zyklen wiederholt werden, um ein Oligonukleotid mit einer definierten Sequenz zu bilden.
Darüber hinaus betrifft die Veröffentlichung ein Verfahren zum Einsetzen einer einzelsträngigen RNA-Sequenz in einen Klonierungsvektor, umfassend: Ligieren beider Termini der einzelsträngigen RNA-Sequenz in Gegenwart einer thermostabilen RNA-Ligase mit einem linearen doppelsträngigen Klonierungsvektor, der einzelsträngige Termini aufweist, welche zu beiden Termini der einzelsträngigen RNA-Sequenz komplementär sind, um ein Anheftungsprodukt (Annealing-Produkt) auszubilden, bei dem die komplementären Enden der einzelsträngigen RNA-Sequenz gebildet werden, indem mit einer thermostabilen RNA-Ligase Oligonukleotidlinker an die RNA-Sequenz angebracht werden.
Hierin ist auch ein Verfahren zum Ausbilden einer Bibliothek von DNA-Sequenzen beschrieben, welches umfasst: a) Ausbilden einer Bibliothek von RNA-Zielfragmenten durch Kontaktieren vieler Kopien nicht denaturierter RNA-Zielsequenzen mit einer Bibliothek zufälliger Oligonukleotide in Gegenwart eines hydrolytischen Agens unter Bedingungen, bei denen eine Teilgruppe der Bibliothek zufälliger Oligonukleotide an die Ziel-RNA hybridisiert, wobei das hydrolytische Agens anschließend die Ziel-RNA an einer Stelle in der Nähe des 5'-Endes eines jeden hybridisierten zufälligen Oligonukleotids hydrolysiert und wobei die 3'-Enden jedes Fragments die gesamte Sequenz enthalten, an welche ein zufälliges Oligonukleotid in der Teilgruppe hybridisierte; und b) Ausbilden einer Bibliothek von Vorlagen (Templates) zur Primerverlängerung aus der Bibliothek von RNA-Zielfragmenten, und Ausbilden einer Bibliothek von DNA-Sequenzen, die zu den RNA-Zielfragmenten aus der Bibliothek von Vorlagen (Templates) zur Primerverlängerung komplementär sind, indem eine Nukleinsäureprimerkomplementsequenz mit einer thermostabilen RNA-Ligase an das 3'-Ende jedes RNA-Zielfragmentes angebracht wird.
Die Veröffentlichung betrifft des Weiteren ein Verfahren zum Amplifizieren einer 5'-Endregion von Ziel-mRNA, umfassend: a) Entphosphorylieren von mRNA-Molekülen mit einer freien Phosphatgruppe am 5'-Ende; b) Entfernen der 5'-Cap an Volllängen-mRNAs; c) Ligieren von Linkern an das 5'-Ende von entcappten mRNA-Molekülen unter Verwendung einer thermostabilen RNA-Ligase; d) Synthetisieren von cDNA unter Verwendung von reverser Transkriptase; und e) Amplifizieren der cDNA durch PCR.
Die Veröffentlichung betrifft ein Verfahren zum Amplifizieren von mRNA, welches umfasst: a) Synthetisieren von cDNA, wobei der erste Strang der cDNA durch reverse Transkription von Ziel-mRNA unter Verwendung eines 5'-endphosphorylierten Primers für die reverse Transkription synthetisiert wird, der für die Ziel-RNA spezifisch ist, wodurch ein DNA-RNA-Hybrid erzeugt wird; b) Abbau des DNA-RNA-Hybrids durch Behandlung mit mindestens einem Enzym mit RNase-H-Aktivität zur Entfernung von RNA; c) Zirkularisieren der einzelsträngigen cDNA zur Ausbildung von Konkatemeren mit einer thermostabilen RNA-Ligase; und d) Amplifizieren von DNA durch PCR unter Verwendung spezifischer Primer, die zu bekannten Sequenzen komplementär sind.
Hierin beschrieben ist auch ein Verfahren zum Amplifizieren von Nukleinsäuren mit einem einzelnen Primer, welches umfasst: a) Hybridisieren eines Gemisches von Nukleinsäuren mit einem degenerierten oder nicht degenerierten Primer, der auf eine einzelne Region in einer Zielsequenz abzielt; b) Synthetisieren einzelsträngiger DNA, die zu einer Region der Zielsequenz komplementär ist, wobei die Synthese von dem degenerierten oder nicht degenerierten Primer geprimt und von einer DNA-Polymerase oder einer reversen Transkriptase katalysiert wird, wodurch eine lineare Amplifikation der Zielsequenz durch wiederholtes Thermozyklieren (Thermal Cycling) durchgeführt wird; c) Ausstatten der einzelsträngigen DNA mit einer zweiten Primerstelle, indem an ihr 3'-Ende ein Oligonukleotid ligiert wird, wobei die Ligation von einer thermostabilen RNA-Ligase katalysiert wird; d) Amplifizieren der einzelsträngigen DNA durch Verwendung eines Primer-Paars, wobei ein erster Primer mindestens einen Teil der degenerierten oder nicht degenerierten Primersequenz aufweist oder wobei einer erster Primer auf eine Region abzielt, die sich stromabwärts (downstream) von der degenerierten oder nicht degenerierten Primersequenz befindet, und der zweite Primer zu der 3'-Primerstelle von Schritt (c) komplementär ist. Die einzelsträngige DNA, die in Schritt b) synthetisiert wurde, wird gereinigt.
Es ist auch ein Verfahren zum Sequenzieren von Oligonukleotiden beschrieben, welches das Kontaktieren eines Zieloligonukleotids mit einer thermostabilen RNA-Ligase unter Bedingungen umfasst, bei denen die Ligase dem 3'-Ende des Zieloligonukleotids ein Hilfsoligonukleotid hinzufügt, und Sequenzieren des Oligonukleotids.
Verfahren, bei denen die thermophilen RNA-Ligasen verwendet werden, werden bei Temperaturen von mindestens 50°C durchgeführt, wie beispielsweise bei mindestens 55°C, wie beispielsweise bei mindestens 60°C, wie beispielsweise bei mindestens 65°C, wie beispielsweise bei mindestens 70°C. Ein bevorzugtes Verfahren der Veröffentlichung verwendet thermophile RNA-Ligasen bei Temperaturen im Bereich von etwa 50°C bis etwa 75°C.
Obgleich die T4-RNA-Ligase für viele sinnvolle Anwendungen genutzt werden kann, ist sie nur bis etwa 40°C funktionell. Die thermostabilen RNA-Ligaseenzyme, wie hierin beschrieben, haben vorteilhafte Eigenschaften, wie beispielsweise verschiedene Substratspezifität, insbesondere erhöhte Aktivität gegenüber ssDNA im Vergleich zu T4-Ligase und Verhinderung unerwünschter Sekundärstrukturen aufgrund der Fähigkeit des Enzyms bei höheren Temperaturen zu funktionieren.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Die vorstehenden und anderen Aufgaben, Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen aus der folgenden, ausführlicheren Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, wie in den begleitenden Zeichnungen veranschaulicht, hervor.
1 ist eine Schemadarstellung des Ein-Primer-Verfahrens bei dem eine Adaptersequenz mit dem 3'-Ende der einzelsträngigen DNA-Kopie ligiert wird, um eine zweite Primerstelle für den zweiten Amplifikationsschritt bereit zu stellen.
2 ist Gel, welches das Screening von Amylasen durch zufällige Auffindung von Genen anhand des Ein-Primer-Verfahrens darstellt, bei dem verschiedene RNA-Ligasen verwendet wurden. Spur 1: 1-Kb-Leiter (Ladder) (New England Biolabs), Spur 2: T4-RNA-Ligase und PCR mit Primer Am508, Spur 3: T4-RNA-Ligase und PCR mit Primer oli11, Spur 4: T4-RNA-Ligase und PCR mit Primern Am508 und oli11, Spur 5: RM378-RNA-Ligase und PCR mit Primer Am508, Spur 6: RM378-RNA-Ligase und PCR mit Primer, oli11, Spur 7: RM378-RNA-Ligase und PCR mit Primer Am508 und oli11, und Spur 8: 1-Kb-Ladder (New England Biolabs).
3 ist ein Gel, das die Synthese von IGFA durch T4-RNA-Ligase und RM378-RNA-Ligase wiedergibt. Spur 1: 100-bp-Ladder (New England Biolabs), Spur 2: T4-RNA-Ligase und PCR mit Primer IGFA-r und IGFA-f, welche das gesamte Gen ergeben, Spur 3: T4-RNA-Ligase und PCR mit Primer IGFA-r und IGFA-2f, die das OligoA (partielles Gen) ergeben, Spur 4: RM378-RNA-Ligase und PCR mit Primer IGFA-r und IGFA-f, die das gesamte Gen ergeben, Spur 5: RM378-RNA-Ligase und PCR mit Primer IGFA-r und IGFA-2f, die das OligoA (partielles Gen) ergeben, und Spur 6: 100-bp-Ladder (New England Biolabs).
4A ist eine Nukleinsäuresequenz der RM378-RNA-Ligase (SEQ ID Nr: 1) und die Aminosäuresequenz der RM378-RNA-Ligase (SEQ ID Nr: 2) und 4B ist die Nukleinsäuresequenz der TS2126-RNA-Ligase (SEQ ID Nr: 3) und die Aminosäuresequenz der TS2126-RNA-Ligase (SEQ ID Nr: 4).
5 ist eine grafische Darstellung, welche die relative Aktivität der RM378-RNA-Ligase als eine Funktion des pH-Wertes zeigt. Der MOPS-Puffer ist in Rauten gezeigt und der IRIS-HCl-Puffer ist in Quadraten gezeigt.
6 ist eine grafische Darstellung von Temperaturprofilen für die Aktivität der RM378-RNA-Ligase und der T4-RNA-Ligase.
7 ist eine grafische Darstellung, welche die relative Aktivität der RM378-RNA-Ligase (Quadrate) und der T4-RNA-Ligase (Rauten) nach Inkubation bei verschiedenen Temperaturen zeigt.
8 ist eine grafische Darstellung, welche die prozentuale Aktivität der RM378-RNA-Ligase bei 60°C über die Zeit in MOPS-Puffer ohne Vorlage (Template) zeigt.
9 ist eine grafische Darstellung, die eine Zeitkurve wiedergibt, welche die RNA-Ligaseaktivität bei einer rA20-Vorlage (10 μM) unter Verwendung von 0,2 μg T4-RNA-Ligaseenzym und 0,2 μg und 0,4 μg RM378-RNA-Ligaseenzym zeigt. Die Reaktion mit der T4-RNA-Ligase wurde bei 37°C und die mit der RM378-RNA-Ligase bei 64°C durchgeführt.
10 ist eine grafische Darstellung, welche die zeitabhängige prozentuale Ligation des Gesamt-DNA-Substrats 5'[³²P]dA₂₀ für die T4-RNA-Ligase und die RM378-RNA-Ligase zeigt.
11 ist ein Balkendiagramm, welches die Ligation eines 90mer-ssDNA-Substrates unter Verwendung der RM378-RNA-Ligase und der T4-RNA-Ligase wiedergibt. Wie zu sehen ist, ist die Ligation mithilfe der RM378-RNA-Ligase bei langen DNA-Oligos sehr effizient (50–80%), bei der RM378-RNA-Ligase auch ohne PEG6000, aber sehr gering bei der T4-RNA-Ligase (3% ohne PEG6000 und 14% mit PEG6000).
12 ist ein Balkendiagramm, welches die intermolekulare Ligation von DNA-Donoren (dA10-Didesoxy oder -NH3⁺) an ein entphosphoryliertes ssDNA(dA10)-Oligo oder entphosphorylierte RNA mit 17 Nukleotiden (agcgtttttttcgctaa-Oligo; SEQ ID Nr: 5) wiedergibt. Die RM378-RNA-Ligase zeigt eine Ligation von 20 bzw. 25 wenn ³²PdA10dd mit bzw. ohne PEG mit dA10 ligiert wird. Die Ligation von dA10-NH3⁺ mit DNA- und RNA-Oligos zeigt eine Ligation von 27% bzw. 28%. Die T4-RNA-Ligase zeigt wenig Aktivität bei der Ligation von dA10-NH3 an einen DNA-Akzeptor, aber hohe Aktivität gegenüber einem RNA-Akzeptor (Ligation von 6% bzw. 60%).
13 ist ein Gel, welches die Ergebnisse einer Kontroll-PCR in einer RLM-RACE unter Verwendung der RM378-RNA-Ligase und des GeneRacer 5'-Nested Primer und des B1-Kontrollprimers zeigt. Spur 1: PCR-Produkt; Spur 2: Lambda-HindIII-Marker. Es ist ein PCR-Produkt mit einer Größe von etwa 800–900 bp zu sehen, wobei das erwartete Produkt 858 bp hat.
14 ist ein Aktivitätsprofil der TS2126-RNA-Ligase als eine Funktion des pH-Wertes. Das pH-Optimum der Ligase beträgt etwa 7,5.
15 ist ein Aktivitätsprofil der TS2126-RNA-Ligase als eine Funktion der Temperatur. Die Ligase zeigt im Bereich von 55–70°C eine Aktivität über 90%.
16 ist ein Thermostabilitätsprofil der TS2126-Ligase. Nach einer Inkubation bei verschiedenen Temperaturen für 1 Stunde wurde die Aktivität bestimmt. Das Enzym ist bei 50°C stabil, verliert 25% der Aktivität bei 60°C und wird durch Inkubation bei 70°C inaktiviert.
17 zeigt den Effekt divalenter Kationen auf die Ligationsreaktion. Divalente Kationen sind für die Reaktion wichtig, und Mn²⁺ ergibt eine etwas höhere Aktivität als Mg²⁺.
18 zeigt den Effekt von ATP auf die Aktivität der TS2126-Ligase. Das Enzym zeigt bei 0,1–2,5 mM ATP eine Aktivität von über 90%, wird aber durch hohe ATP-Konzentrationen gehemmt.
19 ist ein Phosphatase-Resistenztest, der die TS2126- und die T4-RNA-Ligase vergleicht. Die TS2126-Ligase weist eine mehr als 10 Mal höhere spezifische Aktivität auf als die T4-Ligase.
20 ist ein Profil des Effektes der Proteinkonzentration auf die Aktivität der TS2126-Ligase. Die Konzentration der Ligase wurde variiert und die Phosphatase-Resistenz ermittelt. Bei einer Proteinkonzentration von 0,1 mg/ml wurde eine Ligation von über 90% erreicht.
21 zeigt Ergebnisse eines Experimentes, bei dem TS2126 in einer RLM-RACE-Anwendung verwendet wurde. (A) Spur 3: T4-RNA-Ligase; Spur 4: T4-RNA-Ligase; Spur 5: cDNA-Kontrolle; Spur 6: PCR-Kontrolle. (B) Spur 9–12: Beta-Aktin-cDNA-Kontrollen.
22 zeigt Ergebnisse einer inversen Beta-Aktin-PCR. Spur 1: Kontrolle; Spur 2: T4-Ligase; Spur 3: T4-Ligase.
23 zeigt Ergebnisse einer intramolekularen Ligation unter Verwendung eines 5'P-d(N₂₂)-Oligonukleotids, wobei die Proteinkonzentration von 0,1–0,3 mg/ml und die Oligonukleotidkonzentration von 0,5–5 μM variiert wurden.
24 zeigt Ergebnisse eines Vergleichsexperimentes, bei dem T4-Ligase für die intramolekulare Ligation desselben 5'P-d(N₂₂)-Oligonukleotids wie in 23 bei einer Proteinkonzentration von 0,28 mg/ml in 0,02 mM ATP, 1 mM Hexamincobaltchlorid und 10, 20 und 30% PEG6000 bei 17°C und 22°C verwendet wurde.
25 zeigt Ergebnisse einer internen PCR-Reaktion von Ligationsprodukten der IGFA-Synthese, die wie in Beispiel 9 durchgeführt wurde. Die PCR wurde unter Verwendung der Primer Fwd2 und Rev und die Ligationsreaktionen unter Verwendung der Oligonukleotide I3 und I2 unter Verwendung von 1 μg TS2126-RNA-Ligase und 3 μg RM378-Ligase durchgeführt. Spur 1: Marker; Spur 2: TS2126-Ligase; Spur 3: RM378-Ligase; Spur 4: Negativkontrolle; Spur 5: Marker.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Es folgt eine Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung.
Diese Erfindung betrifft Verfahren zur Verwendung thermostabiler RNA-Ligasen, insbesondere Ligasen, die von Bakteriophagen stammen, die thermophile Bakterien infizieren. In bestimmten Aspekten werden RNA-Ligasen bei Verfahren des Manipulierens von Nukleinsäuren verwendet, die von Bakteriophagen stammen, welche die Bakterien Rhodothermus marinus (RM378-RNA-Ligase) und Thermus scotoductus (TS2126-RNA-Ligase) infizieren.
Diese Enzyme sind funktionell analog zu der häufig verwendeten T4-RNA-Ligase, bieten aber mehrere vorteilhafte Eigenschaften gegenüber herkömmlichen mesophilen Enzymen. Zu diesen zählen unter Anderem:

• Unterschiedliche Substratspezifität, insbesondere erhöhte Aktivität gegenüber DNA;
• Prävention unerwünschter Sekundärstrukturen infolge der Fähigkeit der Enzyme, bei hohen Temperaturen zu arbeiten;
• Zuverlässigere Anwendungen aufgrund weniger Komplikationen in Bezug auf die Aktivität konkurrierender Enzyme, unerwünschter Substratstruktur, etc.

Interessanterweise haben diese Ligasen eine Sequenzidentität von 30% untereinander und mit der T4-RNA-Ligase. Die verschiedenen hierin beschriebenen Anwendungen veranschaulichen die breite Anwendbarkeit thermostabiler RNA-Ligasen, welche von den vorteilhaften Eigenschaften dieser Enzyme profitieren.
Die Veröffentlichung betrifft deshalb Verfahren und Prozesse, in denen thermostabile RNA-Ligasen verwendet werden, insbesondere die RM378-RNA-Ligase und die TS2126-RNA-Ligase und andere im Wesentlichen ähnliche Enzyme, für die Ligation von Nukleinsäuren, wie beispielsweise Ribonukleinsäuren, Desoxyribonukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga. Die vorliegende Veröffentlichung betrifft spezifische Prozesse, einschließlich die Synthese von Oligonukleotiden, Gensynthese, Gen-Shuffling, Amplifikation von RNA, einschließlich der Amplifikation von Volllängen-mRNA durch cDNA-Synthese, die Markierung von Nukleinsäuren, Sequenzierung, Analyse von Einzel-Nukleotidpolymorphismen, Genamplifikation, Mutationsanalyse und Verarbeitung von Feststellungsmolekülen und andere. Insbesondere umfassen die Verfahren und Prozesse die Katalyse einer chemischen Reaktion durch thermostabile RNA-Ligasen bei hohen Temperaturen, wie beispielsweise über 40°C, beispielsweise bei Temperaturen von etwa 50°C bis etwa 75°C, noch bevorzugter bei Temperaturen von etwa 55°C bis etwa 70°C.
Die Veröffentlichung betrifft Prozesse, bei denen eine thermostabile RNA-Ligase wie beispielsweise die RM378-RNA-Ligase und die TS2126-RNA-Ligase zur Katalysierung der ATP-abhängigen Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen einer 3'-Hydroxylnukleinsäure und einem 5'-Phosphatnukleinsäuredonor verwendet werden. Diese Prozesse umfassen die Ligation von zwei Oligonukleotiden sowie die Zirkularisierung eines einzelnen Oligonukleotids.
Ein zugrunde liegendes Konzept ist die Verwendung thermostabiler RNA-Ligasen. Ein gemeinsames Thema stellt der Ligationsschritt dar, bei dem eine erfindungsgemäße thermostabile RNA-Ligase verwendet wird.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Nukleobase" auf eine stickstoffhaltige heterozyklische Einheit, z. B. ein Purin, ein 7-Deazapurin oder ein Pyrimidin. Typische Nukleobasen sind Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymin, 7-Deazaadenin, 7-Deazaguanin und dergleichen.
„Nukleosid", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Verbindung, die aus einer Nukleobase in Verknüpfung mit dem C-1'-Kohlenstoff eines Ribosezuckers besteht.
„Nukleotid", wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen Phosphatester eines Nukleosids als Monomereinheit oder innerhalb einer Nukleinsäure. Nukleotide werden bisweilen als „NTP” oder „dNTP" und „ddNTP" bezeichnet, um die strukturellen Merkmale des Ribosezuckers besonders hervorzuheben.
„Nukleotid-5'-triphosphat" bezieht sich auf ein Nukleotid mit einer Triphosphatestergruppe an der 5'-Position. Die Triphosphatestergruppe kann Schwefelsubstitutionen für die verschiedenen Sauerstoffe aufweisen, z. B. Alphathionukleotid-5'-triphosphate.
Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff „Nukleinsäure" die Begriffe „Oligonukleotid" und „Polynukleotid" und bedeutet einzelsträngige und doppelsträngige Polymere von Nukleotidmonomeren, einschließlich 2'-Desoxyribonukleotide (DNA) und Ribonukleotide (RNA). Die Nukleinsäure kann gänzlich aus Desoxyribonukleotiden, gänzlich aus Ribonukleotiden oder chimären Mischungen davon zusammengesetzt sein, verknüpft durch Internukleotidphosphodiesterbindungen, und assoziierten Gegenionen, z. B. H⁺, NH4⁺, Trialkylammonium, Mg²⁺, Na⁺ und dergleichen. Nukleinsäuren haben typischerweise eine Größe im Bereich von einigen monomeren Einheiten, z. B. 5–40, wenn sie üblicherweise als Oligonukleotid bezeichnet werden, bis hin zu mehreren Tausend monomeren Einheiten. Sofern nicht anders bezeichnet, versteht sich, dass immer dann, wenn eine Oligonukleotidsequenz wiedergegeben ist, die Nukleotide von links nach rechts in einer Reihenfolge von 5' nach 3' angegeben sind und dass „A" Desoxyadenosin, „C" Desoxycytosin, „G" Desoxyguanosin und „T" Desoxythymidin bezeichnet, sofern nicht anders angegeben.
Ein „Nukleotidanalog", wie hierin verwendet, kann ein modifiziertes Desoxyribonukleosid, ein modifiziertes Ribonukleosid, eine basenmodifizierte, zuckermodifizierte, eine phosphatmodifizierte Phosphatgruppe, eine Phosphorothioatgruppe, eine Phosphonatgruppe, eine Methylphosphonatgruppe, eine Phosphoramidatgruppe, eine Formylacetylgruppe, eine Phosphorodithioatgruppe, eine Boranphosphatgruppe oder eine Phosphotriestergruppe sein.
Der Begriff „Primer" bezieht sich normalerweise auf ein Oligonukleotid, das beispielsweise bei der Amplifikation von Nukleinsäuren wie beispielsweise der PCR verwendet wird. Der Primer kann aus unmodifizierten und/oder modifizierten Nukleotiden zusammengesetzt sein, beispielsweise modifiziert durch eine am 5'-Ende des Primers an das Nukleotid angebrachte Biotingruppe.
„Marker", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine beliebige Einheit, die kovalent an einem Nukleotid befestigt ist und feststellbar ist oder dem Ligationsverlängerungsprodukt eine erwünschte Funktionalität oder Eigenschaft verleiht.
„Ligation" ist die enzymatische Verbindung durch Ausbildung einer Phosphodiesterbindung zwischen Nukleinsäuren.
„Peptidnukleinsäure" (PNA) bezieht sich auf synthetische Oligomere, die ein beliebiges Gerüst von azyklischen, achiralen und neutralen Polyamidverknüpfungen enthalten, an dem Nukleobasen befestigt sind.
„Thermostabil" oder „thermophil" ist hierin definiert als mit der Fähigkeit versehen, Temperaturen über 50°C für eine Zeitdauer in Minuten Stand zu halten, ohne irreversibel denaturiert zu werden, und die Fähigkeit zur Katalyse einer chemischen Reaktion wie beispielsweise die Ausbildung einer Phosphodiesterbindung bei bevorzugten Temperaturen über 50°C, wie beispielsweise zwischen 50°C und 100°C, bei bevorzugten Temperaturen von etwa 50°C bis etwa 75°C und bei noch mehr bevorzugten Temperaturen von etwa 55°C bis etwa 70°C aufrechtzuerhalten.
„Thermophile Bakterien", auch als „Thermophile" bezeichnet, sind als Bakterien mit einem Wachstumstemperaturoptimum von über 50°C definiert. „Thermophile Bakteriophagen" oder „thermostabile Bakteriophagen" sind als Bakteriophagen definiert, deren Wirte thermophile Bakterien sind.
„Thermophile Mikroorganismen"" sind hierin als thermophile Mikroorganismen definiert, die aus der Gruppe ausgewählt sind, welche aus Archaea, Bakterien und Bakteriophagen besteht.
Verfahren des Produzierens von Replikatkopien desselben Polynukleotids, wie beispielsweise PCR oder Genklonierung, werden hierin kollektiv als „Amplifikation" oder „Replikation" bezeichnet. Beispielsweise kann einzel- oder doppelsträngige DNA repliziert werden, um eine andere DNA mit derselben Sequenz zu bilden. RNA kann beispielsweise durch eine RNA-spezifische RNA-Polymerase oder durch reverse Transkription der RNA und anschließende PCR repliziert werden. Im letzteren Fall handelt es sich bei der amplifizierten Kopie der RNA um eine DNA mit der entsprechenden bzw. homologen Sequenz.
Die Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain Reaktion, „PCR") ist eine Reaktion, bei der aus einem Zielpolynukleotid unter Verwendung von mindestens einem Primer und einem Katalysator der Polymerisierung, beispielsweise einer DNA-Polymerase und insbesondere einem thermisch stabilen Polymeraseenzym, Replikatkopien hergestellt werden. Eine PCR umfasst allgemein das wiederholte Durchführen eines „Zyklus" aus drei Schritten: „Schmelzen (Melting)", bei dem die Temperatur derart angepasst wird, dass die DNA in Einzelstränge dissoziiert; „Anheften (Annealing)", bei dem die Temperatur derart angepasst wird, dass Oligonukleotidprimer ihre komplementäre Rasensequenz anhand von Basenpaarerkennung finden können, um an einem Ende des zu amplifizierenden Bereichs des Polynukleotids einen Doppelstrang zu bilden; und „Verlängerung (Extension)" bzw. „Synthese", die bei derselben Temperatur wie das Anheften stattfinden kann oder bei der die Temperatur derart auf eine etwas höhere und näher beim Optimum gelegene Temperatur angepasst wird, dass Oligonukleotide, die einen Doppelstrang gebildet haben, durch eine DNA-Polymerase verlängert werden. Der Zyklus wird anschließend wiederholt, bis die gewünschte Menge an amplifiziertem Polynukleotid erhalten ist. Verfahren zur PCR-Amplifikation sind in US-Patent Nr. 4,683,195 und 4,683,202 zu finden.
Wenn auf ein bestimmtes Protein wie beispielsweise eine RNA-Ligase Bezug genommen wird, bezieht sich der Begriff „isoliert” auf die Präparation des Proteins, die im Wesentlichen frei von Verunreinigungen ist.
„Reverse Transkription" oder „revers transkribieren" bezieht sich auf den Vorgang, durch den RNA durch die Einwirkung einer Nukleinsäurepolymerase wie beispielsweise die reverse Transkriptase in cDNA umgewandelt wird. Verfahren für die reverse Transkription sind aus dem Stand der Technik hinreichend bekannt und beispielsweise in Ausubel, F. M., et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons (1995); und Innis, M. A. et al., PCR Protocols, Academic Press (1990) beschrieben.
Die hierin beschriebenen Verfahren, welche die molekulare Manipulation von Nukleinsäuren umfassen, sind einem Fachmann bekannt. Siehe allgemein Ausubel, F. M. et al., „Short Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons (1995); und Sambrook, J., et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Die T4-RNA-Ligase wurde für viele verschiedene Anwendungen eingesetzt, welche die Manipulation von Nukleinsäuren beinhalten.
Nach der Entdeckung und frühen Charakterisierung der T4-RNA-Ligase wurde erkannt, dass dieses Enzym für die Synthese von Oligonukleotiden, einschließlich Oligonukleotiden mit einer definierten Sequenz, selbst für vollständige Gene von DNA oder ihrer RNA-Äquivalente, verwendet werden könnte (Gumport and Uhlenbeck, in „Gene Amplification and Analysis,", Vol. II : Analysis of Nucleic Acid Structure by Enzymatic Methods, Chirikjian and Papas, Hrsg. Elsevier North Holland, Inc.; McCoy and Gumport, Biochemistry, 19: 635–642 (1980); Sugino, et al., J. Biol. Chem., 252: 1732–1738 (1980)).
Die T4-RNA-Ligase wurde für die Synthese zirkulärer Hammerhead-Ribozyme (Wang, L. and D. E. Ruffner, Nucleic Acids Res., 26: 2502–2504 (1998)), die Synthese von Dinukleosidpolyphosphaten (Atencia, E. R., et al., Eur. J. Biochem., 261: 802–811 (1999)) und für die Produktion zusammengesetzter Primer (Kaluz, S., et al., BioTechniques, 19: 182–186 (1995)) verwendet.
Die besonderen Limitationen der T4-RNA-Ligase können die praktische Verwendung entworfener Anwendungen behindern und die Entwicklung neuer Anwendungen verhindern. Ein Enzym mit ähnlicher Aktivität, aber wesentlich anderen Eigenschaften, wie beispielsweise einer hohen Arbeitstemperatur und gleichwertigerer Aktivität gegenüber DNA- und RNA-Substraten, kann bestimmte Anwendungen praktikabler machen und die Möglichkeiten für die Entwicklung neuer Verfahren und Anwendungen erhöhen.
Eine thermostabile RNA-Ligase kann für Verbesserungen verschiedener Verfahren verwendet werden, bei denen zuvor die T4-RNA-Ligase eingesetzt wurde, wie beispielsweise oben beschriebener Verfahren. Beispielsweise beinhalten die Amplifikation von mRNA und die Synthese von cDNA häufig die Verwendung eines komplexen RNA-Gemisches, das RNA-Moleküle mit verschiedenen stabilen Sekundärstrukturen enthält und die Tätigkeit der T4-RNA-Ligase hemmt. Der negative Einfluss einer Sekundärstruktur wurde anhand gut definierter Substrate, sowohl RNA als auch DNA, gezeigt. Häufig wird den Verfahren ein zusätzlicher Erwärmungsschritt vor der Ligation hinzugefügt, um unerwünschte Sekundärstrukturen zu reduzieren. Auch die begrenzte Effizienz der T4-RNA-Ligase bei Verwendung natürlicher RNA-Substrate ist aufgezeigt worden (Gumport and Uhlenbeck, in „Gene Amplification and Analysis", Vol. II: Analysis of Nucleic Acid Structure by Enzymatic Methods, Chirikjian and Papas, Hrsg. Elsevier North Holland, Inc. (1980); Bruce and Uhlenbeck, Nucleic Acids Res., 5: 3665–3677 (1978); McCoy and Gumport, Biochemistry, 19: 635–642 (1980)). Einige Protokolle für die mRNA-Amplifikation, die beispielsweise von Herstellern handelsüblicher Kits zur schnellen Amplifikation von cDNA-Enden (Rapid Amplifikation of cDNA Ends, RACE) empfohlen werden, umfassen einen Vorerwärmungsschritt und anschließendes Abkühlen vor der Ligation, um Sekundärstrukturen des RNA-Substrates zu verringern. Die Möglichkeit, Ligationsreaktionen bei höheren Temperaturen durchzuführen, indem eine thermostabile RNA-Ligase verwendet wird, begrenzt die Bildung von Sekundärstrukturen und verbessert daher die Amplifikation der RNA, indem der Anteil an RNA-Molekülen, die für die Ligation durch das Enzym zur Verfügung stehen, erhöht wird. Entsprechend könnten andere Anwendungen, welche die Ligation von Nukleinsäuren umfassen, von einer verminderten Bildung von Sekundärstrukturen bei höheren Temperaturen profitieren. Die T4-RNA-Ligase stammt aus dem Bakteriophagen T4, der einen mesophilen Wirt (E. coli) hat und nicht thermostabil ist. Die vorliegende Veröffentlichung zeigt die Thermostabilität von RNA-Ligasen analog zu der T4-RNA-Ligase. Die Entdeckung thermostabiler Homologe der T4-RNA-Ligase, die von dem thermophilen Bakteriophagen RM378 abstammen, der einen thermophilen Bakterienwirt, Rhodothermus marinus, hat, stellt die erste bekannte thermostabile RNA-Ligase dar, die mit der T4-RNA-Ligase vergleichbar ist. Es sind weitere Belege für verschiedene andere Eigenschaften dieses Enzyms im Vergleich zu der T4-RNA-Ligase beschrieben, in denen wichtige Ähnlichkeiten und Unterschiede in Bezug auf die Eigenschaften dieser homologen Enzyme aufgezeigt werden. Es wurde noch ein zweites thermostabiles RNA-Ligaseenzym aus einem anderen Bakteriophagen, TS2126 charakterisiert, der den Bakterienwirt Thermus scotoductus infiziert. Es ist darauf hinzuweisen, dass Thermus scotoductus genauso wie Rhodothermus marinus thermophil ist, aber die beiden Bakterienarten nicht eng verwandt sind. Basierend auf einer Datenbankrecherche der Sequenzähnlichkeit wurde vorhergesagt, dass das isolierte Enzym, das aus dem Bakteriophagen TS2126 stammt, mit der T4-RNA-Ligase verwandt ist, aber die Sequenzähnlichkeit ist gering. TS2126 weist eine Nukleinsäureligaseaktivität auf, die ähnlich ist wie bei der T4-RNA-Ligase und der RM378-RNA-Ligase. Es wird außerdem gezeigt, dass die TS2126-RNA-Ligase bei hohen Temperaturen aktiv ist.
Die RM378-RNA-Ligase, die TS2126-RNA-Ligase und die T4-RNA-Ligase gehören zu einer Familie von RNA-Ligasen mit sehr wenigen bekannten Mitgliedern, die alle viraler Herkunft sind. Die Entdeckung thermostabiler RNA-Ligasen und die Charakterisierung ihrer Aktivitäten sind ein wesentlicher Beitrag zu dem Wissen über eine kleine Gruppe von Enzymen mit vielseitiger und nützlicher Aktivität für die Manipulation von Nukleinsäuren und zu deren Verwendung. Die verschiedenen Verwendungsmöglichkeiten der T4-RNA-Ligase, die bereits aus den vielen Anwendungen hervorgehen, in denen dieses Enzym derzeit eingesetzt wird, weisen auf die Eignung anderer Enzyme mit ähnlicher Aktivität hin. Die vorliegende Veröffentlichung liefert eine Charakterisierung von RNA-Ligasen mit einer Aktivität, die allgemein mit der der RNA-Ligase des Bakteriophagen T4 vergleichbar ist, aber deutlich andere Eigenschaften aufweist, was die Verwendung der RM378-RNA-Ligase für verschiedene Anwendungen vorteilhaft macht.
„RM378-RNA-Ligase" bezieht sich auf ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr: 2. Die RM378-RNA-Ligase stammt aus dem Bakteriophagen RM378, dessen Wirt das thermophile Bakterium Rhodothermus marinus ist.
„TS2126-RNA-Ligase" bezieht sich auf ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr: 4. Die TS2126-RNA-Ligase stammt aus dem Bakteriophagen TS2126, dessen Wirt das thermophile Bakterium Thermus scotoductus ist.
Der Begriff „RNA-Ligase" wird hierin nach dem konventionellen Namen des homologen Enzyms aus dem Bakteriophagen T4 verwendet, das als „RNA-Ligase" bezeichnet wird (Gumport and Uhlenbeck, in „Gene Amplification and Analysis", Vol. II: Analysis of Nucleic Acid Structure by Enzymatic Methods, Chirikjian and Papas, Hrsg. Elsevier North Holland, Inc. (1980)). Alternativ kann das Enzym durch Begriffe wie „Nukleinsäureligase" oder „Oligonukleotidligase" beschrieben werden.
Die Begriffe „RM378-RNA-Ligase, TS2126-RNA-Ligase bzw. alle im Wesentlichen ähnliche Enzyme" und „thermostabile RNA-Ligasen der vorliegenden Erfindung bzw. alle im Wesentlichen ähnliche Enzyme" beziehen sich auf jedes Polypeptid, das zu der Gruppe gehört, welche besteht aus:

a) einer RNA-Ligase, die aus einem Bakteriophagen erhalten wird, der ein thermophiles Bakterium infiziert, d. h. einem Bakteriophagen mit einem thermophilen bakteriellen Wirt;
b) einem Polypeptid, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr: 2 oder SEQ ID Nr: 4 aufweist;
c) einem Polypeptid, das von einer Nukleinsäure kodiert wird, welche die Sequenz von SEQ ID Nr: 1 oder SEQ ID Nr: 3 aufweist;
d) einem Polypeptid, das mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr: 2 oder SEQ ID Nr: 4 eine Sequenzidentität von mindestens 30% aufweist; oder
e) ein Fragment oder Derivat von (a), (b), (c) oder (d).

Die thermostabilen RNA-Ligasen der vorliegenden Erfindung bzw. alle im Wesentlichen ähnliche Enzyme können partiell oder im Wesentlichen gereinigt (z. B. bis zur Homogenität gereinigt) sein und/oder sind im Wesentlichen frei von anderen Polypeptiden. Entsprechend kann es sich bei der Aminosäuresequenz des Polypeptids um die des natürlich vorkommenden Polypeptids handeln oder um eine, die Änderungen aufweist. Polypeptide, die Änderungen aufweisen, werden hierin als „Derivate" des nativen Polypeptids bezeichnet. Solche Änderungen umfassen konservative oder nicht konservative Aminosäuresubstitutionen, Additionen und Deletionen mindestens einer Aminosäure; jedoch sollten solche Änderungen mindestens eine Aktivität des Polypeptids bewahren, d. h. das veränderte bzw. mutante Polypeptid sollte ein aktives Derivat des natürlich vorkommenden Polypeptids sein. Beispielsweise können die Mutationen vorzugsweise die dreidimensionale Konfiguration der Bindungsstelle des nativen Polypeptids bewahren oder können vorzugsweise die Aktivität des Polypeptids bewahren (z. B. alle Mutationen, welche vorzugsweise die Fähigkeit des Enzyms zur Katalysierung der Ligation von Nukleinsäuren). Das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von Aktivität bzw. Aktivitäten des Polypeptid kann durch verschiedene Standardfunktionstests bestimmt werden, einschließlich unter Anderem mit Tests auf Bindungsaktivität oder enzymatische Aktivität.
Darüber hinaus zielt der Begriff RNA-Ligasen auf alle aktiven Fragmente der thermostabilen RNA-Ligasen der vorliegenden Erfindung bzw. alle im Wesentlichen ähnlichen Enzyme, sowie auf Fragmente der oben beschriebenen aktiven Derivate ab. Ein „aktives Fragment", wie hierin bezeichnet, ist ein Teil eines Polypeptids (bzw. ein Teil eines aktiven Derivates), das die Aktivität des Polypeptids bewahrt, wie oben beschrieben.
Geeignete Aminosäureänderungen können auf Basis mehrerer Kriterien erfolgen, einschließlich Hydrophobie, Basen- oder Säurecharakter, Ladung, Polarität, Größe, dem Vorhandensein bzw. Nichtvorhandensein einer funktionellen Gruppe (z. B. -SH oder einer Glykosylierungsstelle) und dem aromatischen Charakter. Die Zuordnung verschiedener Aminosäuren zu ähnlichen Gruppen auf Basis der obigen Eigenschaften ist für einen Fachmann sofort ersichtlich; weitere geeignete Aminosäureänderungen sind zu finden in Bowie, et al., Science, 247: 1306–1310 (1990). Konservative Aminosäuresubstitutionen können beispielsweise solche sein, die innerhalb einer Familie von Aminosäuren stattfinden, die in Bezug auf ihre Seitenketten verwandt sind. Genetisch kodierte Aminosäuren werden allgemein in vier Familien unterteilt: (1) sauer = Asparaginsäure, Glutaminsäure; (2) basisch = Lysin, Arginin, Histidin; (3) unpolar = Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptopha; und (4) ungeladen polar = Glycin, Asparagin, Glutamin, Cystin, Serin, Threonin, Tyrosin. Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin werden bisweilen gemeinsam als aromatische Aminosäuren klassifiziert. Es ist beispielsweise angemessenerweise davon auszugehen, dass eine isolierte Substitution eines Leucins durch ein Isoleucin oder Valin, eines Aspartats durch ein Glutamat, eines Threonins durch ein Serin oder eine ähnliche konservative Substitution einer Aminosäure durch eine strukturell verwandte Aminosäure keinen größeren Effekt auf die Aktivität bzw. Funktionalität haben wird.
Die thermostabilen RNA-Ligasen der vorliegenden Veröffentlichung bzw. alle im Wesentlichen ähnliche Enzyme können auch Fusionspolypeptidesein, die das gesamte oder einen Teil (z. B. ein aktives Fragment) eines nativen Polypeptids in Fusion mit einer zusätzlichen Komponente, gegebenenfalls mit Linkersequenzen, aufweisen. Zusätzliche Komponenten, wie beispielsweise Radioisotope und antigene Marker, lassen sich auswählen, um die Isolierung oder Reinigung des Polypeptids zu unterstützen oder die Halbwertszeit des Polypeptids zu verlängern; beispielsweise würde ein Hexahistidinmarker die unmittelbare Reinigung durch Nickelchromatographie gestatten. Das Fusionsprotein kann z. B. eine Glutathion-S-Transferase (GST)-, Thioredoxin(TRX)- oder Maltosebindungsprotein(MBP)-Komponente aufweisen, um die Reinigung zu vereinfachen; Kits für die Expression und Reinigung solcher Fusionsproteine sind im Handel erhältlich
Die thermostabilen RNA-Ligasen umfassen außerdem Polypeptide, die zu mindestens 30% mit der RM378-RNA-Ligase oder der TS2126-RNA-Ligase identisch sind (d. h. Polypeptide mit wesentlicher Sequenzidentität). Aber auch Polypeptide, die ein geringeres Maß an Identität aufweisen, sind geeignet, insbesondere, wenn sie über mindestens eine bestimmte Domäne des Polypeptids hinweg höhere Identität aufweisen. Beispielsweise sind hierin Polypeptide eingeschlossen, die über Domänen hinweg, die für eine bestimmte Aktivität wie beispielsweise eine RNA-Ligase-Aktivität erforderlich sind, ein hohes Maß an Identität aufweisen. Deshalb umfasst diese Veröffentlichung Polypeptide, die eine Identität von mindestens etwa 10%, vorzugsweise von mindestens etwa 20%, mehr bevorzugt von mindestens etwa 30%, mehr bevorzugt von mindestens etwa 40%, noch mehr bevorzugt von mindestens etwa 50%, noch mehr bevorzugt von mindestens etwa 70%, noch mehr bevorzugt von mindestens etwa 80% und noch mehr bevorzugt von mindestens etwa 90% aufweisen.
Die thermostabilen RNA-Ligasen der vorliegenden Veröffentlichung bzw. alle im Wesentlichen ähnliche Enzyme können aus natürlich vorkommenden Quellen isoliert werden (z. B. können sie aus Wirtszellen isoliert werden, die mit dem Bakteriophagen RM378, dem Bakteriophagen TS2126 oder einem anderen, ein thermophiles Bakterium infizierenden Bakteriophagen infiziert sind). Alternativ können die Polypeptide chemisch synthetisiert oder rekombinant produziert werden. Beispielsweise können PCR-Primer entworfen werden, um die ORFs vom Startcodon bis zum Stoppcodon zu amplifizieren, indem DNA von RM378 oder TS2126 oder verwandten Bakteriophagen oder entsprechende rekombinante Klone als Vorlage verwendet werden. Die Primer können geeignete Restriktionsschnittstellen für ein effizientes Klonieren in einen geeigneten Expressionsvektor enthalten. Das PCR-Produkt kann mit dem jeweiligen Restriktionsenzym verdaut und zwischen die entsprechenden Restriktionsschnittstellen (in dieselben Restriktionsschnittstellen bzw. in Restriktionsschnittstellen, welche die gleichen kohäsiven Enden hervorbringen, oder in Restriktionsschnittstellen mit stumpfen Enden) in den Vektor ligiert werden.
Die thermostabilen RNA-Ligasen der vorliegenden Veröffentlichung bzw. alle im Wesentlichen ähnliche Enzyme können anhand verschiedener Verfahren aus einer Zellkultur (z. B. aus einer Kultur von Wirtszellen, die mit dem Bakteriophagen RM378 oder dem Bakteriophagen TS2126 infiziert sind) isoliert oder gereinigt (z. B. bis zur Homogenität) werden. Zu diesen gehören unter Anderem Anionen- bzw. Kationenaustauschchromatographie, Ethanolausfällung, Affinitätschromatographie und Hochleistungsflüssigchromatographie (High Performance Liquid Chromatography, HPLC). Das Protein kann durch konventionelle Mittel der Proteinbiochemie und Reinigung isoliert werden, um ein im Wesentlichen reines Produkt zu erhalten, d. h. zu 80, 95 oder 99% frei von Verunreinigungen durch Zellkomponenten, wie beschrieben in Jacoby, Methods in Enzymology, Volume 104, Academic Press, New York (1984); Scopes, Protein Purification, Principles and Practice, 2. Auflage, Springer-Verlag, New York (1987); und Deutscher (Hrsg.), Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology, Vol. 182 (1990).
Die Veröffentlichung betrifft Prozesse, bei denen eine thermostabile RNA-Ligase verwendet wird, wie beispielsweise die RM378-RNA-Ligase, die TS2126-Ligase bzw. alle im Wesentlichen ähnlichen Enzyme, um die ATP-abhängige Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen einem 3'-Hydroxyl-Nukleinsäureakzeptor und einem 5'-Phosphat-Nukleinsäuredonor zu katalysieren. Dies beinhaltet die Ligation zweier Oligonukleotide sowie die Zirkularisierung eines einzelnen Oligonukleotids. Die Erfindung betrifft daher Prozesse, welche die Ligation von Nukleinsäuren bei relativ hohen Temperaturen umfassen. Beispielsweise zeigen die Beispiele die Fähigkeit der RM378-RNA-Ligase zur Katalyse der Ausbildung einer Bindung zwischen dem 3'-Hydroxylende einer Nukleinsäure und einer 5'-Phosphatnukleinsäure durch Zirkularisierung eines einzelnen Nukleinsäuresubstrats. Darüber hinaus ist gezeigt, dass die RM378-RNA-Ligase der vorliegenden Veröffentlichung zwei separate Oligonukleotide ligieren kann, was ihre Fähigkeit zur Ligation zweier Oligonukleotide sowie zur Zirkularisierung eines einzelnen Oligonukleotids zeigt. Es wird auch gezeigt, dass die RM378-RNA-Ligase der vorliegenden Veröffentlichung in der Lage ist, eine Reaktion dieses Typs unter Verwendung von sowohl RNA- als auch DNA-Substraten zu katalysieren.
Die vorliegende Veröffentlichung zeigt, dass die RM378-RNA-Ligase der Veröffentlichung wie die T4-RNA-Ligase keine komplementären Vorlagenstränge benötigt, um Donorphosphate zu Akzeptorhydroxylen auszurichten. Das Enzym kann einzelsträngige Nukleinsäuren als Substrate verwenden, eine Aktivität, die für verschiedene Einsatzgebiete des Enzyms fundamental ist. Bedeutenderweise zeigt die Veröffentlichung, dass die RM378-RNA-Ligase in der Lage ist, diese Reaktionen bei erhöhten Temperaturen zu katalysieren, wie beispielsweise bei etwa 40°C bis etwa 80°C. Die Veröffentlichung zeigt daher erstmals die Fähigkeit eines Enzyms, die Katalyse dieser Reaktionsarten bei hohen Temperaturen optimal auszuführen.
Die Veröffentlichung betrifft außerdem Prozesse, bei denen thermostabile RNA-Ligasen wie beispielsweise die RM378-RNA-Ligase oder die TS2126-RNA-Ligase verwendet werden, um die ATP-unabhängige Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen einem 3'-Hydroxylnukleinsäureakzeptor und einem 5'-Phosphatnukleinsäuredonor zu katalysieren. Dies kann erreicht werden, indem ein ADP-Derivat (Ado-5'ppX) als Donor bei einer enzymatisch katalysierten Verknüpfung der Extraeinheit (p-X) an einen Nukleinsäuresubstratakzeptor unter Eliminierung von AMP verwendet wird.
Die Erfindung betrifft des Weiteren Prozesse, in denen die thermostabilen RNA-Ligasen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um die Ligierung von Nukleinsäuren zu katalysieren, wobei die Nukleinsäure aus Ribonukleotiden (RNA), Desoxyribonukleotiden (DNA) oder Nukleotidanaloga bestehen kann. Die Nukleinsäuren oder Nukleinsäureanaloga können Oligonukleotide oder Polynukleotide oder einzelne Nukleotide sein, wie beispielsweise ein Nukleosid-3',5'-biphosphat (pNp). Die Nukleinsäuren können synthetisch oder natürlich sein. Die natürlichen Nukleinsäuren können aus biologischen Proben stammen und können ungereinigt sein oder sie können im Wesentlichen gereinigt sein. Die Nukleinsäuren können des Weiteren durch vorherige Amplifikation natürlicher Nukleinsäuren hergestellt werden. Die Nukleotidanaloga können Analoge sein, wie beispielsweise Didesoxyribonukleotide oder jedes basenmodifizierte, zuckermodifizierte oder phosphatgruppenmodifizierte Nukleotid. Die Nukleinsäuren können aus natürlichen Nukleinsäuren oder synthetischen Nukleinsäuren bestehen und können Chimären natürlicher Nukleinsäuren wie beispielsweise RNA-DNA-Chimären enthalten. Auch die Substrate für die Ligase können Chimären aus Nukleinsäuren und Nicht-Nukleinsäuren enthalten, wie beispielsweise Chimären von PNA und DNA, d. h. PNA-DNA ( US-Patent Nr. 6,297,016 ).
Beispiel 6 zeigt, dass die RM378-RNA-Ligase ein Nukleotidanalog wie ein Substrat verwenden kann. In dem Beispiel verwendet die RM378-RNA-Ligase 3'NH₂-3'dATP anstelle von ATP für die Adenylierung einer Nukleinsäure.
Die Veröffentlichung umfasst Prozesse, welche die Ligierung von Nukleinsäuren bei Temperaturen von mindestens etwa 40°C, wie beispielsweise mindestens 50°C, wie beispielsweise mindestens 55°C, wie beispielsweise mindestens 55°C, wie beispielsweise mindestens 60°C, wie beispielsweise mindestens 65°C, wie beispielsweise mindestens 70°C, beinhalten. Besonders bevorzugte Aspekte umfassen Prozesse, welche Ligationen bei Temperaturen im Bereich von etwa 50°C bis etwa 75°C beinhalten, wie beispielsweise bei etwa 55°C bis etwa 70°C. Die erhöhten Temperaturen können die Bildung von Sekundärstrukturen beschränken, welche die Anwendung der herkömmlichen T4-RNA-Ligase, von der gezeigt wurde, dass sie bei Substraten, die Sekundärstrukturen enthalten, wie beispielsweise die Hefe-tRNA^Phe, weniger effektiv sind, einschränken (Gumport and Uhlenbeck, in „Gene Amplification and Analysis", Vol. II: Analysis of Nucleic Acid Structure by Enzymatic Methods (1980); Chirikjian and Papas, Hrsg. Elsevier North Holland, Inc; Bruce & Uhlenbeck, Nucleic Acids Res., 5: 3665–3677 (1978); McCoy and Gumport, Biochemistry, 19: 635–642 (1980)). Protokolle für die Amplifikation von mRNA umfassen einen Erwärmungsschritt vor der Ligation mit der T4-RNA-Ligase, um Sekundärstrukturen des Nukleinsäuresubstrates einzuschränken. Darüber hinaus wurde die Eignung einer thermostabilen RNA-Ligase für die Synthese von Oligonukleotiden vorgeschlagen (Hyman, US-Patent Nr. 5,514,569 ). Wie in Beispiel 3 gezeigt, hat die RM378-RNA-Ligase ein deutlich anderes Temperaturprofil als die T4-RNA-Ligase. Die RM378-RNA-Ligase ist bei höheren Temperaturen aktiv als die T4-RNA-Ligase, wie beispielsweise bei etwa 40°C bis etwa 80°C. Das RM378-Enzym weist ein Temperaturoptimum zwischen 60°C und 65°C auf, d. h. bei einer Temperatur, bei der das T4-Enzym praktisch inaktiv ist. Beispiel 13 zeigt, dass das Enzym der vorliegenden Erfindung bei höheren Temperaturen aktiv ist als die T4-RNA-Ligase, wie beispielsweise bei etwa 40°C bis etwa 80°C, wie beispielsweise bei Temperaturen von etwa 50°C bis etwa 75°C und noch mehr bevorzugt bei Temperaturen von etwa 55°C bis etwa 70°C. Die thermostabilen RNA-Ligasen, wie beispielsweise die RM378-RNA-Ligase und die TS2126-RNA-Ligase, können also für die Ligation von Nukleinsäuren bei Temperaturen außerhalb der Arbeitstemperaturen der T4-RNA-Ligase verwendet werden. Erhöhte Temperaturen schränken die Bildung von Sekundärstrukturen zwischen dem Nukleinsäuresubstraten ein, und jeder Prozess, der die Ligation von Nukleinsäuren beinhaltet, die wesentliche Tertiär- oder Sekundärstrukturen enthalten, kann vorzugsweise bei höheren Temperaturen wie beispielsweise über 40°C durchgeführt werden. Natürliche RNA-Substrate, wie beispielsweise ribosomale RNA und mRNA, können beispielsweise eine wesentliche Sekundärstruktur aufweisen, welche die Ligation einschränken kann, wie beispielsweise durch Einschränkung des Zugangs zu 5'-Phosphatgruppen in der Ligationsreaktion.
Die vorliegende Erfindung betrifft Prozesse, welche die Ligation von DNA-Molekülen beinhalten. Es wurde gezeigt, dass die T4-RNA-Ligase bei DNA-Substraten vielweniger aktiv als bei RNA-Substraten ist, und Reaktionen, welche die Ligation von DNA, katalysiert durch die T4-RNA-Ligase, umfassen, haben eine große Menge Enzym und lange Reaktionszeiten verlangt (Gumport and Uhlenbeck, „Gene Amplification and Analysis", Vol. II: Analysis of Nucleic Acid Structure by Enzymatic Methods, Chirikjian and Papas, Hrsg. Elsevier North Holland, Inc (1980); Gumport, et al., Nucleic Acids Symp. Ser., 7: 167–171 (1980)). Wie in Beispiel 5 gezeigt, demonstriert die Veröffentlichung deutlich, dass die RM378-RNA-Ligase bei DNA-Substraten weitaus aktiver ist als die T4-RNA-Ligase, unter anderen Bedingungen, optimiert für das T4-Enzym, ist die Aktivität der beiden Enzyme aber vergleichbarer. Es wird allerdings gezeigt, dass die RM378-RNA-Ligase diese Arten von Reaktionen bei erhöhten Temperaturen katalysieren kann, und die Bestimmung optimaler Bedingungen für das RM378-Enzym, wie es beispielsweise für die T4-RNA-Ligase erfolgt ist, kann zu einem wesentlich Aktivitätsanstiegführen. Im Vergleich zur T4-RNA-Ligase weist die RM378-RNA-Ligase unter den in den Beispielen ausgeführten Bedingungen weitaus ähnlichere Aktivität bei DNA und RNA auf. Aus diesen Ergebnissen geht hervor, dass das RM378-Enzym DNA als Substrat der RNA vorzieht, was im Gegensatz zu der T4-RNA-Ligase steht.
Die Beispiele 12–18 zeigen, dass die TS2126-Ligase unter verschiedenen Bedingungen von Temperatur, Kationenkonzentration, ATP-Konzentration und Proteinkonzentration stabil und aktiv ist. Darüber hinaus zeigt Beispiel 17, dass die TS2126-Ligase bei einem RNA-Substrat weitaus aktiver ist als das T4-Enzym.
Die Veröffentlichung betrifft Prozesse, welche die Ligation von Nukleinsäuren, einschließlich einzelsträngiger DNA und doppelsträngiger DNA, beinhalten, wie beispielsweise Restriktionsfragmente, einschließlich DNA-Restriktionsfragmente mit 5'-gestaffelten (staggered) Enden oder stumpfen Enden.
Die Veröffentlichung betrifft auch Prozesse, bei denen thermostabile RNA-Ligasen wie hierin beschrieben bzw. alle im Wesentlichen ähnlichen Enzyme verwendet werden, um eine Reaktion zwischen einem 3'-Phosphatdonor und einem 5'-Hydroxylakzeptor zu katalysieren. Die Veröffentlichung betrifft ferner Prozesse, welche die vorlagengesteuerte (template-directed) Ligation von Nukleinsäuren beinhalten, wie beispielsweise die vorlagengesteuerte Ligation von DNA.
Die Veröffentlichung betrifft Prozesse, bei denen thermostabile bzw. alle im Wesentlichen ähnlichen Enzyme zur Synthese von Oligonukleotiden verwendet werden. Die synthetischen Oligonukleotide finden breite Anwendung in verschiedenen Gebieten und können beispielsweise bei Anwendungen in der Molekularbiologie verwendet werden, einschließlich der Gentechnik und der PCR, in der Therapeutik, beispielsweise für Antisense-Oligonukleotide, für die Diagnostik, und um Katalysatoren wie beispielsweise Ribozyme herzustellen. Die synthetischen Oligonukleotide können als Primer für die Amplifikation von genetischem Material verwendet werden. Die PCR-Technologie verwendet beispielsweise routinemäßig Oligonukleotide als Primer für die Amplifikation von genetischem Material, und es werden synthetische Gene für verschiedene Zwecke hergestellt, einschließlich für die Optimierung der Codonverwendungfür die effiziente Expression. Geeignete synthetische Oligonukleotide umfassen Polymere, die natürliche Ribonukleotide und Desoxynukleotide enthalten, sowie Polymere, die modifizierte Nukleotide enthalten, wie beispielsweise basenmodifiede, zuckermodifizierte und phosphatgruppenmodifizierte Nukleotide.
Die Erfindung umfasst des Weiteren Prozesse für die Herstellung von Oligonukleotiden bzw. Polynukleotiden, die Gene oder Teile davon darstellen, die aus DNA-Oligonukleotiden oder deren RNA-Analoga bestehen. Die synthetischen Gene können für die Integration in Vektoren bestimmt sein, um ein bestimmtes Genprodukt zu exprimieren. Die synthetischen Gene können Codons aufweisen, die in natürlich vorkommenden Genen nicht verwendet werden, beispielsweise für den Zweck der Optimierung der Codonverwendung für die effiziente Expression in einem bestimmten Wirt. Bei der Synthese von Oligonukleotiden, katalysiert von einer thermostabilen RNA-Ligase, lässt sich die Effizienz der Reaktionen erhöhen, indem der 3'-Terminus von Donormolekülen blockiert oder der 5'-Terminus von Akzeptormolekülen entphosphoryliert wird; dadurch wird die Reaktion veranlasst, Produkte zu liefern, die eine definierte Reihenfolge der Oligonukleotidsequenzen enthalten. Die Verwendung einer thermostabilen Ligase kann gegenüber der Verwendung anderer Ligasen, wie beispielsweise der T4-RNA-Ligase, aufgrund ihrer besonderen Eigenschaften, wie beispielsweise ihre Fähigkeit, bei hohen Temperaturen zu arbeiten, bevorzugt sein. Dies kann die Effizienz der Reaktion erhöhen und die für die Synthese erforderliche Enzymmenge und Zeit begrenzen.
Die Synthese von Oligonukleotiden kann durch wiederholte Zyklen des Kombinierens eines Oligonukleotidprimers und eines blockierten Oligonukleotids unter Verwendung einer thermostabilen RNA-Ligase durchgeführt werden, wie beispielsweise der RM378-RNA-Ligase oder der TS2126 RNA-Ligase.
In einer Reihe von Patenten ( US-Patent Nr. 5,516,664 ; 5,629,177 ; 5,514,569 und 5,602,000 ) beschreibt Hyman die Synthese von Oligonukleotiden durch wiederholte Zyklen des Kombinierens eines Oligonukleotidprimers und eines blockierten Oligonukleotids unter Verwendung einer RNA-Ligase. Das Verfahren umfasst wenige Schritte: i) Kombinieren des Primers und eines Nukleotid mit einem von einer Phosphatgruppe blockierten 3'-Ende, in Gegenwart der RNA-Ligase, wodurch ein verlängerter Primer mit einem blockierten 3'-Ende gebildet wird; ii) enzymatisches Entfernen der blockierenden Phosphatgruppe am 3'-Ende des verlängerten Primers mithilfe einer Phosphatase; und iii) Wiederholen der vorherigen Schritte unter Verwendung des Nukleotidprimers des vorherigen Zyklus (ii) als Primer im ersten Schritt (i) im nächsten Zyklus. Bei Verwendung des Verfahrens nach Hyman fungiert der Primer in jeden Schritt als Akzeptor mit einer freien 3'-OH-Gruppe und das zuzugebende aktivierte adenylierte Nukleotid als Donor mit einer 5'-Phosphatgruppe. Auf diese Weise verläuft das enzymatische Verfahren in der Richtung von 5' zu 3'. Havlina beschreibt jedoch die überraschende Entdeckung der Fähigkeit der RNA-Ligase, einen 3'-Phosphatdonor und einen 5'-Hydroxylakzeptor zu verknüpfen ( US-Patent Nr. 6,329,177 ). Dies gestattet die Synthese von Oligonukleotiden in der Richtung von 3' nach 5' unter Verwendung einer RNA-Ligase, d. h. in im Vergleich zu dem von Hyman beschriebenen obigen Verfahren entgegen gesetzter Richtung. In dem Verfahren nach Havlina kann die RNA-Ligase verwendet werden, um einen Oligonukleotidprimer mit einem Trägermolekül mit einer Schutzgruppe an der 5'-Position bzw. ohne eine Schutzgruppe an der 3'-Position zu verknüpfen.
Das obige Verfahren wurde zuvor unter Verwendung der T4-RNA-Ligase, welche nicht thermostabil ist, und einer Phosphatase, die ebenfalls nicht thermostabil ist, durchgeführt. Wie in US-Patent Nr. 5,516,664 hervorgehoben, könnte das Verfahren von der Verwendung einer thermostabilen RNA-Ligase und vom Thermozyklieren (Thermal Cycling) profitieren, d. h. indem die Ligasereaktion bei hoher Temperatur durchgeführt und dann die Aktivität der Ligase abgeschaltet wird, indem die Temperatur für die anschließende Inkubation mit der Phosphatase verringert wird. Wenn die Temperatur im nächsten Zyklus wieder erhöht wird, wird dann die RNA-Ligase wieder aktiviert.
Unter Verwendung des oben ausgeführten Verfahrens verläuft die Synthese der Oligonukleotid in der Richtung von 5' zu 3', wobei der Primer in jedem Schritt als Akzeptor mit einer freien 3'-OH-Gruppe und das zuzugebende aktivierte adenylierte Nukleotid (adenyliertes 3',5'-Bisphosphat) als Donor mit einer 5'-Phosphatgruppe fungieren. Die Erfindung betrifft auch Prozesse, welche die Synthese von Oligonukleotiden in der Richtung von 3' zu 5' beinhalten, die von der RNA-Ligase katalysiert werden, indem ein 3'-Phosphatdonor und ein 5'-Hydroxylakzeptor verknüpft werden. Die RNA-Ligase kann verwendet werden, um einen Oligonukleotidprimer mit einem Trägermolekül zu ligieren, das eine Schutzgruppe an der 5'-Position bzw. keine Schutzgruppe an der 3'-Position aufweist. Dieses Verfahren zum Herstellen eines Nukleotidpolymers in der Richtung von 3' zu 5' kann im Wesentlichen folgende Schritte umfassen: i) Bereitstellen eines Nukleinsäureprimers und eines Nukleinsäureträgermoleküls; ii) Ligieren des 3'-Endes des Trägermoleküls mit der 5'-Position des Primers durch die RNA-Ligase, wodurch ein Ligationsprodukt erhalten wird; iii) Entschützen des Ligationsproduktes durch Entfernen einer Schutzgruppe von dem Trägermolekül; iv) Übertragen einer natürlichen oder modifizierten Phosphatgruppe auf die 5'-Position des Ligationsproduktes und v) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte (i) bis (iv).
Die erfindungsgemäßen Verfahren betreffen auch die Synthese von Oligonukleotiden in der Richtung von 3' zu 5', katalysiert von der RNA-Ligase, indem ein 5'-Phosphatdonor eines ersten Oligonukleotids und ein 3'-Hydroxylakzeptor eines zweiten Oligonukleotids verknüpft werden. Die Zirkularisierung der einzelnen Oligonukleotide kann blockiert werden, wie beispielsweise durch Anbringung einer chemischen Gruppe wie beispielsweise Biotin an das 3'-Ende des Oligonukleotids oder indem sowohl das 5'-Ende als auch das 3'-Ende eine Hydroxylgruppe aufweisen. Das Verfahren umfasst: i) Kombinieren des ersten Oligonukleotids mit einer 5'-Phosphatgruppe und des zweiten Oligonukleotids mit einer 3'-Hydroxyl- und 5'-Hydroxylgruppe in Gegenwart der RNA-Ligase, wodurch ein verlängertes Oligonukleotid gebildet wird, das durch Ligation des 5'-Phosphats des ersten Oligonukleotids und der 3'-Hydroxylgruppe des zweiten Oligonukleotids gebildet wird; ii) Anfügen einer Phosphatgruppe an das 5'-Ende des verlängerten Oligonukleotids, wie beispielsweise mithilfe einer Polynukleotidkinase; iii) gegebenenfalls Blockieren des 5'-Endes des nicht umgesetzten ersten Oligonukleotids; und iv) Wiederholen von Schritt i) bis iii) unter Verwendung des verlängerten Oligonukleotids aus dem vorherigen Zyklus ii) als erstes Oligonukleotid i) im nächsten Zyklus.
Die erfindungsgemäßen Verfahren betreffen auch die Synthese von Oligonukleotiden in der Richtung von 5' zu 3', katalysiert von der RNA-Ligase, indem ein 3'-Hydroxyldonor eines ersten Oligonukleotids und ein 5'-Phosphatakzeptor eines zweiten Oligonukleotids verknüpft werden. Die Zirkularisierung der einzelnen Oligonukleotide kann blockiert werden, wie beispielsweise durch Anbringung einer chemischen Gruppe wie beispielsweise Biotin an das 5'-Ende des Oligonukleotids oder indem sowohl das 5'-Ende als auch das 3'-Ende eine Hydroxylgruppe aufweisen oder indem sowohl das 5'-Ende als auch das 3'-Ende eine Phosphatgruppe aufweisen. Das Verfahren umfasst: i) Kombinieren des ersten Oligonukleotids mit einer 3'-Hydroxylgruppe und des zweiten Oligonukleotids mit einer 3'-Phosphat- und 5'-Phosphatgruppe in Gegenwart der RNA-Ligase, wodurch ein verlängertes Oligonukleotid gebildet wird, das durch Ligation des 3'-Hydroxyls des ersten Oligonukleotids und der 5'-Phosphatgruppe des zweiten Oligonukleotids gebildet wird; ii) Entfernen der Phosphatgruppe vom 3'-Ende des verlängerten Oligonukleotids, wie beispielsweise mithilfe einer Phosphatase; iii) gegebenenfalls Blockieren des 3'-Endes des nicht umgesetzten ersten Oligonukleotids; und iv) Wiederholen von Schritt i) bis iii) unter Verwendung des verlängerten Oligonukleotids aus dem vorherigen Zyklus ii) als erstes Oligonukleotid i) im nächsten Zyklus
Die für die von der Ligase katalysierten Synthese verwendeten Oligonukleotide können anhand von Verfahren, wie beispielsweise chemische Synthese, hergestellt werden. Die hierin beschriebenen RNA-Ligasen können verwendet werden, um einzelsträngige Oligonukleotide variabler Länge, wie beispielsweise mit etwa 50 bis etwa 100 Basen, zu ligieren. Die Blockierung des 5'-Endes der Oligonukleotide kann beispielsweise durch chemische Modifikation der 5'-Phosphatgruppe erfolgen. Das verlängerte Oligonukleotid kann ein synthetisches Gen aufweisen, welches ein Genprodukt kodiert, welches die Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Proteins aufweist, oder eine Modifikation davon. Die Oligonukleotidsynthese kann des Weiteren mit mehreren ersten Oligonukleotiden variabler Sequenz und/oder mehreren zweiten Oligonukleotiden variabler Sequenz durchgeführt werden, um mehrere verlängerte Oligonukleotide variabler Sequenz herzustellen, welche durch verschiedene Kombinationen verschiedener erster Oligonukleotide mit verschiedenen zweiten Oligonukleotiden produziert werden. Das Verfahren kann für weitere Zyklen wiederholt werden. Das Verfahren kann damit als Verfahren zum Gen-Shuffling verwendet werden, wie beispielsweise, indem die mehreren Oligonukleotide die Sequenz korrespondierender Fragmente von Genen natürlich vorkommender Sequenzen verschiedener Quellen aufweisen. Beispiel 9 unten beschreibt die Synthese eines Gens für ein Protein mit der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Proteins. Das Beispiel zeigt die Synthese des Gens mithilfe der RM378-RNA-Ligase. Das Experiment in dem Beispiel war konzipiert, um ein synthetisches Gen herzustellen, das für die Klonierung und Expression eines Proteins geeignet ist, das äquivalent zu dem aktiven menschlichen insulinähnlichen Wachstumsfaktor ist. Das Beispiel zeigt die Synthese von Genen auf, die für die Produktion eines spezifischen Proteins optimiert sind, welches mehrere mögliche Vorteile gegenüber anderen Verfahren zur Herstellung des gleichen Proteins aufweist. Das Protein ist menschlicher Herkunft und lässt sich schwierig direkt erhalten. Das aktive Protein ist nur ein Teil eines Vorläuferproteins, welches in vivo prozessiert werden muss, um die ausgereifte Proteinkette zu produzieren. Die Produktion des aktiven Proteins durch Expressionsklonierung würde Gentechnik erfordern, wie beispielsweise Subklonieren eines korrespondierenden Genfragments aus cDNA und das Einfügen eines Initiatormethionincodons zur Herstellung eines Expressionsvektor, der nur das aktive Protein exprimiert. Die Zusammensetzung der Sequenz des menschlichen Gens, wie beispielsweise Codonverwendung und GC-Gehalt, sind unter Umständen für die Expression in einem heterologen Wirt, wie beispielsweise E. coli, nicht optimal.
Die Veröffentlichung betrifft auch Verfahren, in denen eine RNA-Ligase für die Amplifikation von RNA verwendet wird, wie beispielsweise Verfahren für die Amplifikation von mRNA einschließlich der Synthese der korrespondierenden cDNA. Die Verfahren könnten von der Verwendung der thermostabilen RNA-Ligase profitieren, wie beispielsweise einer thermostabilen RNA-Ligase gegenüber der herkömmlichen RNA-Ligase von T4. Beispielsweise kann die Amplifikation von mRNA vorzugsweise bei höheren Temperaturen, wie beispielsweise bei etwa 60°C durchgeführt werden, um die Bildung von Sekundärstrukturen in den Nukleinsäuresubstraten, welche die Ligasereaktion hemmen können, einzuschränken.
Amplifikationsverfahren können verwendet werden, um die 5'- und die 3'-untranslatierten Regionen von Genen zu identifizieren, um heterogene Transkriptionsstartstellen zu untersuchen, Promotorregionen zu charakterisieren, die vollständige cDNA-Sequenz eines Gens zu erhalten und die Volllängen-cDNA für die anschließende Klonierung und Expression zu amplifizieren.
Es sind mehrere Verfahren beschrieben worden, welche die Amplifikation von RNA, insbesondere mRNA, durch Synthese der korrespondierenden cDNA beinhalten. Kempe, et al., US-Patent Nr. 4,661,450 , beschreiben ein Verfahren zum molekularen Klonieren von RNA. Bei diesem Verfahren ist die Verwendung der T4-RNA-Ligase grundlegend für die Vorgehensweise, da die RNA-Ligase verwendet wird, um Oligonukleotidlinker an das zu klonierende einzelsträngige Molekül anzubringen. Die angebrachten Oligonukleotide können aus RNA, DNA oder einem Gemisch aus beiden zusammengesetzt sein und das Einfügen der RNA-Art in einen Klonierungsvektor ermöglichen. Nach der Transformation des Klonierungsvektors in einen geeigneten Wirt lassen sich viele DNA-Kopien erhalten. Ein Nachteil dieses besonderen Verfahrens ist, dass sich am 3'-Terminus des Linkers, der an den 5'-Terminus des zu klonierenden einzelsträngigen RNA-Moleküls angebracht wird, ein Ribonukleotid befinden muss. Diese Voraussetzung beruht auf den Eigenschaften der herkömmlichen RNA-Ligase aus dem Bakteriophagen T4, die ein Desoxynukleotid mit der 3'-Hydroxylgruppe des Akzeptors nicht effektiv verwendet. Die Verwendung der T4-RNA-Ligase ist daher durch ihre Substratspezifität eingeschränkt.
In jüngerer Zeit beruhten Verfahren zur Amplifikation von mRNA überwiegend auf der Synthese von cDNA unter Verwendung der reversen Transkriptase und Amplifikation mittels PCR. Es erschienen verschiedene Variationen und Verbesserungen des allgemeinen Verfahrens des Synthetisierens von cDNA, einschließlich Verfahren zur Gewinnung von cDNA von Volllängen-RNA, wie beispielsweise RACE (Rapid Amplifikation of cDNA Ends, Maruyama, et al., Nucleic Acids Res., 23: 3796–7 (1995)). Die beschriebenen Verfahren beinhalten häufig die Verwendung einer RNA-Ligase für die Ligation von Nukleinsäuren wie beispielsweise für die Ligation eines Oligonukleotids an die 5'-Enden der mRNA oder die Zirkularisierung einzelsträngiger cDNA. Ein mit klassischen RACE-Verfahren verbundendes Problem ist die Amplifikation trunkierter cDNA (Schaefer, B. C., Anal. Biochem., 227: 255–273 (1995)). Die ligationsvermittelte Amplifikation von RNA verwendet eine RNA-Ligase, um die Zuverlässigkeit des Verfahrens zu erhöhen, indem die Termini der RNA-Moleküle konserviert werden (Volloch, et al., Nucleic Acids Res., 22: 2507–2511 (1994)). Das Vorhandensein einer Cap-Struktur am 5'-Ende von Volllängen-mRNA kann verwendet werden, um selektiv cDNA mit vollständiger Länge zu produzieren. Zunächst wird eine Phosphatase verwendet, um mRNA-Moleküle mit einer freien Phosphatgruppe am 5'-Ende, d. h. degradierte und unvollständige RNA-Moleküle, zu entphosphorylieren. Nach enzymatischem Entfernen der Cap-Struktur von Volllängen-mRNAs können an entcappte mRNA-Moleküle, die nun eine freie 5'-Phosphatgruppe aufweisen und im Gegensatz zu Molekülen ohne eine 5'-Phosphatgruppe für die RNA-Ligase als Substrate fungieren können, Linker angefügt werden. So kann ein spezifisches Oligonukleotid an das 5'-Ende der Volllängen-RNA-Moleküle ligiert werden, und unter Verwendung der reversen Transkriptase mit beispielsweise einem Primer, der eine Poly(T)-Region aufweist, die zur Poly(A)-Region eukaryotischer mRNA komplementär ist, kann cDNA herstellt werden. Die cDNA kann anschließend durch PCR und mit Primern, die zu dem vorher ligierten Oligonukleotid komplementär sind, und einem genspezifischen Primer oder einem Primer, der zu der Poly(A)-Region komplementär ist, amplifiziert werden (Maruyama & Sugano, Gene, 138: 171–174 (1994)).
US-Patent Nr. 5,597,713 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von cDNAs mit kompletter Länge durch Ligation von DNA oder einer DNA-RNA-Oligonukleotidchimäre an das 5'-Ende intakter mRNAs nach dem Entcappen. PCR-Patent Nr. WO 01/04286 beschreibt die Optimierung eines Verfahrens zur Konstruktion von Bibliotheken aus Volllängen-cDNA, indem durch Optimierung der Reaktionsbedingungen einschließlich der RNA-Ligasereaktion die mRNA-Degradation minimiert und der Anteil der Vollständigen erhöht wird. US-Patent Nr. 6,242,189 beschreibt ein Verfahren für die selektive Isolierung bakterieller mRNA nach enzymatischer Modifikation der mRNA wie beispielsweise durch Verwendung einer RNA-Ligase. Merenkova, et al. ( US-Patent Nr. 6,022,715 ) beschreiben ein Verfahren für die spezifische Kopplung der 5'-Cap der mRNA mithilfe chemischer Modifikationen und anschließender Isolierung von mRNA und Präparation kompletter cDNA, und Zohlnhöfer und Klein (PCT-Patent Nr. WO 01/71027 ) beschreiben ein Verfahren für die Amplifikation von mRNA, das die Ligation von Poly(C)- und Poly(G)-Flanken an cDNA beinhaltet.
Kürzlich identifizierte Anwendungen der T4-RNA-Ligase beruhen auf einer zielvermittelten Ligation von DNA durch die RNA-Ligase ( US-Patent Nr. 6,368,801 ). Entsprechend kann die T4-RNA-Ligase an RNA hybridisierte DNA-Enden effizienter ligieren als die T4-DNA-Ligase. Diese Eigenschaft der T4-RNA-Ligase lässt sich für die Feststellung und/oder Amplifikation von Nukleinsäure verwenden. Bekannte Techniken, die auf der Ligation von DNA beruhen, können also mithilfe der T4-RNA-Ligase verbessert werden. Diese Verfahren umfassen die Ligasekettenreaktion (LCR), die ligationsvermittelte PCR (LD-PCR), reverse Transkription-PCR kombiniert mit Ligation, PCR/Ligationsdetektionsreaktion (PCR/LDR), den Oligonukleotidligationsassay (OLA), Ligation-während (during)-Amplifikation (LDA), iterative Gap-Ligation (IGL) und die Ligation von Padlock-Sonden, offenen zirkulären Sonden und anderen zirkularisierbaren Sonden.
Es wurde ein Verfahren zur Amplifikation von mRNA beschrieben, das jedoch keine cDNA-Synthese umfasst ( US-Patent Nr. 6,338,954 ). Dieses Verfahren verwendet eine RNA-Polymerase für die Amplifikation ausgehend von einer angebrachten Promotorsequenz. Eine RNA-Ligase wird verwendet, um doppelsträngige DNA mit einer Promotorsequenz an RNA-Moleküle anzubringen.
Für das molekulare Klonieren von RNA wird eine thermostabile RNA-Ligase verwendet, wobei die RNA-Ligase dazu dient, an zu klonierende einzelsträngige RNA-Moleküle Oligonukleotidlinker anzubringen. Das angebrachte Oligonukleotid kann aus RNA, DNA oder einem Gemisch aus beiden zusammengesetzt sein und das Einsetzen der RNA-Art in einen Klonierungsvektor vereinfachen. Nach der Transformation des Klonierungsvektors in einen geeigneten Wirt lassen sich viele DNA-Kopien erhalten.
Die Amplifikation von mRNA kann vorzugsweise auf der Synthese von cDNA mittels reverser Transkriptase und PCR-Amplifikation beruhen. Dies beinhaltet Verfahren zur Gewinnung von cDNA aus Volllängen-RNA, wie beispielsweise Verfahren für die rasche Amplifikation von cDNA-Enden (RACE, Maruyama, et al., Nucleic Acids Res., 23: 3796–7 (1995)). Diese Verfahren beinhalten die Verwendung einer RNA-Ligase für die Ligation von Nukleinsäuren wie beispielsweise für die Ligation eines Oligonukleotids an die 5'-Enden der mRNA oder die Zirkularisierung einzelsträngiger cDNA. Die thermostabile RNA-Ligase kann für die ligationsvermittelte Amplifikation von RNA durch Konservierung der Termini der RNA-Moleküle verwendet werden. Das Vorhandensein der Cap-Struktur am 5'-Ende der Volllängen-mRNA kann verwendet werden, um selektiv cDNAs mit kompletter Länge herzustellen. Der Vorgang umfasst beispielsweise im Wesentlichen folgende Schritte: i) eine Phosphatase, wie beispielsweise die alkalische Phosphatase, wird verwendet, um mRNA-Moleküle mit einer freien Phosphatgruppe am 5'-Ende, d. h. degradierte und unvollständige RNA-Moleküle ohne 5'-Cap, zu entphosphorylieren; ii) die 5'-Cap von Volllängen-mRNAs wird entfernt, wie beispielsweise durch enzymatisches Entfernen, wie beispielsweise durch Verwendung des Enzyms Tabaksäurepyrophosphatase (TAP); iii) es wird eine thermostabile RNA-Ligase, wie beispielsweise die RM378-RNA-Ligase oder die TS2126-RNA-Ligase bzw. alle im Wesentlichen ähnliche Enzyme verwendet, um Linker an das 5'-Ende der entcappten mRNA-Moleküle anzufügen; iv) mithilfe der reversen Transkriptase wird eine cDNA synthetisiert, beispielsweise durch Verwendung eines Primers, der eine zu einer Poly(A)-Region der mRNA komplementäre Poly(T)-Region enthält; und v) die cDNA wird amplifiziert, wie beispielsweise mittels PCR, beispielsweise mit Primern, die zu dem zuvor ligierten Oligonukleotid komplementär sind, und einem genspezifischen Primer oder einem Primer, der zu einer Poly(A)-Region komplementär ist.
Beispiel 10 liefert ein Beispiel, wie die RM378-Ligase bei 5'-RACE (RLM-RACE)-Anwendungen verwendet werden kann. 13 zeigt demnach eine Bande eines PCR-Produktes im erwarteten Größenbereich. Beispiel 19 zeigt des Weiteren Ergebnisse, für welche die TS2126- und die T4-Ligase in einer RLM-RACE-Anwendung eingesetzt wurde. Die Ergebnisse (21) zeigen deutlich, dass die TS2126-Ligase für Anwendungen dieser Art geeignet ist. Diese Beispiele veranschaulichen daher die Machbarkeit der Verwendung thermostabiler Ligasen der vorliegenden Veröffentlichung bei RACE-Reaktionen, wobei außerdem die breite Vielfalt neuartiger Anwendungen für diese thermostabilen Enzyme veranschaulicht wird.
Der Ligationsschritt wird vorzugsweise bei hohen Temperaturen durchgeführt, wie beispielsweise bei etwa 40°C bis etwa 80°C, mehr bevorzugt bei Temperaturen von etwa 50°C bis etwa 75°C und noch mehr bevorzugt bei etwa 55°C bis etwa 70°C. Die dem 5'-Ende der RNA-Moleküle hinzugefügten Linker können Oligonukleotide aufweisen, welche aus RNA, DNA, DNA-RNA-Oligonukleotidchimären oder Nukleotidanaloga zusammengesetzt sind.
Es werden auch Variationen dieser Technik für die rasche Amplifikation von cDNA-Enden (RACE) in Betracht gezogen. Beispielsweise kann eine 5'-Endregion einer Ziel-mRNA folgenderweise amplifiziert werden: 1) Synthetisieren der cDNA durch Synthetisieren des ersten cDNA-Stranges durch reverse Transkription der Ziel-mRNA anhand eines 5'-endphosphorylierten RT-Primers, der für die Ziel-RNA spezifisch ist; 2) Degradation des DNA-RNA-Hybrids durch Behandlung mit RNase H, um die RNA zu entfernen; 3) Zirkularisieren der einzelsträngigen cDNA zur Ausbildung von Konkatemeren mit einer thermostabilen RNA-Ligase, wie beispielsweise der RM378-RNA-Ligase oder der TS2126-RNA-Ligase bzw. einem im Wesentlichen ähnlichen Enzym; und 4) Amplifizieren der DNA durch PCR mithilfe spezifischer Primer, die zu bekannten Sequenzen komplementär sind.
Bei einem anderen Verfahren wird die mRNA mit einer Phosphatase behandelt, um die 5'-Phosphate von trunkierter mRNA und Nicht-mRNA zu entfernen, die entphosphorylierte RNA wird mit einer Pyrophosphatase behandelt, um die 5'-Capstruktur von intakten Volllängen-mRNAs zu entfernen, wobei ein 5'-Phosphat zurückbleibt, das für die Ligation mit einem RNA-Oligonukleotid erforderlich ist. Ein Oligonukleotid wird mithilfe einer thermostabilen RNA-Ligase, wie beispielsweise der RM378-RNA-Ligase oder der TS2126-RNA-Ligase bzw. einem im Wesentlichen ähnlichen Enzym, an das 5'-Ende der entcappten Volllängen-mRNA ligiert. Das RNA-Oligonukleotid liefert eine Primingstelle für 3'-Primer. Die ligierte mRNA wird revers transkribiert. mRNA wird durch RNase H degradiert. Die erzeugte cDNA wird dann mittels PCR amplifiziert.
Das PCR-Amplifikationsverfahren beruht generell auf der Anwendung von zwei spezifischen Primern. Beim PCR-Screening werden daher zwei konservierte Zielstellen mit günstiger Länge der Intervallsequenz benötigt. Obgleich sich das Verfahren auf hohen Durchsatz anpassen lässt, wurden die meisten dieser Einzelgen-PCR-Verfahren nur mit DNA-Proben aus einzelnen Arten verwendet, die eine begrenzte Anzahl an Genen tragen.
Ein Ansatz für PCR mit einem Einzelprimer (lineare PCR) lässt sich beispielsweise verfolgen, indem bei jeder PCR ein genspezifischer Primer verwendet und anschließend an das 3'-Ende der einzelsträngigen DNA-Kopie eine Adaptersequenz ligiert wird, um eine zweite Primerstelle für den zweiten Amplifikationsschritt zu liefern. Die entworfenen genspezifischen Primer sind am 5'-Ende affinitätsmarkiert (beispielsweise vorzugsweise mit Biotin markiert), was die Trennung des ersten einzelsträngigen DNA-Produktes von dem DNA-Komplex ermöglicht. Nachdem durch lineare Amplifikation einer Reihe von Kopien der einzelsträngigen DNA hergestellt worden sind, kann eine zweite reverse Primingstelle zur Verfügung gestellt werden, indem ein einzelsträngiges Oligonukleotid bekannter Sequenz mittels einer Ligase, wie beispielsweise der T4-RNA-Ligase, an das 3'-Ende der einzelsträngigen DNA ligiert wird. Die modifizierten Vorlagen werden dann unter Verwendung des genspezifischen Primers (unmarkiert) und eines reversen Primers, der den Adaptersequenzprimer ergänzt, reamplifiziert, um doppelsträngige DNA herzustellen, die anschließend zur weiteren Klonierung und/oder Sequenzierung mittels PCR amplifiziert werden kann (1).
Die Veröffentlichung betrifft auch Verfahren zur Verwendung einer thermostabilen RNA-Ligase, wie beispielsweise der RM378-RNA-Ligase oder der TS2126-RNA-Ligase, bei der Einzelprimer-PCR (lineare PCR und inverse PCR). Die RNA-Ligase kann bei einem PCR-Verfahren verwendet werden, bei dem nur ein spezifischer Primer eingesetzt wird. Der zweite stromabwärts (downstream) bindende reverse Primer (unspezifisch) bindet an eine Ankersequenz, die dem Polymeraseverlängerungsprodukt von dem spezifischen Primer durch die RNA-Ligase hinzugefügt wird. Die auf diese Weise erzeugte doppelsträngige DNA wird dann kloniert und sequenziert. Dieses PCR-Verfahren mit einem einzelnen spezifischen Primer kann für das Screening von familienweiten Genfragmenten und des Weiteren zum Erhalt kompletter Gene von verschiedenen DNA-Quellen angewendet werden, wie beispielsweise aus reinen oder gemischten Kulturen und Umweltproben oder DNA-Bibliotheken.
Das Screening-Verfahren besteht aus DNA oder dem Gemisch der Nukleinsäuren, die aus der Probe extrahiert worden sind, und anschließend wird die DNA mit einem degenerierten Primer hybridisiert, der auf eine einzelne Region in der Zielsequenz gerichtet ist. Der genspezifische Primer ist in Bezug auf eine hoch konservierte Aminosäuresequenzregion degeneriert, welche durch die Analyse multipler Alignments von Proteinen aus der Proteinzielfamilie identifiziert wird. Der degenerierte genspezifische Primer kann durch eine Anzahl von Verfahren entworfen werden, einschließlich dem CODEHOP-Verfahren [Consensus-Degenerate Hybrid Oligonukleotid Primer] (Rose et al., 1998). Die Zielregion der Proteinzielfamilie sollte vorzugsweise mindestens 3–4 konservierte Aminosäuren enthalten. Nach der Hybridisierung werden mit einer Polymerase oder reverser Transkripase durch wiederholtes thermisches Zyklieren (lineare Amplifikation) die einzelsträngigen DNA-Kopie-Moleküle (Verlängerungsprodukte) produziert. Die einzelsträngige DNA wird anschließend durch Säulenreinigung von unverbrauchten Primern und der DNA-Vorlage getrennt. Es kann ein weiterer Reinigungsschritt der einzelsträngigen DNA integriert werden, um den durch unspezifische Hybridisierung von Primern und degradierter DNA verursachten Hintergrund zu reduzieren. Dies erfolgt mit spezifischen Primern, die am 5'-Ende affinitätsmarkiert sind (vorzugsweise mit Biotin markiert). So kann das einzelsträngige DNA-Produkt durch die Bindung an das entsprechende Ligandenmolekül (vorzugsweise Streptavidin, z. B. Streptavidin-beschichtete Kügelchen oder Kavitäten) an einen festen Träger immobilisiert werden, und nicht immobilisierte DNA kann weggewaschen werden. Dann wird durch Ligation eines definierten 5'-phosphorylierten Oligonukleotidlinkers (Ankermoleküle) an das 3'-Ende der zuvor hergestellten einzelsträngigen DNA-Moleküle mit der RNA-Ligase am 3'-Ende der einzelsträngigen DNA-Kopie eine zweite Primerstelle bereit gestellt. Nach der Ligation können die einzelsträngigen DNA-Kopien mit einem Primerpaar amplifiziert werden, das einen Teil der 5' degenerierten Primersequenz und einen Primer aufweist, der zu dem 3'-Ankermolekül komplementär ist. Das PCR-Produkt kann dann kloniert und sequenziert bzw. direkt sequenziert werden.
Darüber hinaus ist das Verfahren zum Erhalten eines Zugangs zu natürlicher Vielfalt und der Auffindung unbekannter Gene und Genfragmente aus komplexer DNA, die aus gemischten Populationen natürlicher Mikroorganismen isoliert wurde, eine Alternative zu anderen herkömmlichen Verfahren auf der Basis der Konstruktion und des Screenings von DNA-Bibliotheken (Woo, et al., Nucleic Acid Res., 22: 4922–4931 (1994); Dalboge H., FEMS Microbiol Rev., 21: 29–42 (1997); Rondon et al., PNAS USA, 96: 6452–6455 (1999); US-Patent Nr. 5,958,672 ; Henne, et al., Appl. Environ. Microbiol., 66: 3133–316 (2000)) oder PCR-Amplifikation von Umweltproben mit zwei spezifischen degenerierten Primern (vorwärts und rückwärts) ( US-Patent Nr. 5,849,491 ). Das oben beschriebene Verfahren hat gegenüber diesen Verfahren tatsächlich mehrere Vorteile. Es ist vor allem einfach, weniger zeitaufwändig und zielgerichteter, um eine neue Vielfalt homologer Gene zu finden, als die Methoden der Konstruktion einer Bibliothek. Zweitens kann dieses Verfahren für alle Genfamilien verwendet werden, so lange mindestens eine gemeinsame konservierte Region gefunden wird, die mindestens 3 gut konservierte Aminosäuren enthalten, und ein spezifischer, genfamilienspezifischer degenerierter Primer entworfen werden kann. Dies steht im Gegensatz zu einem Bibliotheks-Expressionsscreening, bei dem für verschiedene Enzymaktivitäten verschiedene Screeningassays, die von der Verfahrensweise her sehr kompliziert sein können, durchgeführt werden müssen. Die Voraussetzung nur einer konservierten Region in einer Proteinfamilie anstelle von zwei solcher Stellen, wie sie für die Anwendung des herkömmlichen Verfahrens mit zwei Primern erforderlich sind, gestattet es augenscheinlich, mit der vorliegenden Veröffentlichung eine viel größere Vielfalt entfernter verwandter Gene zu erhalten.
Das Ein-Primer-Verfahren hat noch weitere Vorteile gegenüber PCR-Screeningverfahren, bei denen zwei spezifische Primer (vorwärts und rückwärts) verwendet werden. Der erste Schritt erfordert die Hybridisierung von nur einem spezifischen Primer vor Beginn der Polymerisierung und ist daher kinetisch günstiger, als wenn eine Hybridisierung von zwei Primern erforderlich ist. Mit dem Ein-Primer-Verfahren lässt sich deshalb eine größere Vielfalt erhalten. Wenn in jeder Reaktion nur ein genfamilienspezifischer Primer verwendet wird, wie in dem erfindungsgemäßen Verfahren, sind weniger Reaktionen erforderlich (keine Matrix aus Vorwärts- und Rückwärtsprimern). Dies spart nicht zur Zeit und teure Reagenzien, sondern auch Quell-DNA. Ein weiterer signifikanter Vorteil des Verfahrens mit einem einzigen spezifischen Primer im Vergleich gegenüber dem Verfahren mit zwei Primern ist, dass in der ersten Reaktion längere Sequenzen erhalten werden können, da die Fragmentlänge nicht von den Intervallen zwischen zwei konservierten Stellen abhängig sind. Es sind nur wenige Verfahren auf Basis der Anwendung nur eines genspezifischen Primers beschrieben worden (Jones and Winistorfer, Nucleic Acids Res. 20: 595–600 (1992); Jones and Winistorfer, Biotechniques, 15: 894–904 (1993); Megonigal et al., PNAS USA, 97: 9597–9602 (2000); Riley, et al., Nucleic Acids Res., 18: 2887–2890 (1990); Rubie et al., Biotechniques, 27: 414–418 (1999); Morris et al. Appl. Environ. Microbiol., 1998; Rosenthal and Jones, NucleicAcids Res., 18: 3095–3096 (1990); Kilstrup and Kristiansen, Nucleic Acid Res., 28 E55 (2000); Stokes et al., Appl. Environ Microbiol., 67: 5240–5246 (2001) und Laging, et al., Nucleic Acid Res., 29: E8 (2001)). Diese Verfahren sind jedoch nur für den Zweck der Isolierung unbekannter Sequenzen in einer einzelnen genomischen DNA bzw. einer DNA einer Genombibliothek beschrieben worden. In dem oben beschriebenen Verfahren findet darüber hinaus eine Polymerasereaktion als erster Schritt statt, wobei einzelsträngige Polynukleotide produziert werden. Da keine Restriktion oder Ligation der Quell-DNA stattfinden, sind die Anforderungen an eine DNA hoher Qualität nicht so streng wie für die Verfahren, die auf einer Bibliothek basieren.
Das PCR-Verfahren mit einem einzelnen spezifischen Primer lässt sich anwenden, um Sequenzen zu isolieren, die eine bekannte Sequenz flankieren. Das Verfahren kann also für den Erhalt kompletter Gene durch das „Abwandern von Genen" (Gene-Walking) verwendet werden, das von dem Fragment ausgeht, welches durch das PCR-Screening mit dem einzelnen spezifischen Primer isoliert wurde. In diesem Fall werden in zwei PCR-Reaktionen zwei vorwärtsspezifische, nicht degenerierte Primer verwendet. Bei der ersten Reaktion wird ein äußerer Primer verwendet, der mit einem Immobilisierungsligandenmarkiert ist (z. B. biotinmarkiert), um einzelsträngige DNA-Moleküle zu erzeugen, die wie oben beschrieben gereinigt werden. In der zweiten Reaktion wird die in der ersten Runde hergestellte einzelsträngige DNA in der zweiten Runde als Vorlage verwendet. Anschließend wird in einer PCR-Reaktion ein zweiter „Nested"-Vorwärtsprimer gegen den reversen Ankerprimer verwendet, um die Spezifität der Amplifikationsprodukte zu verbessern. Die Produkte können anschließend kloniert und sequenziert werden. Beispiel 8 beschreibt ausführlich ein Experiment einer PCR mit einem einzelnen spezifischen Primer unter Verwendung der T4-RNA-Ligase sowie der RM378-RNA-Ligase. Die Veröffentlichung betrifft Verfahren, die eine PCR mit einem einzelnen Primer betreffen, wobei der Ligationsschritt unter Verwendung der RNA-Ligase vorzugsweise bei hohen Temperaturen, wie beispielsweise bei Temperaturen von etwa 40°C bis etwa 80°C, mehr bevorzugt bei Temperaturen von etwa 50°C bis etwa 75°C, noch mehr bevorzugt bei Temperaturen von etwa 55°C bis etwa 70°C durchgeführt wird.
Die Veröffentlichung betrifft ferner Verfahren zum Markieren von Nukleinsäuren unter Verwendung einer thermostabilen RNA-Ligase, wie beispielsweise der RM378-RNA-Ligase oder der TS2126-RNA-Ligase bzw. eines im Wesentlichen ähnlichen Enzyms. Die RNA-Ligase kann für die Markierung von Oligonukleotidsonden, -primern oder -vorlagemolekülen oder von Polynukleotidsonden oder -vorlagemolekülen verwendet werden, wobei das Nukleotid bzw. Oligonukleotid mit einer chemischen Gruppe markiert wird. Die T4-RNA-Ligase wurde bei der Fluoreszenz-, Isotopen- oder Biotinmarkierung des 5'-Endes von DNA-/RNA-Molekülen verwendet (Kinoshita, et al., Nucl. Acid Res., 26: 2502–2504 (1997)).
Das Markieren der Nukleinsäure (Sonde oder Primer) mit der RNA-Ligase kann vor oder nach der Hybridisierung erfolgen (vgl. PCT WO97/27317 ). Die chemische Gruppe kann die Hybridsonde/das Vorlagemolekül auf einer festen Fläche immobilisieren (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5,595,908 ) oder kann als Ligand dienen, der an ein Molekül (Antikörper) bindet, der mit einer enzymatisch aktiven Gruppe gekoppelt ist, wodurch die Messung der enzymatischen Aktivität und dadurch das Erhalten eines quantitativen Messwertes der spezifischen Nukleinsäure in der Probe ermöglicht werden.
Markierte DNA- oder RNA-Moleküle können bei verschiedenen Verfahren der quantitativen Feststellung von Nukleinsäuren oder zur Feststellung einer Polynukleotidhybridisierung verwendet werden. Die Hybridisierung von DNA- oder RNA-Vorlagemolekülen mit den markierten Nukleinsäuresonden kann in einer Lösung (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 6,136,531 ) oder auf einer festen Fläche durchgeführt werden. Wenn die Hybridisierung auf einer festen Fläche stattfindet, können vor der Hybridisierung entweder die Nukleinsäuresonden oder die DNA-Vorlage immobilisiert werden. Darüber hinaus können die verschiedenen Sonden in einer Anordnung (Array) immobilisiert und organisiert werden. Die Hybridvorlage-/Sondenmoleküle können in Lösung oder an eine feste Fläche immobilisiert festgestellt werden.
Die hierin beschriebenen Verfahren betreffen die Verwendung thermostabiler RNA-Ligasen bei Feststellungsassays für Nukleinsäuren, wie beispielsweise bei diagnostischen Assays. Dazu gehört die Feststellung in verschiedenen Proben, wie beispielsweise die Feststellung einer DNA-Verunreinigung in biopharmazeutischen Präparaten oder die Feststellung seltener Nukleinsäuren in klinischen Proben. Festzustellende Nukleinsäurevorlagemoleküle können mit binären Nukleotidsonden hybridisiert werden, welche zu benachbarten Teilen der Zielsequenz komplementär sind. Nach der Hybridisierung können die Sonden mithilfe der RNA-Ligase in einer vorlagenabhängigen Weise ligiert werden. Bei der Nukleinsäurevorlage kann es sich um DNA oder RNA handeln, und bei den Primermolekülen um DNA oder RNA. Das Ligationsprodukt kann anhand von PCR-Amplifikation unter Verwendung geeigneter Primer, Nukleotide und Polymerasen festgestellt werden. Die Ligationskettenreaktion (LCR) lässt sich auch für die Feststellung des Ligationsproduktes verwenden. Ein Primer oder beide Primer können mit einem radioaktiven, fluoreszierenden oder elektrochemilumineszierenden Molekül oder Liganden markiert werden, die an ein mit einer enzymatisch aktiven Gruppe gekoppeltes Molekül (Antikörper) binden können, was eine quantitative Messung der spezifischen Nukleinsäure in der Probe ermöglicht. Ein anderes Verfahren besteht aus der Verwendung einer Sonde, die zu den 5'- und 3'-Enden der Zielnukleinsäure komplementär ist. Die Enden hybridisieren an benachbarte Teile der Ziel-DNA und können mithilfe der RNA-Ligase in vorlagenabhängiger Weise ligiert werden, wodurch die Sonde zirkularisiert wird. Nach der Ligation kann der zirkulären Vorlage ein komplementärer Primer hinzugefügt werden, und anschließend kann die Primerverlängerung erfolgen. Der zirkulären Vorlage können auch zwei Primer hinzugefügt werden, ein komplementärer Rückwärts- und ein Vorwärtsprimer, um die zirkuläre Vorlage zu amplifizieren. Der Primer oder die dNTPs in der PCR-Reaktion können mit einem radioaktiven, fluoreszierenden oder elektrochemilumineszierenden Molekül oder Liganden markiert werden, die an ein mit einer enzymatisch aktiven Gruppe gekoppeltes Molekül (Antikörper) binden können, was die Feststellung und quantitative Messung des Amplifikationsproduktes ermöglicht.
Die Erfindung betrifft ferner Verfahren, bei denen eine thermostabile RNA-Ligase beim Sequenzieren kurzer Oligonukleotide verwendet wird. Das Verfahren kann im Wesentlichen folgende Schritte umfassen: ein Hilfsoligonukleotid wird mithilfe der RM378-RNA-Ligase an das 3'-Ende eines Zieloligonukleotids ligiert. Ein zu dem Behelfsoligonukleotid komplementärer markierter Primer wird an das Ligationsprodukt hybridisiert. Das Hilfsoligonukleotid kann mit dem Didesoxy-Verfahren nach Sanger sequenziert werden (PNAS USA, 74: 5463–5467 (1977)).
Die Veröffentlichung betrifft des Weiteren Verfahren, in denen eine thermostabile RNA-Ligase, wie beispielsweise die RM 378-RNA-Ligase oder die TS2126-RNA-Ligase für die Analyse von Einzelnukleotidpolymorphismen und zur Feststellung von Mutationen verwendet wird. Das Enzym kann bei einer ligase-polymerase-vermittelten Einzelbasen-Primer-Erweiterung (Genetic Bit Analysis) von Einzelnukleotidpolymorphismen verwendet werden. Im Wesentlichen werden zwei Oligonukleotidprimer an durch ein Nukleotid getrennte, benachbarte Teile eines Zielmoleküls hybridisiert. Einer der Primer kann an einen festen Träger immobilisiert werden, so dass das Hybridisierungsprodukt immobilisiert ist. Nach der Immobilisierung wird eine Polymeraseverlängerung mit entsprechenden, zu dem Nukleotid an der vorselektierten Stelle komplementären Nukleosidtriphosphatarten durchgeführt, um die Lücke zwischen den Primern zu füllen. Anschließend wird zur Ligation des verlängerten Primers mit dem Downstream-Primer eine RNA-Ligase verwendet. Für die Feststellung des Verlängerungsligationsproduktes können entweder einer der Primer oder das dNTP markiert werden.
Bei einem anderen Verfahren der Veröffentlichung kann die RNA-Ligase zur Feststellung von Mutationen verwendet werden, d. h. bei der direkten Sequenzidentifikation von Mutationen durch Spaltung und Ligation in Verbindung mit mutationsspezifischer Sequenzierung. Das DNA-Molekül, das Mutationen enthält (Einzelbasensubstitutionen, -insertionen, -deletionen) wird an einem festen Träger immobilisiert. An das immobilisierte DNA-Molekül werden Oligos hybridisiert, die die Veränderung nicht enthalten. So bildet sich an der Stelle der Fehlpaarung ein Heteroduplex. Im nächsten Schritt werden die Hybride mit Enzymen wie beispielsweise Resolvasen, Fehlpaarungsreparaturproteinen, Nukleotidexzisionsreparaturproteinen oder Kombinationen davon behandelt, so dass einer oder beide DNA-Stränge innerhalb oder in der Nähe der Fehlpaarungsregion gespalten werden. Ein Beispiel einer Resolvase ist die Endonuklease VII des Bakteriophagen T4. Beispiele für Fehlpaarungsreparaturproteine sind MutY aus E. coli und das MutS-, MutL- und MutH-System in E. coli. Beispiele für Nukleotidexzisionsreparaturproteine sind UvrA, B, C und D. Die zwischen der Wildtyp-DNA und der veränderten DNA (mit Mutationen) gebildeten Hybride werden dann durch Denaturierung dissoziiert, und die Wildtyp-DNA und alle Spaltungsprodukte der Ziel-DNA werden durch Waschen entfernt. Anschließend wird die immobilisierte verbleibende Ziel-DNA mithilfe der RNA-Ligase mit einem Oligonukleotidlinker vorbestimmter Sequenz ligiert. Dieser Linker dient als Bindungsstelle für einen Sequenzierungsprimer. Anschließend wird die Sequenz der DNA unmittelbar neben dem ligierten Oligonukleotid durch Sequenzanalyse bestimmt, beispielsweise unter Anwendung des Didesoxy-Verfahrens nach Sanger.
Die Veröffentlichung betrifft ferner Verfahren, bei denen eine thermostabile RNA-Ligase bei der Prozessierung von Detektormolekülen verwendet wird, beispielsweise bei einem SELEX-Verfahren und für die Q-Beta-Technologie (Ellington and Szostak, Nature, 346: 818–22 (1990)). Die Detektormoleküle können für die Feststellung etwaiger Analyte mit RNA-Affinität verwendet werden, wie beispielsweise Proteine, Nukleotide oder Aminosäuren, Vitamine, Antibiotika, Kohlenhydrate, mit denen sie über Nicht-Nukleinsäurebasenpaarungswechselwirkungen einen Komplex bilden. Sie können bei der Diagnose von Krebs und von Infektions- und Erbkrankheiten verwendet werden. Jedes Detektormolekül besteht aus drei funktionellen Teilen, von denen jedes einem bestimmten Zweck dient: einer ist ein Ligand mit hoher Affinität für den Zielanalyten, einer ist mit dem entsprechenden Teil in dem zweiten Molekül ligiert, einer ist eine Vorlage, die nach der Ligation von zwei RNA-Molekülen mithilfe der RNA-Ligase mithilfe der Q-Beta-Replikase amplifiziert werden kann. Zur Auswahl spezifischer Detektormoleküle gegen einen definierten Analysen wird einer Probe mit dem reinen Analyten eine Bibliothek von RNA-Molekülen zugegeben, die aus drei funktionellen Teilen bestehen. RNA-Moleküle, die einen funktionellen Teil mit hoher Affinität für den Analyten enthalten, binden und bilden einen Komplex mit dem RNA-Zielmolekül. Anschließend wird eine RNA-Ligase verwendet, um zwei RNA-Moleküle in dem Komplex zu ligieren. Entsprechend bildet sich eine Vorlagefür die Q-Beta-Replikase, die es ihr ermöglicht, das Detektormolekül zu replizieren. Das Molekül kann weiter mithilfe der reversen Transkriptase und einer Polymerase amplifiziert sowie kloniert und sequenziert werden, um die Zusammensetzung des Detektormoleküls zu analysieren. Die RNA-Moleküle enthalten Erkennungsstellen für Ribozyme. Nach der Ligation wird die Probe mit Ribozymen behandelt, welche alle ungebundenen ligierten RNA-Moleküle verdauen. Die spezifischen RNA-Detektormoleküle können durch Transkription komplementärer DNA-Sequenzen im Plasmid stromabwärts (downstream) vom Promotor, beispielsweise des T7-Promotors, produziert werden. Bei Feststellungsassays werden sie der Probe zugegeben. Anschließend wird eine RNA-Ligase zugegeben, um die beiden RNA-Moleküle zu ligieren, um eine Vorlage für die Q-Beta-Replikase zu bilden. Anschließend wird das Molekül von der Q-Beta-Replikase und weiter mit der reversen Transkriptase und Polymerase amplifiziert.
Die folgenden Beispiele dienen dem Zweck der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung und sind nicht als Beschränkung des Umfangs dieser Erfindung zu verstehen.
Beispiele
Beispiel 1: Expression und Reinigung der RM378-RNA-Ligase
Ein Klon, der das Gen für die RM378-RNA-Ligase enthält (Expressionsvektor pBTac1 in Topo-Zellen), wurde bei 37°C kultiviert und mit IPTG bei OD₆₀₀ = 0,4 induziert. Die Zellen wurden geerntet und durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen. Der ungereinigte Zellextrakt wurde bei 10.000 Umdrehungen pro Minute für 1 Stunde in einem JA 25.50-Rotor zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und Ammoniumsulfat bis zu 30% zugegeben. Die Lösung wurde bei 4°C 40 Minuten lang gerührt und bei 10.000 g für 1 Stunde in einem JA 25.50-Rotor zentrifugiert. Das Proteinpellet wurde in 20 mM Tris pH 8 gelöst und in einem JA 25.50 bei 20.000 Umdrehungen pro Minute 1 Stunde lang zentrifugiert. Der Überstand wurde durch eine Hiprep 26/10-Entsalzungssäule (Pharmacia) in 20 mM Tris pH 8 geschickt. Das Protein wurde anschließend durch eine ResQ-Säule (Pharmacia) geschickt und mit KCl eluiert. Die Ligase eluierte überwiegend in einem Einzelpeak, der aufgefangen wurde. Die Ligase wurde durch Ammoniumsulfatausfällung eingeengt und gegen 20 mM Tris pH 8 dialysiert. Das Protein wurde in 10 mM Tris pH 8, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA und 50% Glycerol aufbewahrt.
Beispiel 2: pH-Optimum der RM378-RNA-Ligase
Mithilfe von zwei verschiedenen Puffern wurde ein pH-Aktivitätsprofil ermittelt: Tris HCl und MOPS, 500-mM-Stammlösungen. Beide Puffer wurden über den pH-Bereich von 4–11 hergestellt. Die MOPS-Stammlösungspuffer wurden bei Raumtemperatur, Tris aufgrund des drastischen Effektes der Temperatur auf seinen pH-Wert allerdings bei 55°C kalibriert. Die Reaktionsgemische (10 μl) wurden folgenderweise hergestellt:

MOPS oder Tris HCl 50 mM bei pH 4–11

ATP 1 mM

MgCl₂ 10 mM

BSA 25 μg/ml

DTT 10 mM

³²P-5'-markiertes rA20-Oligo 10 μM

RM378-RNA-Ligase Konzentration: 0,45 μM
Jedes Gemisch wurde 1 Stunde lang bei 55°C inkubiert, und die Reaktion wurde durch 5-minütiges Erhitzen bei 95°C abgebrochen. Anschließend wurde 30 μl SAP-Cocktail, der 5 E alkalische Phosphatase aus Eismeergarnelen (Shrimp Alkaline Phosphatase, SAP) in 1 × SAP-Puffer (20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM MgCl₂) (USB Corp. Cleveland, Ohio, USA) enthielt, zugegeben, und die Inkubation wurde für 3 Stunden bei 37°C fortgesetzt. Nach dem Inkubationszeitraum wurden 10 μl punktweise auf DE81-Filter (Whatman plc. Kent, GB) aufgetragen, zweimal in 500 mM Phosphatpuffer (pH 7) gewaschen und getrocknet. Die Filter wurden in Fläschchen zur Flüssigszintillationszählung überführt, es wurden 5 ml OptiGold-Cocktail zugegeben, und die Radioaktivität der Filter wurde im Flüssigszintillationszähler (Packard-Tricarb) gemessen. Die Ergebnisse sind in 5 angegeben. Das pH-Optimum beträgt in Tris pH 6,5 und in MOPS 7. Aufgrund der Temperaturtoleranz wurde in anschließenden Experimenten MOPS verwendet. 5 zeigt die relative prozentuale Aktivität der RM378-RNA-Ligase als Funktion des pH-Wertes unter Verwendung von MOPS-Puffer und Tris-HCl-Puffer.
Beispiel 3: Temperaturoptimum der RM378-RNA-Ligase und der T4-RNA-Ligase
Es wurden Reaktionen bei folgenden verschiedenen Temperaturen inkubiert: 4°C, 20°C, 30°C, 37°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 80°C und 90°C für die RM378-RNA-Ligase und 4°C, 20°C, 37°C, 45°C, 55°C und 65°C für die T4-RNA-Ligase (New England Biolabs, Redford, MA, USA). Die Reaktionsgemische (10 μl) waren wie folgt:
Für die RM378-RNA-Ligase:

MOPS 50 mM (pH 7.0)

ATP 1 mM

MgCl₂ 10 mM

BSA 25 μg/ml

DTT 10 mM

³²P-5'-markiertes rA20-Oligo 10 μM

RM378-RNA-Ligase Konzentration: 0,45 μM (0,2 μg)
Für die T4-RNA-Ligase:

MOPS 50 mM (pH 7.8)

ATP 1 mM

MgCl₂ 10 mM

BSA 25 μg/ml

DTT 10 mM

³²P-5'-markiertes rA20-Oligo 10 μM

T4-RNA-Ligase Konzentration: 0,45 μM (0,2 μg)
Jedes Gemisch wurde für 1 Stunde bei einer bestimmten Temperatur inkubiert, und die Reaktion wurde durch 5-minütiges Erhitzen bei 95°C abgebrochen. Anschließend wurde 30 μl SAP-Cocktail, der 5 E alkalische Phosphatase aus Eismeergarnelen (Shrimp Alkaline Phosphatase, SAP) in 1 × SAP-Puffer (20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM MgCl₂) (USB Corp. Cleveland, Ohio, USA) enthielt, zugegeben, und die Inkubation wurde für 3 Stunden bei 37°C fortgesetzt. Anschließend wurden 10 μl punktweise auf DE81-Filter aufgetragen, zweimal in 500 mM Phosphatpuffer (pH 7) gewaschen und getrocknet. Die Filter wurden in Fläschchen zur Flüssigszintillationszählung überführt, es wurde 5 ml OptiGold-Cocktail zugegeben, und die Radioaktivität der Filter wurde im Flüssigszintillationszähler (Packard-Tricarb) gemessen. Die Ergebnisse sind in 6 angegeben. Die RM378-RNA-Ligase (Quadrate) hat ein Temperaturoptimum bei 60°C, ist aber von 40 bis 70°C aktiv, während die T4-RNA-Ligase (Rauten) ein Temperaturoptimum bei 37–45°C aufweist, aber bei 55°C sämtliche Aktivität verliert. Die T4-RNA-Ligase ist nicht thermostabil und hat im Vergleich zu der RM378-RNA-Ligase ein anderes Temperaturprofil. Die T4-RNA-Ligase weist beim Temperaturoptimum des RM378-Enzyms keine Aktivität auf. Durch Optimierung des Puffers, durch Verringerung der DTT-Konzentration auf 1 mM und von MgCl₂ auf 5 mM (Daten nicht gezeigt) und bei Inkubationszeiten von 1 Stunde konnten wir das Temperaturoptimum auf 64°C erhöhen, aber das Enzym ist bei dieser Temperatur nicht stabil und verliert an Aktivität, wenn die Inkubation länger als 1 Stunde dauert (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 4: Thermostabilität der RM378-RNA-Ligase
Die Thermostabilität der RM378-RNA-Ligase wurde bestimmt, indem die Fähigkeit der RM378-RNA-Ligase untersucht wurde, nach Inkubation bei verschiedenen Temperaturen einer Denaturierung standzuhalten. Die Reaktionsgemische (wie in Beispiel 3 beschrieben) wurden 1 Stunde lang ohne die Vorlage bei 60–90°C inkubiert. Anschließend wurde die rA20-Vorlage zugegeben und 30 Minuten bei 60°C inkubiert. Jede Reaktion wurde durch 5-minütiges Erhitzen bei 95°C abgebrochen, gewaschen, und die Radioaktivität wurde wie oben beschrieben bestimmt. Zur Untersuchung der Stabilität der T4-RNA-Ligase wurde das gleiche Experiment durchgeführt, aber die Reaktionen wurden 1 Stunde lang bei 37°C, 45°C und 55°C inkubiert, woraufhin die Vorlage zugegeben und 60 Minuten bei 37°C inkubiert wurde. Die Reaktion wurde durch 5-minütiges Erhitzen bei 95°C abgebrochen, gewaschen, und die Radioaktivität wurde wie oben beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt.
Die RM378-RNA-Ligase bleibt bei 60°C stabil, beginn aber bei 70°C, an Stabilität zu verlieren. Nach 1 Stunde bei 70°C sind nur noch 40% Aktivität vorhanden. Bei 80°C war sämtliche Aktivität verschwunden. Der Startpunkt (Nullpunkt) auf dem Diagramm entspricht der Aktivität des Enzyms, die direkt nach Aufbewahrung des Enzyms in einer Gefriereinrichtung mit –20°C gemessen wurde. Wie in 7 gezeigt, verliert die T4-RNA-Ligase 80% ihrer Aktivität, nachdem sie 1 Stunde lang in dem Reaktionspuffer bei 37°C inkubiert wurde. Es wird darauf hingewiesen, dass den Enzymen keine Vorlage zugegeben wurde, die ihre Stabilität beeinflussen könnte. Unter den gegebenen Bedingungen wird das RM378-Enzym allerdings aktiver, während das T4-Enzym bei der gleichen Temperatur schnell an Aktivität verliert. Auch der MOPS-Puffer wurde diesen Bedingungen unterzogen, und anschließend wurden das Enzym und die Vorlage zugegeben. Nach 1-stündigem Erhitzen des Puffers bei 90°C ging die Aktivität um weniger als 10% zurück (Daten nicht gezeigt).
Es wurde auch die Zeitabhängigkeit der Thermostabilität bei 90°C beobachtet, wobei die RM378-RNA-Ligase nach 5 Minuten bei 90°C alle Aktivität verlor (Daten nicht gezeigt). Es wurde auch die Stabilität bei 60°C über einen längeren Zeitraum beobachtet. Wie in 8 gezeigt, ist das Enzym mindestens einige Stunden lang bei 60°C stabil und zeigt klare Anzeichen einer Thermoaktivierung. Es wird darauf hingewiesen, dass das Enzym in diesen Experimenten ohne Vorlage (Template) inkubiert wurde. Die Daten der dA20-Oligoligation über die Zeit deuten darauf hin, dass das Enzym in Gegenwart einer DNA-Vorlage mindestens 8 Stunden lang stabil ist.
Beispiel 5: Ligation von Oligonukleotiden mithilfe der RM378-RNA-Ligase und der T4-RNA-Ligase
Es wurde die Fähigkeit der RM378-RNA-Ligase und der T4-RNA-Ligase untersucht, Ligationen definierter Oligoribonukleotidsubstrate (5'-phosphoryliertes rA20-Mer) und Desoxyribonukleotidsubstrate (5-phosphoryliertes dA20-Mer)) zu katalysieren.
Aktivitätsmessungen mit einem Ribonukleotid (RNA)-Substrat
Es wurde die Ligation eines rA20-Oligoribonukleotids (RNA) oder eines RNA-Oligoribonukleotids mit 17 Nukleotiden (5'P-agcgtttttttcgctaa (SEQ ID Nr: 5) mithilfe der RM378-RNA-Ligase und der T4-RNA-Ligase gemessen. Dies entspricht einer Ende-mit-Ende-Ligation und demzufolge einer Zirkularisierung des Substrates. Im Anschluss an die Reaktion erfolgte die Entnahme von Proben nach verschiedenen Zeiträumen, bevor die Reaktion durch 5-minütiges Erwärmen bei 95°C beendet wurde.
Es fanden folgende Reaktionen (10 μl) statt:

MOPS 50 mM (pH 7,0)

ATP 1 mM

MgCl₂ 10 mM

BSA 25 μg/ml

DTT 1 mM

³²P-5'-markiertes RNA-Oligo 10 μM

RM378-RNA-Ligase Konzentration: 0,45 μM
Die Reaktionen mit der T4-RNA-Ligase (New England Biolabs; Redford, MA, USA) wurden entsprechend den Anleitungen des Herstellers mit dem mitgelieferten Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 1 mM ATP und 10 mM DTT) bei 37°C mit der gleichen ³²P-5'-markierten rA20-Oligomenge und Proteinkonzentration (2 mg/ml nach Messung anhand des Bradford-Assays, nachdem 3 μl der T4-RNA-Ligase auf einem 10%igen PAGE-Gel aufgetrennt wurden, um eine Hauptbande bei etwa 50 kDa zu beobachten) durchgeführt. Nach dem Erhitzen wurden 30 μl SAP-Cocktail (5 E) zugegeben und das Gemisch 3 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 10 μl punktförmig auf DE81-Filter aufgetragen, zweimal in 500 mM Phosphatpuffer (pH 7) gewaschen und getrocknet. Die Filter wurden in Röhrchen zur Flüssigszintillationszählung überführt, es wurden 5 ml OptiGold-Cocktail zugegeben, und die Radioaktivität der Filter wurde wie oben beschrieben ermittelt.
Die in 9 gezeigten Ergebnisse, für die Ribonukleotid (RNA)-Substrate verwendet wurden, zeigen, dass die RM378-RNA- und die T4-RNA-Ligase in dem jeweiligen Assay ähnliche Aktivität aufweisen, wobei in 1 Stunde etwa 30–40% der Gesamt-RNA ligiert wurden. Die T4-RNA-Ligase macht einen aktiveren Eindruck, aber die RM378-RNA-Ligase kann ihre Ligation erhöhen, wenn die Proteinkonzentration erhöht wird. Die unspezifischere Aktivität könnte ein Ergebnis der Thermoaktivität des RM378-RNA-Ligaseenzyms sein.
Aktivitätsmessungen mit einem Desoxyribonukleotid (DNA)-Substrat
Aus einem Reaktionsgemisch wurden Proben nach verschiedenen Zeiträumen entnommen, und die Reaktion durch 5-minütiges Erwärmen bei 95°C beendet.
Das Reaktionsgemisch (10 μl) wurde folgenderweise hergestellt:

MOPS 50 mM (pH 7,0)

ATP 1 mM

MgCl₂ 10 mM

BSA 25 μg/ml

DTT 1 mM

³²P-5'-markiertes dA20-Oligo 10 μM

RM378-RNA-Ligase Konzentration: 1,0 μM

H₂O bis zu einem Volumen von 10 μl
Die RM378-RNA-Ligase wurde bei 37 und 60°C getestet. Die T4-Reaktionen erfolgten nach den Anleitungen des Herstellers, wobei der mitgelieferte Puffer bei 20°C und bei 37°C mit derselben ³²P-5'-markierten dA20-Oligomenge und Proteinkonzentration verwendet wurde. Die Verarbeitung der Proben erfolgte wie im rA20-Aktivitätsassay beschrieben. Wie in 10 gezeigt, zeigen die Ergebnisse mit Desoxyribonukleotid (DNA)-Substraten, dass die RM378-RNA-Ligase bei DNA aktiver ist als die T4-RNA-Ligase. Es wurde berichtet, dass einige Chemikalien die Aktivität der T4-RNA-Ligase bei DNA erhöhen, dazu gehören 10–25% PEG6000 und Hexamincobaltchlorid.

Um aufzuzeigen, dass die RM378-RNA-Ligase größere ssDNA-Moleküle ligieren kann, wurde eine Ligation eines (5'cggcgaattctttatgggtccggaaaccctgtgcggtgctgaactggttgatgctctgcaattcgtttgcggtgatcgtggtttctac ttcaa-3)', (SEQ ID Nr: 6) unter folgenden Reaktionsbedingungen durchgeführt:

RM378-RNA-Ligase	2,0 μM (1 μg)
	5 × MOPS-Puffer 2 μl (50 mM MOPS, pH 7, 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 1 mM ATP und 25 μg/ml BSA)
³²2-5'-markiertes ssDNA-Oligo	10 μM
PEG6000	0–30 Gew./Vol.-%
H₂O bis zu einem Volumen von 10 μl

Die Reaktion wurde 2,5 Stunden lang bei 60°C inkubiert und wie oben beschrieben einem Phosphataseresistenzassay unterzogen. Das Gleiche erfolgte für die T4-RNA-Ligase (gleiche Enzymmenge) bei 22°C mit 0 und 25% PEG 6000. Wie in 11 zu sehen ist, ist die RM378-RNA-Ligase mit der ssDNA hinreichend gut aktiv, und PEG6000 hilft bei der Ligation, wie es für die T4-RNA-Ligase bekannt ist, aber die Aktivität beträgt noch immer mehr als 50% der Gesamt-ssDNA ohne PEG6000. Die Aktivität der T4-DNA-Ligation ist niedrig und liegt auch mit PEG6000 nur bei etwa 15%. Es wurde berichtet, dass die Aktivität der T4-RNA-Ligase höher ist, wenn dem DNA-Ligationsgemisch Hexamincobaltchlorid zugegeben wird.

Um aufzuzeigen, dass die RM378-RNA-Ligase zwei DNA-Moleküle miteinander ligieren kann, wurde ein ³²P-5'-dA10dd (Didesoxy-dA ohne C3-OH-Gruppe)- oder ein ³²P-5'-dA10-Aminomodifikator (C3-NH₃+)-Oligo (das keine Selbstligation durchführen kann) mit und ohne PEG6000 wie beschrieben mit dA10 ligiert:

RM378-RNA-Ligase	3,3 μM (1,45 μg)
5 × MOPS-Puffer	2 μl (50 mM MOPS, pH 7, 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 1 mM ATP und 25 μg/ml BSA)
³²P-5'-markiertes ssDNA-Oligo	10 μM (Donor)
5'-entphosphoryliertes Oligo	10 μM (Akzeptor, RNA oder DNA)
PEG6000	0 oder 25 Gew./Vol.-%
H₂O bis zu einem Volumen von 10 μl

Die Reaktion wurde 1 Stunde lang bei 64°C inkubiert und wie oben beschrieben einem Phosphataseresistenzassay unterzogen. Die gleiche Reaktion wurde für die T4-RNA-Ligase (gleiche Proteinmenge) bei 22°C mit 25% PEG zubereitet. Wie in 12 zu sehen ist, ist die RM378-RNA-Ligase mit der ssDNA hinreichend gut aktiv, und PEG6000 hilft bei der Ligation, wie es für die T4-RNA-Ligase bekannt ist. Die T4-DNA-Ligationsaktivität ist bei der Ligation mit einem DNA-Akzeptor niedrig, aber höher bei Ligation mit einem RNA-Akzeptor. Die RM378-RNA-Ligase zeigt keine Unterscheidung dieser Art, was zu einer sehr ähnlichen Ligation mit dem RNA- und dem DNA-Akzeptor führt. Es wurde berichtet, dass die Aktivität der T4-RNA-Ligase höher ist, wenn dem DNA-Ligationsgemisch Hexamincobaltchlorid zugegeben wird.
Beispiel 6: DNA-Adenylierung unter Verwendung modifizierter Nukleotide
Die RM378-RNA-Ligase wurde mit modifizierten Nukleotiden verwendet, um ihre Eignung bei der Modifikation von Nukleinsäuren, wie beispielsweise der Markierung, zu ermitteln. ATP wurde durch 3'NH₂-3'dATP ersetzt. Die Reaktion fand in MOPS-Puffer unter Verwendung von 2,0 μM RM378-RNA-Ligase und 10 μM rA20- bzw. dC14-ddC-Vorlage in Reaktionsvolumen von 10 ml statt, wurde 8 Stunden lang bei 60°C inkubiert und anschließend auf Eis gestellt. Die Proben wurden mit ZipTip (Millipore, Redford, MA, USA) entsalzt und in 50% Acidonitril resuspendiert. Die Proben wurden auf einen AnchorChip^TM (Bruker Daltonics) mit einem 400-μm-Anker punktförmig aufgetragen. Als Matrix wurden 7 mg/ml 3-Hydroxypicolinsäure (3-HPA) und 0,7 mg/ml Ammoniumcitrat (dibasisch) verwendet. Es wurden die Massenspektren aufgezeichnet und mit einem Bruker Reflex III (Bruker Daltonics) im Linearmodus analysiert.
Die RM378-RNA-Ligase kann für die Adenylierung einer Nukleinsäure modifizierte Nukleotide anstelle von ATP verwenden (Ergebnisse der Massenspektren nicht gezeigt). DNA ist als Substrat im Vergleich zu RNA weniger effizient, aber die Adenylierung von DNA ist dennoch deutlich feststellbar (es ist zu beachten, dass dieses C15-Substrat an seinem 3'-Ende ein Didesoxynukleotid aufweist, dessen mögliche Wechselwirkung mit der Adenylierungsreaktion nicht bekannt ist).
Es wurde auch das Massenspektrum nach der enzymkatalyiserten Adenylierung des Substrates 5'P-dC14ddC (DNA) unter Verwendung von 3'NH₂-3'-dATP erstellt (Ergebnisse nicht gezeigt).
Beispiel 7: DNA-Ligation
Die DNA-Ligation erfolgte für MALDI-TOF, wie in Beispiel 5 beschrieben, wobei 2,0 μM RM378-RNA-Ligase und 25 mM 5'P-dC15 und 5'P-dC5-Oligodesoxyribonukleotide als Substrate verwendet wurden. Die Reaktion fand bei 60°C 8 Stunden lang. Nach der Inkubation wurde das Gemisch entsalzt und wie in Beispiel 6 beschrieben analysiert.
Die Ergebnisse zeigen, dass die RM378-RNA-Ligase für die Ligation einzelsträngiger DNA verwendet werden kann (Daten nicht gezeigt). Die Massenspektren deuten darauf hin, dass die Oligos auf dreierlei Weise ligiert sind: i) 5'P-dC5-dC15; ii) 5'P-dC5-dC5-dC15; und iii) 5'P-dC15-dC15. Es wird auch gezeigt, dass die Ligase mehrere Ligationen durchführen kann, d. h. das Produkt einer Ligationsreaktion kann als Substrat für eine anschließende Reaktion verwendet werden. Die Ligasereaktion kann auch zur Zirkularisierung eines der Substrate führen (eher 5'P-dC15 als 5'P-dC5). Obgleich aus den Massenspektren nicht ersichtlich, kann dieses Substrat mit den linearen Ligationen konkurrieren.
Beispiel 8: Genauffindung (Gen-Retrieval) mit einem Primer mithilfe der T4- und der RM378-RNA-Ligase
Das Ziel dieser Studie war es, die RM378-RNA-Ligase in Bezug auf die zufällige Genauffindung (Random Gen-Retrieval) mit dem Ein-Primer-Verfahren, wie im Schema von 1 beschrieben, zu analysieren und sie mit der T4-RNA-Ligase zu vergleichen. Dieses Verfahren beruht auf dem Prinzip der Verwendung einer RNA-Ligase zur Ligierung eines kurzen Oligonukleotids mit langen einzelsträngigen PCR-Produkten, die mithilfe der Ein-Primer-PCR erhalten wurden.
Sammlung von Umweltproben und DNA-Extraktion
Aus einem Becken einer alkalischen heißen Quelle (pH 8,5) mit 80°C wurde eine Umweltprobe (mikrobielle Biomasse und Wasserprobe) entnommen. Zur Extraktion der Mikroorganismen aus Sediment und Biomasse wurden die Biomasse und das Quellwasser vor der DNA-Isolation gründlich vermischt. Genomische DNA aus der Biomasse der heißen Quelle wurde extrahiert, wie von Marteinsson, et al., Appl. Environ. Microbiol., 827–833 (2001 b) beschrieben.
Konstruktion eines degenerierten Primers
Es wurde ein zufallsdegenerierter Primer (Degeneration von 32) konstruiert. Der Primer war an der 3'-Kernregion der Länge von 11 bp degeneriert, aber nicht degeneriert an der 5'-Region (Konsensus-Clampregion) mit 29 bp. Bei dem Primer handelte es sich um Am508 (5'-GATATTTAATATGT1TAGCTGCATCAATTckraanccrtc-3' (SEQ ID Nr: 7). Die Kleinbuchstaben entsprechen der Kernregion und die Großbuchstaben der Konsensus-Clampregion.
Lineare PCR mit einem einzelnen degenerierten Randomprimer
Die DNA aus der Umweltprobe wurde als Vorlage für den Primer Am508 verwendet. Der Primer war am 5'-Ende biotinmarkiert (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland). Die PCR wurde in einem Reaktionsgemisch von 50 μl, das 1–100 ng genomische DNA (verwendete Verdünnungen), 0,2 μM Am508, 200 μM je dNTP in 1 × DyNAzyme-DNA-Polymerasepuffer und 2,0 E DyNAzyme-DNA-Polymerase (Finnzymes) enthielt, in einem Thermal Cycler PTC-0225 von MJ Research durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde zunächst bei 95°C für 5 Min. denaturiert, gefolgt von 40 Zyklen aus Denaturierung bei 95°C (50 Sekunden), Anheften (Annealing) bei zwei verschiedenen Temperaturen (44°C und 50°C) für 50 Sekunden und Verlängerung (Extension) bei 72°C (2 Minuten). Die Proben wurden auf ein 1%iges TAE-Agarosegel geladen, um einen hohen Anteil an Primerbindung („High Priming") zu identifizieren. Die Proben ohne PCR-Produkte aus den Reaktionen verschiedener Anheftungstemperaturen wurden für die Reamplifikation ausgewählt. PCR-Reinigung und Immobilisierung einzelsträngiger PCR-Produkte. Zum Entfernen überschüssiger biotinmarkierter Primer, Nukleotide und Polymerase wurden die PCR-Proben durch QIAquick-PCR-Reinigungszentrifugationssäulen (QIAGEN, Deutschland) geschickt, wobei die Anleitungen des Herstellers befolgt wurden. Vor der Reinigung wurden Proben aus den Reaktionen verschiedener Anheftungstemperaturen gepoolt. Die Proben wurden mit 30 μl H₂O eluiert, und anschließend wurden die biotinmarkierten PCR-Produkte immobilisiert, indem 150 μg streptavidinbeschichtete Magnetkügelchen (Dynal, Oslo, Norwegen) nach den Anleitungen des Herstellers verwendet wurden. Die eingefangenen (gebundenen) biotinmarkierten PCR-Produkte wurden in 5 μl dH₂O resuspendiert. Die immobilisierte einzelsträngige DNA wurde dann verschiedenen Ligationsreaktionen unterzogen, wie unten beschrieben ist. Die Ligation eines Adapters (oli10) an die einzelsträngigen biotinmarkierten PCR-Produkte erfolgte mithilfe T4-RNA-Ligase und der RM378-Ligase.
In Gegenwart von 20 E der T4-RNA-Ligase (New England BioLabs, Beverly, MA, USA), 1 × T4-RNA-Ligationspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT und 1 mM ATP), 10% PEG8000 wurden der gebundenen DNA in einem Endvolumen von 20 μl 50 nM des 5'-phosphorylierten Oligodesoxyribonukleotidadapters oli10 (5'-AAGGGTGCCAACCTCTTCAAGGG-3') (SEQ ID Nr: 8) zugegeben. Das Gemisch wurde 20 Stunden lang bei 22°C inkubiert. Vor der Ligationsreaktion wurde die immobilisierte DNA 1 Minute bei 90°C erhitzt.
In Gegenwart von 0,5 μg RM378-RNA-Ligase (in 50% Glycerol), 1 × MOPS-Ligationspuffer (50 mM MOPS, pH 7,0, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 0,5 μg BSA und 1 mM ATP), 10% PEG8000 wurden der gebundenen DNA in einem Endvolumen von 20 μl 50 nM des 5'-phosphorylierten Oligodesoxyribonukleotidadapters oli10 (5'-AAGGGTGCCAACCTCTTCAAGGG-3') (SEQ ID Nr: 8) zugegeben. Das Gemisch wurde 20 Stunden lang bei 60°C inkubiert. Vor der Ligationsreaktion wurde die immobilisierte DNA 1 Minute bei 90°C erhitzt.
Reamplifikations-PCR der Ligationsreaktion
Die exponenzielle Reamplifikations-PCR erfolgte in einem 50-μl-Reaktionsgemisch, das 2 μl Ligationsgemisch, 1,0 μM unmarkierten Primer Am508, 1,0 μM oli11 (5'-CTrGAAGAGGTTGGCACCCT-3' (SEQ ID Nr: 9), der zu oli10 komplementär ist, 200 μM je dNTP in 1 × DyNAzyme-DNA-Polymerasepuffer und 2,0 E DyNAzyme-DNA-Polymerase (Finnzymes, Espoo, Finnland) enthielt, in einem Thermal Cycler PTC-0225 von MJ Research. Das Reaktionsgemisch wurde zunächst bei 95°C für 5 Min. denaturiert, gefolgt von 30 Zyklen aus Denaturierung bei 95°C (50 Sekunden), Anheften (Annealing) bei 55°C für 50 Sekunden und Verlängerung (Extension) bei 72°C (2 Minuten). Im Anschluss daran erfolgte eine letzte Verlängerung für 7 Minuten bei 72°C, um überhängende A-Enden zu erhalten. Unter den oben angegebenen Bedingungen wurden auch Kontroll-PCR-Reaktionen mit nur Primer Am508 oder nur oli11 durchgeführt.
Analyse, Reinigung und Klonierung des PCR-Produktes
Sieben Mikroliter der PCR-Reamplifikationsprodukte wurden für eine Elektrophorese in einem 1%igen TAE-Agarosegel verwendet, um die Identität der PCR-Produkte zu bestätigen, und die Muster zwischen den Kontroll-PCR-Reaktionen (Primer Am508 oder Primer oli11) und den Haupt-PCR-Reaktionen (Primerpaar oli11 und Am508) zu vergleichen. Vor dem Klonieren wurden zwanzig Mikroliter der PCR-Produkte auf dicke 1%ige TAE-Agaroseelektrophoresegele geladen. Für die Ligasereaktionen mit der T4- und der RM378-RNA-Ligase wurde jeweils dasselbe PCR-Muster erhalten (2). Bei der Kontroll-PCR mit oli11 fand keine Amplifikation statt. Auf Agarosegelen der Kontroll-PCR, bei der nur Primer Am508 verwendet wurde, der eine dicke Bande bei etwa 1500 bp ergab, waren DNA-Amplifikationsprodukte von 0,5–3,0 kb (hauptsächlich als Schmierbanden) sichtbar. Die Haupt-PCR (Primerpaar oli11 und Am508) ergaben Amplifikationsprodukte von 0,2–0,3 kb, wobei vier Banden sichtbar waren. Deren Größe betrug etwa 1,5 kb, 0,5 kb und zwei unter 0,5 kb. Verglichen mit der Kontroll-PCR des Primers Am508 sind drei Extrabanden sichtbar, was nahe legt, dass die oli11-Ligation erfolgreich war. Banden und Schmierbanden der Haupt-PCR (Primerpaar oli11 und Am508) wurden mithilfe von Zentrifugationssäulen, GFX PCR-DNA und dem Gelbanden-Reinigungskit nach Herstelleranleitung (Amersham Biosciences, Hørsholm, Dänemark) gereinigt. Die Proben wurden mit 20 μl H₂O eluiert. Anschließend wurden die gereinigten PCR-Produkte (4 μl) mithilfe des TA-Klonierungsverfahrens (Zhou and Gomes-Sanchez, Curr. Issues Mol. Bio. 2: 1–7(2000)) kloniert. Die Klone wurden über Nacht angezüchtet und ihre Inserts wurden mit M13-Rückwärts- und M13-Vorwärtsprimern amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 15 μl, die 0,8 μl Übernachtkultur, 0,5 μM M13-Rückwärtsprimer, 0,5 μM M13-Vorwärtsprimer, 200 μM je dNTP in 1 × DyNAzyme-DNA-Polymerasebuffer und 0,75 E DyNAzyme-DNA-Polymerase (Finnzymes, Espoo, Finnland) enthielten, in einem Thermal Cycler PTC-0225 von MJ Research durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde zunächst bei 95°C für 5 Min. denaturiert, gefolgt von 30 Zyklen aus Denaturierung bei 95°C (50 Sekunden), Anheften (Annealing) bei 50°C für 50 Sekunden und Verlängerung (Extension) bei 72°C (2 Minuten). Vor dem Sequenzieren wurden die PCR-Produkte mit dem PCR-Produkt-Präsequenzierungskit nach den Herstelleranleitungen (USB) gereinigt. Aus den mit der T4-RNA-Ligase ligierten Proben wurden in insgesamt 79 Klonen Inserts sequenziert, und aus den mit der RM378-RNA-Ligase ligierten Proben wurden insgesamt 85 Klone sequenziert. Die Geninserts wurden mit M13-Rückwärts- und M13-Vorwärtsprimern mit ABI 3700 DNA-Sequenziervorrichtungen unter Verwendung des BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction-Kit nach den Anleitungen des Herstellers (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) sequenziert. Alle Sequenzen wurden in Sequencer 4.0 für Windows (Gene Codes Cooperation, Ann Arbor, MI, USA) analysiert und XBLAST durchsucht (Altschul, et al., 1990; Altschul, et al., 1997). Mit beiden RNA-Ligasen wurden mit dem Ein-Primer-Verfahren mit Primer Am508 verschiedene Proteine in verschiedenen Längen erhalten. Ihre Längen lagen zwischen 150 und 850 bp. Die Sequenzen zeigten die höchste Sequenzidentität mit verschiedenen Proteinen, z. B. Dehydrogenasen, Amylasen, Endoglukanen, Carboxylasen, einer Kinase und einer Oxidase.
Das Hauptziel der Studie war es, die Ligationseffizienz der RM378-RNA-Ligase zu analysieren, d. h. ihre Effizienz bei der Ligation eines kurzen Oligonukleotids mit längeren einzelsträngigen PCR-Produkten verschiedener Länge. Von den 85 mit der RM378-Ligation erhaltenen Sequenzen wiesen 66 Sequenzen das kurze oli10-Oligonukleotid an ihr Ende ligiert auf, was 78% der Sequenzen entspricht. Dies entspricht 2, wo in der Haupt-PCR mit Am508/oli11 drei neue Banden gegenüber der Kontroll-PCR mit Am508 erhalten wurden. Die Ergebnisse für die T4-RNA-Ligase zeigten, dass 47 der 79 Sequenzen (60%) das oli10-Oligonukleotid an ihr Ende ligiert aufwiesen,
Beispiel 9 Gensynthese mithilfe der RM378-RNA-Ligase
[0154] Das Ziel der Studie war es zu bestimmen, ob die RM378-RNA-Ligase für die Gensynthese verwendet werden kann, bei der einzelsträngige Oligos einer Länge von 60–150 Basen nacheinander ligiert werden. Mithilfe dieses Ansatzes für die Gensynthese kann das thermostabile Enzym aufgrund der unerwünschten Ausbildung von Sekundärstrukturen bei niedrigeren Temperaturen, was sich mit der Sequenzlänge erhöht, wichtig sein. Daher ist eine Gensynthese dieser Art sinnvoll. Darüber hinaus kann das Verfahren verwendet werden, um die Codonverwendung zu optimieren, da die bevorzugten Codons eines. Wirts für Aminosäuren die Genexpression drastisch zu verbessern scheinen. Darüber hinaus kann das hierin beschriebene Verfahren verwendet werden, um Transkriptionspromotor- oder Translationsfaktorbindungsstellen zu modifizieren oder Domänen funktioneller Proteine hinzuzufügen oder zu entfernen. Das Gen des humanen insulinähnlichen Wachstumsfaktors (IGFA) wird als Modell für die Gensynthese verwendet.
IGFA-Oligonukleotidsynthese
Das Gen für den humanen insulinähnlichen Wachstumsfaktor (IGFA) (ECBI-Zugangsnummer P01343) wurde synthetisiert. Die Codonverwendung des IGFA-Gens wurde entsprechend der Codonverwendung bei E. coli geändert, und anschließend wurde das Gen aufgeteilt und drei Oligonukleotide entworfen. Die Oligonukleotide am 5'- und 3'-Ende wurde mit Linkern der Länge 13–14 Basen entworfen. Bei den Oligonukleotiden handelte es sich um I1 (5'-cggcgaattctttatgggtccggaaaccctgtgcggtgctgaactggttgatgctctgcaattcgtttgcggtgatcgtggtttctacttcaa-3'), (SEQ ID Nr: 6), I2 (5'-caaaccgaccggttacggttcttcttctcgtcgtgctccgcaaaccggtatcgttgatgaa-3') (SEQ ID Nr: 10) und I3 (5'-tgctgcttccgttcttgcgatctgcgtcgtctggaaatgtactgcgctccgctgaaaccggctaaatctgcttaaggatcccggcg-3') (SEQ ID Nr: 11). Das Oligonukleotid I3 wurde am 3'-Ende biotinmarkiert und am 5'-Ende phosphoryliert. Die Oligonukleotide wurden von Transgenomics, Cruachem Limited (Glasgow, Schottland) hergestellt.
Immobilisierung des biotinmarkierten Oligonukleotids I3 mit Dynabeads-M-280-Streptavidin
Das biotinmarkierte Oligonukleotid I3 (10 pmol) wurde immobilisiert, indem 150 μg streptavidinbeschichtete Magnetkügelchen (Oynal, Oslo, Norwegen) nach den Anleitungen des Herstellers verwendet wurden. Das gebundene biotinmarkierte Oligonukleotid I3 wurde in 5 μl H₂O resuspendiert. Vor der Immobilisierung wurde das Oligonukleotid 1 Minute lang auf 90°C erhitzt. Das immobilisierte Oligonukleotid I3 wurde anschließend verschiedenen Ligationsreaktionen unterzogen, wie unten beschrieben ist.
Ligation zwischen Oligonukleotid I3 und I2 mithilfe der T4-RNA-Ligase oder der RM378-Ligase
Vor der Ligation wurden die immobilisierten Oligonukleotide I3 und I2 1 Minute lang bei 90°C erhitzt. In Gegenwart von 20 E T4-RNA-Ligase (New England BioLabs, Beverly, MA, USA), 1 × T4-RNA-Ligationspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT und 1 mM ATP), 10% PEG8000 wurden dem gebundenen Oligonukleotid I3 (10 pmol) in einem Endvolumen von 20 μl 50 pmol Oligonukleotid I2 zugegeben. Das Gemisch wurde 20 Stunden bei 22°C inkubiert. Das neue Ligationsprodukt wurde als oligoA-T4 bezeichnet.
In Gegenwart von 0,5 μg RM378-RNA-Ligase (in 50% Glycerol) und 1 × MOPS-Ligationspuffer (50 mM MOPS, pH 7,0, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 0,5 μg BSA und 1 mM ATP) wurden dem gebundenen Oligonukleotid I3 (10 pmol) in einem Endvolumen von 20 μl 50 pmol Oligonukleotid I2 zugegeben. Das Gemisch wurde 20 Stunden bei 60°C inkubiert. Das neue Ligationsprodukt wurde als oligoA-RM bezeichnet.
Nach der Ligation und der Ausbildung von OligoA-T4 und OligoA-R wurde der Rest von Oligonukleotid I2, der nicht mit Oligonukleotid I3 ligiert war, entfernt, indem die Lösung zweimal mit 100 μl dH₂O gewaschen wurde. Nach dem Waschen wurden die Proben in 17 μl dH₂O resuspendiert.
Phosphorylierung des 5'-Endes von OligoA (vormals 5'-Ende von Oligonukleotid I2) mithilfe der Polynukleotidkinase.
Um OligoA-T4 und OligoA-RM einer weiteren Ligation zu unterziehen, wurden ihre 5'-Enden in Gegenwart von 10 E Polynukleotidkinase (New England BioLabs, Beverly, MA, USA) und 1 × PNK-Puffer (70 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl₂ und 5 mM Dithiothreitol) in einem Endvolumen von 20 μl phosphoryliert Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Inaktivierung des Enzyms erfolgte durch 20-minütiges Erhitzen bei 65°C.
Im Anschluss an die Phosphorylierung wurden die Lösungen zweimal mit 100 μl dH₂O wie oben beschrieben gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Proben in 5 μl dH₂O resuspendiert.
Ligation zwischen Oligonukleotid I1 und OligoA-T4 mithilfe der T4-RNA-Ligase und Ligation zwischen Oligonukleotid I1 und OligoA-RM mithilfe der RM378-Ligase
Vor dem nächsten Ligationsschritt wurden die Ligationsprodukte OligoA-T4 und OligoA-RM sowie Oligonukleotid I1 (50 pmol) 1 Minute lang bei 90°C erhitzt, um Sekundärstrukturen zu minimieren. Die Ligationsreaktionen wurden wie oben beschrieben durchgeführt, wobei die Ligation zwischen Oligonukleotid I1 und OligoA-T4 mit der T4-RNA-Ligase erfolgte, was das Produkt OligoB-T4 ergab, und die Ligation zwischen Oligonukleotid I1 und OligoA-RM unter Verwendung der RM378-Ligase stattfand, was das Produkt OligoB-RM ergab. Nach der Ligation wurden die Lösungen zweimal mit 100 μl dH₂O wie oben beschrieben gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Proben in 20 μl H₂O resuspendiert.
PCR des synthetisierten IGFA-Gens (OligoB) mit zwei Primern
Verschiedene PCR-Amplifikationen der Ligationslösungen ermöglichten es festzustellen, ob die Ligationen erfolgreich waren. Diese Analyse erfolgte durch drei verschiedene PCR-Reaktionen. Erstens sollte geprüft werden, ob das ganze Gen gebildet worden war, indem Primer verwendet wurden, die zu Oligonukleotid I2 und I3 komplementär sind (Primer IGFA-r und IGFA-f, die eine Bande von etwa 240 bp ergeben sollten). Die anderen beiden PCR-Reaktionen dienten dazu, die Ligationsreaktionen zu überprüfen. Eine der PCR-Ligationskontrollen diente dazu, zu überprüfen, ob die erste Ligation erfolgreich war, indem Primer verwendet wurden, die zu Oligonukleotid I3 und I2 komplementär sind (Bildung von OligoA: Primer IGFA-r und IGFA-f2, die eine Bande von etwa 150 bp ergeben). Die andere PCR-Ligationskontrolle diente dazu, zu überprüfen, ob die zweite Ligation erfolgreich war, indem Primer verwendet wurden, die zu Oligonukleotid I1 und I2 komplementär sind (Bildung von OligoB: Primer IGFA-2r und IGFA-f, die eine Bande von etwa 150 bp ergeben). Die PCR-Reaktionen wurden in einem 50-μl-Reaktionsgemisch, das 2 μl Ligationsgemisch, 1,0 μM Rückwärtsprimer IGFA-r (5'-CCGGGATCCTTAAGCAGATT-3') (SEQ ID Nr: 12): komplementär zu I3) oder IGFA-2r (5'-TCATCAACGATACCGGTTTGC-3') (SEQ ID Nr: 13): komplementär zu I2), 1,0 μM Primer IGFA-f (5'-GGCGAATTCTTTATGGGTCCGGAAAC-3') (SEQ ID Nr: 14: komplementär zu I1) oder 1,0 μM Primer IGFA-2f (5'-ACCGACCGGTTACGGTTCTTC-3') (SEQ ID Nr: 15): komplementär zu I2), 200 μM je dNTP in 1 × DyNAzyme-DNA-Polymerasepuffer und 2,0 E DyNAzyme-DNA-Polymerase (Finnzymes, Espoo, Finnland) enthielt, in einem Thermal Cycler PTC-0225 von MJ Research durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde zunächst bei 95°C für 5 Min. denaturiert, gefolgt von 30 Zyklen aus Denaturierung bei 95°C (50 Sekunden), Anheften (Annealing) bei 50°C für 50 Sekunden und Verlängerung (Extension) bei 72°C (2 Minuten). Anschließend erfolgte bei 72°C eine letzte Verlängerung für 7 Minuten, um überhängende A-Enden zu erhalten.
Analyse, Reinigung und Klonierung der PCR-Produkte
Sieben Mikroliter der PCR-Reamplifikationsprodukte wurden für eine Elektrophorese in einem 1%igen TAE-Agarosegel verwendet, um zu bestätigen, dass die beiden Ligationsreaktionen stattgefunden hatten. Für beide Ligationsreaktionen und die PCR des gesamten Gens wurden sichtbare DNA-Amplifikationsprodukte von etwa 200 b auf den Agarosegelen beobachtet (3). Die Banden wurden kloniert, um die Ligationsreaktionen und die Gensynthese zu bestätigen. Vor dem Klonieren wurden zwanzig Mikroliter der PCR-Produkte auf dickte 1%ige TAE-Agaroseelektrophoresegele geladen. Die Banden wurden mithilfe von Zentrifugationssäulen, GFX PCR-DNA und dem Gelbanden-Reinigungskit nach Herstelleranleitung (Amersham Biosciences, Hørsholm, Dänemark) gereinigt. Die Proben wurden mit 20 μl H₂O eluiert. Anschließend wurden die gereinigten PCR-Produkte (4 μl) mithilfe des TA-Klonierungsverfahrens (Zhou and Gomes-Sanchez, Curr. Issues Mol. Bio. 2: 1–7 (2000)) kloniert.
Die Klone wurden über Nacht angezüchtet und ihre Inserts wurden mit M13-Rückwärts- und M13-Vorwärtsprimern amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 15 μl, die 0,8 μl Übernachtkultur, 0,5 μM M13-Rückwärtsprimer, 0,5 μM M13-Vorwärtsprimer, 200 μM je dNTP in 1 × DyNAzyme-DNA-Polymerasebuffer und 0,75 E DyNAzyme-DNA-Polymerase (Finnzymes, Espoo, Finnland) enthielten, in einem Thermal Cycler PTC-0225 von MJ Research durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde zunächst bei 95°C für 5 Min. denaturiert, gefolgt von 30 Zyklen aus Denaturierung bei 95°C (50 Sekunden), Anheften (Annealing) bei 50°C für 50 Sekunden und Verlängerung (Extension) bei 72°C (2 Minuten). Vor dem Sequenzieren wurden die PCR-Produkte mit dem PCR-Produkt-Präsequenzierungskit nach den Herstelleranleitungen (USB) gereinigt. Die Geninserts wurden mit M13-Rückwärts- und M13-Vorwärtsprimern mit ABI 3700 DNA-Sequenziervorrichtungen unter Verwendung des BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction-Kit nach den Anleitungen des Herstellers (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) sequenziert. Alle Sequenzen wurden in Sequencer 4.0 für Windows (Gene Codes Cooperation, Ann Arbor, MI, USA) analysiert und XBLAST durchsucht (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403–410 (1990); Altschul et al., Biotechniques, 15: 894–904 (1997)).
Das Sequenzierergebnis der ersten Ligationsreaktion (Ligation zwischen I3 und I2) entsprach dem PCR-Ergebnis, das heißt, die RM378-Ligation war erfolgreich, und es wurde eine korrekte OligoA-Sequenz erhalten. Es wurden auch falsche Ligationsprodukte erhalten (siehe unten). Die Sequenzierergebnisse der zweiten Ligationsreaktion (Ligation zwischen I2 und I1) entsprach den PCR-Ergebnissen, das heißt, die Ligation war erfolgreich. Für diese Ligation mit der RM378-RNA-Ligase wurde jedoch keine korrekte Sequenzerhalten, das heißt, Oligonukleotid I1 war korrekt, wurde aber an eine trunkierte Sequenz von I2 ligiert. Dies könnte durch die Tatsache erklärt werden, dass bei der Synthese langer Oligonukleotide verschiedene Formen trunkierter Oligonukleotid ein gängiges Artefakt darstellen. Mit der T4-RNA-Ligase wurden korrekte I1–I2- und I2–I3-Produkte sowie auch trunkierte Produkte gebildet. Das Ergebnis, dass ein PCR-Produkt I1–I2 beobachtet wurde (wenngleich auch im Fall der RM378-RNA-Ligase trunkiert), zeigt, dass sich das Produkt I1–I2–I3 tatsächlich gebildet hat. Dies ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass wenn sich nur I1–I2, aber nicht I1–I2–I3 gebildet hätte, das I1–I2- oder das I2-Oligonukleotid in einem der vielen Waschschritte weggewaschen worden wäre, wäre es nicht mit I3 ligiert worden, und hätte daher nicht beobachtet werden können. Dies bedeutet, dass nur Produkte, die mit I3 ligiert wurden, in der Lösung bleiben, da es sich dabei um das einzige biotinmarkierte Oligonukleotid handelt.
Die Sequenzierung der PCR-Reaktionen des gesamten Gens ergaben sowohl für die T4- als auch für die RM378-RNA-Ligase nur I1–I3-Produkte. Wie jedoch bei der I1–I2-Ligation beobachtet wurde, wurde in keinem Fall für diese Ligation eine korrekte Sequenz erhalten. Etwa 40% der Produkte I1–I3 wiesen eine falsche Sequenz auf, das heißt, Oligonukleotid I1 war normalerweise korrekt, aber mit verschiedenen trunkierten Sequenzen von I3 ligiert. Die Klonierungsergebnisse zeigen, dass I1–I3-Produkte die IGFA-r/IGFA-f-PCR dominieren und wir das Produkt I1–I2–I3 nicht sehen können, obgleich die I1–I2-Ligationen zeigen, dass das I1–I2–I3-Produkt wie oben erwähnt, tatsächlich gebildet wurde.
Wenngleich das Produkt I1–I2–I3 bei der Sequenzierung nicht erhalten wurde, zeigt dieses Experiment, dass die RM378-RNA-Ligase (wie auch die T4-RNA-Ligase) mit den PCR-Reaktionen und den Sequenzierergebnissen für sequenzielle Ligationen einzelsträngiger DNA verwendet werden kann, um lange Oligonukleotide für den Zweck der Gensynthese miteinander zu ligieren. Um das gesamte Gen zu erhalten, können verschiedene PCR-Verfahren verwendet werden, wie beispielsweise das Gene-Splicing-Overlap-Verfahren (SOE-Verfahren) (Lefebvre et al., 1995, Biotechniques 19: 186–8).

IGFA-Gen mit E. coli-Codonverwendung und Linkern (kursiv und fett) am 3'- und am 5'-Ende.

RM-Ligationen

Sequenz für die Ligation von I1 und I2 (trunkierte Form von I2) (SEQ ID Nr: 21):
Sequenz für die Ligation von I2 und I3 (korrekte Ligation) (SEQ ID Nr: 22):
Sequenz für die Ligation I1 und I3 (korrekte Ligation) (SEQ ID Nr: 23):

Beispiel 10: RLM-RACE (RNA-Ligase-vermittelte rasche Amplifizierung von cDNA-Enden)
Dieses Verfahren kann beispielsweise verwendet werden, um 5'-Enden von mRNA-Molekülen zu erhalten, wenn nur ein Teil der Sequenz bekannt ist. In diesem Beispiel wurde ein RACE-Experiment durchgeführt, indem einige Bestandteile des GeneRacer-Core-Kit (Invitrogen Inc.) und zusätzliche Bestandteile verwendet wurden. Die verwendete RNA-Probe enthielt die Kontroll-RNA aus dem GeneRacer-Kit.
Die RNA wurde mit Kalbsdarmphosphatase (CIP) entphosphoryliert, die jede RNA, außer gecappte mRNA, entphosphoryliert. Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt:

Gesamt-RNA 5 μg (Gesamt-RNA aus der HeLa-Zelllinie)

10 × CIP-Puffer 1 μl

RnaseOUT (40 E/ml) 1 μl

CIP (10 E/ml) 1 μl

DEPC-behandeltes Wasser bis 10 μl
Die Lösung wurde gemischt und 1 Stunde bei 50°C inkubiert, anschließend zentrifugiert und auf Eis gestellt. Die RNA wurde mithilfe des RNeasy-Kit (QIAgenInc.) nach Herstelleranleitung gereinigt und in 30 μl DEPC (zur Beseitigung von RNase-Verunreinigungen)-behandeltem Wasser resuspendiert.
Das Entcappen erfolgte mit der Volllängen-mRNA mit Tabaksäurepyrophosphatase (TAP). Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt:

CIP-behandelte RNA 7 μl

10 × TAP-Puffer 1 μl

TAP (0,5 E/ml) 1 μl

RNAseOUT (40 E/ml) 1 μl

Gesamt 10 μl
Die Lösung wurde gemischt und 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die RNA wurde anschließend mit dem RNeasy-Kit (QIAgen Inc.) gereinigt und in 30 μl DEPC-behandeltem Wasser resuspendiert.
Das GeneRacer-RNA-Oligo wurde mithilfe der T4-RNA-Ligase (5 E je Reaktion) und der RM378-RNA-Ligase (5 E je Reaktion) mit der entcappten mRNA ligiert. Während dieses Schritts wurde die RNA-Lösung (7 μl) mit voraliquotiertem, lyophilisiertem GeneRacer-RNA-Oligonukleotid (0,25 mg) und einem zweiten Oligonukleotid (5'-CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA-3') (SEQ ID Nr: 17) gemischt.

Die RNA-Lösung für die Ligation durch die T4-RNA-Ligase wurde 5 Minuten bei 65°C erhitzt, anschließend zentrifugiert und auf Eis gestellt, um Sekundärstrukturen zu minimieren. Mit der RNA-Lösung für die Reaktion mit der RM378-RNA-Ligase wurde dies nicht durchgeführt. Es wurde folgende Reaktionslösung verwendet:

Encappte RNA	6 μl
10 × RNA-Ligase-Puffer	1 μl (MOPS-Puffer für die
	RM378-RNA-Ligase und der dem GeneRacer-Kit beiliegende Puffer für die T4-RNA-Ligase)
ATP (10 mM)	1 μl
RNaseOUT	1 μl (es wurde der RNase-Inhibitor von CHIMERx (50 E) bei 60°C verwendet, da er bei unter 70°C stabil ist)
RNA-Ligase	1 μl
Gesamt	10 μl

Die Reaktion wurde mit der T4-RNA-Ligase 1 Stunde lang bei 37°C und mit der RM378-RNA-Ligase 1 Stunde lang bei 60°C inkubiert. Anschließend wurde die RNA mit dem RNeasy-Kit (QIAgen Inc.) gereinigt und in 30 ml DEPC-behandeltem Wasser resuspendiert.
Die cDNA-Synthese wurde in wenigen Schritten durchgeführt. Zunächst erfolgte ein Anheftungsschritt unter folgenden Bedingungen:

Ligierte RNA 18,4μl

dT20-Oligo (50 μM) 1,6μl
Die Lösung wurde 10 Minuten lang bei 70°C inkubiert und auf Eis gekühlt.
Zweitens erfolgte die Synthese des ersten Stranges in folgender Lösung:

5 × Puffer zur Synthese des ersten Stranges 6 μl

PowerScript RT (Clontech) 1,5 μl

dNTP-Mix (je 10 mM) 3 μl

DTT (100 mM) 3 μl

RNaseOUT (40 E/ml) 1,5 μl

RNA- und dT20-Gemisch 15 μl
Die Lösung wurde 70 Minuten bei 42°C inkubiert und die Reaktion durch 15-minütiges Erhitzen bei 70°C beendet. Die Lösung wurde anschließend zentrifugiert und auf Eis gestellt.
Anschließend wurde 1,5 ml RNase-H-Lösung (2 E/ml, Stratagene Inc.) zugegeben, die Lösung gemischt und 20 Minuten bei 37°C inkubiert und auf Eis gestellt.
Drittens wurde eine Polymerasekettenreaktion (PCR) (unter Verwendung der AmpliTaq Gold^TM DNA-Polymerase (Applied Biosystems), siehe die Herstelleranleitungen für Einzelheiten) mit 0,1–1,0 μl der vorherigen Lösung für eine PCR-Reaktion von 30 μl durchgeführt. Als Primer wurden der GeneRacer 5'-Primer (SEQ: 5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3') (SEQ ID Nr: 18) oder der GeneRacer 5'-Nested-Primer (5'-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3') (SEQ ID Nr: 19) und der GeneRacer 5'-Kontrollprimer B1 (Betaaktin-genspezifischer Primer) (5'-GACCTGGCCGTCAGGCAGCTCG-3') (SEQ ID Nr: 20) verwendet. Die Reaktionslösung bestand aus:

cDNA 1 μl

10 × Gold-Puffer 3 μl

MgCl₂-Lösung 3 μl

AmpliTaq (5 E/ml) 0,3 μl

dNTPs (2 mM) 3 μl

Wasser 19,7 μl

Die PCR erfolgte nach folgendem Programm:

Temperatur	Zeit	Zyklen
94°C	12 Min.	1
94°C	30 s	4
72°C	2 Min.
94°C	30 s	4
70°C	2 Min.
94°C	30 s	30
Gradient	30 s
55–70°C
72°C	2 Min.
4°C	Für die Dauer der Aufbewahrung

Nach der Reaktion wurden 5 μl des PCR-Produktes auf einem 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt.
Ergebnisse:
Es wurde ein PCR-Produkt mit ähnlicher Größe wie erwartet hergestellt (13). Diese Ergebnisse zeigen, dass die RM378-RNA-Ligase in einem RLM-RACE-Verfahren verwendet werden kann.
Beispiel 11. Klonierung, Expression und Reinigung der TS2126-RNA-Ligase
Ein Klon, der das TS2126-Gen enthält, wurde verwendet, um das TS2126-Gen durch herkömmliche PCR-Verfahren zu amplifizieren. Die PCR-Produkte wurden auf einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt und DNA-Fragmente der richtigen Größe ausgeschnitten. Die Fragmente wurden mithilfe von GFX-Säulen (Amersham Biosciences) nach den Anleitungen des Herstellers gereinigt und mit Restriktionsenzymen (BamHI und NdeI) geschnitten. Die Fragmente wurden in den Expressionsvektor pET-23b (Novagen) ligiert, mit denselben Restriktionsenzymen geschnitten, was konzipiert war, um dem C-Terminus des Proteins einen Histidinmarker hinzuzufügen. Der Vektor wurde anschließend in E. coli BL21-(DE3)-RIL (Strategene) transformiert und nach Verifizierung der korrekten Sequenz durch DNA-Sequenzierung ausgewählt. Die Zellen wurden in einem 10-l-Fermenter angezüchtet und die Produktion des Enzyms in der Log-Phase durch IPTG induziert. Die Zellen wurden geerntet und durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen. Nach Entfernung der Zelltrümmer durch Zentrifugation wurde das Enzym mittels Standardchromatographietechniken gereinigt, zunächst durch Affinitätschromatographie (HiTrap Chelating, Amersham Biosciences) und anschließend durch Gelfiltration (Hi Prep 26/10 Sephacryl S200 HR Amersham Biosciences), um die endgültige Proteinprobe zu erhalten. Das Gen wurde außerdem mit einem Vektorsystem für den Thermuswirt (O. H. Fridjonsson, Prokaria Ltd, persönliche Mitteilung) exprimiert, und das entsprechende Protein für den Vergleich mit dem im E. coli exprimierten Protein gereinigt.
Beispiel 12: pH-Optimum der TS2126-RNA-Ligase:

Der Aktivitätsassay für die RNA-Aktivität beruht auf dem Phosphataseresistenzassay, der von Silber et al. (Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 69: 3009–3013 (1972)) entwickelt wurde. Reaktionsbedingungen:

2 μl	5 × Ligasepuffer (250 mM MOPS (pH 4–11), 25 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 50 mM KCl, 125 μg/ml BSA)
0,04 μg	TS2126 RNA-Ligase
2 μl	³²P-5'-rA20-RNA-Substrat (25 μM)
1 μl	ATP (10 mM)
H₂O	bis 10 μl.

Jedes Gemisch wurde 30 Minuten lang bei 60°C inkubiert und die Reaktion anschließend durch 5-minütiges Erhitzen bei 95°C beendet. Anschließend wurde 30 μl SAP-Cocktail zugegeben, der 5 E alkalische Phosphatase von Eismeerkrabben (Shrimp alkaline Phosphatase, SAP) in 1 × SAP-Puffer (20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM MgCl₂) (USB Corp. Cleveland, Ohio, USA) und die Inkubation für 3 Stunden bei 37°C fortgesetzt. Nach dem Inkubationszeitraum wurden 10 μl auf DE81-Filter (Whatman plc. Kent, GB) punktförmig aufgetragen, zweimal mit 500 mM Phosphatpuffer (pH 7) gewaschen und getrocknet. Die Filter wurden in Flüssigszintillationszählerröhrchen überführt, es wurden 5 ml OptiGold-Cocktail zugegeben und die Radioaktivität der Filter in einem Flüssigszintillationszähler (Packard-Tricarb) gemessen. Die Ergebnisse sind in 14 gezeigt.
Beispiel 13: Temperaturoptimum der TS2126 RNA-Ligase:

Zur Untersuchung des Temperaturoptimums der TS2126 RNA-Ligase wurde die Ligationsreaktion für 30 Minuten bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt und die Aktivität anschließend im Phosphatase-Resistenzassay (Silber et al.) bestimmt. Reaktionsbedingungen:

2 μl	5 × Ligasepuffer (250 mM MOPS (pH 7,5), 25 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 50 mM KCl, 125 μg/ml BSA)
0,04 μg	TS2126 RNA-Ligase
2 μl	³²P-5'-rA20-RNA-Substrat (25 μM)
1 μl	ATP (10 mM)
H₂O	bis 10 μl.

Die enzymatische Aktivität des Enzyms als Funktion der Temperatur ist in 15 gezeigt.
Beispiel 14: Thermostabilität der TS2126 RNA-Ligase:
Das Enzym wurde in der Reaktionslösung ohne Substrat 1 Stunde lang bei 50, 60, 70, 80 und 90°C inkubiert, anschließend wurde Substrat zugegeben und 1 Stunde bei 60°C inkubiert und die Proben wie oben für den Phosphatase-Resistenzassay beschrieben verarbeitet. Die Ergebnisse sind in 16 gezeigt.
Beispiel 15: Effekt von Kationen auf die Aktivität der TS2126 RNA-Ligase.

Die Effekte der Variierung der Konzentration divalenter Kationen Mn²⁺ oder Mg²⁺ wurde anhand verschiedener Konzentrationen der jeweiligen Kationen im Reaktionspuffer untersucht und die Ligationsreaktion wie beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 17 gezeigt. Reaktionsbedingungen:

2 μl	5 × Ligasepuffer (250 mM MOPS (pH 7,5), 5 mM DTT, 50 mM KCl, 125 μg/ml BSA)
0,04 μg	TS2126 RNA-Ligase
2 μl	³²P-5'-rA20-RNA-Substrat (25 μM)
1 μl	ATP (10 mM)
MgCl₂ oder MnCl₂	Endkonzentration; 0–10 mM
H₂O	bis 10 μl.

Beispiel 16: Effekte der ATP-Konzentration auf die Aktivität der TS2126-RITA-Ligase.

Der Effekt der ATP-Konzentration wurde untersucht, indem die Aktivität der TS2126-RNA-Ligase mit verschiedenen Mengen an ATP bestimmt wurde. Die Ergebnisse sind in 18 gezeigt. Wir empfehlen, bei RNA-Ligationen eine ATP-Konzentration von 0,1–1 mM und bei Ligationen einzelsträngiger DNA eine ATP-Konzentration von 0,02–0,2 mM zu verwenden. Reaktionsbedingungen:

2 μl	5 × Ligasepuffer (250 mM MOPS (pH 7,5), 25 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 50 mM KCl, 125 μg/ml BSA)
0,04 μg	TS2126 RNA-Ligase
2 μl	³²P-5'-rA20-RNA-Substrat (25 μM)
0,1–10 mM	ATP (Endkonzentration)
H₂O	bis 10 μl.

Beispiel 17: Spezifische Aktivität der TS2126 RNA-Ligase:

Es wurde die spezifische Aktivität der TS2126-RNA-Ligase und der T4-RNA-Ligase verglichen. Reaktionsbedingungen:

2 μl	5 × Ligasepuffer (250 mM MOPS (pH 7,5), 25 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 50 mM KCl, 125 μg/ml BSA)
0,01 μg	TS2126 RNA-Ligase
2 μl	³²P-5'-rA20-RNA-Substrat (25 μM)
0,1–10 mM	ATP (Endkonzentration)
H₂O	bis 10 μl.

Die Proben wurden für 0, 2,5, 5, 15, 30, 60 und 120 Minuten bei 60°C inkubiert, bevor die Aktivität bestimmt wurde.
Die gleiche Vorgehensweise erfolgte mit der T4-RNA-Ligase von NEB (New England Biolabs) wie vom Hersteller beschrieben, wobei die gleiche Menge an Protein (0,1 μg) verwendet und für die gleichen Zeiträume bei 37°C inkubiert wurde. Die Ergebnisse sind in 19 gezeigt.
Beispiel 18: Effekte der Proteinkonzentration auf die Aktivität der TS2126 RNA-Ligase.

Es wurde der RNA-Ligase-Standardassay verwendet, um den Effekt der Proteinkonzentration auf die Ligation des RNA-Substrates zu überwachen. Reaktionsbedingungen:

2 μl	5 × Ligasepuffer (250 mM MOPS (pH 7,5), 25 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 50 mM KCl, 125 μg/ml BSA)
0,001–0,4 μg	TS2126 RNA-Ligase
2 μl	³²P-5'-rA20-RNA-Substrat (25 μM)
1 μl	ATP (10 mM)
H₂O	bis 10 μl.

Vor der Bestimmung der Aktivität erfolgte eine Inkubation für 30 Minuten bei 60°C. Die Ergebnisse sind in 20 gezeigt.
Beispiel 19: Die TS2126-RNA-Ligase bei der RLM-RACE-Anwendung.
RLM-RACE (RNA-Ligase vermittelte rasche Amplifikation von cDNA-Enden) ist eine der wichtigsten Anwendungen der RNA-Ligase in der Molekularbiologie. Sie wird verwendet, um 5'-Enden von mRNA-Molekülen zu erhalten, wenn nur ein Teil der Sequenz bekannt ist. Dieses Experiment wurde unter Verwendung einiger Bestandteile des GeneRacer-Core-Kit (Invitrogen Inc.) und zusätzlicher Komponenten durchgeführt.
Das Substrat für dieses Experiment war 100 ng mRNA aus menschlichem Hoden (Ambion Inc.).
Schritt 1. Entphosphorylierung mit Kalbsdarmphosphatase (CIP), die jede RNA entphosphoryliert, ausgenommen gecappte mRNA:
Reaktionsbedingungen:

Gesamt-RNA 100 ng mRNA

10 × CIP-Puffer 1 μl

RNaseOUT (40 E/μl) 1 μl

CIP (10 E/μl) 1 μl

DEPC-behandeltes Wasser bis zu 10 μl
Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde lang bei 50°C inkubiert und anschließend zentrifugiert und auf Eis gestellt. Die mRNA wurde mittels Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolausfällung gereinigt, bevor sie in 10 μl Wasser resuspendiert wurde.
Schritt 2: Entcappen der Volllängen-mRNA mithilfe der Tabaksäurepyrophosphatase (TAP):
Reaktionsbedingungen:

CIP-behandelte RNA 7 μl

10 × TAP-Puffer 1 μl

TAP (0,5 E/μl) 1 μl

RNaseOUT (40 E/μl) 1 μl

Gesamt 10 μl
Es wurde gemischt und 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die RNA wurde durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolausfällung gereinigt, bevor sie in 20 μl Wasser resuspendiert wurde.
Schritt 3: Ligation des GeneRacer-RNA-Oligos mit der entcappten mRNA mithilfe der TS2126-RNA-Ligase:

Die Ligation erfolgte sowohl mit der T4-RNA-Ligase (5 E je Reaktion) als auch mit der TS2126-RNA-Ligase (5 E je Reaktion):
Die RNA (7 μl) wurde mit voraliquotiertem lyophilisiertem GeneRacer-RNA-Oligo (0,25 μmg) (SEQ: 5'-CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA-3') sorgfältig gemischt. Die mRNA für die T4-RNA-Ligaseligation wurde 5 Minuten bei 65°C erhitzt und anschließend abzentrifugiert und auf Eis gestellt, um Sekundärstrukturen zu minimieren. Mit der entcappten mRNA für die Reaktion mit der TS2126 RNA-Ligase erfolgte dieser Schritt nicht. Reaktionsbedingungen:

Entcappte RNA	6 μl
10 × RNA-Ligasepuffer	1 μl (MOPS-Puffer für die TS2126-RNA-Ligase und der Puffer aus dem GeneRacer-Kit für die T4-RNA-Ligase)
ALP (10 mM)	1 μl
RNaseOUT	1 μl
RNA-Ligase (5 E/μl)	1 μl
Gesamt	10 μl

Das Reaktionsgemisch wurde bei Verwendung der T4-RNA-Ligase 1 Stunde lang bei 37°C und bei Verwendung der TS2126-RNA-Ligase 1 Stunde lang bei 60°C inkubiert. Die RNA wurde durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolausfällung gereinigt und in 10 μl Wasser resuspendiert. Schritt 4: cDNA-Synthese

Ligierte RNA 18,4 μl

dT20-Oligo 1,6 μl (1 μg)

Gesamt 20 μl

Es folgten eine Inkubation für 10 Minuten bei 70°C und Abkühlen auf Eis.

5 × Puffer zur Synthese des ersten Stranges	6 μl
PowerScript RT (Clontech)	1,5 μl
dNTP-Mix (je 10 μM)	3 μl
DTT (100 mM)	3 μl
RNaseOUT (40 E/μl)	1,5 μl
RNA und dT₂₀-Gemisch	15 μl

Nach Inkubation für 70 Minuten bei 42°C wurde die Reaktion durch 15-minütiges Erhitzen bei 70°C beendet und anschließend zentrifugiert und auf Eis gestellt. Wir haben anschließend 0,1–1,0 μl für die PCR-Reaktion mit 30 μl und den GeneRacer 5'-Primer (SEQ: 5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3') oder den GeneRacer 5'-Nested-Primer (SEQ: 5'-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3') und den GeneRacer 5'-Kontrollprimer B1 (Beta-Aktingen-spezifischer Primer) (SEQ: 5'-GACCTGGCCGTCAGGCAGCTCG-3') verwendet. Das PCR-Protokoll (unter Verwendung von AmpliTaq Gold^® (Applied Biosystems)) war wie folgt (siehe die Anleitungen des Herstellers für Einzelheiten):

cDNA	1 μl
10 × Gold-Puffer	3 μl
MgCl₂-Lösung	3 μl
AmpliTaq (5 E/μl)	0,3 μl
dNTPs (2 mM)	3 μl
Wasser	19,7 μl

PCR-Programm:

Temperatur	Zeit	Zyklen
94°C	12 Min.	1
94°C	30 s	4
72°C	2 Min.
94°C	30 s	4
70°C	2 Min.
94°C	30 s	30
Gradient	30 s
55–70°C
72°C	2 Min.
4°C	Unbegrenzt lang

Nach der PCR wurden 5 μl des PCR-Produktes auf einem 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt. Wie an den Ergebnissen in 21 zu sehen ist, haben wir wie erwartet ein PCR-Produkt ähnlicher Größe erhalten. Wir zogen daher den Schluss, dass wir die TS2126-RNA-Ligase in einem RLM-RACE-Verfahren verwenden können.
Beispiel 20: Die Verwendung der TS2126-RNA-Ligase in einem Protokoll für ein umgekehrtes RACE-Verfahren
Die DNA-Zirkularisierung großer Vorlagen bei der umgekehrten RACE auf cDNA-Ebene erfolgte, indem Beta-Aktin-cDNA aus 500 ng Hoden-mRNA (Ambion Inc.) hergestellt wurde.
Bei der cDNA-Synthese wurde ein phosphorylierter interner Primer 5'P-B1 (5'P-GACCTGGCCGTCAGGCAGCTCG) und das AMV-First-Strand-Synthesis-Kit (Invitrogen Inc) nach den Herstellerempfehlungen verwendet und die RNA mit RNaseH (Ambion Inc.) wie vom Hersteller empfohlen verdaut. Die ca. 800 Basen lange Beta-Aktin-spezifische cDNA wurde anschließend auf einer PCR-Reinigungssäule (Qiagen Inc.) nach den Herstellerempfehlungen gereinigt und in 30 μl Wasser resuspendiert. Bei jeder Ligation wurden 10 μl der Beta-Aktin-cDNA verwendet.
Anschließend wurden die Proben unter Verwendung von 50 E T4-RNA-Ligase und TS2126-RNA-Ligase in Standardpuffer (mit PEG6000 und 1 mM Hexamincobaltchlorid für die T4-RNA-Ligase) und 20 μM ATP in einem Volumen von 20 μl bei 22°C bzw. 60°C 12 Stunden lang ligiert. Die ligierten Proben wurden mithilfe interner inverser Primer (InvA: CTGGACTTCGAGCAAGAGATG und InvB: GCCGTTGTCGACGACGAGC) über die Ligationsgrenze hinaus amplifiziert. Das Reaktionsgemisch wurde wie folgt hergestellt:

Ligierte cDNA 3 μl

10 × Gold-Puffer 3 μl

MgCl₂-Lösung 3 μl

AmpliTaq (5 E/μl) 0,3 μl

dNTPs (2 mM) 3 μl

Wasser 17,7 μl

PCR-Programm:

Temperatur Zeit Zyklen

94°C 12 Min. 1

94°C 30 s 35

55°C 30 Min.

72°C 1 Min.

4°C Unbegrenzt lang
8 μl des PCR-Produktes wurden auf einem 2%igen Agarosegel aufgetrennt. Die Ergebnisse sind in 22 gezeigt.
Beispiel 21: Intramolekulare DNA-Ligationen

RNA-Ligasen zeigen auch Ligationsaktivität mit ssDNA. Zur Messung der Aktivität mit ssDNA wurde das 5'P-d(N₂₂)-Oligonukleotid unter den folgenden Bedingungen ligiert (zirkularisiert). Reaktionsbedingungen:

4 μl	2 × Ligasepuffer (250 mM MOPS (pH 7,5), 25 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 50 mM KCl, 125 μg/ml BSA).
2 μg	TS2126-RNA-Ligase (Endkonzentration: 0,1 mg/ml)
2 μl	ssDNA-Substrat (1,5 oder 50 μM)
1 μl	ATP (1 mM)
H₂O	bis zu 20 μl.

Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden lang bei 60°C inkubiert. Von jeder Probe wurden 10 μl mit 10 E Exonuklease I, gemischt mit Oligreen-Reagens (Molecular Probes) verdaut und mit Oligreen Ex/Em 490–520 nm gemessen. Die verbleibende Probe wurde insgesamt gemessen, indem unligierte Probe (Exo-I-verdaut) zur Subtraktion des Hintergrunds verwendet wurde. Die Proben mit und ohne Ligation wurden auf 4%igen Agarosegelen aufgetrennt. Die Ergebnisse sind in 23 gezeigt.
Die DNA-Zirkularisierungsexperimente ergeben routinemäßig nach 2 Stunden bei 60°C eine Ligation von 50%, wobei 20–100 μM ATP und 0,1 mg/ml TS2126-RNA-Ligase verwendet wurden. Die Zugabe von Hexamincobaltchlorid oder PEG6000 verstärkt die Aktivität nicht wesentlich.
Zum Vergleich wurde auch die T4-RNA-Ligase für die Ligation des gleichen Substrates in einer Konzentration von 0,28 mg/ml (1 E/μl) in 0,02 mM ATP mit 1 mM Hexamincobaltchlorid und 10, 20 und 30% PEG6000 bei 17°C und 22°C verwendet. Die Ergebnisse sind in 24 gezeigt.
Beispiel 22. Ende-mit-Ende-Ligation mit der RM378-RNA-Ligase und der TS2126 RNA-Ligase.
Es wurde eine interne PCR mit Ligationen aus der IGFA-Gensynthese mit den Primern Fwd2 und Rev durchgeführt, wie in Beispiel 9 beschrieben. Die Reaktionen entsprachen dem Standardprotokoll, wie wir es für die IGFA-Gensynthese mit Oligonukleotid I3 und I2 (Beispiel 9) verwendet haben, unter Verwendung von 1 μg TS2126-RNA-Ligase und 3 μg RM378-RNA-Ligase je Reaktion. Die PCR-Produkte wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt. Die in 25 gezeigten Ergebnisse belegen, dass beide RNA-Ligasen in der Lage sind, verschiedene Oligonukleotide Ende-mit-Ende zu ligieren.
SEQUENZLISTE

Claims

Verfahren des Ligierens eines Nukleotids oder Nukleotidanalogs oder einer Nukleinsäure, welche Nukleotide oder Nukleotidanaloga enthalten, mit einem anderen Nukleotid oder Nukleotidanalog oder einer Nukleinsäure, welche Nukleotide oder Nukleotidanaloga enthalten, wobei das Verfahren das Kontaktieren der Nukleotide, Nukleotidanaloga oder Nukleinsäuren mit einer isolierten thermostabilen RNA-Ligase umfasst, wobei die Ligase eine Ligationsreaktion der Nukleotide, Nukleotidanaloga oder Nukleinsäuren katalysiert, wobei die Ligation bei einer Temperatur von mindestens 50°C durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ligation bei einer Temperatur im Bereich von 50°C bis 75°C durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–2, wobei die RNA-Ligase von einem thermophilen Mikroorganismus stammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, wobei es sich bei den Nukleotiden um RNA oder DNA handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–4, wobei die Nukleotidanaloga modifizierte Basen, modifizierte Zucker und/oder modifizierte Phosphatgruppen enthalten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–5, wobei es sich bei den Nukleotiden um einzelsträngige RNA oder DNA handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–6, wobei es sich bei der thermostabilen RNA-Ligase um eine isolierte RNA-Ligase handelt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Folgenden besteht: a) einer RNA-Ligase, die von einem thermophilen Mikroorganismus stammt; b) einem Polypeptid, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr: 2 oder SEQ ID Nr: 4 aufweist; c) einem von einer Nukleinsäure kodiertes Polypeptid, welches die Sequenz von SEQ ID Nr: 1 oder SEQ ID Nr: 3 aufweist; d) einem Polypeptid, das RNA-Ligaseaktivität und eine Sequenzidentität von mindestens 70% zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr: 2 oder SEQ ID Nr: 4 aufweist; und e) einem Fragment oder Derivat von a), b), c) oder d), das RNA-Ligaseaktivität aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–7, wobei der Mikroorganismus aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Bakterien, Bakteriophage und Archaea besteht.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Ausbilden einer Phosphodiesterbindung zwischen einem 3'-Hydroxylnukleinsäureakzeptor und einem 5'-Phosphatnukleinsäuredonor, umfassend: a) Kontaktieren eines 3'-Hydroxylnukleinsäureakzeptors und b) eines 5'-Phosphatnukleinsäuredonors mit einer thermostabilen RNA-Ligase, wobei zwischen den Nukleinsäuren eine Phosphodiesterbindung gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Ligation bei einer Temperatur im Bereich von 50°C bis 75°C durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Synthetisieren eines Oligonukleotidpolymers durch sich wiederholende Zyklen des Kombinierens eines Oligonukleotidprimers und eines blockierten Oligonukleotids, welches umfasst: a) Kombinieren des Oligonukleotidprimers und eines am 3'- oder 5'-Ende blockierten Oligonukleotids in Gegenwart einer thermostabilen RNA-Ligase, wodurch ein verlängerter Primer mit einem blockierten 3'- oder 5'-Ende gebildet wird; b) enzymatisches Entfernen der blockierten Phosphatgruppe am 3'- oder 5'-Ende oder enzymatisches Hinzufügen einer Phosphatgruppe an das 5'-Ende des verlängerten Primers; und c) Wiederholen von a) und b), wobei der verlängerte Primer von b) als Primer für a) verwendet wird, wobei ein Oligonukleotidpolymer gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das gebildete Oligonukleotidpolymer ein Gen oder einen Teil eines Gens umfasst, welches ein Polypeptid kodiert.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Ligation bei einer Temperatur im Bereich von 50°C bis 75°C durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Synthetisieren eines rekombinanten Genproduktes, umfassend: a) Bereitstellen einer Anordnung immobilisierter Oligonukleotide, umfassend vorbestimmte Bereiche auf einer Fläche eines festen Trägers, wobei auf jedem Bereich Kopien eines Oligonukleotids immobilisiert sind; b) Hybridisieren erster einzelsträngiger terminaler Regionen von ersten zu ligierenden Nukleinsäuresträngen an die immobilisierten Oligonukleotide; und c) Ligieren des hybridisierten ersten Endes einer ersten Nukleinsäure und einer zweiten Nukleinsäure mit einer thermostabilen RNA-Ligase;
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Ligation bei einer Temperatur im Bereich von 50°C bis 75°C durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Feststellen von Nukleinsäuren, umfassend: a) Kontaktieren einer ersten Sonde, einer zweiten Sonde, einer Nukleinsäurezielprobe und einer thermostabilen RNA, wobei die erste Sonde und die zweite Sonde derart an die Nukleinsäurezielprobe hybridisieren, dass das 5'-Ende der ersten Sonde und das 3'-Ende der zweiten Sonde benachbart sind und ligiert werden können; und b) Inkubieren der ersten Sonde, der zweiten Sonde, der Zielprobe und der RNA-Ligase unter Bedingungen, welche die Hybridisierung der Sonden an die Zielsequenz fördern und die Ligation der Sonden fördern, wenn die Zielsequenz in der Zielprobe vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Ligation bei einer Temperatur im Bereich von 50°C bis 75°C durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Amplifizieren von Nukleinsäuren, umfassend: a) Kontaktieren einer eine Nukleinsäure enthaltenden Probe, wobei die Probe einen Pool von mRNA mit einem Poly-A-Schwanz umfasst, mit i) einem Oligonukleotid mit einem 5'-Ende und einem 3'-Ende, das eine Oligo-dT-Sequenz am 3'-Ende aufweist, eine von einer RNA-Polymerase erkannte Promotorsequenz am 5'-Ende aufweist und bei dem sich zwischen der Oligo-dT-Sequenz und der Promotorsequenz eine Transkriptionsinitiatoinsregion befindet, wobei das Oligonukleotid am 3'-Ende blockiert ist, um eine Verlängerung zu verhindern, ii) einem Enzym mit reverser Transkriptionsaktivität, das eine doppelsträngige Promotor-Primer-Sequenz ausbildet, iii) mindestens einem Enzym mit RNase-H-Aktivität, iv) einem Enzym mit RNA-Polymeraseaktivität und v) ausreichenden Mengen von dNTPs und rNTPs; b) Halten des resultierenden Reaktionsgemisches für eine ausreichende Zeitdauer unter geeigneten Bedingungen für enzymatische Aktivität, so dass in Abwesenheit von cDNA-Zwischenstufen eine Antisense-RNA gebildet wird; c) Kontaktieren der vielen Kopien von RNA mit i) einer thermostabilen RNA-Ligase, ii) einem doppelsträngigen DNA-Komplex, der eine doppelsträn gige DNA-Promotorsequenz aufweist, wobei jeder Strang ein 5'-Ende und ein 3'-Ende aufweist, die Promotorsequenz von einer RNA-Polymerase erkannt werden kann, wobei ein Strang des Komplexes eine RNA-Strecke aufweist, die an dessen 5'-Ende angebracht ist, iii) einem Enzym mit RNA-Polymeraseaktivität und iv) ausreichenden Mengen von dNTPs und rNTPs; und d) Halten des resultierenden Reaktionsgemisches für eine ausreichende Zeitdauer unter geeigneten Bedingungen, damit die enzymatischen Prozesse stattfinden können.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Ligation bei einer Temperatur im Bereich von 50°C bis 75°C durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Synthetisieren einer Wiederholungsregion eines Oligonukleotids mit einer definierten Sequenz, wobei die Wiederholungsregion ein wiederholtes Nukleotid aufweist, das mehr als einmal in Aufeinanderfolge auftritt, umfassend: a) Ligieren eines Oligonukleotidprimers an ein 3'-phosphatblockiertes wiederholtes Nukleotid, um einen 3'-phosphatblockierten Primer zu bilden; b) Entfernen der 3'-Phosphatblockierungsgruppe von dem 3'-phosphatblockierten Primer unter Verwendung eines 3'-Phosphataseenzyms, wodurch ein entblockter Primer hergestellt wird, ohne dass die 3'-Phosphatblockierungsgruppe von nicht umgesetztem 3'-phosphatblockiertem wiederholtem Nukleotid entfernt wird; und c) Wiederholen von Schritt (a) und (b) unter Verwendung von nicht umgesetztem 3'-phosphatblockiertem wiederholtem Nukleotid von Schritt (b) als 3'-phosphatblockiertes wiederholtes Nukleotid von Schritt (a) und dem entblockten Primerprodukt von Schritt (b) als dem Oligonukleotidprimer von Schritt (a) ohne vorherige Trennung des nicht umgesetzten 3'-phosphatblockierten wiederholten Nukleotids von dem entblockten Primerprodukt, wobei die Zyklen wiederholt werden, um ein Oligonukleotid mit einer definierten Sequenz zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Ligation bei einer Temperatur im Bereich von 50°C bis 75°C durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Einsetzen einer einzelsträngigen RNA-Sequenz in einen Klonierungsvektor, umfassend: Ligieren beider Termini der einzelsträngigen RNA-Sequenz in Gegenwart einer thermostabilen RNA-Ligase mit einem linearen doppelsträngigen Klonierungsvektor, der einzelsträngige Termini aufweist, welche zu beiden Termini der einzelsträngigen RNA-Sequenz komplementär sind, um ein Anheftungsprodukt (Annealing-Produkt). auszubilden, bei dem die komplementären Enden der einzelsträngigen RNA-Sequenz gebildet werden, indem mit einer thermostabilen RNA-Ligase Oligonukleotidlinker an die RNA-Sequenz angebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Ligation bei einer Temperatur im Bereich von 50°C bis 75°C durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Ausbilden einer Bibliothek von DNA-Sequenzen, umfassend: a) Ausbilden einer Bibliothek von RNA-Zielfragmenten durch Kontaktieren vieler Kopien nicht denaturierter RNA-Zielsequenzen mit einer Bibliothek zufälliger Oligonukleotide in Gegenwart eines hydrolytischen Agens unter Bedingungen, bei denen eine Teilgruppe der Bibliothek zufälliger Oligonukleotide an die Ziel-RNA hybridisiert, wobei das hydrolytische Agens anschließend die Ziel-RNA an einer Stelle in der Nähe des 5'-Endes eines jeden hybridisierten zufälligen Oligonukleotids hydrolysiert und wobei die 3'-Enden jedes Fragments die gesamte Sequenz enthalten, an welche ein zufälliges Oligonukleotid in der Teilgruppe hybridisierte; und b) Ausbilden einer Bibliothek von Vorlagen (Templates) zur Primerverlängerung aus der Bibliothek von RNA-Zielfragmenten, und Ausbilden einer Bibliothek von DNA-Sequenzen, die zu den RNA-Zielfragmenten aus der Bibliothek von Vorlagen (Templates) zur Primerverlängerung komplementär sind, indem eine Nukleinsäureprimerkomplementsequenz mit einer thermostabilen RNA-Ligase an das 3'-Ende jedes RNA-Zielfragmentes angebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Ligation bei einer Temperatur im Bereich von 50°C bis 75°C durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Amplifizieren einer 5'-Endregion von Ziel-mRNA, umfassend: a) Entphosphorylieren von mRNA-Molekülen mit einer freien Phosphatgruppe am 5'-Ende; b) Entfernen der 5'-Cap an Volllängen-mRNAs; c) Ligieren von Linkern an das 5'-Ende von entcappten mRNA-Molekülen unter Verwendung einer thermostabilen RNA-Ligase; d) Synthetisieren von cDNA unter Verwendung von reverser Transkriptase; und e) Amplifizieren der cDNA durch PCR.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Ligation bei einer Temperatur im Bereich von 50°C bis 75°C durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Amplifizieren von mRNA, umfassend: a) Synthetisieren von cDNA, wobei der erste Strang der cDNA durch reverse Transkription von Ziel-mRNA unter Verwendung eines 5'-endphosphorylierten Primers für die reverse Transkription synthetisiert wird, der für die Ziel-RNA spezifisch ist, wodurch ein DNA-RNA-Hybrid erzeugt wird; b) Abbau des DNA-RNA-Hybrids durch Behandlung mit mindestens einem Enzym mit RNase-H-Aktivität zur Entfernung von RNA; c) Zirkularisieren der einzelsträngigen cDNA zur Ausbildung von Konkatemeren mit einer thermostabilen RNA-Ligase; und d) Amplifizieren von DNA durch PCR unter Verwendung spezifischer Primer, die zu bekannten Sequenzen komplementär sind.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Ligation bei einer Temperatur im Bereich von 50°C bis 75°C durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Amplifizieren von Nukleinsäuren mit einem einzelnen Primer, umfassend: a) Hybridisieren eines Gemisches von Nukleinsäuren mit einem degenerierten oder nicht degenerierten Primer, der auf eine einzelne Region in einer Zielsequenz abzielt; b) Synthetisieren einzelsträngiger DNA, die zu einer Region der Zielsequenz komplementär ist, wobei die Synthese von dem degenerierten oder nicht degenerierten Primer geprimt und von einer DNA-Polymerase oder einer reversen Transkriptase katalysiert wird, wodurch eine lineare Amplifizierung der Zielsequenz durch wiederholtes Thermozyklieren (Thermal Cycling) durchgeführt wird; c) Ausstatten der einzelsträngigen DNA mit einer zweiten Primerstelle, indem an ihr 3'-Ende ein Oligonukleotid ligiert wird, wobei die Ligation von einer thermostabilen RNA-Ligase katalysiert wird; d) Amplifizieren der einzelsträngigen DNA durch Verwendung eines Primer-Paars, wobei ein erster Primer mindestens einen Teil der degenerierten oder nicht degenerierten Primersequenz aufweist oder wobei einer erster Primer auf eine Region abzielt, die sich stromabwärts (downstream) von der degenerierten oder nicht degenerierten Primersequenz befindet, und der zweite Primer zu der 3'-Primerstelle von Schritt (c) komplementär ist.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei die in Schritt (b) synthetisierte einzelsträngige DNA gereinigt wird.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Ligation bei einer Temperatur im Bereich von 50°C bis 75°C durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Sequenzieren von Oligonukleotiden, umfassend: a) Kontaktieren eines Zieloligonukleotids mit einer thermostabilen RNA-Ligase unter Bedingungen, bei denen die Ligase dem 3'-Ende des Zieloligonukleotids ein Hilfsoligonukleotid hinzufügt; und b) Sequenzieren des Oligonukleotids.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei die Ligation bei einer Temperatur im Bereich von 50°C bis 75°C durchgeführt wird.