CN111334501B - 适于冠状病毒保存和稀释复合缓冲液及其应用 - Google Patents

适于冠状病毒保存和稀释复合缓冲液及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111334501B
CN111334501B CN202010173001.1A CN202010173001A CN111334501B CN 111334501 B CN111334501 B CN 111334501B CN 202010173001 A CN202010173001 A CN 202010173001A CN 111334501 B CN111334501 B CN 111334501B
Authority
CN
China
Prior art keywords
buffer
nucleic acid
low
concentration
buffer solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010173001.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111334501A (zh
Inventor
李志民
王娟
潘伟业
孙雪光
程世月
彭琼芳
陈雪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Annoroad Gene Technology Beijing Co ltd
Beijing Annoroad Medical Laboratory Co ltd
Original Assignee
Annoroad Gene Technology Beijing Co ltd
Beijing Annoroad Medical Laboratory Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Annoroad Gene Technology Beijing Co ltd, Beijing Annoroad Medical Laboratory Co ltd filed Critical Annoroad Gene Technology Beijing Co ltd
Priority to CN202010173001.1A priority Critical patent/CN111334501B/zh
Publication of CN111334501A publication Critical patent/CN111334501A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111334501B publication Critical patent/CN111334501B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种复合缓冲液。根据本发明的实施例，该复合缓冲液包括：1‑5mM两性离子缓冲液、0.05‑0.5mM非离子螯合剂、0.002‑0.03质量/体积％非离子型表面活性剂，pH＝7.0‑8.0。该复合缓冲液适于低浓度核酸的保存，有利于核酸保持良好的稳定性和活性。并且，该复合缓冲液有利于核酸抵抗非低吸附处理耗材，降低核酸之间的交缠，和非特异吸附，尤其适于高通量测序的低浓度核酸样本的保存，能显著降低长期反复冻融对样本活性的影响。

Description

适于冠状病毒保存和稀释复合缓冲液及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及复合缓冲液及其应用，更具体地，涉及复合缓冲液、试剂盒及其用途，尤其适用于病原微生物如冠状病毒的保存和稀释。
背景技术
目前复合缓冲液的储存浓度一般不建议低于10ng/μL，主要是考虑到在中碱性溶液中核酸常带负电，容易吸附到带正电的塑料表面上，如果对于不太平整的塑料表面，比表面积会进一步提高，导致核酸分子滞留在塑料表面的比例提高。低浓度核酸随液体操作次数的增加丢失得越来越多。最终会造成基于PCR类的高灵敏度的核酸检测灵敏度和准确度下降。
高通量测序的低丰度检测，需要对一个目标区域测到较高的深度，基于成本的考虑，通常希望去除非目标区域进行测序，这就会在文库构建的过程中用到区域捕获的技术。液相捕获使用特异性的核酸探针，在特定的盐浓度下，根据探针对特异和非特异区域的融熵温度差异进行特异性的捕获。常用的液相探针杂交的平台和产品，经常会用到浓缩待富集的文库或者模板的操作，浓缩倍数从几倍到几十倍。对于常用的核酸洗脱和储存液，含有盐和金属非离子螯合剂，浓缩后会导致这部分试剂的浓度上升，造成液相捕获特异性和灵敏度的偏差。因此一般的体系建议使用去离子水进行纯化后的洗脱溶液。而去离子水对于核酸的稳定性和溶解度，都是不太有利的，尤其不利于长期储存。以及上面描述的第一种情况，也无法得到很好的解决，导致低丰度的检测稳定性的波动变大。
而对于低浓度的纯的RNA模板，在面临上述问题之外，还另外面临一个问题，就是多种RNA酶不需要二价盐离子的加入就能对RNA进行水解反应，所以提取好比较纯的RNA模板在浓度低的时候对储存的要求非常苛刻，通常需要-70度的保存，避免反复冻融等，也不能保证RNA模板能进行长期的保存。
由此，现有复合缓冲液有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种复合缓冲液，该复合缓冲液适于低浓度核酸的保存，有利于核酸保持良好的稳定性和活性。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种复合缓冲液。根据本发明的实施例，该复合缓冲液包括：1-5mM两性离子缓冲液、0.05-0.5mM非离子螯合剂、0.002-0.03质量/体积％非离子型表面活性剂，pH＝7.0-8.0。
发明人惊奇的发现，该复合缓冲液适于低浓度核酸的保存，有利于核酸保持良好的稳定性和活性。并且，该复合缓冲液有利于核酸抵抗非低吸附处理耗材，降低核酸之间的交缠，和非特异吸附，尤其适于高通量测序的低浓度核酸样本的保存，能显著降低长期反复冻融对样本活性的影响。
另外，根据本发明上述实施例的复合缓冲液还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的实施例，所述两性离子缓冲液为选自Tris缓冲液，MOPS缓冲液、PIPES缓冲液和HEPES缓冲液中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述核酸为DNA，所述两性离子缓冲液为Tris缓冲液，优选地，为Tris-盐酸。
根据本发明的实施例，所述核酸为RNA，所述两性离子缓冲液为选自MOPS缓冲液、PIPES缓冲液和HEPES缓冲液的至少一种，优选地，为MOPS缓冲液或PIPES缓冲液。
根据本发明的实施例，所述两性离子缓冲液的浓度为1-3mM。
根据本发明的实施例，所述非离子螯合剂为选自乙二胺四乙酸(EDTA)盐、柠檬酸盐、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)盐和次氮基三乙酸三钠盐一水合物(NTA)盐中的至少一种，优选地，为乙二胺四乙酸盐。
根据本发明的实施例，所述非离子型表面活性剂为选自吐温-20-80、乙基苯基聚乙二醇(NP-40)、异辛醇聚氧乙烯聚氧丙烯醚(CA-60)和聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)中的至少一种，优选地，为吐温-20-80。
根据本发明的实施例，该复合缓冲液进一步包括：1-50ng/μL协载RNA，优选地，为tRNA，更优选地，为酵母tRNA。
根据本发明的实施例，所述复合缓冲液包括：1-3mM两性离子缓冲液；0.05-0.5mM非离子螯合剂；0.002-0.03质量/体积％非离子型表面活性剂，pH＝7.0-7.5。
根据本发明的实施例，所述复合缓冲液包括：1-4mM两性离子缓冲液；0.05-0.3mM非离子螯合剂；0.002-0.02质量/体积％非离子型表面活性剂，pH＝7.0-7.8。
根据本发明的实施例，所述复合缓冲液包括：1-30ng/μL tRNA，1-5mM两性离子缓冲液；0.05-0.2mM非离子螯合剂；0.008-0.02质量/体积％非离子型表面活性剂，pH＝7.0-7.5。
根据本发明的实施例，所述复合缓冲液包括：1-50ng/μL tRNA；1-3mM两性离子缓冲液；0.05-0.5mM非离子螯合剂；0.002-0.03质量/体积％非离子型表面活性剂，pH＝7.0-7.5。
根据本发明的实施例，所述复合缓冲液包括：1-3mM Tris-盐酸缓冲液；0.05-0.5mM乙二胺四乙酸(EDTA)；0.002-0.03质量/体积％吐温-20-80，pH＝7.0-7.5。
根据本发明的实施例，所述复合缓冲液包括：1-4mM Tris-盐酸缓冲液；0.05-0.3mM乙二胺四乙酸(EDTA)；0.002-0.02质量/体积％乙基苯基聚乙二醇(NP-40)，pH＝7.0-7.8。
根据本发明的实施例，所述复合缓冲液包括：1-30ng/μL tRNA，1-5mM MOPS缓冲液缓冲液；0.05-0.2mM二胺四乙酸(EDTA)；0.008-0.02质量/体积％异辛醇聚氧乙烯聚氧丙烯醚(CA-60)，pH＝7.0-7.5。
根据本发明的实施例，所述复合缓冲液包括：1-50ng/μL tRNA；1-3mMPIPES缓冲液；0.05-0.5mM乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)；0.002-0.03质量/体积％吐温-20-80，pH＝7.0-7.5。
根据本发明的又一方面，本发明提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前述的复合缓冲液。
根据本发明实施例的试剂盒含有前述的复合缓冲液，该复合缓冲液适于低浓度核酸的保存，有利于核酸保持良好的稳定性和活性。并且，该复合缓冲液有利于核酸抵抗非低吸附处理耗材的吸附，降低核酸之间的交缠，和非特异吸附。由此，该试剂盒尤其适于低浓度核酸样本高通量测序的检测，检测的准确度高，假阳性率低，能显著降低长期反复冻融对样本活性的影响。
根据本发明的再一方面，本发明提供了前述复合缓冲液用于核酸提取和保存的用途。该复合缓冲液适于低浓度核酸的保存，有利于核酸保持良好的稳定性和活性。并且，该复合缓冲液有利于核酸抵抗非低吸附处理耗材的吸附，降低核酸之间的交缠，和非特异吸附。由此，该试剂盒尤其适于低浓度核酸样本高通量测序的检测，检测的准确度高，假阳性率低，能显著降低长期反复冻融对样本活性的影响。
根据本发明的再一方面，本发明提供了前述试剂盒用于核酸检测的用途。由于核酸检测的核酸样本浓度低，通常需要高通量测序进行检测，适于利用前述的试剂盒进行检测，检测的准确度高，假阳性率低，能显著降低长期反复冻融对样本活性的影响。根据本发明的再一方面，本发明提供了前述试剂盒用于病原微生物核酸检测的用途。根据本发明的实施例，该病原微生物优选为冠状病毒。由于冠状病毒的样本浓度低，通常需要高通量测序进行检测，适于利用前述的试剂盒进行检测，检测的准确度高，假阳性率低，能显著降低长期反复冻融对样本活性的影响。
根据本发明实施例的复合缓冲液至少具有下列优点之一：
1、本发明实施例的复合缓冲液有利于低浓度核酸模板的长期储存稳定性，方便低浓度核酸标准品的日常使用；
2、本发明实施例的复合缓冲液有利于抵抗非低吸附处理耗材的吸附，例如Tips之类，对低浓度模板的反复操作时，对结果一致性的影响；
3、本发明实施例的复合缓冲液有利于降低核酸之间的交缠，和非特异吸附，提高液相捕获前文库的纯度；
4、本发明实施例的复合缓冲液有利于RNA模板的长期低温储存稳定性，缓冲外源RNAse的降解，方便RNA模板的反复操作及日常使用。
5、本发明实施例的复合缓冲液可用于保持低至2个拷贝模板的低浓度核酸样品的长期保存。
6、本发明实施例的复合缓冲液有利于保持核酸样本的活性，30～90天内在-20度的反复取出冻融使用不影响效果。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种复合缓冲液。发明人惊奇的发现，该复合缓冲液适于低浓度核酸的保存，有利于核酸保持良好的稳定性和活性。并且，该复合缓冲液有利于核酸抵抗非低吸附处理耗材，降低核酸之间的交缠，和非特异吸附，尤其适于高通量测序核酸样本的保存。
根据本发明的实施例，该复合缓冲液可用于保持低至2个拷贝模板的低浓度核酸样品的长期保存，且复合缓冲液有利于保持核酸样本的活性，30～90天内在-20度的反复取出冻融使用不影响效果。
根据本发明的实施例，该复合缓冲液包括1-5mM两性离子缓冲液，且该复合缓冲液的pH＝7.0-8.0，优选地，pH＝7.0-7.5。发明人利用低浓度的两性离子缓冲液，控制pH在中性，让长链核酸保持在相对螺旋度较高的状态，保持分子刚性和减少相互交缠，同时能减少核酸和塑料表面的接触面积。
根据本发明的实施例，该两性离子缓冲液为选自Tris缓冲液，MOPS缓冲液、PIPES缓冲液和HEPES缓冲液中的至少一种。
根据本发明的实施例，该核酸为DNA，则两性离子缓冲液为Tris缓冲液，优选地，为Tris-盐酸。由此，缓冲液的pH适于DNA保存，DNA的稳定性和活性高，且价格便宜。
根据本发明的实施例，该核酸为RNA，该两性离子缓冲液为选自MOPS缓冲液、PIPES缓冲液和HEPES缓冲液的至少一种，优选地，为MOPS缓冲液或PIPES缓冲液。上述缓冲液对温度不敏感，适于RNA保存，避免RNA降解，尤其适用保存2-2000拷贝冠状病毒RNA。
发明人研究发现，低浓度缓冲液一方面有利于在液相杂交中浓缩模板时不改变最终杂交反应中的缓冲条件，另一方面也有利于核酸长链分子的在低pH缓冲体系下的舒展，不会造成长链间的相互纠缠，对于定量反应的稳定性有帮助。并且，在一些实施例中发现，在低浓度缓冲液中保存的核酸，30～90天内在-20度的反复取出冻融使用不会对RNA模板造成损害。经发明人研究发现，所述两性离子缓冲液的浓度为1-3mM，保存效果更佳。
根据本发明的实施例，该复合缓冲液包括0.05-0.5mM非离子螯合剂，发明人采用低浓度的非离子螯合剂，一方面有利于抑制依赖于二价盐的DNase的活性，另一方面，避免金属螯合剂浓缩后会导致这部分试剂的浓度上升，造成液相捕获特异性和灵敏度的偏差。
根据本发明的实施例，该非离子螯合剂为选自乙二胺四乙酸(EDTA)盐、柠檬酸盐、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)盐和次氮基三乙酸三钠盐一水合物(NTA)盐中的至少一种，优选地，为乙二胺四乙酸盐。由此，对DNase的抑制性好，避免核酸降解，液相捕获特异性和灵敏度的偏差小。
根据本发明的实施例，该复合缓冲液包括0.002-0.03质量/体积％非离子型表面活性剂，发明人利用低浓度的非离子型表面活性剂在溶液中形成胶束，提高中性pH下核酸的水溶性，并对疏水的塑料表面进行饱和吸附，以降低塑料对核酸分子的吸附稳定性。
根据本发明的实施例，该非离子型表面活性剂为选自吐温-20-80、乙基苯基聚乙二醇(NP-40)、异辛醇聚氧乙烯聚氧丙烯醚(CA-60)和聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)中的至少一种，优选地，为吐温-20-80。由此，核酸在复合缓冲液中的溶解性高，且不易吸附于塑料表面，有利于降低检测结果的假阳性率。
根据本发明的实施例，该复合缓冲液进一步包括：1-50ng/μL协载RNA，优选地，为tRNA。由于RNA酶不需要二价盐离子的加入就能对RNA进行水解反应，所以提取好比较纯的RNA模板在浓度低的时候对储存的要求非常苛刻。发明人发现，通过加入RNA，尤其是tRNA，如酵母tRNA，一方面饱和塑料表面对核酸的吸附，还会和低浓度的RNA模板有一定的亲和性，在RNA模板周围形成对核酸酶的保护层，从而可以缓冲RNA酶对目标模板的降解速度，适于RNA保存，尤其是低浓度RNA保存，RNA的浓度可低至2拷贝。
进一步地，发明人对复合缓冲液的配方进行了优化，根据本发明的实施例，所述复合缓冲液包括：1-3mM两性离子缓冲液；0.05-0.5mM非离子螯合剂；0.002-0.03质量/体积％非离子型表面活性剂，pH＝7.0-7.5。根据本发明的实施例，所述复合缓冲液包括：1-4mM两性离子缓冲液；0.05-0.3mM非离子螯合剂；0.002-0.02质量/体积％非离子型表面活性剂，pH＝7.0-7.8。根据本发明的实施例，所述复合缓冲液包括：1-30ng/μL tRNA，1-5mM两性离子缓冲液；0.05-0.2mM非离子螯合剂；0.008-0.02质量/体积％非离子型表面活性剂，pH＝7.0-7.5。根据本发明的实施例，所述复合缓冲液包括：1-50ng/μL tRNA；1-3mM两性离子缓冲液；0.05-0.5mM非离子螯合剂；0.002-0.03质量/体积％非离子型表面活性剂，pH＝7.0-7.5。
更进一步地，根据本发明的实施例，该复合缓冲液可以包括：1-3mM Tris-盐酸缓冲液；0.05-0.5mM乙二胺四乙酸(EDTA)；0.002-0.03质量/体积％吐温-20-80，pH＝7.0-7.5。根据本发明的实施例，该复合缓冲液可以包括：1-4mM Tris-盐酸缓冲液；0.05-0.3mM乙二胺四乙酸(EDTA)；0.002-0.02质量/体积％乙基苯基聚乙二醇(NP-40)，pH＝7.0-7.8。根据本发明的实施例，该复合缓冲液可以包括：1-30ng/μL tRNA，1-5mM MOPS缓冲液缓冲液；0.05-0.2mM二胺四乙酸(EDTA)；0.008-0.02质量/体积％异辛醇聚氧乙烯聚氧丙烯醚(CA-60)，pH＝7.0-7.5。根据本发明的实施例，该复合缓冲液可以包括：1-50ng/μL tRNA；1-3mMPIPES缓冲液；0.05-0.5mM乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)；0.002-0.03质量/体积％吐温-20-80，pH＝7.0-7.5。由此，核酸的稳定性和活性高，检测的准确度高，假阳性率低。
根据本发明的又一方面，本发明提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前述的复合缓冲液。
根据本发明实施例的试剂盒含有前述的复合缓冲液，该复合缓冲液适于低浓度核酸的保存，有利于核酸保持良好的稳定性和活性。并且，该复合缓冲液有利于核酸抵抗非低吸附处理耗材的吸附，降低核酸之间的交缠，和非特异吸附。由此，该试剂盒尤其适于低浓度核酸样本高通量测序的检测，检测的准确度高，假阳性率低。
根据本发明的再一方面，本发明提供了前述复合缓冲液用于核酸提取和保存的用途。该复合缓冲液适于低浓度核酸的保存，有利于核酸保持良好的稳定性和活性。并且，该复合缓冲液有利于核酸抵抗非低吸附处理耗材的吸附，降低核酸之间的交缠，和非特异吸附。由此，该试剂盒尤其适于低浓度核酸样本高通量测序的检测，检测的准确度高，假阳性率低，能显著降低长期反复冻融对样本活性的影响。
根据本发明的再一方面，本发明提供了前述试剂盒用于核酸检测的用途。由于核酸检测的核酸样本浓度低，通常需要高通量测序进行检测，适于利用前述的试剂盒进行检测，检测的准确度高，假阳性率低，能显著降低长期反复冻融对样本活性的影响。
根据本发明的再一方面，本发明提供了前述试剂盒用于病原微生物核酸检测的用途。根据本发明的实施例，该病原微生物优选为冠状病毒。由于冠状病毒的样本浓度低，通常需要高通量测序进行检测，适于利用前述的试剂盒进行检测，检测的准确度高，假阳性率低。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。
实施例1
采用本发明实施例的配方配置用于DNA提取保存的复合缓冲液，该DNA复合缓冲液简称为TET缓冲液，本实施例中配制TET缓冲液，并检测其在低模板量QPCR标准曲线稀释中的作用。
1.1TET缓冲液的配制：
1)所需试剂：
PH8.0 1M Tris-HCL(invitrogen提供)
100％Tween20(sigma提供)
PH8.0 0.5M EDTA(invitrogen提供)
无核酸酶水(Nuclease-free water)(invitrogen提供)
2)TET缓冲液配制过程：
(1)将PH8.0 1M Tris-HCL加入离心管中至终浓度2mM；
(2)100％Tween20加入离心管中至终浓度0.01％；
(3)PH8.0 0.5M EDTA加入离心管中至终浓度0.1mM；
(4)使用Nuclease-free water补至目标体积，震荡混匀，4℃保存。
1.2TET缓冲液在低模板量QPCR标准曲线稀释中的作用
1)实验前准备：
将天根DNA稀释缓冲液、TET缓冲液、无菌无酶水(Solarbio water)、Nuclease-free water(invitrogen)、去离子水(Milli-Q water)、天根原管5个梯度标准品从4℃取出。
2)稀释标准品
第1梯度标准品均为高浓度原管定量标准品，不需稀释。第2-5梯度标准品需要进行以下稀释。准备20个0.2mL PCR管，分别标记1-20，将第1梯度标准品(100pM)进行10倍梯度稀释，共5个梯度，浓度分别为100pM、10pM、1pM、0.1pM、0.01pM。1-4号为天根商业稀释缓冲液稀释，5-8号为TET缓冲液稀释，9-12号为Solarbio water稀释，13-16号为Nuclease-free water(invitrogen)稀释，17-20号为Milli-Q water稀释。具体稀释操作如下：
1、5、9、13、17号管：取10μL第1梯度标准品，加入90μL稀释缓冲液，吹打混匀20次，离心。标记为第2梯度标准品。
2、6、10、14、18号管：取10μL第2梯度标准品，加入90μL稀释缓冲液，吹打混匀20次，离心。标记为第3梯度标准品。
3、7、11、15、19号管：取10μL第3梯度标准品，加入90μL稀释缓冲液，吹打混匀20次，离心。标记为第4梯度标准品。
4、8、12、16、20号管：取10μL第4梯度标准品，加入90μL稀释缓冲液，吹打混匀20次，离心。标记为第5梯度标准品。
3)反应体系配制
将10×引物-探针混合物(Primer-Probe mix)、反应混合物(Master mix)2、50xROX从-20℃取出，冰盒上融化，震荡混匀，简短离心。配制30个反应mix(混合物)，每个混合物(mix)分别向1.5mL管中加入3.5μL 10×Primer-Probe mix，17.5μL Master mix 2，0.7μL 50x ROX，3.3μL RNAse-Free H2O，10μL标准品，共35μL，震荡混匀，简短离心，置于冰盒上。
1.3准备384QPCR板，将上述mix每个mix分装3个孔，每个孔10μL。分装后，使用封口膜将QPCR板密封，简短离心，检查孔底无气泡后，使用12K QPCR仪进行QPCR反应，反应程序为：热盖105℃，95℃3min，(95℃15s，60℃30s)35循环。实验结果：
ΔCT结果
从上述结果可见，TET buffer相对于其他常用的试剂用于稀释和储存低浓度模板具备良好的扩增效率(eff％>95％)和均一性(StdevΔCT越小越好)。
实施例2
本实施例中，检测实施例1的TET缓冲液在低浓度模板建库中提高文库浓度和多种耗材下的均一性，具体如下：
a)TET在低浓度模板建库中提高文库浓度
血浆提取的2ng游离DNA，按照标准NIPT建库流程进行建库，在整个建库过程中核酸纯化洗脱液分别使用TET和Milli-Q水，各2个重复。建好的文库使用dsDNA HSAssay Kit进行定量；其结果显示TET可以提高文库浓度，结果如下表所示：
b)TET在多种耗材下的均一性的作用
血浆提取的2ng游离DNA，按照NIPT建库流程进行建库，分别使用不同的耗材，在整个建库过程中核酸纯化洗脱液分别使用TET和Milli-Q水。建好的文库使用dsDNA HSAssay Kit进行定量；其结果显示在不同的耗材中TET洗脱都可以显著提高文库浓度，并且TET在不同耗材中的均一性较好，结果如下表所示：
分组 文库浓度ng/μL
TET+普通0.2ml PCR管 13.15
TET+普通0.2ml PCR板 19.45
TET+普通1.5ml EP管 10.65
TET+低吸附0.2ml PCR管 10.95
Milli-Q+普通0.2ml PCR管 11
Milli-Q+普通0.2ml PCR板 14.95
Milli-Q+普通1.5ml EP管 6.1
实施例3
本实施例中，检测实施例1的TET缓冲液在杂交建库中的作用，具体如下：
3.1杂交建库流程：
先构建小片段文库，包括片段化、末端修复与加A、加接头、PCR，PCR后纯化等步骤，然后进行杂交，将构建的小片段文库中的目的片段与探针结合，再进行洗杂交，通过探针上的生物素与磁珠上的链霉亲和素互补结合，再通过磁珠吸附于磁力架将所需目的片段钓取，洗脱掉结合不牢固和不结合的非目的片段，只得到结合牢固的目的片段，再进行PCR以及PCR后纯化。
3.2PCR后纯化的过程：
杂交建库流程中，共有两次PCR后纯化的操作，两次纯化操作相同，操作步骤如下：
1)实验前平衡Ann磁珠至少半小时，震混2min，每次使用前再震混1min。
2)取45μL Ann磁珠加入到1.5ml离心管中，将待纯化反应液转移至装有磁珠的离心管中，使用移液器吹打混匀20次，室温静置8min，静置后简短离心。
3)将离心管置于磁力架上，静置5min。
4)弃去上清，加入200μL 80％酒精，吹打6次。
5)弃去上清，加入200μL 80％酒精，吹打6次。
6)弃去上清，打开离心管盖，室温晾干约5min。
7)将离心管移去磁力架，向离心管内加入25μL TET缓冲液，吹吸混匀20次，室温静置5min。
8)将离心管置于磁力架上，待上清彻底澄清后，转移上清至新离心管中。
在杂交建库过程中，杂交前Pre-PCR后纯化使用TET缓冲液进行洗脱，进行后续定量，按照8杂1体系进行AgilentV6芯片杂交。杂交后进行Post-PCR后纯化，使用TET缓冲液洗脱，进行后续定量及上机测序。
3.3实验结果：
1)下机数据产出结果
使用TET缓冲液洗脱结果如下：
使用去离子水洗脱结果如下：
TET缓冲液洗脱数据产出波动CV＝6.3％，去离子水洗脱数据产出波动CV＝21.9％，结果表明，本发明实施例的TET缓冲液有利于均一化测序数据产量，对减少数据量不足和数据溢出有良好的效果。
实施例4
本实施例中，配置一种用于RNA保存的缓冲液，该复合缓冲液简称为TMET缓冲液，该TMET缓冲液的配制以及在高灵敏度RT-PCR中的作用
1)TMET的配制
b)TMET在RT-PCR中的作用
使用配制好的TMET将纯化后的RNA样本进行稀释并置于-20℃保存，分别取保存0天和30天的稀释RNA样本使用TMET按原始标定量5000拷贝稀释至不同的梯度，然后进行RT-qPCR反应(Tagman探针法)，RT-qPCR结果显示RNA在-20℃保存30天模板拷贝数与初始状态基本一致。结果如下表所示：
拷贝数 Ct值(0天) Ct值(30天)
500 29.56 29.66
50 32.83 33.13
5 36.19 36.42
结果表明，本发明实施例的TMET缓冲液适于低浓度核酸样品的长期保存，并能有效保持低浓度核酸样本的活性，且能保证低至1～10拷贝数模板的定量准确性和稳定性。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种复合缓冲液，其特征在于，其组成为：
2mM两性离子缓冲液、0.1mM非离子螯合剂、0.01质量/体积%非离子型表面活性剂，pH=7.5，10ng/μL 协载RNA ；
所述非离子螯合剂为乙二胺四乙酸盐；
所述非离子型表面活性剂为吐温20；
所述两性离子缓冲液为MOPS缓冲液；
所述协载RNA为tRNA；所述tRNA为酵母tRNA。
2.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的复合缓冲液。
3.权利要求1所述复合缓冲液用于核酸稀释和保存的用途。
4.权利要求2所述的试剂盒用于非疾病诊断目的的核酸检测的用途。
5.权利要求2所述的试剂盒用于非疾病诊断目的的病原微生物核酸检测的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述病原微生物为冠状病毒。
CN202010173001.1A 2020-03-13 2020-03-13 适于冠状病毒保存和稀释复合缓冲液及其应用 Active CN111334501B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010173001.1A CN111334501B (zh) 2020-03-13 2020-03-13 适于冠状病毒保存和稀释复合缓冲液及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010173001.1A CN111334501B (zh) 2020-03-13 2020-03-13 适于冠状病毒保存和稀释复合缓冲液及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111334501A CN111334501A (zh) 2020-06-26
CN111334501B true CN111334501B (zh) 2024-03-15

Family

ID=71180992

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010173001.1A Active CN111334501B (zh) 2020-03-13 2020-03-13 适于冠状病毒保存和稀释复合缓冲液及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111334501B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111979227A (zh) * 2020-09-03 2020-11-24 郑州安图生物工程股份有限公司 一种rna保存液及其制备方法和应用
CN113832138A (zh) * 2021-08-25 2021-12-24 苏州新海生物科技股份有限公司 一种生物样本保存系统及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102016066A (zh) * 2008-01-24 2011-04-13 生物风险公司 使用核酸探针检测样品中的相关核苷酸序列
CN106867998A (zh) * 2017-03-15 2017-06-20 郑州安图生物工程股份有限公司 高通量自动化从痰液样本中提取病原体核酸的试剂盒
KR20180059046A (ko) * 2016-11-25 2018-06-04 한국과학기술연구원 글리코겐 및 효모 유래 tRNA 첨가에 의한 혈중 내 miRNA의 추출 효율의 증가 방법

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040058330A1 (en) * 2002-09-20 2004-03-25 Prokaria, Ltd. Methods of use for thermostable RNA ligases
US20050277121A1 (en) * 2004-06-11 2005-12-15 Ambion, Inc. Crude biological derivatives competent for nucleic acid detection
CN106434924B (zh) * 2016-09-29 2019-08-13 北京全式金生物技术有限公司 一种利用qPCR精确定量不同GC含量的二代测序文库的方法及试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102016066A (zh) * 2008-01-24 2011-04-13 生物风险公司 使用核酸探针检测样品中的相关核苷酸序列
KR20180059046A (ko) * 2016-11-25 2018-06-04 한국과학기술연구원 글리코겐 및 효모 유래 tRNA 첨가에 의한 혈중 내 miRNA의 추출 효율의 증가 방법
CN106867998A (zh) * 2017-03-15 2017-06-20 郑州安图生物工程股份有限公司 高通量自动化从痰液样本中提取病原体核酸的试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
不同分离缓冲液对杉木根尖细胞核悬液DNA分辨率的影响;沈捷;徐进;刘光欣;施季森;;分子植物育种(第01期);第190-196页 *
链亲和素-磁性微粒的制备及其应用;张志锋;朱宏莉;唐一通;崔婷;耿婷婷;陈超;崔亚丽;;中国科学(B辑:化学)(第04期);第353-360页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111334501A (zh) 2020-06-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111334501B (zh) 适于冠状病毒保存和稀释复合缓冲液及其应用
US9976136B2 (en) Rapid methods for the extraction of nucleic acids from biological samples
US8012685B2 (en) Detection of analytes and nucleic acids
CA2614069C (en) Nucleic acid isolation using polidocanol and derivatives
US20100086924A1 (en) Use of tde for isolation of nucleic acids
KR100785016B1 (ko) 단일 마이크로 챔버에서 핵산의 농축 및 증폭을 수행하는방법 및 장치
CN103305499B (zh) 一种直接扩增试剂及其应用
JP2575290B2 (ja) ミコバクテリアの試料処理方法
WO2021114713A1 (zh) 细胞裂解液、试剂盒及应用
EP3135769A1 (en) Kits and methods for extracting rna
Clement et al. Isolating PCR-quality DNA from human feces with a soil DNA kit
EP1201753A1 (en) Methods for the analysis of non-proteinaceous components using a protease from a bacillus strain
CA2786644C (en) Improved recovery of nucleic acids from magnetic glass particles
EP2940136A1 (en) Method for isolating poly(A) nucleic acids
CN111118126B (zh) 一种基于高通量测序的mRNA检测方法
Erkenbrack et al. Whole mount in situ hybridization techniques for analysis of the spatial distribution of mRNAs in sea urchin embryos and early larvae
CN106133145B (zh) 从含有甲醛的液基细胞学防腐剂中的样本分离核酸的方法
KR20210132628A (ko) 신규한 가이드 rna 및 이를 이용한 코로나바이러스감염증 2019를 진단하는 방법
US20100204050A1 (en) Target preparation for parallel sequencing of complex genomes
CN112708939A (zh) 构建dna文库的试剂盒及方法
JP2002520073A (ja) ベクターの保管
US20210054444A1 (en) Rapid cellular lysis by reduction/oxidation reaction
CN116355893B (zh) 一种磁珠法核酸提取试剂盒及其应用
CN117417982A (zh) 一种生物样本rna释放保存液及其制备方法
CN117165579A (zh) 一种高纯度粪便病原体dna或rna提取试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant