CN117165579A

CN117165579A - 一种高纯度粪便病原体dna或rna提取试剂盒

Info

Publication number: CN117165579A
Application number: CN202311358617.6A
Authority: CN
Inventors: 李彤; 汪康游; 牛明月; 卜振中; 李红东; 苗保刚; 李明
Original assignee: Xi'an Tianlong Science & Technology Co ltd
Current assignee: Xi'an Tianlong Science & Technology Co ltd
Priority date: 2023-10-19
Filing date: 2023-10-19
Publication date: 2023-12-05

Abstract

本发明属于分子生物学检测技术领域，涉及一种高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒。一种高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒，包括样本前处理液、裂解液和洗涤液1，所述样本前处理液包括醋酸钾、盐酸胍和Tween80。组成成分简单、操作方法简便且提取核酸准确率高，能够快速、简便及高纯度的实现粪便DNA/RNA的提取。

Description

一种高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，尤其是涉及一种高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒。

背景技术

肠道菌群是机体的重要组成部分，包括潜在能源的发酵、短链脂肪酸的产生以及致癌物质的激活或失活，其菌群结构数量和种类的变化与机体的健康状况息息相关，我们有必要通过各种分析方法来研究宿主与体内菌群之间的相互作用关系。

与培养方法相比，微生物临床样本的分子分析可以提供各种优势，包括检测更广泛的目标生物，以及更高的灵敏度和特异性。与血液或其他临床样本相比，粪便中复杂的微生物菌群、可变的稠度以及可变的内源性和膳食成分使病原体DNA/RNA提取特别困难，然而从这种异质复杂的样本中提取高纯度的DNA/RNA，是下游进一步分析的关键(如感染病原体的PCR分析)。针对粪便病原体的检测方法包括免疫学检测法、生物传感器法和核酸检测法三种。免疫学检测法利用抗原-抗体杂交反应，能够快速检测目标物；生物传感器检测法主要依靠光学和电化学分析技术，样品制备简单，能够实现间测系统的微型化；而核酸检测法通过对目标序列进行放大扩增，可以检测目标病原体的特定基因，检测准确度高。

目前，对于粪便病原体提取试剂，存在组分复杂、提取纯度低以及不能适用于不同形状粪便的技术问题。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒。组成成分简单、操作方法简便且提取核酸准确率高，能够快速、简便及高纯度的实现粪便DNA/RNA的提取。

为此，本发明提供了一种高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒，包括样本前处理液、裂解液和洗涤液1，所述样本前处理液包括醋酸钾、盐酸胍和Tween80。

在本发明的一些实施方式中，所述样本前处理液中醋酸钾的浓度为0.5-1.5M。在一些例子中，所述样本前处理液中醋酸钾的浓度可以但不限于为0.5M、1.0M或1.5M。优选地，所述样本前处理液中醋酸钾的浓度为1.0M。

在本发明的一些实施方式中，所述样本前处理液中盐酸胍的浓度为1.0-5.0M，在一些例子中，所述样本前处理液中盐酸胍的浓度可以但不限于为1M、2M、3M、4M或5M。优选地，所述样本前处理液中盐酸胍的浓度为5.0M。

在本发明的一些实施方式中，所述样本前处理液中Tween80的质量百分含量为15％-25％。在一些例子中，所述样本前处理液中Tween80的质量百分含量可以但不限于为15％、20％或25％。

在本发明的一些实施方式中，所述裂解液包括Tris-HCl、EDTA、盐酸胍、十二烷基硫酸钠、NP-40和异丙醇。

在本发明的一些实施方式中，所述裂解液中Tris-HCl的浓度为0.05-0.2M。在一些例子中，所述裂解液中Tris-HCl的浓度可以但不限于为0.05M、0.1M、0.15M或0.2M。

在本发明的一些实施方式中，所述裂解液中EDTA的浓度为0.02-0.6M。在一些例子中，所述裂解液中EDTA的浓度可以但不限于为0.02M、0.1M、0.2M或0.6M。

在本发明的一些实施方式中，所述裂解液中盐酸胍的浓度为4.0M。

在本发明的一些实施方式中，所述裂解液中十二烷基硫酸钠的质量百分含量为1％-4％。在一些例子中，所述裂解液中十二烷基硫酸钠的质量百分含量可以但不限于为1.0％、2％或4.0％。优选地，所述裂解液中十二烷基硫酸钠的质量百分含量为2％。

在本发明的一些实施方式中，所述裂解液中NP-40的质量百分含量为0.5％-2％。在一些例子中，所述裂解液中NP-40的质量百分含量可以但不限于为0.5％、1.0％或2.0％。优选地，所述裂解液中NP-40的质量百分含量为1.0％。

在本发明的一些实施方式中，所述裂解液中异丙醇的体积比为30％-70％。在一些例子中，所述裂解液中异丙醇的体积比可以但不限于为30％、40％、60％或70％。

在本发明的一些实施方式中，所述洗涤液1包括Tris-HCl、EDTA、碳酸氢钠、盐酸胍和异丙醇。

在本发明的一些实施方式中，所述洗涤液1中Tris-HCl的浓度为0.04-0.2mol/L。在一些例子中，所述洗涤液1中Tris-HCl的浓度可以但不限于为0.04M、0.16M或0.2M。

在本发明的一些实施方式中，所述洗涤液1中EDTA的浓度为0.02-0.1M。在一些例子中，所述洗涤液1中EDTA的浓度可以但不限于为0.02M、0.08M或0.1M。

在本发明的一些实施方式中，所述洗涤液1中碳酸氢钠的浓度为0.1-0.4M。在一些例子中，所述洗涤液1中碳酸氢钠的浓度可以但不限于为0.1M、0.2M或0.4M。优选地，所述洗涤液1中碳酸氢钠的浓度为0.2M。

在本发明的一些实施方式中，所述洗涤液1中盐酸胍的浓度为2.0M。

在本发明的一些实施方式中，所述洗涤液1中异丙醇的体积比为30％-60％。在一些例子中，所述洗涤液1中异丙醇的体积比可以但不限于为30％、40％、50％或60％。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括洗涤液2、洗脱液、蛋白酶K溶液和磁珠混合液。

在本发明的一些实施方式中，所述洗涤液2包括体积比为50％-80％的无水乙醇和0.2M的碳酸氢钠。在一些例子中，所述洗涤液2中无水乙醇的体积比可以但不限于为50％、60％、70％或80％。

在本发明的一些实施方式中，所述洗脱液包括10mM的Tris-HCl和0.1mM的EDTA溶液。

在本发明的一些实施方式中，所述蛋白酶K溶液的浓度为15mg/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述蛋白酶K溶液的使用量为10μL。

在本发明的一些实施方式中，所述磁珠混合液的浓度为20mg/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述磁珠混合液中的磁珠表面包括但不限于羧基、氨基或硅羟基基团。优选地，所述磁珠混合液中的磁珠为硅羟基磁珠。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒的使用方法包括：使用天隆GeneRotex96提取仪或其他同等类型的仪器上进行自动化提取，

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒的使用方法，包括以下具体步骤：

S1：样本前处理

称取待测样品100-200mg或100-200μL，加入1mL样本前处理液，在70℃条件下加热5min后涡旋混匀10秒，15000rpm离心1min后获得样本上清液备用；

S2：根据提取样本的数量，在96深孔板的第1、7列中按顺序加入10μL蛋白酶K溶液、200μL前处理后的样本上清液、400μL裂解液；

S3：根据提取样本的数量，在96深孔板的第2、8列中加入500μL的磁珠混合液；添加磁珠混合液前需充分混匀磁珠，如提取的样本数量较多，建议每添加完8个样品孔重悬一次磁珠；

S4：根据提取样本的数量，在96深孔板的第3、9列中加入700μL的洗涤液1；

S5：根据提取样本的数量，在96深孔板的第4、10列中加入700μL的洗涤液2；

S6：根据提取样本的数量，在96深孔板的第6、12列中加入100μL的洗脱液。

利用天隆GeneRotex96自动提取仪，GeneRotex96核酸提取仪按以下程序进行自动化提取(注意：程序运行前需在深孔板第2和第8列放置搅拌套)：

自动化程序结束后，将第6或12列的洗脱孔核酸产物转移至干净的无核酸酶离心管中。

本发明的有益效果：

(1)本发明的提取试剂盒，样本前处理液中醋酸钾与盐酸胍和Tween80复配，提高了粪便样本中的病原体的多糖组分含量较多的样本的破坏力，能够有效地去除样本中的蛋白质、腐植酸、多糖、脂类等杂质，为后续提取步骤提供优质的保障。

(2)本发明的提取试剂盒，裂解液中采用十二烷基硫酸钠、NP-40两种表面活性剂与Tris-HCl、EDTA、盐酸胍和异丙醇复配进行使用，对样本中一些硫酸盐的菌类、腐生菌等有较强破坏力，使得核酸能够更高效的释放，可以远远提高裂解液对样品的裂解能力，尤其对复杂粪便样品作用较明显。

(3)本发明的提取试剂盒，洗涤液1中的碳酸氢纳的碱性作用强于现有技术常用中的醋酸钠，又能兼顾溶液中离子平衡，解决了对粘蛋白的洗涤能力不足以及洗脱效率的问题，且与Tris-HCl、EDTA、盐酸胍和异丙醇复配，会对核酸上携带的杂质洗涤会更彻底。

(4)本发明的提取试剂盒，匹配天隆全自动核酸提取仪平台，裂解效率高，样本经过前处理，再经后续的自动化裂解消化，能够得到浓度更高、纯度更高的DNA/RNA核酸，为下游PCR等检测提供优质的质量保证，保证后续操作的准确性。

附图说明

图1为本发明实施例1核酸提取试剂线性相关性验证图；

图2为本发明实施例2核酸提取试剂线性相关性验证图；

图3为本发明实施例3核酸提取试剂线性相关性验证图；

图4为本发明对比例1核酸提取试剂线性相关性验证图；

图5为本发明对比例2核酸提取试剂线性相关性验证图；

图6为本发明对比例3核酸提取试剂线性相关性验证图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。

本发明的样本为由协议医院提供的人阳性粪便样本。

实施例1

本实施例提供一种高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒，试剂组分如表1所示。

表1高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒组分表

实施例2

本实施例提供一种高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒，试剂组分如表2所示。

表2高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒组分表

实施例3

本实施例提供一种高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒，试剂组分如表3所示。

表3高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒组分表

对比例1

本对比例提供的粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒与实施例1提供的高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒的唯一区别是：前处理液中不包括醋酸钾，其他各组分和浓度与实施例1相同。

对比例2

本对比例提供的粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒与实施例1提供的高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒的唯一区别是：裂解液中不包括NP-40，其他各组分和浓度与实施例1相同。

对比例3

本对比例提供的粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒与实施例1提供的高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒的唯一区别是：洗涤液1中不包括碳酸氢钠，其他各组分和浓度与实施例1相同。

对比例4

本对比例提供的粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒与实施例1提供的高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒的唯一区别是：前处理液中醋酸钾的浓度增加为2.0M，其他各组分和浓度与实施例1相同。

对比例5

本对比例提供的粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒与实施例1提供的高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒的唯一区别是：前处理液中醋酸钾的浓度降低为0.2M，其他各组分和浓度与实施例1相同。

对比例6

本对比例提供的粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒与实施例1提供的高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒的唯一区别是：洗涤液中碳酸氢钠的浓度增加为0.8M，其他各组分和浓度与实施例1相同。

对比例7

本对比例提供的粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒与实施例1提供的高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒的唯一区别是：洗涤液中碳酸氢钠的浓度降低为0.05M，其他各组分和浓度与实施例1相同。

实验例1

使用PBS溶液将从高浓度的人或动物粪便样本经10倍稀释5个梯度，每个浓度样本分别采用实施例1-3提供的高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒和对比例1-3提供的粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒进行提取，每个浓度样本重复提取3次，提取完的病毒核酸使用苏州天隆生物科技有限公司的金黄色葡萄球菌核酸扩增试剂进行扩增检测，具体操作步骤参照试剂盒说明书。检测结果如图1-6所示。

如图1-3结果可知，实施例1-3提供的高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒检测各浓度之间梯度均一性及线性良好，线性相关系数R²≥0.98。

如图4-6结果可知，对比例1-3提供的粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒检测各浓度之间梯度线性良好，线性相关系数R²≥0.98。

实验例2

使用PBS溶液将高浓度的人或动物粪便样本稀释至试剂盒精密度CT＝26和CT＝32，每个浓度样本分别采用实施例1-3提供的高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒和对比例1-3提供的粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒进行提取，每个浓度重复提取20次，提取完的病毒核酸使用苏州天隆生物科技有限公司的金黄色葡萄球菌核酸扩增试剂进行扩增检测，具体操作步骤参照试剂盒说明书。结果如表4-9所示。

表4实施例1试剂盒精密度检测数据表

由表4结果可知，精密度两个浓度水平样本的检测结果CT值的变异系数≤2％，说明本发明实施例1提供的高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒提取样本一致性较好。

表5实施例2试剂盒精密度检测数据表

由表5结果可知，精密度两个浓度水平样本的检测结果CT值的变异系数≤2％，说明本发明实施例2提供的高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒提取样本一致性较好。

表6实施例3试剂盒精密度检测数据表

由表6结果可知，精密度两个浓度水平样本的检测结果CT值的变异系数≤2％，说明本发明实施例3提供的高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒提取样本一致性较好。

综合图1-3和表4-6数据可知，按照本发明组分及表1-3中各组分浓度进行体系配置的高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒，各浓度之间梯度均一性及线性良好，线性相关系数R²≥0.98，各体系精密检测两个浓度水平样本的检测结果CT值的变异系数≤2％，提取样本一致性较好，均符合提取标准要求。

表7对比例1试剂盒精密度检测数据表

由表7结果可知，精密度两个浓度水平样本的检测结果CT值的变异系数>2％，说明对比例1提供的粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒提取样本一致性较差，不符合要求；对比例1验证了本发明试剂盒体系前处理液中醋酸钾组分的必要性，当体系缺失醋酸钾时，精密度检测结果不符合要求。

表8对比例2试剂盒精密度检测数据表

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由表8结果可知，精密度两个浓度水平样本的检测结果CT值的变异系数>2％，说明对比例2提供的粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒提取样本一致性较差，不符合要求；对比例2验证了本发明试剂盒体系裂解液中NP-40组分的必要性，当体系缺失NP-40时，精密度检测结果不符合要求。

表9对比例3试剂盒精密度检测数据表

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由表9结果可知，高精密度样本的检测结果CT值的变异系数CV≤2％，低精密度样本的检测结果CT值的变异系数CV>2％，说明对比例3提供的粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒提取样本一致性较差，不符合要求；对比例3验证了本发明试剂盒体系洗涤液1中碳酸氢钠组分的必要性，当体系缺失碳酸氢钠时，精密度检测结果不符合要求。

实验例3

以实施例1为实验例，以对比例1-3为对照例，使用Nanodrop仪器对实施例1提供的高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒及对比例1-3提供的粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒提取的核酸浓度及纯度进行检测，结果如表10所示。

表10提取核酸浓度及纯度检测结果数据表

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由表10结果可知，对比例1-3提供的粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒提取得到的核酸因为前处理中淀粉、脂肪等杂质未处理彻底，导致260/280值小于1；或者由于洗涤过程不彻底，存在胍盐或其他组分污染导致260/230比值小于1，实施例1提供的高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒提取得到的核酸浓度、纯度(260/280、260/230值高于1.7)均比较高，实现对粪便病原体DNA或RNA进行高浓度和高纯度的提取，其测试结果不仅满足提取标准要求，而且能够满足后续核酸检测实验需要。

此外，将对比例1-3的数据进行比较，对比例2试剂盒提取核酸的浓度和纯度高于对比例1，可从侧面证明前处理液中醋酸钾组分与盐酸胍和Tween80复配及与裂解液中Tris-HCl、EDTA、盐酸胍、十二烷基硫酸钠和异丙醇协同对试剂盒的核酸提取性能的提升作用；对比例3试剂盒提取核酸的浓度和纯度高于对比例2，可从侧面证明裂解液中NP-40与Tris-HCl、EDTA、盐酸胍、十二烷基硫酸钠和异丙醇复配及与洗涤液1的Tris-HCl、EDTA、盐酸胍和异丙醇协同对试剂盒的核酸提取性能的提升作用；对比例3试剂盒提取核酸的浓度和纯度高于对比例1，可从侧面证明前处理液中醋酸钾组分与盐酸胍和Tween80复配及与洗涤液1的Tris-HCl、EDTA、盐酸胍和异丙醇协同对试剂盒的核酸提取性能的提升作用。

实验例4

以实施例1为实验例，以对比例4-7为对照例，使用Nanodrop仪器对实施例1提供的高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒及对比例4-7提供的粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒提取的核酸浓度及纯度进行检测，结果如表11所示。

表11提取核酸浓度及纯度检测结果数据表

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由表11结果可知，在本发明提供的高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒中，不同浓度的醋酸钾对试剂盒提取效果有不同的影响，当醋酸钾含量过低时，前处理液对样本的破坏能力减弱，使得对沉淀样本中多糖组分能力较差，样本中多糖组分较多，进而影响样本的提取浓度，结果见对比例4；当醋酸钾含量过高时，虽然对样本中多糖等杂质的破坏能力增强，但样本中过多小分子盐的存在会影响样本提取纯度，结果见对比例5。因此，本发明样本前处理液中醋酸钾的含量应严格地控制在本发明所要求的范围内，含量过低或过高都会导致核酸提取或纯化的效果变差。

此外，在本发明提供的高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒洗涤过程中，磁珠表面除结合吸附有核酸外，还会有蛋白、脂肪等其他杂质，洗涤液1中加入适量的碳酸氢钠不仅可以中和体系中杂质等酸性物质，使反应液的pH环境更接近于中性或弱碱性，更适合核酸的充分洗涤，反之，过量的碳酸氢钠会使洗涤体系中因引入较多盐组分而导致提取的核酸纯度(260/230)偏低，结果见对比例6。因此，本发明洗涤液1中碳酸氢钠的含量应严格地控制在本发明所要求的范围内，含量过低或过高都会导致核酸提取或纯化的效果变差。

本发明对试剂盒整体体系进行调整，对各组分及组分浓度均进行了探究，因此，本发明提供的高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒中样本前处理液、裂解液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液各组分的含量应严格地控制在本发明所要求的范围内，含量过低或过高都会导致核酸提取或纯化的效果变差。

实验例5

为进一步在实施例1-3中选出性能最优的高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒，使用Nanodrop仪器对实施例1-3提供的高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒提取得到核酸的浓度及纯度进行检测，检测结果如表12所示。

表12提取核酸浓度及纯度检测结果数据表

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由表12结果可知，实施例2-3试剂盒提取的核酸浓度及纯度均低于实施例1试剂盒。另外，由图1-3和表4-6结果可知，实施例2-3的线性相关性、精密度结果与实施例1相差1CT。因此，实施例1提供的高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒中组分及组分浓度为本发明的最优体系，核酸纯度(260/280、260/230值高于1.7)均比较高，其测试结果不仅满足提取标准要求，而且可以更好的满足后续核酸检测实验需要。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims

1.一种高纯度粪便病原体DNA或RNA提取试剂盒，包括样本前处理液、裂解液和洗涤液1，其特征在于，所述样本前处理液包括醋酸钾、盐酸胍和Tween80。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样本前处理液中醋酸钾的浓度为0.5-1.5M；所述样本前处理液中盐酸胍的浓度为1.0-5.0M；所述样本前处理液中Tween80的质量百分含量为15％-25％。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液包括Tris-HCl、EDTA、盐酸胍、十二烷基硫酸钠、NP-40和异丙醇。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液中Tris-HCl的浓度为0.05-0.2M；所述裂解液中EDTA的浓度为0.02-0.6M；所述裂解液中盐酸胍的浓度为4.0M；所述裂解液中十二烷基硫酸钠的质量百分含量为1％-4％；所述裂解液中NP-40的质量百分含量为0.5％-2％；所述裂解液中异丙醇的体积比为30％-70％。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液1包括Tris-HCl、EDTA、碳酸氢钠、盐酸胍和异丙醇。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液1中Tris-HCl的浓度为0.04-0.2M；所述洗涤液1中EDTA的浓度为0.02-0.1M；所述洗涤液1中碳酸氢钠的浓度为0.1-0.4M；所述洗涤液1中盐酸胍的浓度为2.0M；所述洗涤液1中异丙醇的体积比为30％-60％。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括洗涤液2、洗脱液、蛋白酶K溶液和磁珠混合液。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液2包括体积比为50％-80％的无水乙醇和0.2M的碳酸氢钠。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液包括10mM的Tris-HCl和0.1mM的EDTA溶液。

10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶K溶液的浓度为15mg/mL。