CN117587004A

CN117587004A - 真菌dna提取用裂解结合液、试剂盒和提取方法及其应用

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Publication number: CN117587004A
Application number: CN202311773019.5A
Authority: CN
Inventors: 邹永龙; 曲峰; 何宗顺; 张佳斌; 王子珵
Original assignee: Suzhou Cretaceous Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Cretaceous Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-12-21
Filing date: 2023-12-21
Publication date: 2024-02-23

Abstract

本发明涉及真菌DNA提取用裂解结合液、试剂盒和提取方法及其应用。所述裂解结合液包含高碘酸钠、盐酸胍、尿素、氯化锂、Gemini(双子)季铵盐、聚氧乙烯辛烷基苯酚醚、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠、聚乙二醇和异丙醇。所述试剂盒包括用于配制所述裂解结合液的裂解结合试剂。所述方法采用所述裂解结合液或所述试剂盒进行。所述应用为所述裂解结合液或试剂盒在真菌DNA提取中的应用。本发明能够从例如临床样本中快速提取痕量真菌DNA，裂解和结合一步进行，适合自动化高通量操作，无需液氮研磨、离心或珠研磨等繁琐步骤，操作简单快捷，适用样本类型广，核酸提取纯度高，真菌DNA提取效率高。

Description

真菌DNA提取用裂解结合液、试剂盒和提取方法及其应用

技术领域

本发明涉核酸提取试剂领域，尤其涉及真菌DNA提取用裂解结合液、试剂盒和提取方法及其应用。

背景技术

真菌感染是临床常见的疾病之一。对人类有致病性的真菌约有300多种。根据侵犯人体部位的不同，临床上将致病真菌分为浅部真菌和深部真菌。浅部真菌仅侵犯皮肤、毛发和指甲，而深部真菌能侵犯黏膜、深部组织和内脏，甚至引起全身播散性感染。

近年来，随着高效广谱抗生素、免疫抑制剂和抗恶性肿瘤药物的广泛应用，器官移植以及外科其他介入性治疗的深入开展，特别是AIDS的出现，条件致病性真菌引起的系统性真菌病日益增多，新的致病菌不断出现，对免疫力低下的患者尤其是ICU患者的病情带来严重负担。

真菌感染的实验室检查是包括直接镜检法和培养法、病理学方法、血清学方法和分子生物学方法等检查方法。目前，临床常见真菌检测方法主要是通过形态学进行观察，但该方法培养时间长，受人员经验影响比较大，且形态比较接近的真菌难以通过该方法鉴定到种。因此，通过分子生物学方法(核酸检测)进行真菌鉴定显得越来越重要。

然而，真菌细胞壁成分复杂，往往难以得到充分裂解，且真菌中富含多糖、色素、核酸酶等物质，使得真菌DNA的提取更加困难，从而限制了分子鉴定方法的应用。因此，探索临床常见真菌高效、快速的DNA提取方法十分重要。

传统的真菌DNA提取方法步骤繁琐，且耗时较长，不符合真菌分子快速鉴定方法的需求。如中国专利CN102102098B一种改良的酚-氯仿法提取真菌DNA方法，通过液氮研磨与酚-氯仿试剂法结合，其本质是增加了液氮研磨破坏真菌细胞壁的步骤，延长蛋白酶K的消化时间，延长无水乙醇萃取时间并将萃取环境改为-20℃。但是上述步骤的增加且流程的繁琐使其无法真正在临床端进行使用，因为真菌感染的患者无法等待如此漫长的DNA提取过程，且全部人工的操作会带来非常大的误差。又如中国专利CN108676791B提供一种磁珠提取DNA提取试剂盒，认为可以快速地提取多糖真菌DNA，然而该技术方案中首先需要进行液氮进行冷冻研磨，之后进行多次的离心，很难符合临床端的需求。

因此，在临床端需要高效且具有可操作性的真菌DNA的快速提取方法，可以直接使用临床端的样本(如全血、血浆、肺泡灌洗液和痰液等)，无需液氮研磨、无需离心、无需酚氯仿等有毒试剂，能够在30分钟左右就能得到高纯度的DNA样本以用于后续的检测，例如用于qPCR检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用医院临床端样本直接快速提取真菌DNA的试剂和方法，这样的试剂和方法无需离心，无需液氮研磨，不使用有毒试剂，裂解结合一步进行，操作简单、快捷，可以适用于高通量的提取，适用于医院临床样本(如全血、血浆、肺泡灌洗液和痰液等)中痕量真菌DNA提取。

为了实现本发明的上述目的，本发明在第一方面提供了一种用于真菌DNA提取的裂解结合液，所述裂解结合液包含如下组分：高碘酸钠、盐酸胍、作为可选组分的尿素、氯化锂、Gemini(双子)季铵盐、聚氧乙烯辛烷基苯酚醚、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠、聚乙二醇和异丙醇。

本发明在第二方面提供了一种用于真菌DNA提取的试剂盒，所述试剂盒包括用于配制本发明第一方面所述的裂解结合液的裂解结合试剂。

本发明在第三方面提供了一种从样本中提取真菌DNA的方法，所述方法采用本发明第一方面所述的裂解结合液或本发明第二方面所述的试剂盒进行。

本发明在第四方面提供了本发明第一方面所述的裂解结合液或本发明第二方面所述的试剂盒在真菌DNA提取中的应用。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供一种样本(例如临床样本，如全血、血浆、肺泡灌洗液和痰液等)中痕量真菌DNA的快速提取方法，裂解和结合一步法，适合自动化高通量操作。

(2)本发明无需液氮研磨、离心或珠研磨等繁琐的步骤，操作简单快捷。

(3)本发明适用样本类型广，核酸提取纯度高，真菌DNA提取效率高。

附图说明

图1显示了实施例6中进行的荧光定量PCR扩增的曲线图。

图2显示了实施例7中进行的荧光定量PCR扩增的曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请进行进一步的介绍。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。不同实施例之间可以替换或者合并组合，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。

定义

在详细描述本教导之前，应理解本公开不限于具体的组合物或工艺步骤，因为这些具体的组合物或工艺步骤可以在本发明相同或相似的构思的基础上做出改变，而这些改变也应当属于本发明的保护范围之内。应当注意，如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。

当本文提供值的范围时，除非另有明确说明，否则所述范围意在包括起始值和结束值，以及其间的值或值的范围。例如，“0.2至0.5”包括0.2、0.3、0.4、0.5等；其间的范围如0.2-0.3、0.3-0.4、0.2-0.4等；其间的具有更多小数点的值如0.25、0.35、0.220、0.325、0.49等；其间的端值具有更小数点的值的范围如0.26-0.39等。

本文使用的术语“样本”或“样品”将被理解意为任何这样的样品：可能包含目标核酸物质的样品，术语“样本”或“样品”或可包括溶液，如水溶液、细胞、组织、活检、粉末、或其中一种或多种的组合。

应当理解的是，在本公开中讨论的温度、质量、重量、体积比、浓度、时间等之前存在暗示的“约”，因此轻微和非实质性的偏差也落在本发明的保护范围内。通常，术语“约”表示组合物的组分量的非实质性变化，其对组合物的效果或稳定性没有任何显著影响。而且，“包含”、“含有”、和“包括”的使用不旨在是限制性的。应理解的是，前面的一般性描述和详细描述都仅是示例性和解释性的，并不是对本发明的限制。

除非特别指出，否则描述为“包含”各种组分的说明书中的实施方式除了表示含有列举的组分之外，还表示“由所述组分组成”或“基本上由所述组分组成”的意思。

在本申请中，“提取”、“分离”或“纯化”是指样品的一个或多个组分被除去或与其它样品组分分离。样品组分包含常处于通常水性溶液相中的目标核酸，其也可以包含细胞片段、蛋白质、碳水化合物、脂质、盐离子、金属离子和其它核酸。“提取”、“分离”或“纯化”并不意味着任何程度的纯化。通常，分离或纯化从其它样品组分中去除至少70％或至少80％或至少90％的目标核酸。

下文将对本发明的具体实施方式进行进一步的说明。

如上所述，本发明在第一方面提供了一种用于真菌DNA提取的裂解结合液，其特征在于，所述裂解结合液包含如下组分：高碘酸钠、盐酸胍、作为可选组分的尿素、氯化锂、Gemini(双子)季铵盐、聚氧乙烯辛烷基苯酚醚、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠、聚乙二醇和异丙醇。

本文中所述的“作为可选组分的尿素”表示尿素在所述裂解结合液中是可选组分，而不是必需组分。当所述裂解结合液不含有尿素时，其真菌DNA提取效果也能够满足例如PCR检测要求。当所述裂解结合液含有尿素时，其真菌DNA提取效果得到进一步的优化。

在本发明中，所述高碘酸钠和盐酸胍以及作为可选组分的尿素作为离液试剂，用于变性蛋白，破真菌细胞壁和细胞膜，并提供磁珠结合DNA的有效环境。

所述Gemini(双子)季铵盐可以来源于宁波东方永宁化工科技有限公司的12-3-12型Gemini(双子)季铵盐，与聚氧乙烯辛烷基苯酚醚复配从而产生更大的协同效应，可大幅度降低体系的表(界)面张力，具有较强的破壁效果。

所述聚氧乙烯辛烷基苯酚醚(有时称为CA630)可以是来源于Sigma公司的CA-630(货号为I3021)的聚氧乙烯辛烷基苯酚醚。

所述聚乙二醇可以是聚乙二醇2000，和异丙醇一起提供了磁珠与DNA结合的环境。

在一些优选的实施方式中，所述裂解结合液还包含余量的水。即，所述裂解结合液包含如下组分：高碘酸钠、盐酸胍、氯化锂、Gemini(双子)季铵盐、聚氧乙烯辛烷基苯酚醚、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠、聚乙二醇、异丙醇和余量的水。

在一些优选的实施方式中，所述裂解结合液还包含余量的水。即，所述裂解结合液包含如下组分：高碘酸钠、盐酸胍、尿素、氯化锂、Gemini(双子)季铵盐、聚氧乙烯辛烷基苯酚醚、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠、聚乙二醇、异丙醇和余量的水。

更优选的是，所述裂解结合液包含0.1-1M(例如为0.2、03、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9M)的高碘酸钠、2-8M(例如为3、4、5、6、7、8或9M)的盐酸胍、0-5M(例如为0、1、2、3、4或5M，或1-5M)的尿素、质量体积百分比为0.1-5％(例如为0.5、1、2、3或4％)的Gemini(双子)季铵盐、质量体积百分比为0.5-10％(1、2、3、4、5、6、7、8或9％)的聚氧乙烯辛烷基苯酚醚、20-200mM(例如为50、100或150mM)的三羟甲基氨基甲烷、10-50mM(例如为20、30或40mM)的乙二胺四乙酸二钠、质量体积百分比为1-20％(例如为2、5、10或15％)的聚乙二醇和质量体积百分比为5-50％(例如为10、20、30或40％)的异丙醇。在该实施方式中，所述裂解结合液还可以包含余量的水。

进一步优选的是，所述裂解结合液包含0.2-0.5M的高碘酸钠、2.5-6M的盐酸胍、1.5-3M的尿素、质量体积百分比为0.5-4％的Gemini(双子)季铵盐、质量体积百分比为2-8％的聚氧乙烯辛烷基苯酚醚、30-100mM的三羟甲基氨基甲烷、15-40mM的乙二胺四乙酸二钠、质量体积百分比为2-10％的聚乙二醇和质量体积百分比为15-35％的异丙醇。在该实施方式中，所述裂解结合液还可以包含余量的水。

更进一步优选的是，所述裂解结合液包含0.25-0.4M的高碘酸钠、3-4M的盐酸胍、2-3M的尿素、质量体积百分比为1-3％的Gemini(双子)季铵盐、质量体积百分比为3-6％的聚氧乙烯辛烷基苯酚醚、40-80mM的三羟甲基氨基甲烷、20-30mM的乙二胺四乙酸二钠、质量体积百分比为5-10％的聚乙二醇和质量体积百分比为20-35％的异丙醇。在该实施方式中，所述裂解结合液还可以包含余量的水。

在一些更优选的实施方式中，所述裂解结合液包含0.25M的高碘酸钠、3M的盐酸胍、2M的尿素、质量体积百分比为2％的Gemini(双子)季铵盐、质量体积百分比为5％的聚氧乙烯辛烷基苯酚醚、50mM的三羟甲基氨基甲烷、25mM的乙二胺四乙酸二钠、质量体积百分比为8％的聚乙二醇和质量体积百分比为25％的异丙醇。在该实施方式中，所述裂解结合液还可以包含余量的水。

在一些优选的实施方式中，所述裂解结合液的pH为5-8.5(例如为6、6.5、7或7.5)。更优选的是，所述裂解结合液的pH为6-7.5。

本发明在第二方面提供了一种用于真菌DNA提取的试剂盒，所述试剂盒包括用于配制本发明第一方面所述的裂解结合液的裂解结合试剂。所述裂解结合试剂例如可以包括如下组分或者由如下组分组成：高碘酸钠、盐酸胍、氯化锂、Gemini(双子)季铵盐、聚氧乙烯辛烷基苯酚醚、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠、聚乙二醇和异丙醇。所述裂解结合试剂还可以包括尿素和/或用于配制所述裂解结合液的水。

在一些优选的实施方式中，所述试剂盒还包括如下试剂中的至少一种：(1)蛋白酶K；(2)用于配制磁珠悬浮液的磁珠悬浮试剂；(3)用于配制清洗液的清洗试剂；和(4)用于配制洗脱液的洗脱试剂。

所述蛋白酶K可以冻干粉存在，也可以以蛋白酶K溶液存在。于是，在一些优选的实施方式中，所述蛋白酶K可以为蛋白酶k溶液形式，优选所述蛋白酶k溶液的浓度为20mg/mL。

所述磁珠悬浮试剂可以包括磁珠(例如纳米级或微米级磁性二氧化硅颗粒或者纳米级或微米级磁性羧基颗粒)和用于配制磁珠悬浮液的分散液。当然，也可以以磁珠悬浮液的形式存在。

在一些优选的实施方式中，所述磁珠悬浮液包含(i)纳米级或微米级磁性二氧化硅颗粒或者(ii)纳米级或微米级磁性羧基颗粒。优选的是，所述磁珠悬浮液中的磁珠为苏州白垩纪生物科技有限公司生产的磁珠系列产品，例如为硅羟基磁珠MagH1N Silica(Cat#BMD007511)、硅羟基磁珠MagH1 Silica(Cat#BMD003511)或Mag2000 Silica(Cat#BMD004511)。更优选的是，所述磁珠悬浮液为来自苏州白垩纪生物科技有限公司生产的MagH1 Silica，每次使用量可以为1-3mg，磁珠分散液(悬浮液)可以为无核酶水。

在一些优选的实施方式中，所述清洗液包括清洗液1和清洗液2。

其中，所述清洗液1包含0.5-5M(例如为1、2、3或4M)的氯化锂、0.1-0.5M(例如为0.2、0.3或0.4M)的吗啉乙磺酸、质量体积比为30-80％(例如为40、50、60或70％)的乙醇，pH为5.0-8.0(例如为5.5、6.0、6.5、7.0或7.5)。

优选的是，所述清洗液1包含1-4M的氯化锂，0.1-0.2M的吗啉乙磺酸，质量体积比为40-70％的乙醇，pH为5.0-7.0。

更优选的是，所述清洗液1为2.5M的氯化锂，0.1M的吗啉乙磺酸，质量体积比为50％的乙醇，pH为6.0。

其中，所述清洗液2包含0.05-0.2M(例如为0.1或0.15M)的氯化锂、0.05-0.5M(例如为0.1、0.2、0.3或0.4M)的三羟基甲基氨基甲烷和质量体积比为70-80％(例如为75％)的乙醇，pH为7.5。

优选的是，所述清洗液2为0.1M的氯化锂、0.1M的三羟基甲基氨基甲烷和质量体积比为70％的乙醇，pH为7.5。

更优选的是，所述洗脱液为10mM的Tris-HCl和0.1mM的EDTA，pH为8.5。

于是，所述用于配制清洗液的清洗试剂可以包括用于配制清洗剂1和清洗剂2的氯化锂、吗啉乙磺酸、乙醇以及三羟基甲基氨基甲烷。

在一些优选的实施方式中，所述洗脱液包含10mM Tris-HCl和0.1mM EDTA，pH为8.5。相应地，用于配制洗脱液的洗脱试剂可以包括Tris-HCl和EDTA。

用于配制所述蛋白酶K溶液、裂解结合液、清洗液和洗脱液的组分除了所示组分之外还可以包括余量的水。

在一些优选的实施方式中，所述方法可以包括如下步骤：(1)向真菌样本加入蛋白酶K溶液、裂解结合液和磁珠悬浮液进行裂解结合；(2)磁性分离，去除上清液，加入清洗液，涡旋振荡以去除大分子杂质；(3)磁性分离，去除上清液，加入清洗液，涡旋振荡以去除无机盐杂质；(4)磁性分离，去除上清液，再次加入清洗液，涡旋振荡以去除无机盐杂质；(5)磁性分离，去除上清液，室温挥发除醇后，使用洗脱液洗脱，磁性分离后，吸取上清液作为真菌DNA提取产物。

优选的是，所述蛋白酶K溶液、裂解结合液、磁珠悬浮液和/或洗脱液如本发明第二方面所述。

更优选的是，所述清洗液包括清洗液1和清洗液2，并且所述清洗液1和清洗液2如本申请第二方面所述。在这种情况下，步骤(2)中使用清洗液1作为清洗液，并且步骤(3)和(4)使用清洗液2作为清洗液。

本发明对各试剂的用量没有特别的要求，只要能够提取出样本中包含的真菌DNA样品并达到预期效果即可。本领域技术人员可以根据实际情况或预期效果对各试剂的用量进行酌情调整。例如，所述方法可以包括如下步骤：

(1)在2mL离心管中依次加入0.2mL临床样本，50μL蛋白酶K溶液，600μL裂解结合液和20-60μL磁珠悬浮液(优选其中包含1-3mg磁珠)，在55℃(可以采用金属浴或水浴)裂解结合15分钟；(2)磁性分离，去除上清液，加入0.5-1mL清洗液1，涡旋振荡1min去除大分子杂质；(3)磁性分离，去除上清液，加入0.5-1mL清洗液2，涡旋振荡1min去除无机盐杂质；(4)磁性分离，去除上清液，再次加入0.5-1mL清洗液2，涡旋振荡1min去除无机盐杂质；(5)磁性分离，去除上清液，室温挥发除醇后，使用50-200μL洗脱液在60℃下加热洗脱5min，磁性分离后，吸取上清液作为真菌DNA提取产物。

本发明方法对所要提取的样本没有特别的限制。例如，所述样本为医院临床样本。另外优选的是，所述样本选自全血、血浆、肺泡灌洗液和痰液中的一种样本。本发明方法可以用于痕量真菌DNA的提取，所提取得到的DNA可以用于PCR例如qPCR的检测。

实施例

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：

配制如下试剂，包括如下组分：蛋白酶K溶液、裂解结合液、磁珠悬浮液、清洗液1、清洗液2和洗脱液。

所述蛋白酶K溶液的浓度为20mg/mL，来源于苏州白垩纪生物科技有限公司生产的蛋白酶K溶液(Cat#CNA02120)。

所述裂解结合液包含0.25M高碘酸钠、3M盐酸胍、2M尿素、质量体积百分比为2％的Gemini(双子)季铵盐、质量体积百分比为5％的CA630(Sigma公司的CA-630，货号为I3021，CAS No.9002-93-1)、50mM三羟甲基氨基甲烷、25mM乙二胺四乙酸二钠、质量体积百分比为8％聚乙二醇2000、质量体积百分比为25％异丙醇，以及余量的水，pH＝7.0。

所述Gemini(双子)季铵盐来自宁波东方永宁化工科技有限公司的12-3-12型Gemini(双子)季铵盐。

所述磁珠悬浮液来源于苏州白垩纪生物科技有限公司生产的MagH1Silica(50mg/mL)，每次使用量为2mg(40μL)，悬浮液为无核酶水。

所述清洗液1为2.5M氯化锂，0.1M吗啉乙磺酸，质量体积比为50％乙醇，pH为6.0。

所述清洗液2为0.1M氯化锂，0.1M三羟基甲基氨基甲烷和质量体积比为70％乙醇，pH为7.5。

所述洗脱液为10mM Tris-HCl和0.1mM EDTA，pH为8.5。

对比例1

与实施例1的配方基本一致，不同之处在于，所述裂解结合液中不含有Gemini(双子)季铵盐。

对比例2

与实施例1的配方基本一致，不同之处在于，所述裂解结合液中不含有高碘酸钠。

对比例3

与实施例1的配方基本一致，不同之处在于，上述裂解结合液中不含有盐酸胍。

对比例4

与实施例1的配方基本一致，不同之处在于，所述裂解结合液中不含有尿素。

实施例2

本实施例提供一种通过实施例1的试剂组合进行手工提取方法，该方法包括如下步骤：

1)在2mL离心管中依次加入0.2mL临床样本，50μL蛋白酶K溶液，600μL裂解结合液和40μL磁珠悬浮液(2mg磁珠固体)，55℃金属浴振荡裂解结合15分钟。

2)磁性分离，去除上清液，加入0.6mL清洗液1，涡旋振荡1min去除大分子杂质。

3)磁性分离，去除上清液，加入0.6mL清洗液2，涡旋振荡1min去除无机盐杂质。

4)磁性分离，去除上清液，再次加入0.6mL清洗液2，涡旋振荡1min去除无机盐杂质。

5)磁性分离，去除上清液，室温挥发除醇后，使用100μL洗脱液在60度下加热洗脱5min，磁性分离后，吸取上清液作为DNA提取产物。

实施例3

本实施例提供一种通过实施例1的试剂组合进行32位核酸提取仪自动化提取方法。

【试剂加板方式】

【上机提取步骤——白垩纪32位核酸提取仪】

1)将装好试剂的试剂板平放于桌面上；

2)向1/7号孔位中依次加入200μL临床样本、40μL磁珠悬浮液、50μL蛋白酶K溶液。

3)将试剂板放置于核酸提取仪底座上，将8位磁棒套插入核酸提取仪卡槽内，运行相应自动化提取程序；

4)程序运行完毕，转移6/12号孔位中DNA洗脱液至新的离心管中储存。

【白垩纪32位核酸提取仪程序参数】

实施例4

本实施例提供一种通过实施例1的试剂组合进行96位核酸提取仪自动化提取方法

【试剂加板方式】

试剂板	内容物	白垩纪核酸提取仪
			样品盘(Sample Plate)	裂解结合液:600μL	盘位1
第1洗涤盘(Wash 1Plate)	清洗液1:600μL	盘位2
			第2洗涤盘(Wash 2Plate)	清洗液2:600μL	盘位3
第3洗涤盘(Wash 3Plate)	清洗液2:600μL	盘位4
			洗脱盘(Elute Plate)	洗脱液:100μL	盘位8

【上机提取步骤——96位核酸提取仪】

1)将装好试剂的试剂板平放于桌面上；

2)在样品盘(Sample Plate)中相应孔位中依次加入200μL临床样本、40μL磁珠悬浮液、50μL蛋白酶K溶液。

3)将96位磁棒套放入卡槽中到第3洗涤盘(Wash 3Plate)中(必须准确放入，否则可能损坏磁棒套。

4)将试剂板按对应顺序放入核酸提取仪中，运行程序。

5)程序运行完毕，转移洗脱盘(Elute Plate)中产物至新的离心管中，提取过程结束。

【白垩纪生物96位核酸提取仪程序参数】

OFF表示关闭加热装置。

实施例5

使用全血、血浆、肺泡灌洗液和已经液化好的痰液样本，分别取2mL上述样本，在其中加入新生隐球菌(真菌类，隐球菌的一种，来自上海保藏微生物有限公司，菌种编号SHBCCD10519)原始菌液5μL，室温混匀20分钟，使原始菌液在临床样本中充分均匀分布。

使用实施例1的试剂组合，分别配套实施例2的手动提取，实施例3的32位核酸提取仪自动化操作以及实施例4的96位核酸提取仪自动化操作。分别使用上述的方法，提取含新生隐球菌的全血样本、含新生隐球菌的血浆样本、含新生隐球菌的肺泡灌洗液样本和含新生隐球菌的液化好的痰液样本。

每种样本提取的取样量为200μL，最终的洗脱体积为100μL。对提取完成的DNA进行新生隐球菌荧光定量PCR检测，扩增试剂使用苏州白垩纪生物科技有限公司的UniversalDirect Taqman qPCR Master Mix(5×)(Cat：CRP02380)作为qPCR预混液进行检测，选用新生隐球菌的特异性基因进行扩增，选用苏州雅睿生物技术股份有限公司旗下的荧光定量PCR仪(MA-688)进行定量，使用模板上样量为5μL，总体系为25μL。

如下表所示，使用本发明提供的实施例1的试剂组合，使用手动提取、或者仪器自动化的方案，其Ct值结果都是吻合的。

此外，我们使用不同的临床样本，全血、血浆、肺泡灌洗液和已经液化好的痰液样本，如上的样本都是在临床端经常用来筛查真菌感染的样本，本发明无需通过离心或者液氮研磨等方式，直接吸取临床样本并且直接上仪器自动化就可以实现真菌DNA的提取，而且当新生隐球菌在不同的样本中的浓度一致时，本发明提供的试剂组合对不同的样本类型中真菌DNA的检出没有明显的差异，从Ct值看基本都是接近的，这证明了本发明对于不同临床样本的兼容性较好。

所使用到的新生隐球菌的引物和探针如下表所示：

Cry-F	5'-GTCTCTAACATGTTGGGTCTCG-3'
		Cry-R	5'-TCCTAGAGTCATCCACACTTCA-3'
Cry-P-FAM	FAM-5'-CCCTTACATCCAAGTCTCTAGAGGAAGCC-3'-TAMRA

扩增程序如下表所示：

表1.采用不同方案检测不同临床样本中的新生隐球菌的Ct值。

实施例6

使用临床新鲜全血样本，取2mL在其中加入白色念珠菌(真菌类，念珠菌的一种，又名白色假丝酵母菌，来自上海保藏微生物有限公司，菌种编号SHBCC D10545)原始菌液5μL，室温混匀20分钟，使原始菌液在临床样本中充分均匀分布。

使用实施例1的试剂组合以及对比例1-4的试剂组合结合实施例3的提供的32位核酸提取仪自动化提取方案，对上述的样本提取的取样量为200μL(含白色念珠菌的新鲜全血样本)，最终的洗脱体积为100μL。

对提取完成的DNA进行白色念珠菌荧光定量PCR检测，扩增试剂使用苏州白垩纪生物科技有限公司的Universal Direct Taqman qPCR Master Mix(5×)(Cat：CRP02380)作为qPCR预混液进行检测，选用白色念珠菌的特异性基因进行扩增，选用苏州雅睿生物技术股份有限公司旗下的荧光定量PCR仪(MA-688)进行定量，使用模板上样量为5μL，总体系为25μL。扩增程序如实施例5一致。

从图1可以看出，实施例1提供的试剂组合具有最高的检测灵敏度(Ct＝26.1)，而对比例1-4提供的试剂组合的Ct值都有不同程度的延迟，尤其发现对比例1提供的试剂组合中，当裂解结合液不含有Gemini(双子)季铵盐时，Ct值降至36.2，与实施例1的Ct值差异值接近10个，这表明当不使用Gemini(双子)季铵盐时，本发明无法对白色念珠菌完成裂解。同样的，对比例2提供的试剂组合中，当裂解结合液不含有高碘酸钠时，Ct值也降至35.1，对比例3提供的试剂组合中，当裂解结合液不含有盐酸胍时，Ct值降至32.1。此外，对比例4提供的试剂组合中，当裂解结合液不含有尿素时Ct值降至28.1，与其他对比例相比，效果较好。这表明在裂解结合液中，Gemini(双子)季铵盐、高碘酸钠和盐酸胍对临床样本中的真菌裂解和结合起到至关重要的作用，而尿素的作用是其次的，不过相对于实施例1的试剂组合，也有较为明显的延迟。

所使用到的白色念珠菌的引物和探针如下表所示：

Can-F	5’-TTTGGTGGTGGTAGACAT-3'
		Can-R	5’-ATCAGGGTCAGGCACTTT-3'
Can-P-FAM	FAM-5'-TAGATGTATTGGGGAACAATTTGCTTATGTTCA-3'-BHQ

实施例7商品化对照

本发明采购了市场上主流用到的真菌提取试剂盒来自天根生化科技(北京)有限公司的酵母基因组DNA提取试剂盒(Cat#DP307)作为对照，本发明提供的实施例1的试剂组合搭配本发明实施例3提供的32位核酸提取仪自动化提取方案与商品化试剂进行比较。

临床样本使用肺泡灌洗液，分取2mL在其中加入白色念珠菌原始菌液5μL和0.1μL，室温混匀20分钟，使原始菌液在临床样本中充分均匀分布。对上述的样本提取的取样量为200μL(含白色念珠菌的肺泡灌洗液样本)，最终的洗脱体积为100μL，本发明的操作方案与实施例6提供的提取操作流程一致。而使用天根生化科技(北京)有限公司的酵母基因组DNA提取试剂盒(Cat#DP307)的操作按照其说明书进行，具体如下：首先将含有白色念珠菌的肺泡灌洗液样本进行离心操作，选用12,000rpm离心1min，弃上清液，向菌体中加入600μL山梨醇buffer以及50U Lyticase(裂解酶)，30℃孵育30份，4,000rpm离心10min，向沉淀中加入200μL缓冲液GA重悬沉淀，充分混匀。加入20μL Proteinase K溶液，混匀，加入220μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，待溶液变清亮，简短离心以使管盖内壁的水珠收入管内液体中。加220μL无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心以使管盖内壁的水珠收人管内液体中。然后按照说明书进行三次清洗，并最终洗脱。

计时发现，当使用天根生化科技(北京)有限公司的酵母基因组DNA提取试剂盒时全程手动操作，离心2次，总耗时1.5小时。而使用本发明的自动化方案，直接加入200μL临床样本即可自动化完成裂解、结合、清洗和洗脱，全程30分钟无需人工干预即可获得真菌DNA。

对提取完成的DNA进行白色念珠菌荧光定量PCR检测，扩增试剂使用苏州白垩纪生物科技有限公司的Universal Direct Taqman qPCR Master Mix(5×)(Cat：CRP02380)作为qPCR预混液进行检测，选用白色念珠菌的特异性基因进行扩增，选用苏州雅睿生物技术股份有限公司旗下的荧光定量PCR仪(MA-688)进行定量，使用模板上样量为5μL，总体系为25μL。扩增程序如实施例5一致，扩增引物和探针如实施例6所示。

从图2可以看出，当在肺泡灌洗液中加入菌液为5μL时，本发明提供的方案提取DNA的Ct值为26.0，而对照试剂(天根生化提供)的Ct值为27.8。当在肺泡灌洗液中加入菌液为0.1μL时，本发明提供的方案提取DNA的Ct值为33.7，而对照试剂(天根生化提供)的Ct值为35.4。这表明不管在临床样本如肺泡灌洗液中加入是高浓度菌液(5μL)还是低浓度菌液(0.1μL)，本发明提供的方案都比对照试剂盒灵敏度高。此外，比较明显的是，本发明提供的方案只需要30分钟即可自动化完全临床样本真菌DNA的提取，而市场主流的真菌DNA提取流程过于繁琐，耗时长，需要手工操作，无法自动化完成。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例进行的上述说明的目的在于使本领域专业技术人员能够实施本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不应该被限制于本文所示的这些实施例，而是只要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围即为本发明的保护范围。

Claims

1.一种用于真菌DNA提取的裂解结合液，其特征在于，所述裂解结合液包含如下组分：高碘酸钠、盐酸胍、作为可选组分的尿素、氯化锂、Gemini(双子)季铵盐、聚氧乙烯辛烷基苯酚醚、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠、聚乙二醇和异丙醇。

2.根据权利要求1所述的裂解结合液，其特征在于，所述裂解结合液还包含余量的水。

3.根据权利要求1或2所述的裂解结合液，其特征在于：

所述裂解结合液包含0.1-1M的高碘酸钠、2-8M的盐酸胍、0-5M的作为可选组分的尿素、质量体积百分比为0.1-5％的Gemini(双子)季铵盐、质量体积百分比为0.5-10％的聚氧乙烯辛烷基苯酚醚、20-200mM的三羟甲基氨基甲烷、10-50mM的乙二胺四乙酸二钠、质量体积百分比为1-20％的聚乙二醇和质量体积百分比为5-50％的异丙醇；

优选的是，所述裂解结合液包含0.2-0.5M的高碘酸钠、2.5-6M的盐酸胍、1.5-3M的作为可选组分的尿素、质量体积百分比为0.5-4％的Gemini(双子)季铵盐、质量体积百分比为2-8％的聚氧乙烯辛烷基苯酚醚、30-100mM的三羟甲基氨基甲烷、15-40mM的乙二胺四乙酸二钠、质量体积百分比为2-10％的聚乙二醇和质量体积百分比为15-35％的异丙醇；

更优选的是，所述裂解结合液包含0.25-0.4M的高碘酸钠、3-4M的盐酸胍、2-3M的作为可选组分的尿素、质量体积百分比为1-3％的Gemini(双子)季铵盐、质量体积百分比为3-6％的聚氧乙烯辛烷基苯酚醚、40-80mM的三羟甲基氨基甲烷、20-30mM的乙二胺四乙酸二钠、质量体积百分比为5-10％的聚乙二醇和质量体积百分比为20-35％的异丙醇；

进一步优选的是，所述裂解结合液包含0.25M的高碘酸钠、3M的盐酸胍、2M的作为可选组分的尿素、质量体积百分比为2％的Gemini(双子)季铵盐、质量体积百分比为5％的聚氧乙烯辛烷基苯酚醚、50mM的三羟甲基氨基甲烷、25mM的乙二胺四乙酸二钠、质量体积百分比为8％的聚乙二醇和质量体积百分比为25％的异丙醇。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的裂解结合液，其特征在于：

所述裂解结合液的pH为5-8.5；优选的是，所述裂解结合液的pH为6-7.5。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的裂解结合液，其特征在于：

所述Gemini(双子)季铵盐为12-3-12型Gemini(双子)季铵盐；

所述聚氧乙烯辛烷基苯酚醚为来自Sigma公司的CA-630；和/或

所述聚乙二醇为聚乙二醇2000。

6.一种用于真菌DNA提取的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于配制权利要求1至5中任一项所述的裂解结合液的裂解结合试剂。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括如下试剂中的至少一种：(1)蛋白酶K；(2)用于配制磁珠悬浮液的磁珠悬浮试剂；(3)用于配制清洗液的清洗试剂；和(4)用于配制洗脱液的洗脱试剂；

优选的是，所述蛋白酶K为蛋白酶k溶液形式，优选所述蛋白酶k溶液的浓度为20mg/mL；所述磁珠悬浮液包含(i)纳米级或微米级磁性二氧化硅颗粒或者(ii)纳米级或微米级磁性羧基颗粒；优选的是，所述磁珠悬浮液中的磁珠为苏州白垩纪生物科技有限公司生产的磁珠系列产品，例如为硅羟基磁珠MagH1N Silica(Cat#BMD007511)、硅羟基磁珠MagH1Silica(Cat#BMD003511)或Mag2000 Silica(Cat#BMD004511)；更优选的是，所述磁珠悬浮液为来自苏州白垩纪生物科技有限公司生产的MagH1 Silica；所述清洗液包括清洗液1和清洗液2；其中：所述清洗液1包含0.5-5M的氯化锂、0.1-0.5M的吗啉乙磺酸、质量体积比为30-80％的乙醇，pH为5.0-8.0；优选的是，所述清洗液1包含1-4M的氯化锂，0.1-0.2M的吗啉乙磺酸，质量体积比为40-70％的乙醇，pH为5.0-7.0；更优选的是，所述清洗液1为2.5M的氯化锂，0.1M的吗啉乙磺酸，质量体积比为50％的乙醇，pH为6.0；所述清洗液2包含0.05-0.2M的氯化锂、0.05-0.5M的三羟基甲基氨基甲烷和质量体积比为70-80％的乙醇，pH为7.5；优选的是，所述清洗液2为0.1M的氯化锂、0.1M的三羟基甲基氨基甲烷和质量体积比为70％的乙醇，pH为7.5；更优选的是，所述洗脱液为10mM的Tris-HCl和0.1mM的EDTA，pH为8.5；和/或所述洗脱液包含10mM Tris-HCl和0.1mM EDTA，pH为8.5。

8.一种从样本中提取真菌DNA的方法，其特征在于，所述方法采用权利要求1至5中任一项所述的裂解结合液或权利要求6或7所述的试剂盒进行。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)向真菌样本加入蛋白酶K溶液、裂解结合液和磁珠悬浮液进行裂解结合；

(2)磁性分离，去除上清液，加入清洗液，涡旋振荡以去除大分子杂质；

(3)磁性分离，去除上清液，加入清洗液，涡旋振荡以去除无机盐杂质；

(4)磁性分离，去除上清液，再次加入清洗液，涡旋振荡以去除无机盐杂质；

(5)磁性分离，去除上清液，室温挥发除醇后，使用洗脱液洗脱，磁性分离后，吸取上清液作为真菌DNA提取产物；

优选的是，所述方法包括如下步骤：(1)在2mL离心管中依次加入0.2mL临床样本，50μL蛋白酶K溶液，600μL裂解结合液和20-60μL磁珠悬浮液(优选其中包含1-3mg磁珠)，在55℃裂解结合15分钟；(2)磁性分离，去除上清液，加入0.5-1mL清洗液1，涡旋振荡1min去除大分子杂质；(3)磁性分离，去除上清液，加入0.5-1mL清洗液2，涡旋振荡1min去除无机盐杂质；(4)磁性分离，去除上清液，再次加入0.5-1mL清洗液2，涡旋振荡1min去除无机盐杂质；(5)磁性分离，去除上清液，室温挥发除醇后，使用50-200μL洗脱液在60℃下加热洗脱5min，磁性分离后，吸取上清液作为真菌DNA提取产物。

10.权利要求1至5中任一项所述的裂解结合液或权利要求6或7所述的试剂盒在真菌DNA提取中的应用；优选的是，所述真菌DNA提取采用医院临床样本进行提取；另外优选的是，述真菌DNA提取采用选自全血、血浆、肺泡灌洗液和痰液中的一种样本进行提取。