CN106867998A - 高通量自动化从痰液样本中提取病原体核酸的试剂盒 - Google Patents

高通量自动化从痰液样本中提取病原体核酸的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高通量自动化从痰液样本中提取病原体核酸的试剂盒，包括痰液消化试剂，裂解液，磁珠，洗涤液和洗脱液；其中的痰液消化试剂为1~6M的 NaOH；裂解液是由2~8M的胍盐、表面活性剂、pH缓冲介质和金属螯合剂配制而成的pH≤3的酸性溶液。本发明的试剂盒在提取痰液样本中的病原体（包括细菌、病毒、真菌）核酸时无需离心，便于自动化操作；对痰液样本中的病毒、细菌、真菌DNA和RNA均可提取，更具有通用性；提取过程中无有机毒剂，更加安全；提取核酸的纯度高，提高了痰液临床样本在疾病诊断中的价值。

Description

高通量自动化从痰液样本中提取病原体核酸的试剂盒
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域，尤其是涉及一种高通量自动化从痰液样本中提取病原体核酸的试剂盒。
背景技术
人体气管、支气管的内壁都覆盖着一层粘膜，在粘膜下层含较多的粘液腺和浆液腺。正常情况下，杯状细胞和腺体分泌少量粘液覆盖在粘膜层表面，对粘膜起保护作用，可保持气管粘膜的湿润，以便把吸入气管、支气管内的尘埃颗粒、细菌等粘附住，阻挡其进入肺组织深处。当气管、支气管和肺受到有害因素的刺激或致病菌感染而发生炎症时，呼吸道的粘膜充血、水肿，大量炎性细胞浸润，血管扩张，渗出增加，粘膜层的杯状细胞和粘膜下层的腺体增生肥大，粘液分泌大量增多，产生一些变性坏死组织细胞，滞留在支气管内，粘液和这些变性坏死的组织细胞就构成了痰。正常人一般不咯痰或仅有少量泡沫样痰或粘液样痰，当呼吸道有病变时，呼吸道粘膜受刺激，分泌物增多，痰也增多。病变包括支气管扩张症、肺脓肿、肺结核、肺癌等；此时痰液中就会包含粘液、异物、病原微生物，各种炎症细胞及坏死脱落的粘膜上皮细胞、肿瘤细胞等成分。痰液中的细菌真菌病毒等病原微生物核酸是呼吸道感染等疾病分子诊断的重要标本。从呼吸道痰液脱落细胞中提取病原物核酸（DNA和RNA)，通过PCR、荧光定量PCR等分子生物学检测手段进行基因检测，可用于呼吸道感染的快速诊断。
传统的痰液病原体核酸提取方法为：用氢氧化钠消化痰液，然后高速离心收集沉淀，用磷酸缓冲液洗涤沉淀2次，离心收集菌体，再利用高温煮沸，裂解核酸，然后高速离心，取上清即为制备的核酸。此过程需要反复的离心洗涤，操作非常复杂，容易在消化和提取过程中损失大量核酸，同时杂质去除率低，导致检测假阴性；而反复离心工作不利于核酸检测的自动化，且该方法不适用于痰液中病原体RNA的提取，不具有通用性，直接限制了通过痰液进行呼吸道感染等疾病的临床诊断，降低了痰液这一重要临床样本在疾病诊断中的价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高通量自动化从痰液样本中提取病原体核酸的试剂盒。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的高通量自动化从痰液样本中提取病原体核酸的试剂盒，包括痰液消化试剂，裂解液，磁珠，洗涤液和洗脱液；所述痰液消化试剂为1~6M的 NaOH；所述裂解液是由2~8M的胍盐、表面活性剂、pH缓冲介质和金属螯合剂配制而成的pH≤3的酸性溶液。
所述胍盐可以为异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍、碳酸胍、磷酸胍或硝酸胍等，优选为异硫氰酸胍，可起到抑制RNase 活性，保护核酸不被降解的作用，优选其浓度为4M；所述表面活性剂可以由SDS、Tween 20、Triton X-100、NP-40、十二烷基肌氨酸钠、CTAB中的一种或两种以上组合物组成，其浓度为1~20%，优选的表面活性剂为Triton X-100，浓度为10%；所述pH缓冲介质为10~100mM 的Tris-HCl，由盐酸或醋酸调节至pH≤3，优选pH＜2；所述金属螯合剂为10~25 mM 的EDTA，用于稳定体系pH值，并除去作为核酸酶活性辅因子的金属离子。
所述磁珠为磁性复合微粒，由核酸吸附载体和具有超顺磁性的磁性纳米粒子组成；所述核酸吸附载体为二氧化硅或是用氨基或羧基修饰的聚乙烯醇、多糖、硅树脂、聚苯乙烯中的一种或两种以上的混合物；所述超顺磁性的磁性纳米粒子为Fe、Co、Ni、 Fe203、Fe304、Co203、Co304中的一种或两种以上的混合物。
所述洗涤液为柠檬酸盐缓冲液，或磷酸盐缓冲液，或75%乙醇的Tris缓冲液，当然也可以采用本领域常用的其他洗涤液。
本发明采用的洗脱液可以为本领域常用的各种洗脱液，如10mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0。
本发明的试剂盒在提取痰液样本中的病原体（包括细菌、病毒、真菌）核酸时无需离心，便于自动化操作；对痰液样本中的病毒、细菌、真菌DNA和RNA均可提取，更具有通用性；提取过程中无有机毒剂，更加安全；提取核酸的纯度高，提高了痰液临床样本在疾病诊断中的价值。
本发明试剂盒提取总核酸（包括DNA和RNA）时无需离心，用氢氧化钠消化痰液后，直接取消化液，将其添加到酸性的裂解液中后直接加磁珠，酸碱中和反应与样本裂解反应、核酸吸附反应一步完成；特制的核酸溶液能保护核酸DNA和RNA，同时维持适合磁珠核酸吸附的pH环境和高盐环境；用洗涤液洗涤杂质和残留的盐分，洗脱核酸即制备出痰液总核酸（DNA和RNA）。
附图说明
图1是采用本发明实施例1制备的试剂盒从痰液中提取白色念球菌DNA的RealtimePCR扩增图。
图2是采用本发明实施例2制备的试剂盒从痰液中提取合胞病毒 RNA和梯度稀释RNA 的Realtime PCR扩增图。
图3是采用本发明实施例3制备的试剂盒从痰液中提取支原体DNA和梯度稀释DNA的RealtimePCR扩增图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步解释，以帮助理解本发明。
实施例1
一、本发明高通量自动化从痰液样本中提取病原体核酸的试剂盒，包括下述试剂：
1）痰液消化液：氢氧化钠，浓度1M；
2）裂解液：pH＜1.0，包括
异硫氰酸胍，浓度4M，
Trizma®HCl，浓度50mM，
Triton X-100（v/v,%），浓度10%，
EDTA ，浓度10mM，
HCl，浓度0.1M；
3）洗涤液：柠檬酸钠，浓度10 mM，pH 6.0；
4）洗脱液：pH 8.0，包括
Trizma®Base，浓度10 mM，
EDTA，浓度1 mM；
5）磁珠 20 ul。
二、取临床痰液培养鉴定白色念球菌阳性的患者痰液标本，使用上述试剂在自动化移液工作站上进行痰液核酸提取，具体步骤包括：
1）将痰液标本内加入3倍量的痰液消化液，室温静置30min液化；
2）吸取液化后的样本上清，取300ul 消化物至离心管中，加入600ul 裂解液和20ul 磁珠；
3）吸打混匀10次，室温静置5min；
4）将离心管放置于磁力架上，磁吸1min，去上清；
5）加600ul洗液，吸打混匀10次；
6）将离心管放置于磁力架上，磁吸1min，去上清；
7）重复加600ul洗液，吸打混匀5次；
8）上磁力架，磁吸1min，取上清；
9）加100ul 洗脱液，80℃ 5min；上磁力架磁吸1min，取洗脱液物即为提取的核酸；
10）用制备的核酸和系列10倍梯度稀释制备的核酸，用于Realtime PCR扩增鉴定提取结果，如下表1和附图1所示。
表1
结论：从痰液中成功提取到了白色念球菌DNA核酸，经10倍梯度稀释核酸后，曲线典型，梯度均一，说明提取的纯度高。
实施例2
一、本发明高通量自动化从痰液样本中提取病原体核酸的试剂盒，包括下述试剂：
1）痰液消化液：氢氧化钠，浓度1M；
2）裂解液：pH＜2.0，包括
异硫氰酸胍，浓度4M，
Trizma®HCl，浓度50mM，
Triton X-100（v/v,%），浓度10%，
EDTA ，浓度10mM，
HCl，浓度50mM；
3）洗涤液：柠檬酸钠，浓度10 mM，pH 6.0；
4）洗脱液：pH 8.0，包括
Trizma®Base，浓度10 mM，
EDTA，浓度1 mM；
5）磁珠 20 ul。
二、取临床PCR鉴定呼吸道合胞病毒感染患者的痰液标本，使用上述试剂在自动化移液工作站上进行痰液核酸提取，具体步骤包括：
1）将痰液标本内加入3倍量的痰液消化液，室温静置30min液化；
2）吸取液化后的样本上清，取200ul 消化物至离心管中，加入400ul 裂解液和20ul 磁珠；
3）吸打混匀10次，室温静置5min；
4）将离心管放置于磁力架上，磁吸1min，去上清；
5）加600ul洗液，吸打混匀10次；
6）将离心管放置于磁力架上，磁吸1min，去上清；
7）重复加600ul洗液，吸打混匀5次；
8）上磁力架，磁吸1min，取上清；
9）加100ul 洗脱液，80℃ 5min；上磁力架磁吸1min，取洗脱液物即为提取的核酸；
10）用制备的核酸和系列10倍梯度稀释制备的核酸，用于Realtime PCR扩增鉴定提取结果，如下表2和附图2所示。
表2
结论：从痰液中成功提取到了呼吸道合胞病毒核酸RNA，经10倍梯度稀释核酸后，曲线典型，梯度均一，说明提取的纯度高。
实施例3
一、本发明高通量自动化从痰液样本中提取病原体核酸的试剂盒，包括下述试剂：
1）痰液消化液：氢氧化钠，浓度1M；
2）裂解液：pH＜2.0，包括
异硫氰酸胍，浓度4M，
Trizma®HCl，浓度50mM，
Triton X-100（v/v,%），浓度10%，
EDTA ，浓度10mM，
HCl，浓度50mM；
3）洗涤液：柠檬酸钠，浓度10 mM，pH 6.0；
4）洗脱液：pH 8.0，包括
Trizma®Base，浓度10 mM，
EDTA，浓度1 mM；
5）磁珠 20 ul。
二、取临床PCR鉴定支原体肺炎感染患者的痰液标本，使用上述试剂在自动化移液工作站上进行痰液核酸提取，具体步骤包括：
1）将痰液标本内加入3倍量的痰液消化液，室温静置30min液化；
2）吸取液化后的样本上清，取500ul 消化物至离心管中，加入1000ul 裂解液和20ul磁珠；
3）吸打混匀10次，室温静置5min；
4）将离心管放置于磁力架上，磁吸1min，去上清；
5）加600ul洗液，吸打混匀10次；
6）将离心管放置于磁力架上，磁吸1min，去上清；
7）重复加600ul洗液，吸打混匀5次；
8）上磁力架，磁吸1min，取上清；
9）加100ul 洗脱液，80℃ 5min；上磁力架磁吸1min，取洗脱液物即为提取的核酸；
10）用制备的核酸和系列10倍梯度稀释制备的核酸，用于Realtime PCR扩增鉴定提取结果，如下表3和附图3所示。
表3
结论：从痰液中成功提取到了支原体细菌核酸DNA，经10倍梯度稀释核酸后，曲线典型，梯度均一，说明提取的纯度高。

Claims (4)

1.一种高通量自动化从痰液样本中提取病原体核酸的试剂盒，其特征在于：包括痰液消化试剂，裂解液，磁珠，洗涤液和洗脱液；所述痰液消化试剂为1~6M的 NaOH；所述裂解液是由2~8M的胍盐、表面活性剂、pH缓冲介质和金属螯合剂配制而成的pH≤3的酸性溶液。
2.根据权利要求1所述的高通量自动化从痰液样本中提取病原体核酸的试剂盒，其特征在于：所述胍盐为异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍、碳酸胍、磷酸胍或硝酸胍；所述表面活性剂由SDS、Tween 20、Triton X-100、NP-40、十二烷基肌氨酸钠、CTAB中的一种或两种以上组合物组成，其浓度为1~20%；所述pH缓冲介质为10~100mM 的Tris-HCl，由盐酸或醋酸调节至pH≤3；所述金属螯合剂为10~25 mM 的EDTA。
3.根据权利要求1所述的高通量自动化从痰液样本中提取病原体核酸的试剂盒，其特征在于：所述磁珠为磁性复合微粒，由核酸吸附载体和具有超顺磁性的磁性纳米粒子组成；所述核酸吸附载体为二氧化硅或是用氨基或羧基修饰的聚乙烯醇、多糖、硅树脂、聚苯 乙烯中的一种或两种以上的混合物；所述超顺磁性的磁性纳米粒子为Fe、Co、Ni、 Fe203、Fe304、Co203、Co304中的一种或两种以上的混合物。
4.根据权利要求1所述的高通量自动化从痰液样本中提取病原体核酸的试剂盒，其特征在于：所述洗涤液为柠檬酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液或75%乙醇的Tris缓冲液。
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